CN110373457B - 一种用于溃疡性结肠炎诊断的mRNA标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于溃疡性结肠炎诊断的mRNA标志物及其应用，所述标志物为SEQ ID No:1所示的ETV5。本发明提供的mRNA标志物ETV5对于诊断UC具有很高的特异性及灵敏度，可以作为新型的生物标志物用于UC的临床诊断。

Description

一种用于溃疡性结肠炎诊断的mRNA标志物及其应用

技术领域

本发明属于医学分子生物学技术领域，具体涉及一种用于溃疡性结肠炎诊断的mRNA标志物及其应用。

背景技术

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种主要累及结肠的慢性、非特异性的炎症性疾病，临床表现主要包括腹痛、腹泻及粘液脓血便等。虽然目前UC的发病机制仍不清楚，但是越来越多的研究表明，CD4⁺T细胞免疫调节功能紊乱诱导的炎症反应在UC发生发展过程中发挥关键作用。随着环境和饮食习惯改变，UC发病率在我国呈逐年上升趋势。该病易复发，常迁延不愈，有致残、癌变等风险，给患者身心造成沉重打击。

随着科技进步，UC的诊断和治疗不断发展。目前用于UC临床诊断的方法主要为内镜、组织病理学和血液检查。但是许多患者因病情严重导致肠腔狭窄、虚弱等情况，难以耐受内镜检查，使得临床诊断和病情严重程度评估受到巨大限制。血液检查包括血沉、C-反应蛋白、内毒素等指标，但是由于上述指标缺乏特异性，导致UC难以与其他消化道疾病(如：淋巴瘤、肠结核、缺血性肠炎等)相鉴别，易引起误诊，延误治疗。此外，由于发病机制尚不明确，目前UC的临床治疗亦面临巨大挑战。因此，探索UC的发病机制，寻找特异性的UC诊断标志物和治疗靶点，对我国UC的临床诊治极其重要。

人类ETS variant 5(ETV5)基因位于3号染色体上。有研究表明，ETV5在多种肿瘤性疾病及自身免疫性疾病的发生发展过程中发挥重要作用。但是ETV5基因在UC患者外周血CD4⁺T细胞中的表达水平及其对CD4⁺T细胞的免疫调节作用未见相关报道。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种用于溃疡性结肠炎诊断的mRNA标志物及其应用，该mRNA标志物为ETV5，该mRNA标志物对于诊断UC具有很高的特异性及灵敏度，可以作为新型的生物标志物用于UC的临床诊断。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于溃疡性结肠炎诊断的mRNA标志物，所述标志物为SEQ ID No:1所示的ETV5。

针对上述mRNA标志物的引物组合，包括如SEQ ID No:2所示的上游引物和如SEQID No:3所示的下游引物。

上述mRNA标志物在制备诊断溃疡性结肠炎的产品中的应用。

上述引物组合在制备诊断溃疡性结肠炎的产品中的应用。

一种溃疡性结肠炎检测试剂盒，包括上述的引物组合。

进一步地，上述检测试剂盒还包括mRNA逆转录试剂和mRNA qRT-PCR反应试剂。

有益效果：

1、采用qRT-PCR技术检测UC患者和健康对照者外周血CD4+T细胞中ETV5 mRNA表达水，为UC的临床诊治提供新的生物标志物和治疗靶点。

2、ETV5作为生物标志物用于UC诊断的敏感性高，特异性强，操作简单，结果稳定，具有广泛的临床应用前景。ETV5作为诊断标志物的特异度和灵敏度都达到90％以上，是诊断UC的比较可靠的特异性标志物。

附图说明

图1为实施例1中UC患者和健康对照者的ETV5表达差异分析；

图2为实施例1中ETV5表达水平对UC诊断的ROC曲线分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1

1.化合物：ETV5 qRT-PCR引物和GAPDH qRT-PCR引物。

ETV5上游引物	ACGACACTTGTGTTGTGCCTGAG(SEQ ID No:2)
		ETV5下游引物	GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG(SEQ ID No:3)
GAPDH上游引物	GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT(SEQ ID No:4)
		GAPDH下游引物	CTTGAACTCCATGCCTCGACCTG(SEQ ID No:5)

2.组合物：

(1)mRNA逆转录试剂：5×PrimerScript RT Master Mix，RNase-free H₂O。(Takara生物公司提供)。

(2)mRNA qRT-PCR反应试剂：TB Green Premix Ex Taq(TaKaRa Ex Taq HS，dNTPMixture，Mg2⁺，Tli RNaseH，TB Green)；ROX Reference Dye II；ETV5 qRT-PCR上游引物和下游引物。该方法以cDNA作为模板进行PCR反应时，可以很好地抑制由于cDNA中残存mRNA对PCR反应造成的阻害作用，对靶基因进行准确定量、检测，重复性好，可信度高。(Takara生物公司提供)。

3.方法：

(1)分离提取外周血CD4⁺T细胞：使用肝素抗凝试管收集UC患者和健康对照者外周静脉血10mL。将收集的外周血与等体积的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)混匀，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，室温下2000rpm梯度离心20分钟。离心结束后用吸管缓慢吸取中间云雾层细胞置于50mL离心管中，用PBS清洗，1800rpm离心8分钟后弃上清可得到单个核细胞。将上述单个核细胞转移至流式管中，加入200微升CD4⁺T细胞分选磁珠(购自BD Biosciences)，冰上孵育30分钟。孵育结束后将试管置于磁柱上提取CD4⁺T细胞，重复该步骤三次纯化CD4⁺T细胞并转移至无菌无酶EP管中，即为所需外周血CD4⁺T细胞样本。加入1mL Trizol室温放置5分钟后保存于-80℃冰箱中备用。

(2)RNA提取：将预先准备好的UC患者和健康对照者CD4⁺T细胞标本置于室温溶解，加入200微升氯仿，充分混匀并剧烈震荡15s后置于室温下5min。将上述标本在4℃、12000rpm条件下离心15min。离心结束后缓慢吸取上层清液400微升至另一EP管中，然后加入500微升异丙醇。缓慢混匀后室温静置10分钟，然后在4℃、12000rpm离心条件下离心10min可见RNA沉于EP管底部。弃去全部液体，加入75％乙醇静置5分钟在4℃，7500rpm条件下离心5min。离心结束后吸弃乙醇，置于室温下迅速烘干，可得到纯化后的RNA。加入适量DEPC水溶解RNA，使用Experion Automated Electrophoresis System(美国Bio-RadLaboratories)检测RNA纯度及浓度，A260/280介于1.8-2.0的RNA样本可用于后续PCR实验。

(3)mRNA逆转录：

使用Takara公司mRNA逆转录试剂盒对ETV5 mRNA进行逆转录获得模板cDNA，该试剂盒包含了：5×PrimerScript RT Master Mix，RNase-free H₂O。

具体方法及步骤如下：将上述试剂取出后分别放置在冰上进行缓慢融解，待溶解完全后混匀，按照如下表格所示体积配制所需的反应溶液。

试剂组分	体积
		RNA(400ng/μL)	1μL
5×PrimerScript RT Master Mix	2μL
		RNase-free H<sub>2</sub>O	7μL

以上溶液混匀后，置于逆转录PCR仪中，使用逆转录反应程序为：37℃15分钟，85℃5秒。逆转录反应结束后，将所得cDNA样本迅速转移至冰上冷却，用于以下qRT-PCR实验。

(4)qRT-PCR实验

ETV5 qRT-PCR检测使用Takara公司mRNA检测剂盒，ETV5前引物、后引物，内参基因GAPDH前引物、后引物。qRT-PCR反应过程中ETV5和GAPDH cDNA扩增信号及CT值使用ABI公司的7500型实时PCR仪进行收集。

具体过程如下：将上述试剂取出后放置于冰上缓慢融解，待溶解完全后混匀，按照如下表格所示体积配制所需的反应溶液。

试剂组分	体积
		cDNA模板	2μL
TB Green Premix Ex Taq	10μL
		ROX Reference Dye II	0.4μL
ETV5/GAPDH前引物	0.4μL
		ETV5/GAPDH后引物	0.4μL
灭菌水	6.8μL

按照上述溶液组分和体积配置反应液，加入96孔PCR板中，每个样本重复三次。反应条件为95℃30秒；95℃5秒，60℃34秒，40个循环。反应结束后，将每个样本的ETV5及内参基因GAPDH的CT值取平均值，拷贝后置于Excel表中进行分析。

计算公式如下：

ΔCT＝ETV5基因CT值-内参基因GAPDH CT值；

ΔΔCT＝UC患者ETV5基因ΔCT值－健康对照组ETV5基因ΔCT值；

相对值＝2^-ΔΔCT；

按照上述公式处理实验结果，分析ETV5在UC和健康对照者外周血CD4⁺T细胞中表达水平差异。

(5)统计学分析：

1)应用prism5统计软件，采用非配对样本t检验的方法分析ETV5在UC和健康对照者外周血CD4⁺T细胞中表达水平差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

2)ETV5诊断价值评价应用prism5统计软件对数据进行受试者工作特征(receiveroperating characteristic，ROC)曲线分析，通过绘制ROC曲线并计算曲线下面积AUC评价ETV5诊断UC的敏感性和特异性。AUC＜0.5时，表示诊断无意义；AUC＝0.5-0.7时，表示诊断准确性较低；AUC＝0.7-0.9时，表示诊断准确性中等；AUC＞0.9时，表示诊断准确性高。

4.结果分析：

(1)如图1所示，UC患者外周血CD4⁺T细胞中ETV5表达比健康对照者ETV5表达水平显著上升，差异有统计学意义(p<0.05)。

(2)ETV5对UC的诊断价值：

利用ROC曲线分析ETV5在CD4⁺T细胞中的表达水平对UC诊断的检验效能，如图2所示：ETV5的ROC曲线下面积(area undercurve，AUC)为0.9297，灵敏度为82.76，特异度为84.62，提示ETV5作为UC诊断标志物的准确性、特异性及灵敏度均较高。

综上所述，UC患者CD4⁺T细胞中ETV5表达水平显著升高，ROC曲线分析结果显示AUC为0.9297，灵敏度为82.76，特异度为84.62。表明ETV5对UC有一定的诊断价值，是诊断UC的比较可靠的特异性生物标志物。

本发明利用RNA提取试剂提取健康对照者和UC患者外周血CD4⁺T细胞中总RNA分子，利用逆转录试剂制备ETV5模板cDNA。利用上述cDNA分子与ETV5 qRT-PCR引物、qRT-PCR试剂进行反应，检测ETV5在各样本中的CT值(CT值表示每个样本荧光强度达到阈值时所用的PCR循环数)，利用相对值＝＝2^-ΔΔCT计算方法和非配对t检验方法比较ETV5在UC患者和健康对照者外周血CD4⁺T细胞表达差异。绘制ROC曲线并计算曲线下面积AUC，用于评价ETV5分子对UC诊断的特异性和敏感性。AUC<0.5时，表示无诊断意义；AUC＝0.5-0.7时，表示诊断准确性较低；AUC＝0.7-0.9时，表示诊断准确性中等；AUC>0.9时，表示诊断准确性较高。

通常由于UC胃肠道病变内镜下及组织病理学表现难以与其他消化道疾病相鉴别，使得UC的临床诊断面临许多难点。本发明利用qRT-PCR等方法检测ETV5在UC患者外周血CD4⁺T细胞中的表达水平，可作为生物标志物用于UC临床诊断，其特异度、灵敏度及准确性均较高。相对于现在所用的内镜检查及组织病理学检测方法，该检测方法更加快捷、方便，同时避免了肠镜检查存在的局限性，受试范围更加广泛。本发明中所用的qRT-PCR等方法操作简便，所用试剂及引物针对性强，可重复性强，结果稳定，有利于推广。

序列表

<110> 镇江市第一人民医院

<120> 一种用于溃疡性结肠炎诊断的mRNA标志物及其应用

<130> 20190620

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4082

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtccagc cgctggtgcg cggagcggtt caccgtcttc ggagcggttc ggcccagcct 60

ttcgcccagg cgcccaggcc cgctgcgcgc gtgcgtgagc gcgcctgcgc cgccggggcc 120

gctgcaaggg gaggagagag gccgcctcag gaggatccct tttcccccag aaattactca 180

atgctgaaac ctctcaaagt ggtattagag acgctgaaag caccatggac gggttttatg 240

atcagcaagt cccttttatg gtcccaggga aatctcgatc tgaggaatgc agagggcggc 300

ctgtgattga cagaaagagg aagtttttgg acacagatct ggctcacgat tctgaagagc 360

tatttcagga tctcagtcaa cttcaagagg cttggttagc tgaagcacaa gttcctgatg 420

atgaacagtt tgtcccagat tttcagtctg ataacctggt gcttcatgcc ccacctccaa 480

ccaagatcaa acgggagctg cacagcccct cctctgagct gtcgtcttgt agccatgagc 540

aggctcttgg tgctaactat ggagaaaagt gcctctacaa ctattgtgcc tatgatagga 600

agcctccctc tgggttcaag ccattaaccc ctcctacaac ccccctctca cccacccatc 660

agaatcccct atttccccca cctcaggcaa ctctgcccac ctcagggcat gcccctgcag 720

ctggcccagt tcaaggtgtg ggccccgccc ccgcccccca ttcgcttcca gagcctggac 780

cacagcagca aacatttgcg gtcccccgac caccacatca gcccctgcag atgccaaaga 840

tgatgcctga aaaccagtat ccatcagaac agagatttca gagacaactg tctgaaccct 900

gccacccctt ccctcctcag ccaggagttc ctggagataa tcgccccagt taccatcggc 960

aaatgtcaga acctattgtc cctgcagctc ccccgccccc tcagggattc aaacaagaat 1020

accatgaccc actctatgaa catggggtcc cgggcatgcc agggccccca gcacacgggt 1080

tccagtcacc aatgggaatc aagcaggagc ctcgggatta ctgcgtcgat tcagaagtgc 1140

ctaactgcca gtcatcctac atgagagggg gttatttctc cagcagccat gaaggttttt 1200

catatgaaaa agatccccga ttatactttg acgacacttg tgttgtgcct gagagactgg 1260

aaggcaaagt caaacaggag cctaccatgt atcgagaggg gcccccttac cagaggcgag 1320

gttcccttca gctgtggcag ttcctggtca cccttcttga tgacccagcc aatgcccact 1380

tcattgcctg gacaggtcga ggcatggagt tcaagctgat agaaccggaa gaggttgctc 1440

ggcgctgggg catccagaag aaccggccag ccatgaacta tgacaagctg agccgctctc 1500

tccgctatta ctatgaaaag ggcatcatgc agaaggtggc tggagagcga tacgtctaca 1560

aatttgtctg tgacccagat gccctcttct ccatggcttt cccggataac cagcgtccgt 1620

tcctgaaggc agagtccgag tgccacctca gcgaggagga caccctgccg ctgacccact 1680

ttgaagacag ccccgcttac ctcctggaca tggaccgctg cagcagcctc ccctatgccg 1740

aaggctttgc ttactaagtt tctgagtggc ggagtggcca aaccctagag ctagcagttc 1800

ccattcaggc aaacaagggc agtggttttg tttgtgtttt tggttgttcc taaagcttgc 1860

cctttgagta ttatctggag aacccaagct gtctctggat tggcaccctt aaagacagat 1920

acattggctg gggagtggga acagggaggg gcagaaaacc accaaaaggc cagtgcctca 1980

actcttgatt ctgatgaggt ttctgggaag agatcaaaat ggagtctcct taccatggac 2040

aatacatgca aagcaatatc ttgttcaggt tagtacccgc aaaacgggac atagtatgtg 2100

acaatctgca tcgatcatgg actactaaat gcctttacat agaagggctc tgatttgcac 2160

aatttgttga aaaatcacaa acccatagaa aagtaagtag gctaagttgg ggaggctcaa 2220

accattaagg gttaaaaata catcttaaac attggaaagc tcttctagct gaatctgaaa 2280

tattacccct tgtctagaaa aaggggggca gtcagaacag ctgttcccca ctccgtggtt 2340

ctcaaaatca taaaccatgg ctactcttgg gaaccacccg gccatgtggt cgccaagtag 2400

agcaagcccc ctttctcttc ccaatcacgt ggctgagtgt ggatgacttt tattttagga 2460

gaagggcgat taacactttt gacagtattt tgttttgccc tgatttgggg gattgttttg 2520

ttttggtggt tgttttggaa aaacagttta taaactgatt tttgtagttt tggtatttaa 2580

agcaaaaaaa cgaaaaacaa aaaacaaaaa caaacctttt ggtaactgtg cactgtgtcc 2640

tttagccagg gccgtgccaa cttatgaaga cactgcagct tgagaggggc tttgctgagg 2700

cttccccttg gccatgtgaa agcccgcctt gttgcctgct ttgtgctttc tgcaccagac 2760

aacctgatgg aacatttgca cctgagttgt acatttttga agtgtgcagg gcagcctgga 2820

cacaagctta gattctctat gtatagttcc ccgtgttcac taacatgccc tctctggaaa 2880

gcatatgtat ataacatgtg tcatgtcctt tggaaacctg gtcacctggt gaaaaccctt 2940

gggattcttc cctgggcatg actgatgaca atttccattt catcagtttg ttttgttttc 3000

ctttttcttt aaatcttgga ctttaaaccc tacctgtgtg attcagtagg gtttgagact 3060

tacgtgtgat actgacaggt aagcaacagt gctagcattc tagattcctg ccttttttta 3120

aaaagaaatt attctcattg ctgtattata ttggaaaagt tttaaacaac caagctaaag 3180

ctatgtgaaa gttgagctca aagtagagga aaagttactg gtggtacctt gctgcctgct 3240

ctgctggtag aattctgtgc tccccgtgac acttagtaca ttaagaatga ctacactgtt 3300

cctcgtatgt gaaggaggca gtgctgactc cgtgagtgtg agacacgtgc tttgaactgc 3360

ttttctattc atggagcact ccatagtctc aaactgtccc ccttatgacc aacagcacat 3420

ttgtgaagag gttcgcaggg ataaggggtg cactttatag ctatggaaac atgagattct 3480

cctctattgg aagctaatta gcccacaaag gtggtaaacc tgtagattgg gccttaatta 3540

gcattgtact ctaatcaaag gactctttct aaaccatatt tatagctttc ttaacctaca 3600

catagtctat acatagatgc atattttacc cccagctggc tagagattta tttgttgtaa 3660

atgctgtata gatttggttt tcctttcttt acttaccctg gtttggattt tttttttttt 3720

tcttttgaat ggatttatgc tgtcttagca atatgacaat aatcctctgt agcttgagct 3780

acccctcccc tgctgtaact tacgtgacct gtgctgtcac tgggcatagg acagcggcat 3840

cacggttgca ttcccattgg actcatgcac ctcccggatg gtttttgttt ttttcggggg 3900

ttctttgggg tttgtttgtt tgcttctttt ccagagtgtg gaaagtctac agtgcagaaa 3960

ggcttgaacc tgccagctga tttgaaatac tttcccctgc gcagggccgt atgcatcctg 4020

ccaagctgcg ttatattctg tactgtgtac aataaagaag tttgcttttc gtttaccaag 4080

ca 4082

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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acgacacttg tgttgtgcct gag 23

<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggctgttgtc atacttctca tgg 23

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggagcgagat ccctccaaaa t 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cttgaactcc atgcctcgac ctg 23

Claims (1)

1.用于检测mRNA标志物的引物对在制备检测溃疡性结肠炎诊断试剂盒中的应用，该标志物为SEQ ID No:1 所示的ETV5；所述引物对包括如SEQ ID No:2所示的上游引物和如SEQID No:3所示的下游引物，所述试剂盒包括mRNA逆转录试剂和mRNA qRT-PCR反应试剂。

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