CN110354121B - 环吡酮胺在制备治疗肿瘤药物中的应用和包含环吡酮胺的组合药物及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了环吡酮胺在制备治疗胶质母细胞瘤药物中的应用，以及提供一种组合药物，包括环吡酮胺与硼替佐米，硼替佐米增加环吡酮胺抗肿瘤细胞生长的敏感性，特别是抗胶质母细胞瘤细胞生长的敏感性，环吡酮胺与硼替佐米联合使用可以作为抗肿瘤治疗药物，特别是抗胶质母细胞瘤治疗药物，以减低环吡酮胺在作为治疗肿瘤药物时产生的耐药性。

Description

环吡酮胺在制备治疗肿瘤药物中的应用和包含环吡酮胺的组合药物及用途

技术领域

本发明涉及肿瘤药物领域，具体涉及到环吡酮胺在制备治疗肿瘤药物中的应用和相关组合药物及用途。

背景技术

近年来，颅内肿瘤发病率呈上升趋势，据统计，颅内肿瘤约占全身肿瘤的5％，占儿童肿瘤的70％。无论良性或恶性脑瘤，均能挤压、推移正常脑组织，造成颅内压升高，威胁人类生命。其中胶质母细胞瘤是大脑中最常见的原发性恶性肿瘤，多呈浸润性生长。目前胶质母细胞瘤的主要治疗方法是手术治疗，辅助放化疗，但预后较差，复发率高，中位生存期仅有14.6个月，呈浸润性生长，多数患者无法进行手术治疗。因此，找到高效、低毒的抑制胶质母细胞瘤生长的药物具有重要意义。

环吡酮胺(ciclopirox olamine，CPX)是一种广谱的抗真菌药物，近年来已被证实具有良好的抗肿瘤活性作用，CPX可以抑制人乳腺癌细胞MDA-MB231异种移植物中的肿瘤生长。并可以通过半胱天冬酶依赖性和非依赖性机制诱导Rh30细胞死亡。此外，其在治疗恶性血液病中的功效目前正处于I期临床研究评估阶段。但CPX对胶质瘤和胶质母细胞瘤的作用鲜有报道。

硼替佐米(Bortezomib，BTZ，Velcade)商品名为万珂Velcade，是临床上治疗多发性骨髓瘤的一线用药，且对多种肿瘤细胞具有毒性作用。在儿童白血病和淋巴瘤治疗进展I期和II期的研究表明，硼替佐米能够恢复白血病细胞对常规地塞米松、天冬酰胺酶、长春新碱、多柔比星和阿糖胞苷类药物的化疗敏感性。而现有技术中并未有研究报道在硼替佐米和环吡酮胺联合治疗肿瘤时，肿瘤细胞对环吡酮胺的敏感性。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的为提供环吡酮胺的新用途，以及硼替佐米和环吡酮胺组合药物在临床治疗的应用。

为实现上述目的，本发明提供环吡酮胺在制备治疗胶质母细胞瘤药物中的应用。

在本发明的另一方面，提供一种组合药物，其包含环吡酮胺、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐，及硼替佐米、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐。

在一个优选例中，组合药物包含至少一种药学上可接受的载剂。

在一个优选例中，组合药物中环吡酮胺、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐与硼替佐米、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐的摩尔配比为1000:1到100:1。

在一个优选例中，所述组合药物呈用于组合给药的各部分套组的形式，其中所述环吡酮胺、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐及硼替佐米、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐联合地或独立地同时或在时间间隔内分开地给予。

在一个优选例中，所述药物组合物的剂型为注射剂、片剂、胶囊剂、丸剂、悬浮剂或乳剂。

在一个优选例中，所述药物组合物的剂型为口服剂型、经皮剂型、静脉或肌肉注射剂型。

在一个优选例中，所述组合药物呈药物组合物的形式。

在本发明的另一方面，提供一种组合药物的用途，在制备治疗肿瘤药物中的应用，优选的，肿瘤为乳腺癌、肺癌、直肠癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌、胃癌、宫颈癌、胰腺癌、食管癌、绒毛膜上皮癌、恶性葡萄胎、膀胱癌、皮肤癌、头颈部癌、支气管肺癌、大肠癌、脑神经癌。

在一个优选例中，提供一种组合药物的用途，在制备治疗胶质瘤药物中的应用。

在一个优选例中，提供一种组合药物的用途，在制备治疗胶质母细胞瘤药物中的应用。

本发明提供环吡酮胺的新用途，公开环吡酮胺在治疗胶质瘤以及胶质母细胞瘤的优异的疗效，而且环吡酮胺已经在临床上有数十年的应用，安全性良好。这说明环吡酮胺是安全有效的治疗胶质瘤以及胶质母细胞瘤的药物。

本发明公开一种组合药物包括环吡酮胺与硼替佐米，硼替佐米增加环吡酮胺抗肿瘤细胞生长的敏感性，特别是抗胶质母细胞瘤细胞生长的敏感性，环吡酮胺与硼替佐米联合使用可以作为抗肿瘤治疗药物，特别是抗胶质母细胞瘤治疗药物，以减低环吡酮胺在作为治疗肿瘤药物时产生的耐药性。

附图说明

图1不同浓度的CPX处理U118、U251和SF126细胞的毒性试验结果；

图2为CPX处理U118、U251和SF126细胞对细胞增殖影响；

图3(A)U251和U118细胞裸鼠异种移植瘤模型腹腔注射CPX两周剥离的瘤体；(B)CPX药物处理期间的肿瘤体积曲线(n＝6，**p<0.01，***p<0.001)；(C)手术剥离瘤体后的重量(n＝6，***p<0.001)；(D)对照组与实验组的裸鼠体重变化曲线(n＝6，ns代表p>0.05)；

图4为CPX、BTZ以及CPX和BTZ组合处理U251和SF126细胞对细胞增殖影响结果统计图；

图5(A)为CPX、BTZ以及CPX和BTZ组合处理U251和SF126细胞对细胞克隆形成能力实验，(B)为结果统计图；

图6(A)为CPX、BTZ以及CPX和BTZ组合处理U251和SF126细胞对细胞凋亡影响实验，(B)为结果统计图；

图7(A)U251细胞裸鼠异种移植瘤模型腹腔注射CPX和(或)BTZ两周剥离的瘤体。(B)CPX和(或)BTZ药物处理期间的肿瘤体积曲线(n＝5，**p<0.01，***p<0.001)。(C)手术剥离瘤体后的重量(n＝5，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。(D)对照组与实验组的裸鼠体重变化曲线(n＝5，ns代表p>0.05)。

具体实施方式

下面将结合附图以及实施例和效果例对本发明做进一步的详述，而非限制本发明。

1.主要研究药物

本专利申请中实验主要药物环吡酮胺Ciclopirox olamine(CPX)购买自上海笛柏化学品技术有限公司，硼替佐米Bortezomib(BTZ)购买自Sigma公司。

两种药物的溶剂均为二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，溶解一次药物的量以满足本次课题的所有研究，待药物充分溶解且混匀后，将药物分装在高压灭菌过的1.5mL去酶离心管中，环吡酮胺存放在-20℃冰箱长期保存，硼替佐米存储在-80℃冰箱长期保存。避免反复称量或者反复冻融药物带来的误差。在药物称量、溶解、分装、保存以及使用的过程中均采用关灯或者锡箔纸包裹等避光保护措施。

2.主要研究细胞

本申请用到的细胞系为人类胶质母细胞瘤细胞U118、U251和SF126。这些细胞均购自中国科学院上海细胞库。

3.研究所用实验动物

本申请所用的实验动物为5周的雄性裸鼠，购买于上海史莱克公司，饲养在温州医科大学无特定病原体(Specific pathogen Free，SPF)级动物房。

4.主要试剂

实施例1环吡酮胺处理培养胶质母细胞瘤细胞对其存活率的影响

1.细胞培养

正常培养胶质母细胞瘤细胞U118、U251和SF126所用的培养基为含有1％的双抗(青霉素/链霉素)和10％FBS的DMEM培养基。培养基用量为10cm培养皿用7mL，6cm培养皿用2.5mL，6孔板用2mL，96孔板用0.1mL。细胞放置于37℃、5％CO2培养箱中培养，培养箱内放置适量高压灭菌水以维持一定的湿度。细胞生长的汇合度应少于95％，否则需要传代或者冻存。

2.细胞毒性实验

(1)细胞铺板：U251、SF126和U118细胞在培养皿中培养48小时后，镜下观察细胞状态良好，细胞密度80％左右，吸弃原来的培养基，加入2mL PBS洗皿，弃掉PBS加入2mL胰酶消化细胞，终止消化后离心收集细胞沉淀，细胞计数，将细胞分别接种于96孔板中，每种细胞铺48(6×8)个孔，密度为每孔5×10³个，培养基0.1mL，置于细胞培养箱中培养过夜。

(2)细胞加药：待细胞贴壁吸弃原培养基，加入含有药物的培养基。U118所用CPX的药物浓度为0μM，2.5μM，5μM，10μM，20μM，40μM，80μM，160μM；U251和SF126所用CPX的药物浓度为0μM，5μM，10μM，20μM，40μM，80μM，160μM，320μM，由于CPX使用DMSO配制，因此浓度为0的孔加入与最大药物浓度等量的DMSO，每个药物浓度设置六个复孔。细胞加药后继续放置于37℃培养箱中培养48h。

(3)MTT细胞毒性及细胞增殖试剂盒检测细胞毒性：吸去培养基，每孔按100μL培养基中加入10μl MTT(5mg/mL)溶液配制MTT工作液(0.5mg/mL)，在细胞培养箱内继续孵育4h，而后每孔加入100μL Formazan溶解液，适当混匀，在细胞培养箱内再继续孵育4-5h，直至在普通光学显微镜下观察发现formazan全部溶解，若结晶较小胶少，则溶解时间会短一些，若结晶较多较大，则溶解时间会长一些。采用多功能酶标仪测定在570nm波长下各个孔吸光度。

(4)所有时间点的吸光度检测完成后，用GraphPad Primpad 5作图，并计算CPX的半抑制浓度IC₅₀。

(5)其结果如图1所示，CPX对以上五种肿瘤细胞的IC₅₀均小于100μM，低浓度时即具有细胞毒性。对U118、SF126和U251细胞的IC₅₀分别是34.02μM、39.82μM、39.82μM。

3.细胞增殖实验

(1)细胞铺板：U251、SF126和U118细胞在培养皿中培养48小时后，镜下观察细胞状态良好，细胞密度80％左右，吸弃原来的培养基，加入2mLPBS洗皿，弃掉PBS加入2mL胰酶消化细胞，终止消化后离心收集细胞沉淀，细胞计数，分别接种到96孔板中，密度为2×10³个/孔，培养基0.1mL/孔，放在细胞培养箱中培养48h，细胞放置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，培养箱内放置适量高压灭菌水以维持一定的湿度，培养基为培养基为含有1％的双抗(青霉素/链霉素)和10％FBS的DMEM培养基。

(2)细胞加药：待细胞贴壁后加入含有环吡酮胺的培养基，加药时避光。

U251所用CPX浓度为0μM、20μM、40μM、80μM；SF126和U118所用的CPX浓度分别为0μM、10μM、20μM、40μM，每个浓度设置六个复孔，由于CPX使用DMSO配制，因此浓度为0的孔加入与最大药物浓度等量的DMSO。细胞加药后继续放置于37℃培养箱中培养48h。共测定五个时间点：0、1、2、3、4天的细胞增殖情况。

(3)MTT试剂盒检测细胞增殖：吸去培养基，每孔按100μL培养基中加入10μl MTT(5mg/mL)溶液配制MTT工作液(0.5mg/mL)，在细胞培养箱内继续孵育4h，而后每孔加入100μL Formazan溶解液，适当混匀，在细胞培养箱内再继续孵育4-5h，直至在普通光学显微镜下观察发现formazan全部溶解，若结晶较小胶少，则溶解时间会短一些，若结晶较多较大，则溶解时间会长一些。采用多功能酶标仪测定在570nm波长下各个孔吸光度。

(4)待所有时间点检测完成后，用GraphPad Primpad 5作图，绘制生长曲线。

(5)结果如图2所示，从图2可以得出环吡酮胺能显著抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖。

实施例2环吡酮胺作用于胶质母细胞瘤裸鼠异种移植瘤的药效实验

(1)扩增培养细胞：扩增人胶质母细胞瘤细胞U251和U118，直至培养达到所需的细胞数量。

(2)构建裸鼠成瘤模型：消化U251和U118细胞，收集细胞沉淀并计数，沉淀用无血清的DMEM培养基重悬，计数后在细胞沉淀中加入与无血清的DMEM培养基等体积的基质胶制成细胞悬液，每只5周龄的雄性裸鼠左侧肩胛皮下注射150μL含有1×10⁸个细胞的细胞悬液。

(3)观察与分组：用游标卡尺测量移植瘤横径与纵径，待肿瘤体积(体积V＝1/2×a×a×b，a为横径，b为纵径)生长至75-100mm³时将裸鼠随机分成实验组和对照组，每组6只。

(4)药物注射：U251细胞CPX实验组腹腔注射CPX 20mg/kg，0.1mL/10g，每两天注射一次；U118细胞CPX实验组腹腔注射CPX 15mg/kg，0.1mL/10g，每天注射一次。对照组给予与实验组等量的0.9％生理盐水。每两天测量一次瘤体的横径与纵径。

(5)给药结束后，颈椎脱臼处死裸鼠，拍照。手术剥取瘤体，拍照、称重。将瘤体冻存于-80℃。动物尸体送回温州医科大学动物房进行处理。

(6)结果如图3所示，可以从图3得出CPX在裸鼠体内具有抗胶质母细胞瘤的效果，其对裸鼠的体重影响值不大，在动物体内呈低毒性，安全性能较好。

实施例3环吡酮胺和硼替佐米联合使用对胶质母细胞瘤细胞的作用

1.细胞培养，如实施例1中培养方法。

2.细胞增殖实验

(1)细胞铺板：U251和SF126细胞消化后计数，分别接种到96孔板中，密度为2×10³个/孔，培养基0.1mL/孔，放在细胞培养箱中培养过夜。

(2)细胞加药：待细胞贴壁后加入含有相应药物的培养基，加药时避光。U251和SF126所用的药物浓度分别为0μM，20μM CPX，20μM CPX+24nM BTZ，24nM BTZ，每个浓度设置六个复孔，共测定五个时间点：0h，12h，24h，36h，48h。

(3)MTT细胞毒性及细胞增殖试剂盒检测细胞增殖：方法如同实施例1中细胞毒性实验方法。

(4)待所有时间点检测完成后，用GraphPad Primpad 5作图，绘制生长曲线。

(5)如图4所示，在对胶质母细胞瘤细胞U251和SF126中单独使用环吡酮胺或单独使用硼替佐米或者联合使用环吡酮胺及硼替佐米的对照实验中，发现联合使用两种药物可以更显著的抑制胶质母细胞瘤细胞U251和SF126增殖。

3.细胞克隆实验

(1)细胞铺板：将U251和SF126细胞消化后计数，分别接种到六孔板中，每种细胞铺两个六孔板，密度为1000个/孔，培养基2mL/孔，培养七至十天，直到显微镜下看到明显的细胞集落。

(2)细胞加药：吸弃六孔板中原培养基，换成含有相应药物浓度的培养基，加药时避光。所用药物浓度同细胞增殖实验，每个浓度点设置三个复孔，加药处理24h。

(3)细胞固定：吸弃原培养基，每孔加入1mL PBS洗皿，重复三次。弃掉PBS后，每孔加入1mL甲醇固定20min。弃掉甲醇，用PBS洗皿，倒扣六孔板晾干。每孔加入1mL结晶紫染液染色20min。回收结晶紫染液，用PBS洗去皿底残留的染料，室温倒扣晾干后拍照。

(4)如图5所示，在对胶质母细胞瘤细胞U251和SF126中单独使用环吡酮胺或单独使用硼替佐米或者联合使用环吡酮胺及硼替佐米的对照实验中，发现联合使用两种药物可以更显著的抑制胶质母细胞瘤细胞U251和SF126克隆形成能力。

4.细胞凋亡实验

(1)细胞分皿：将生长状态良好的U251和SF126细胞接种于6cm细胞培养皿中，细胞密度为6×10⁵/皿，培养基2.5mL/皿，在细胞培养箱中培养过夜。

(2)细胞加药：细胞贴壁后分别给U251和SF126细胞加药，加药时避光。所用药物浓度均为0μM，20μM CPX，20μM CPX+24nM BTZ，24nM BTZ，加药后放回细胞培养箱中继续培养24h。

(3)染色孵育：在超净工作台中避光操作，用高压灭菌过的去离子水将10x的结合缓冲液稀释成1x。工作液为100μL的1x结合缓冲液中加入5μL FITC和5μL PI。另设置空白管即100μL的1x结合缓冲液，FITC单染管和PI单染管即100μL的1x结合缓冲液中加入5μL FITC或者5μL PI。细胞分别收集在1.5mL EP管中，用100μL的工作液重悬，使得细胞浓度为2×10⁵～2×10⁷/mL，并且每一种细胞需要用阴性对照设置空白管和单染管。室温孵育20min。

(4)上机检测：每管加入400μL的1x结合缓冲液，混匀后立即用流式细胞仪1通道和2通道检测荧光强度，并在0.5h内完成。

(5)其结果如图6所示，在对胶质母细胞瘤细胞U251和SF126中单独使用环吡酮胺或单独使用硼替佐米或者联合使用环吡酮胺及硼替佐米的对照实验中，发现联合使用两种药物可以更显著的促进胶质母细胞瘤细胞U251和SF126凋亡。

实施例4环吡酮胺和硼替佐米联合作用于胶质母细胞瘤裸鼠异种移植瘤的药效实验

(1)扩细胞：扩增人胶质母细胞瘤细胞U251，直至培养达到所需的细胞数量。

(2)构建裸鼠成瘤模型：消化U251细胞，收集细胞沉淀并计数(沉淀用无血清的DMEM培养基重悬)，计数后在细胞沉淀中加入与无血清的DMEM培养基等体积的基质胶制成细胞悬液，每只5周龄的雄性裸鼠左侧肩胛皮下注射150μL含有1×10⁸个细胞的细胞悬液。

(3)观察与分组：用游标卡尺测量移植瘤横径与纵径，待肿瘤体积(体积V＝1/2×a×a×b,a为横径，b为纵径)生长至75-100mm³时将裸鼠随机分成实验组和对照组，每组5只。

(4)药物注射：U251细胞CPX实验组腹腔注射CPX 5mg/kg，0.1mL/10g；CPX+BTZ实验组腹腔注射CPX 5mg/kg，BTZ 0.4mg/kg，0.1mL/10g；BTZ实验组腹腔注射BTZ 0.4mg/kg，0.1mL/10g。对照组给予与实验组等量的0.9％NaCl(生理盐水)。每天注射一次，每两天测量一次瘤体的横径与纵径。

(5)给药结束后，颈椎脱臼处死裸鼠，拍照。手术剥取瘤体，拍照、称重。将瘤体冻存于-80℃。动物尸体送回温州医科大学动物房进行处理。

(6)结果如图7所示，环吡酮胺及硼替佐米联合处理U251细胞裸鼠异种移植物模型后发现，联合用药组裸鼠腹腔注射环吡酮胺及硼替佐米后能够显著抑制瘤体的生长，且联合用药组瘤体重量显著较轻，可以得出环吡酮胺及硼替佐米联合作用下对肿瘤细胞具有协同抑制其增殖，促进凋亡的效果，且各组别裸鼠体重无明显差异，环吡酮胺及硼替佐米联合用药并不会加重药物对动物体的毒副作用。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种组合药物在制备治疗胶质母细胞瘤药物中的用途，其特征在于：组合物包含20μM 环吡酮胺或其药学上可接受的盐，及24nM硼替佐米或其药学上可接受的盐；

或组合物包含剂量为5mg/kg 的环吡酮胺或其药学上可接受的盐，以及剂量为0.4 mg/kg的硼替佐米或其药学上可接受的盐。

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