CN110368531A - 矿化胶原基牙槽骨修复材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及矿化胶原基牙槽骨修复材料及其制备方法；所述制备方法包括如下步骤：制备胶原溶液；添加含钙离子水溶液；添加含磷酸根离子水溶液；调节至pH值为8；洗涤沉淀物并抽滤；冷冻干燥；研磨制得矿化胶原干粉；制备I型胶原纤维水溶液；添加矿化胶原干粉；一次冷冻干燥；交联；离心、过滤并水洗；二次冷冻干燥；灭菌。所述方法具有成本低、材料利用率高、易操作等优点，由该方法制得的矿化胶原基牙槽骨修复材料具有均质性高、力学强度高、降解时间长、交联剂残留少、孔隙率高、引导性和诱导性优异等优点。
Description
本申请是发明名称为“矿化胶原基牙槽骨修复材料及其制备方法”、申请日为“2016年10月31日”、申请号为“201610928747.2”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明专利涉及医学治疗领域，尤其是医用生物材料制备特别是牙移植材料的制备领域，具体涉及一种采用一种以矿化胶原为基体的新型修复材料及其制备方法和在牙槽骨修复中的应用。
背景技术
齿科临床会遇到牙齿移动区骨量不足及骨缺损的病例，拔牙窝感染等造成的骨量不足；多生牙，埋伏牙以及错位牙拔除也常造成骨缺损。此情况均会造成牙齿移动区的骨量不足，会影响医生的治疗方案。骨移植术利用自体骨、异体骨或人工骨的移植来引导或诱导新骨再生，维持了生物学特性以及成骨空间，从而达到修复牙槽骨缺损的目的。
目前最常使用的生物活性材料有羟基磷灰石(HA)和异种无机骨两种类型。羟基磷灰石(HA)是人体骨和齿的重要无机组成部分，烧结或非烧结的不同晶相的羟基磷灰石是具有良好骨引导作用的支架材料，但是降解速率或快或慢，不能与成骨速率相匹配。无机牛骨Bio-oss是经过特殊处理，除去蛋白和其他有机成分，抗原性低、高纯度并保持多孔天然骨无机结构，与人体骨的结构几乎相同的异种骨。但是异种骨尚不能完全克服移植后的免疫排斥反应，有潜在的病源传播危险，同时存在医学伦理学方面的障碍。
采用仿生的思路，可以制备出与天然骨类似的羟基磷灰石与胶原结合成具有独特规律的分级结构的复合物。清华大学材料系的崔福斋教授在中国专利ZL01129699.2中提到了采用生物矿化技术发明一种用于骨修复材料的纳米相钙磷盐/胶原/高分子骨复合多孔材料以及制备方法。北京奥精医药科技有限公司在中国专利申请201410275022.9也提到了一种矿化胶原人工骨膜及其制备方法。
发明内容
为了得到生物相容性更好、降解速率更加可控、更加易成型的具有高度孔隙率和合适的孔径尺寸的框架材料，本发明通过与纳米晶磷酸钙胶原复合胶原支架的方式来制备性能更加良好的生物活性修复材料尤其是生物型牙槽骨修复材料，从而既保持了生物矿化胶原的骨引导性，又改性了胶原支架材料。针对齿科牙槽骨的临床应用的特殊要求，即材料具有一定柔软性可以塑造不同牙槽缺损的形状，本发明采用牛胶原作为粘合剂使矿化胶原干粉分散于胶原支架材料中，成型后进行适当的交联，增加了胶原支架的机械强度和生物降解时间。另外，本发明的修复材料不仅在成份上与天然骨一致，而且因为含有矿化胶原，所以在结构上也与天然骨相似，是良好的人工骨材料。另外，针对现有技术中制造矿化胶原干粉时局部离子浓度过大或者过小、磷酸根离子和/或钙离子残留导致的洗涤时间过长、沉淀物洗涤费时、钙磷盐利用率低等问题以及矿化胶原基牙槽骨修复材料力学性能低、降解时间短以及制备时矿化胶原干粉分散性差、交联剂残留量过大和难以去除、孔隙率低等问题，对现有技术进行了改进和优化，从而部分地甚至是全部地解决了上述问题。
本发明在第一方面提供了一种制备矿化胶原干粉的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)使用酸液将I型胶原纤维配制成浓度为0.0001至0.001g/ml的胶原溶液；
(2)以0.08至0.12摩尔钙离子/克胶原的量向所述胶原溶液中加入含钙离子水溶液，从而制得钙/胶原复合溶液；
(3)以Ca/P＝1.2～1.8的量向所述钙/胶原复合溶液中加入含磷酸根离子水溶液，从而制得钙/磷/胶原复合溶液；
(4)将钙/磷/胶原复合溶液调节至pH值为8，搅拌、分离沉淀、水洗沉淀直到上清液的pH值在7.0～7.5，从而获得沉淀物；
(5)使用纯化水洗涤沉淀物并抽滤，获得滤饼；
(6)在常压下将滤饼于-30～-20℃进行预冻，再在真空条件下于-10～0℃进行升华，从而对滤饼进行冷冻干燥；
(7)将经过冷冻干燥的滤饼研磨成粒径不大于80目的矿化胶原干粉。
本发明在第二方面提供了本发明第一方面所述方法制得的矿化胶原干粉。
本发明在第三方面提供了本发明第二方面所述的矿化胶原干粉在制备矿化胶原基牙槽骨修复材料中的应用。
本发明在第四方面提供了一种制备矿化胶原基牙槽骨修复材料的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)制备浓度为0.0286-0.0667g/ml的I型胶原纤维水溶液；
(b)向所述胶原纤维水溶液中加入矿化胶原干粉，制得矿化胶原/胶原混合溶液，所述矿化胶原干粉与所述I型胶原纤维的质量比为1:4～4:1；
(c)在常压下将矿化胶原/胶原混合溶液于-30～-20℃进行预冻，再在真空条件下于-10～0℃进行升华，从而制得一次冻干胶原复合物；
(d)将一次冻干胶原复合物于交联剂溶液中浸泡24至48小时，从而制得交联胶原复合物，所述交联剂溶液为0.005质量％至0.25质量％的戊二醛的乙醇溶液；
(e)将所述交联胶原复合物离心、过滤并水洗，从而制得水洗胶原复合物；
(f)在常压下将水洗胶原复合物于-30～-20℃进行预冻，再在真空条件下于-10～0℃进行升华，从而制二次冻干胶原复合物；
(g)将所述二次冻干胶原复合物进行灭菌，从而制得所述矿化胶原基牙槽骨修复材料。
本发明在第五方面还提供了一种制备矿化胶原基牙槽骨修复材料的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)使用酸液将I型胶原纤维配制成浓度为0.0001至0.001g/ml的胶原溶液；
(2)以0.08至0.12摩尔钙离子/克胶原的量向所述胶原溶液中加入含钙离子水溶液，从而制得钙/胶原复合溶液；
(3)以Ca/P＝1.2～1.8的量向所述钙/胶原复合溶液中加入含磷酸根离子水溶液，从而制得钙/磷/胶原复合溶液；
(4)将钙/磷/胶原复合溶液调节至pH值为8，搅拌、分离沉淀、水洗沉淀直到上清液的pH值在7.0～7.5，从而获得沉淀物；
(5)使用纯化水洗涤沉淀物并抽滤，获得滤饼；
(6)在常压下将滤饼于-30～-20℃进行预冻，再在真空条件下于-10～0℃进行升华，从而对滤饼进行冷冻干燥；
(7)将经过冷冻干燥的滤饼研磨成粒径不大于80目的矿化胶原干粉；
(8)制备浓度为0.0286-0.0667g/ml的I型胶原纤维水溶液；
(9)向所述胶原纤维水溶液中加入矿化胶原干粉，制得矿化胶原/胶原混合溶液，所述矿化胶原干粉与所述I型胶原纤维的质量比为1:4～4:1；
(10)在常压下将矿化胶原/胶原混合溶液于-30～-20℃进行预冻，再在真空条件下于-10～0℃进行升华，从而制得一次冻干胶原复合物；
(11)将一次冻干胶原复合物于交联剂溶液中浸泡24至48小时，从而制得交联胶原复合物，所述交联剂溶液为0.005质量％至0.25质量％的戊二醛的乙醇溶液；
(12)将所述交联胶原复合物离心、过滤并水洗，从而制得水洗胶原复合物；
(13)在常压下将水洗胶原复合物于-30～-20℃进行预冻，再在真空条件下于-10～0℃进行升华，从而制二次冻干胶原复合物；
(14)将所述二次冻干胶原复合物进行灭菌，从而制得所述矿化胶原基牙槽骨修复材料。
本发明在第六方面提供了本发明第四或第五方面所述方法制得的矿化胶原基牙槽骨修复材料。
本发明在第七方面提供了本发明第六方面所述的矿化胶原基牙槽骨修复材料在制备用于修复牙槽骨的材料中的应用。
本发明的优点以及所带来的预想不到的技术效果至少包括如下几点：
(1)采用的胶原溶液浓度为0.0001-0.001g/ml，在该胶原浓度下，整体溶液粘度更加适中，不会造成粘度对于局部离子浓度过大或过小的影响。
(2)采用钙磷摩尔投料比为Ca：P＝1.2-1.8，提高了钙盐和磷盐的利用效率，减少了材料中游离钙盐和磷盐的残留。
(3)采用pH值为8的沉淀终点，使得矿化胶原沉淀得更加快速而充分，显著减少了搅拌和静置时间。
(4)采用80目以下的矿化胶原干粉，使得其在与胶原粘合剂混合时，更容易分散。
(5)采用了40kgy以下的辐照剂量进行灭菌加工，不明显降低材料的力学性能和降解时间。
(6)采用了I型胶原蛋白，非凝胶状态的纤维作为胶原原料，避免因凝胶中固含量的不一致造成投料量不一致的问题。
(7)采用抽滤方式进行上清液与沉淀物的分离，pH值能够或者更容易趋近于中性。
(8)通过分段冻干的方式，使得材料能够在较低温度下固化，在稍高温度下升华，缩短了冻干时间。
(9)采用胶原纤维作为粘合剂和支架材料，使得材料成份保持了与天然骨一致的化学成份；干粉与胶原的质量比为1:4～4:1，根据作为组织工程用的多孔支架，不同的组织细胞对孔径有不同的要求，而骨和软骨组织工程则需要100-250μm的孔径，对于可降解多孔支架材料200-400μm为佳，故该浓度下纯化水造孔孔径接近理论值，且孔隙率为70-95％。
(10)通过离心水洗、二次冷冻干燥的方式，缩短了水洗的时间，提高了效率。
具体实施方式
如上所述，本发明在第一方面提供了一种制备矿化胶原干粉的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)使用酸液将I型胶原纤维配制成浓度为0.0001至0.001g/ml(例如0.0001、0.0005或0.001g/ml)的胶原溶液；
(2)以0.08至0.12(例如0.08、0.10或0.12)摩尔钙离子/克胶原的量向所述胶原溶液中加入含钙离子水溶液，从而制得钙/胶原复合溶液；
(3)以Ca/P＝1.2～1.8(例如1.2、1.4、1.6或1.8)的量向所述钙/胶原复合溶液中加入含磷酸根离子水溶液，从而制得钙/磷/胶原复合溶液；
(4)将钙/磷/胶原复合溶液调节至pH值为8，搅拌、分离沉淀、水洗沉淀直到上清液的pH值在7.0～7.5(例如7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5)，从而获得沉淀物；
(5)使用纯化水洗涤沉淀物并抽滤，获得滤饼；
(6)在常压下将滤饼于-30～-20℃(例如-30、-25或-20℃)进行预冻，再在真空条件下于-10～0℃(例如-10、-5或0℃)进行升华，从而对滤饼进行冷冻干燥；
(7)将经过冷冻干燥的滤饼研磨成粒径不大于80目(例如不大于80、90、100或120目)的矿化胶原干粉。
在一些优选的实施方式中，步骤(1)中的所述酸液选自由盐酸水溶液、硝酸水溶液和乙酸水溶液组成的组，优选的是乙酸水溶液。
在一些优选的实施方式中，所述酸液的浓度为0.45至0.55mM(例如0.45、0.50或0.55mM)。
在一些优选的实施方式中，步骤(4)中的pH使用氢氧化钠水溶液来调节，优选的是，所述氢氧化钠水溶液的浓度为0.9M至1.1M(例如0.9、1.0或1.1M)。
在一些优选的实施方式中，所述含钙离子水溶液和/或含磷酸根离子水溶液的加入采用边缓慢滴加边搅拌的方式进行。
在一些优选的实施方式中，在步骤(4)中将pH调节至8之后，再搅拌8至24小时，形成白色悬浊液，静置12至24小时(例如12、18或24小时)，除去上清，再加纯化水至原体积后搅拌5至10次(例如5、6、7、8、9或10次)，静置1至3小时后除去上清，连续清洗3至7次，直到上清液的pH值在7.0～7.5(7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5)之间。
在一些优选的实施方式中，所述含钙离子水溶液的浓度为0.45M至0.55M(例如0.45、0.50或0.55M)。
在一些优选的实施方式中，所述含磷酸根离子水溶液的浓度为0.4M至0.6M(例如0.40、0.50或0.60M)。
在一些优选的实施方式中，所述I型胶原纤维为非凝胶状态的I型牛胶原纤维。
在一些优选的实施方式中，用于制备所述含钙离子水溶液的钙盐和含磷酸根离子水溶液的钙盐和用于制备含磷酸根离子水溶液的磷盐为药用或药用辅料级别的钙盐和磷盐。
本发明在第二方面提供了本发明第一方面所述方法制得的制得的矿化胶原干粉。
本发明在第三方面提供了本发明第一方面所述方法制得的或者本发明第二方面所述的矿化胶原干粉在制备矿化胶原基牙槽骨修复材料中的应用。
本发明在第四方面提供了一种制备矿化胶原基牙槽骨修复材料的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)制备浓度为0.0286-0.0667g/ml(例如0.0286、0.0476或0.0667g/ml)的I型胶原纤维水溶液；
(b)向所述胶原纤维水溶液中加入矿化胶原干粉，制得矿化胶原/胶原混合溶液，所述矿化胶原干粉与所述I型胶原纤维的质量比为1:4～4:1(例如1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1或4:1)；
(c)在常压下将矿化胶原/胶原混合溶液于-30～-20℃(例如-30、-25或-20℃)进行预冻，再在真空条件下于-10～0℃(例如-10、-5或0℃)进行升华，从而制得一次冻干胶原复合物；
(d)将一次冻干胶原复合物于交联剂溶液中浸泡24至48小时(例如24、30、36、42或48)，从而制得交联胶原复合物，所述交联剂溶液为0.005质量％至0.25质量％(例如0.005、0.010、0.015、0.020或0.025质量％)的戊二醛的乙醇溶液；
(e)将所述交联胶原复合物离心、过滤并水洗，从而制得水洗胶原复合物；
(f)在常压下将水洗胶原复合物于-30～-20℃(例如-30、-25或-20℃)进行预冻，再在真空条件下于-10～0℃(例如-10、-5或0℃)进行升华，从而制二次冻干胶原复合物；
(g)将所述二次冻干胶原复合物进行灭菌，从而制得所述矿化胶原基牙槽骨修复材料。
在一些优选的实施方式中，在步骤(f)和(g)之间还包括交联剂残留量是否处在合格残留值范围内的检测步骤。
在一些优选的实施方式中，所述合格残留值范围为小于或者等于25ppm。
在一些优选的实施方式中，所述检测步骤通过如下方式进行：称取0.1g的二次冻干胶原复合物，检测交联剂残留量是否小于或者等于25ppm(例如不大于25、20、15、10或5ppm)，如果大于25ppm，则重复步骤(e)中的水洗和步骤(f)的二次冻干，直至交联剂残留量小于或者等于25ppm。
在一些优选的实施方式中，所述灭菌通过采用15kgy至40kgy(例如15、20、25、30、35或40kgy)的钴-60辐照剂量进行。
在一些优选的实施方式中，在步骤(d)中，所述交联剂溶液的体积相对于一次冻干胶原复合物的质量为50至200ml/g(例如50、100、150或200ml/g)。
在一些优选的实施方式中，步骤(b)是通过在室温下分散混合均匀来进行。
在一些优选的实施方式中，步骤(e)通过如下方式进行：将交联胶原复合物从交联剂溶液中取出并放入离心机装载过滤袋，在2000-3000r/min(例如2000、2500或3000r/min)离心2至4次(例如3次)，每次3至10秒(例如3、5、7或10秒)；再将交联胶原复合物置于层析柱里，以流动的纯化水淋洗48至72(48、54、60、66或72)小时以除去残留的交联剂。
在一些优选的实施方式中，所述矿化胶原干粉为本发明第一方面所述的方法制得。
本发明在第五方面还提供了一种制备矿化胶原基牙槽骨修复材料的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)使用酸液将I型胶原纤维配制成浓度为0.0001至0.001g/ml的胶原溶液；
(2)以0.08至0.12摩尔钙离子/克胶原的量向所述胶原溶液中加入含钙离子水溶液，从而制得钙/胶原复合溶液；
(3)以Ca/P＝1.2～1.8的量向所述钙/胶原复合溶液中加入含磷酸根离子水溶液，从而制得钙/磷/胶原复合溶液；
(4)将钙/磷/胶原复合溶液调节至pH值为8，搅拌、分离沉淀、水洗沉淀直到上清液的pH值在7.0～7.5，从而获得沉淀物；
(5)使用纯化水洗涤沉淀物并抽滤，获得滤饼；
(6)在常压下将滤饼于-30～-20℃进行预冻，再在真空条件下于-10～0℃进行升华，从而对滤饼进行冷冻干燥；
(7)将经过冷冻干燥的滤饼研磨成粒径不大于80目的矿化胶原干粉；
(8)制备浓度为0.0286-0.0667g/ml的I型胶原纤维水溶液；
(9)向所述胶原纤维水溶液中加入矿化胶原干粉，制得矿化胶原/胶原混合溶液，所述矿化胶原干粉与所述I型胶原纤维的质量比为1:4～4:1；
(10)在常压下将矿化胶原/胶原混合溶液于-30～-20℃进行预冻，再在真空条件下于-10～0℃进行升华，从而制得一次冻干胶原复合物；
(11)将一次冻干胶原复合物于交联剂溶液中浸泡24至48小时，从而制得交联胶原复合物，所述交联剂溶液为0.005质量％至0.25质量％的戊二醛的乙醇溶液；
(12)将所述交联胶原复合物离心、过滤并水洗，从而制得水洗胶原复合物；
(13)在常压下将水洗胶原复合物于-30～-20℃进行预冻，再在真空条件下于-10～0℃进行升华，从而制二次冻干胶原复合物；
(14)将所述二次冻干胶原复合物进行灭菌，从而制得所述矿化胶原基牙槽骨修复材料。
在一些优选的实施方式中，步骤(1)中的所述酸液选自由盐酸水溶液、硝酸水溶液和乙酸水溶液组成的组，优选的是乙酸水溶液。
在一些优选的实施方式中，所述酸液的浓度为0.45至0.55mM。
在一些优选的实施方式中，步骤(4)中的pH使用氢氧化钠水溶液来调节，优选的是，所述氢氧化钠水溶液的浓度为0.9M至1.1M。
在一些优选的实施方式中，所述含钙离子水溶液和/或含磷酸根离子水溶液的加入采用边缓慢滴加边搅拌的方式进行。
在一些优选的实施方式中，在步骤(4)中将pH调节至8之后，再搅拌8至24小时，形成白色悬浊液，静置12至24小时，除去上清，再加纯化水至原体积后搅拌5至10次，静置1至3小时后除去上清，连续清洗3至7次，直到上清液的pH值在7.0～7.5之间。
在一些优选的实施方式中，所述含钙离子水溶液的浓度为0.45M至0.55M。
在一些优选的实施方式中，所述含磷酸根离子水溶液的浓度为0.4M至0.6M。
在一些优选的实施方式中，所述I型胶原纤维为非凝胶状态的I型牛胶原纤维。
在一些优选的实施方式中，用于制备所述含钙离子水溶液的钙盐和含磷酸根离子水溶液的钙盐和用于制备含磷酸根离子水溶液的磷盐为药用或药用辅料级别的钙盐和磷盐。
在一些优选的实施方式中，在步骤(13)和(14)之间还包括交联剂残留量是否处在合格残留值范围内的检测步骤。
在一些优选的实施方式中，所述合格残留值范围为小于或者等于25ppm。
在一些优选的实施方式中，所述检测步骤通过如下方式进行：称取0.1g的二次冻干胶原复合物，检测交联剂残留量是否小于或者等于25ppm，如果大于25ppm，则重复步骤(12)中的水洗和步骤(13)的二次冻干，直至交联剂残留量小于或者等于25ppm。
在一些优选的实施方式中，所述灭菌通过采用15kgy至40kgy的钴-60辐照剂量进行。
在一些优选的实施方式中，在步骤(11)中，所述交联剂溶液的体积相对于一次冻干胶原复合物的质量为50至200ml/g。
在一些优选的实施方式中，步骤(9)是通过在室温下分散混合均匀来进行。
在一些优选的实施方式中，步骤(12)通过如下方式进行：将交联胶原复合物从交联剂溶液中取出并放入离心机装载过滤袋，在2000-3000r/min离心2至4次，每次3至10秒；再将交联胶原复合物置于层析柱里，以流动的纯化水淋洗48至72小时以除去残留的交联剂。
在一些更具体的实施方式中，本发明的用于制备矿化胶原基牙槽骨修复材料的方法包括如下步骤：
(1)配制成I型胶原纤维的酸溶液，其中的酸选自由盐酸、硝酸或乙酸组成的组中的任何一种，胶原溶液的浓度为0.0001-0.001g/ml；
(2)向所述酸溶液中边搅拌边缓慢滴加含钙离子水溶液，加入量为每克胶原滴加钙离子0.08-0.12mol，从而形成钙/胶原复合溶液；
(3)在钙/胶原复合溶液中边搅拌边滴加含有磷酸根离子的水溶液，加入的磷酸根离子的量与加入的钙离子的量的摩尔比为Ca：P＝1.2-1.8；
(4)在滴加了磷酸根离子的溶液中边搅拌边滴加NaOH溶液至pH值为8，再搅拌8-24小时，形成白色悬浊液，静置12-24小时，除去上清，再加纯化水至原体积后搅拌，静置1-3小时后除去上清，连续清洗5至10次，直到上清液的pH值在7.0～7.5之间，得到沉淀物；
(5)开启抽滤设备，倒入沉淀物，进行抽滤，用纯化水重复洗涤滤饼2-4次，得到滤饼；
(6)将滤饼放入冷冻干燥机内在-30～-20℃在常压下进行预冻，在真空条件下-10～0℃进行升华从而实现冷冻干燥；
(7)将经过冷冻干燥的滤饼研磨，制得矿化胶原干粉，80目不锈钢筛网筛分备用；
(8)将I型胶原纤维置于反应釜中，加入纯化水，在室温下配制质量体积浓度为0.0286-0.0667g/ml的I型胶原纤维水溶液；
(9)向胶原溶液中加入矿化胶原干粉，在室温下分散混合均匀，其中，干粉与胶原的质量比为1:4～4:1，制得矿化胶原/胶原混合溶液；
(10)在常压下将矿化胶原/胶原混合溶液于-30～-20℃进行预冻，再在真空条件下于-10～0℃进行升华，从而制得一次冻干胶原复合物；
(11)配制0.005-0.25％质量分数的戊二醛的乙醇溶液作为交联剂溶液，将一次冻干胶原复合物按照交联剂溶液的体积与一次冻干胶原复合物的质量为50-200ml/g的量完全浸泡24至48小时，从而制得交联胶原复合物；
(12)将交联胶原复合物从交联剂溶液中取出，离心机装载过滤袋，2000-3000r/min离心2-4次，每次3-10秒；再将交联胶原复合物置于层析柱里，以流动的纯化水淋洗48至72小时以除去残留的交联剂，从而制得水洗胶原复合物；
(13)在常压下将水洗胶原复合物于-30～-20℃进行预冻，再在真空条件下于-10～0℃进行升华，从而制二次冻干胶原复合物；
(14)冻干结束后，取出约0.1g做交联剂残留测试，如果交联剂残留量大于25ppm，则重复水淋洗和二次冻干工序，直至交联剂残留量小于或者等于25ppm；
(15)将交联剂残留量小于或者等于25ppm的二次冻干胶原复合物采用15kgy至40kgy的钴-60辐照剂量进行灭菌加工，从而获得矿化胶原基牙槽骨修复材料。
本发明在第六方面提供了本发明第四方面或第五方面所述方法制得的矿化胶原基牙槽骨修复材料。
本发明第七方面提供了本发明第六方面所述的矿化胶原基牙槽骨修复材料在修复牙槽骨中的应用。
在本发明中，本发明人至少在如下方面进行了改进并取得了相应的技术效果：
(1)采用每克胶原滴加钙离子0.08-0.12mol；现有技术中有时候会滴加过少的钙离子，有时甚至低至0.01mol；有时候又滴加过多的钙离子，有时高至0.16mol/g；过多的钙离子会导致钙盐的浪费或者材料中残留多余的游离钙离子，使得后续的清洗变得复杂甚至困难，如果钙离子过少，则可能导致胶原矿化不足，强度变低，材料与骨组织差异大，影响材料的骨引导性和诱导性。
(2)采用胶原溶液浓度为0.0001-0.001g/ml，在该胶原浓度下，整体溶液粘度更加适中，避免因粘度造成局部离子浓度过大或过小所带来的影响。
(3)采用钙磷摩尔投料比为Ca：P＝1.2-1.8，使得材料的无机盐成份更加符合羟基磷灰石的理论钙磷比1.667，提高了钙盐和磷盐的利用率，减少钙离子和/或磷酸根离子在材料中的残留，降低后续洗涤等操作难度，提高时间效率，避免游离钙离子或磷酸根离子残留造成的材料强度不足的问题。
(4)采用pH值为8的沉淀终点，使得矿化胶原沉淀得更加快速更加充分，显著减少了搅拌和静置时间；现有技术中甚至采用高达9或低至7的pH，使得仅静置时间甚至长达5天时间。另外，由于过去经常滴加NaOH溶液至混合体系pH＝6～8，并观察到当pH＝5～6时，混合体系开始出现沉淀，当pH＝7时，混合体系出现白色悬浊液，因此经常滴加NaOH至pH在7左右。本发明人经过试验发现，滴加NaOH溶液至混合体系pH＝8，沉淀后再洗涤至7.0-7.5，反而可以提高沉淀效果并降低所需时间。
(5)采用80目以下的矿化胶原干粉与高分子聚合物混合，该目数下的干粉更容易在聚合物溶液体系中进行分散。
(6)采用了40kgy以下的辐照剂量进行灭菌加工，因为材料为可吸收聚合物和胶原等对于辐照敏感的材料，为了不明显降低材料的力学性能和降解时间，采用低的辐照剂量进行灭菌是非常必要的。
另外，本发明人还在质量体系建立过程中，对部分原材料进行了如下改进并取得了相应的技术效果：
(1)采用了I型胶原蛋白，非凝胶状态的纤维作为胶原原料，避免因为凝胶中固含量的不一致，造成投料量不一致；同时Ⅰ型胶原是在动物体中发现的一种结构蛋白，是自体骨的主要有机组成部分。I型胶原蛋白是脊柱动物的主要结构蛋白，是成骨过程中成骨细胞分泌的细胞外基质，是钙盐沉积的支架和骨基质矿化的促进剂、矿化的模板；能促进细胞迁移、吸附、分化，并能调节细胞生长，作为生物材料已被美国FDA认可，并有一系列胶原植入产品，包括骨植入产品。
(2)采用了药用或药用辅料级别的钙盐、磷盐，避免因为原料的级别造成杂质、重金属、灰分的超标，也影响材料的生物相容性。
另外，本发明人还采用抽滤方式进行上清液与沉淀物的分离，并清洗到中性。本发明人发现，与现有技术中的离心方式相比，如此可以使得多孔材料得到重新与纯化水接触的机会，其内外部经过多次洗涤后，浸提液的pH值能够趋近于中性。
此外，本发明人通过分段冻干的方式，除去溶剂并造孔，即在常压下(不抽真空)在冻干机中在-30～-20℃先进行预冻，然后在真空条件才在-10～0℃进行升华，使得材料能够在较低温度下固化，在稍高温度下升华，显著地缩短了冻干时间。
还有，本发明人采用胶原纤维作为粘合剂和支架材料，使得材料成份保持了与天然骨一致的化学成份；干粉与胶原的质量比为1:4～4:1，根据作为组织工程用的多孔支架，不同的组织细胞对孔径有不同的要求，而骨和软骨组织工程则需要100-250μm的孔径，对于可降解多孔支架材料200-400μm为佳，故该浓度下纯化水造孔孔径接近理论值，且孔隙率为70-95％。
此外，所制得的修复材料中交联剂残留一直是技术难题。本发明人通过离心水洗来除去残留的交联剂，使得将交联剂残留量降低至25ppm成为可能，并且能够方便地实现。在本发明的去除残留的交联剂的技术方案中，先经过离心以清除材料多孔结构中大部分交联剂溶，因为层析柱淋洗是交联剂稀释的过程，离心操作会缩短水洗的时间，效率甚至可以提高1倍！另外，由于经过了水洗过程，因此进行了二次冷冻干燥。
需要特别指出的是，本说明书的数值范围表示该数值范围的上限值、下限值以及处在该数值范围之内的任何数值或者子范围。因此，如果没有特别说明，在本说明书中涉及数值范围时就不再详细列举包含在该数值范围内的具体数值。
实施例
下文将通过实施例的形式对本发明进行举例说明，但是本发明的保护范围不应被理解为限于这些实施例。
实施例1
(1)使用0.5M的乙酸溶液配制0.0005g/ml的I型胶原纤维的酸溶液；
(2)向所述酸溶液中边搅拌边缓慢滴加0.5M的含钙离子水溶液，加入量为每克胶原滴加钙离子0.10mol，从而形成钙/胶原复合溶液；
(3)在钙/胶原复合溶液中边搅拌边滴加0.5M的含磷酸根离子水溶液，加入的磷酸根离子的量与加入的钙离子的量的摩尔比为Ca/P＝1.5；
(4)在滴加了磷酸根离子的溶液中边搅拌边滴加1M的NaOH水溶液至pH值为8，再搅拌16小时，形成白色悬浊液，静置18小时，除去上清，再加纯化水至原体积后搅拌，静置2小时后除去上清，连续清洗5次，经检测，此时的上清液的pH值为7.2(处在7.0～7.5之间)，得到沉淀物；
(5)开启抽滤设备，倒入沉淀物，进行抽滤，用纯化水重复洗涤滤饼3次，得到滤饼；
(6)将滤饼放入冷冻干燥机内在-25℃在常压下进行预冻，在真空条件下-5℃进行升华从而实现冷冻干燥；
(7)在滤饼周边四等分处以及滤饼中央位置进行五点取样，观察分析其均质性；然后将经过冷冻干燥的滤饼研磨，制得矿化胶原干粉，80目不锈钢筛网筛分备用。
实施例2至4
除了下表1的内容之外，以与实施例1基本相同的方式进行。
实施例5
除了下表1的内容之外，以与实施例1基本相同的方式进行，其中沉淀时间36小时后测量pH。
实施例6
除了下表1的内容之外，以与实施例1基本相同的方式进行，其中检测pH达到7.2时所需要的静置沉淀时间，如果pH没有达到7.2，则重复添加水再静置沉淀，记录静置所需的时间。
实施例7
(7')以与实施例1相同的方式制备矿化胶原干粉；
(8)将I型胶原纤维置于反应釜中，加入纯化水，在室温下配制质量体积浓度为0.0286g/ml的I型胶原纤维水溶液；
(9)向胶原溶液中加入矿化胶原干粉，在室温下分散混合均匀，其中，干粉与胶原的质量比为1:4，制得矿化胶原/胶原混合溶液；
(10)在常压下将矿化胶原/胶原混合溶液于-30℃进行预冻，再在真空条件下于-10℃进行升华，从而制得一次冻干胶原复合物；
(11)配制0.005％质量分数的戊二醛的乙醇溶液作为交联剂溶液，将一次冻干胶原复合物按照交联剂溶液的体积与一次冻干胶原复合物的质量为50ml/g的量完全浸泡24小时，从而制得交联胶原复合物；
(12)将交联胶原复合物从交联剂溶液中取出，离心机装载过滤袋，2000r/min离心2次，每次3秒；再将交联胶原复合物置于层析柱里，以流动的纯化水淋洗48小时以除去残留的交联剂，从而制得水洗胶原复合物；
(13)在常压下将水洗胶原复合物于-30℃进行预冻，再在真空条件下于-10℃进行升华，从而制二次冻干胶原复合物；
(14)冻干结束后，取出约0.1g做交联剂残留测试，结果发现交联剂残留量小于25ppm；
(15)将二次冻干胶原复合物采用40kgy的钴-60辐照剂量进行灭菌加工，从而获得矿化胶原基牙槽骨修复材料。
然后测量所制得的矿化胶原基牙槽骨修复材料的孔径和孔隙率。
实施例8-9
除了下表2所示内容之外，以与实施例7相同的方式进行。
实施例10
除了下表2所示内容之外，以与实施例7基本相同的方式进行，不过在步骤(12)中，不进行离心，而是直接将交联胶原复合物置于层析柱里，以流动的纯化水淋洗48小时以除去残留的交联剂，从而制得水洗胶原复合物。
实施例11
以与实施例7基本相同的方式进行，区别在于采用60kgy的钴-60辐照剂量对二次冻干胶原复合物进行灭菌加工，然后测量实施例7和实施例11所得的矿化胶原基牙槽骨修复材料的力学性能和降解时间。结果发现，前者抗压强度是后者的2倍，后者往往小于0.2MPa，降解时间前者是后者的1.5倍，后者往往小于2个月。
Claims (11)
1.一种制备矿化胶原基牙槽骨修复材料的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)使用酸液将I型胶原纤维配制成浓度为0.0001至0.001g/ml的胶原溶液；
(2)以0.08至0.12摩尔钙离子/克胶原的量向所述胶原溶液中加入含钙离子水溶液，从而制得钙/胶原复合溶液；
(3)以Ca/P＝1.2～1.8的量向所述钙/胶原复合溶液中加入含磷酸根离子水溶液，从而制得钙/磷/胶原复合溶液；
(4)将钙/磷/胶原复合溶液调节至pH值为8，搅拌、分离沉淀、水洗沉淀直到上清液的pH值在7.0～7.5，从而获得沉淀物，其中将pH调节至8之后，再搅拌8至24小时，形成白色悬浊液，静置12至24小时，除去上清，再加纯化水至原体积后搅拌5至10次，静置1至3小时后除去上清，连续清洗3至7次，直到上清液的pH值在7.0～7.5之间。
(5)使用纯化水洗涤沉淀物并抽滤，获得滤饼；
(6)在常压下将滤饼于-30～-20℃进行预冻，再在真空条件下于-10～0℃进行升华，从而对滤饼进行冷冻干燥；
(7)将经过冷冻干燥的滤饼研磨成粒径不大于80目的矿化胶原干粉；
(8)制备浓度为0.0286-0.0667g/ml的I型胶原纤维水溶液；
(9)向所述胶原纤维水溶液中加入矿化胶原干粉，制得矿化胶原/胶原混合溶液，所述矿化胶原干粉与所述I型胶原纤维的质量比为1:4～4:1；
(10)在常压下将矿化胶原/胶原混合溶液于-30～-20℃进行预冻，再在真空条件下于-10～0℃进行升华，从而制得一次冻干胶原复合物；
(11)将一次冻干胶原复合物于交联剂溶液中浸泡24至48小时，从而制得交联胶原复合物，所述交联剂溶液为0.005质量％至0.25质量％的戊二醛的乙醇溶液；
(12)将所述交联胶原复合物离心、过滤并水洗，从而制得水洗胶原复合物；
(13)在常压下将水洗胶原复合物于-30～-20℃进行预冻，再在真空条件下于-10～0℃进行升华，从而制二次冻干胶原复合物；
(14)将所述二次冻干胶原复合物进行灭菌，从而制得所述矿化胶原基牙槽骨修复材料。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中的所述酸液选自由盐酸水溶液、硝酸水溶液和乙酸水溶液组成的组，优选的是乙酸水溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤(4)中的pH使用浓度为0.9M至1.1M的氢氧化钠水溶液来调节；
所述酸液的浓度为0.45至0.55mM；
所述含钙离子水溶液的浓度为0.45M至0.55M；和/或
所述含磷酸根离子水溶液的浓度为0.4M至0.6M。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述I型胶原纤维为非凝胶状态的I型牛胶原纤维。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(13)和(14)之间还包括交联剂残留量是否处在合格残留值范围内的检测步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述合格残留值范围为小于或者等于25ppm。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述灭菌通过采用15kgy至40kgy的钴-60辐照剂量进行。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(11)中，所述交联剂溶液的体积相对于一次冻干胶原复合物的质量为50至200ml/g。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(12)通过如下方式进行：将交联胶原复合物从交联剂溶液中取出并放入离心机装载过滤袋，在2000-3000r/min离心2至4次，每次3至10秒；再将交联胶原复合物置于层析柱里，以流动的纯化水淋洗48至72小时以除去残留的交联剂。
10.由权利要求1至9中任一项所述的方法制得的矿化胶原基牙槽骨修复材料。
11.由权利要求1至9中任一项所述的方法制得的矿化胶原基牙槽骨修复材料在制备用于修复牙槽骨的材料中的应用。
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