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CN110337444B - 穿越血脑屏障的纳米药物载体 - Google Patents

穿越血脑屏障的纳米药物载体 Download PDF

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CN110337444B CN201880010782.3A CN201880010782A CN110337444B CN 110337444 B CN110337444 B CN 110337444B CN 201880010782 A CN201880010782 A CN 201880010782A CN 110337444 B CN110337444 B CN 110337444B
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Abstract

本发明公开了一种穿越血脑屏障的纳米药物载体，所述载体能够靶向脑部病灶(脑部肿瘤或者其他神经退行性疾病)，所述穿越血脑屏障的靶向性药物载体包含全重链人铁蛋白或其功能片段重建体或突变体。其穿越血脑屏障的方式为受体介导的转胞吞作用。本发明所述的药物载体将为脑瘤或神经退行性疾病的治疗提供一种有效的纳米药物载体。

Description

穿越血脑屏障的纳米药物载体
技术领域
本发明属于纳米生物、生物仿生和生物医药的交叉领域。特别地，本发明涉及一种可以穿越血脑屏障，并对脑部病灶具有主动靶向性的纳米药物递送系统，所述递送系统包含全重链人铁蛋白或其功能片段重建体或突变体。
背景技术
血脑屏障(Blood-Brain Barrier，简称BBB)是治疗脑部疾病所面临的一道国际难题。因为它的存在，使100％的大分子药物及98％以上的小分子药物均无法穿过并到达脑组织，极大限制了药物对脑部疾病的疗效[1-3]。因此，发明一种能有效穿透血脑屏障的药物一直以来备受期待。
血脑屏障主要由大脑毛细血管内皮细胞、星形胶质细胞粘性末端及周皮细胞紧密连接形成的特殊结构。在正常生理条件下，血脑屏障仅允许气体及相对分子质量小于600Da的脂溶性小分子通过[4]。外界物质穿越血脑屏障有两种途径，即自由扩散和受体介导的主动转运。自由扩散仅限于小分子量、非极性、亲脂性物质，而大多数药物分子穿越血脑屏障主要借助于脑内皮细胞上的受体转运系统[4]。因此，设计可穿越血脑屏障药物的关键是发现和鉴定BBB上具有转胞吞作用的受体，以及与受体结合的靶向载体。
发明内容
本发明的第一方面涉及一种人H铁蛋白的功能片段，其中该功能片段短于全长的人H铁蛋白且在重构(reconstitute)后能形成包含多个亚基的笼状蛋白，且该功能片段展示在所述笼状蛋白的外表面，并且其中所述全长的人H铁蛋白的序列如SEQ ID NO：10所示，优选地，该功能片段的序列如SEQ ID NO：1-3、20-25所示，或与SEQ ID NO：1-3、20-25任一项所示的序列具有至少85％的序列同一性且仍可在重构形成笼状蛋白后展示在笼状蛋白的外表面，或在SEQ ID NO：1-3、20-25任一项所示的序列中取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基且仍可在重构形成笼状蛋白后展示在笼状蛋白的外表面；和/或优选地，重构时介于该功能片段间的序列为支撑序列，为人铁蛋白L亚基中对应于人铁蛋白H亚基该区段的氨基酸序列区段，优选地，所述支撑序列选自SEQ ID No.4-6、26-31。
本发明的第二方面涉及一种笼状蛋白，所述笼状蛋白包含多个亚基，所述多个亚基自组装为所述笼状蛋白，其中每个所述亚基展示在所述笼状蛋白表面的部分为如权利要求1所示的人H铁蛋白的功能片段，优选地，所述亚基的序列如SEQ ID No.7或19所示；和/或，所述多个亚基为人铁蛋白的H亚基和L亚基并自组装为杂合体人铁蛋白的笼状蛋白，其中H亚基和L亚基的比例与天然人铁蛋白的H亚基和L亚基的比例不同并保持了人H铁蛋白的生物活性，优选地，H/L亚基的比例为1:23～23:1。
本发明的第三方面涉及一种人H铁蛋白突变体，其与全人H铁蛋白相比存在一个或多个氨基酸残基突变，优选地，所述突变位于人H铁蛋白的内部或外表面，优选地，所述突变位于序列如SEQ ID No.4-6、26-31所示的支撑序列中，其识别其天然受体TfR1并经由TfR1转运而跨越BBB，优选地，所述人H铁蛋白突变体的序列如SEQ ID NO：8或9所示，或与SEQ IDNO：8或9所示的序列具有至少85％的序列同一性且仍形成包含多个亚基的笼状蛋白，或在SEQ ID NO：8或9所示的序列中取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸残基且仍形成包含多个亚基的笼状蛋白；和/或所述人H铁蛋白突变体的功能片段替换人L铁蛋白的外表面区域，优选地，所述人H铁蛋白突变体的功能片段替换序列如SEQ ID No.12所示的人L铁蛋白的第10-13，19-21，77-79，86-87，91-102，116-122，153-157位氨基酸序列区段区域或替换与SEQ ID No.20-25所示的氨基酸序列区段序列对应的序列如SEQ ID No.12所示的人L铁蛋白中的氨基酸序列。
在一些实施方案中，笼状蛋白质具有穿越血脑屏障的能力。
在一些实施方案中，所述多个亚基为3-30个亚基，优选6-28个，更优选8-26个，最优选24个。
在一些实施方案中，所述笼状蛋白包含药物，优选地，所述药物为化疗药物或抗神经退行性疾病的药物，优选地，所装载的药物选自烷基化剂，如亚硝基脲类；铂类，如顺铂、卡铂及其衍生物；抗代谢类，如胸苷酸合成酶抑制剂；肿瘤抗生素类药物如阿霉素、道诺霉素、柔红霉素；天然提取物，如植物碱(长春花碱)；激素类，如抗雌激素类(他莫替芬)；放射性药物如64Cu、235U；神经递质类药物，如碳酰胆碱、阿托品、东莨菪碱、多巴胺及其衍生物；多巴胺受体激动剂，如溴隐亭、培高利特、阿扑吗啡等麦角碱类衍生物及非麦角碱类衍生物；神经中枢抗胆碱药，如苯海索、苯扎托品及丙环定；胆碱受体激动剂类药物，如毒蕈碱、毛果芸香碱；γ分泌酶抑制剂如双氟酮类；抗氧剂，如褪黑激素；麻醉剂，如蒽胺。
本发明的第四方面涉及一种药物组合物，其包含如上所述的功能片段或如上所述的笼状蛋白或如上所述的人H铁蛋白突变体。
在一些实施方案中，如上所述的功能片段或如上所述的笼状蛋白或如上所述的人H铁蛋白突变体或如上所述的药物组合物用于制备药物载体。
本发明的第五方面涉及如上所述的功能片段或如上所述的笼状蛋白或如上所述的人H铁蛋白突变体或如上所述的药物组合物在制备用于治疗或预防疾病的药物载体中的用途。
本发明的第六方面涉及人H铁蛋白或如上所述的功能片段或如上所述的笼状蛋白或如上所述的人H铁蛋白突变体或如上所述的药物组合物在制备用于治疗或预防疾病的穿越血脑屏障的药物载体中的用途，优选地，所述药物载体还同时靶向脑部病灶或疾病。
本发明的第七方面涉及一种治疗和/或预防疾病的方法，其包括给受试者施用如上所述的功能片段或如上所述的笼状蛋白或如上所述的人H铁蛋白突变体或如上所述的药物组合物的步骤。
本发明的第八方面涉及一种治疗和/或预防脑部疾病的方法，其包括给受试者施用人H铁蛋白或如上所述的功能片段或如上所述的笼状蛋白或如上所述的人H铁蛋白突变体或如上所述的药物组合物的步骤。
在一些实施方案中，所述药物选自烷基化剂，如亚硝基脲类；铂类，如顺铂、卡铂及其衍生物；抗代谢类，如胸苷酸合成酶抑制剂；肿瘤抗生素类药物如阿霉素、道诺霉素、柔红霉素；天然提取物，如植物碱(长春花碱)；激素类，如抗雌激素类(他莫替芬)；放射性药物如64Cu、235U；神经递质类药物，如碳酰胆碱、阿托品、东莨菪碱、多巴胺及其衍生物；多巴胺受体激动剂，如溴隐亭、培高利特、阿扑吗啡等麦角碱类衍生物及非麦角碱类衍生物；神经中枢抗胆碱药，如苯海索、苯扎托品及丙环定；胆碱受体激动剂类药物，如毒蕈碱、毛果芸香碱；γ分泌酶抑制剂如双氟酮类；抗氧剂，如褪黑激素；麻醉剂，如蒽胺；和/或所述疾病选自脑瘤、阿尔茨海默病、帕金森病、脑卒中、癫痫、亨廷顿病及肌萎缩侧索硬化症，和/或人体的恶性肿瘤和癌症，优选用于治疗结直肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、胃癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、前列腺癌以及各种造血系统癌如Hodgkin氏疾病、非Hodgkin氏淋巴癌、白血病等。
在一些实施方案中，所述脑部疾病选自脑瘤、阿尔茨海默病、帕金森病、脑卒中、癫痫、亨廷顿病及肌萎缩侧索硬化症。
换言之，本发明人在系统研究BBB结构与功能特点的基础上，根据人体天然铁蛋白独特的壳核结构，从一个全新的视角仿生合成了一种新型铁蛋白纳米药物载体(KelongFan,et al and Xiyun Yan.Magnetoferritin nanoparticles for targeting andvisualizing tumour tissues.Nature Nanotechnol.7,459-464(2012).)；PCT专利申请：PCT/CN2012/075291)。该载体的特点是，其是由人铁蛋白的H亚基自组装形成的24聚体笼状蛋白(称为人H铁蛋白)，该笼状蛋白的外壳直径为12nm，内腔直径为8nm。根据形成笼状蛋白的H亚基数目的不同，上述外壳直径和内腔直径会相应增大或缩小。本发明人的前期工作已经证明这种纳米铁蛋白粒子具有双功能，既能特异靶向肿瘤，又能有效携带化疗药物精准地到达肿瘤部位，抑制肿瘤的生长与转移(Minmin Liang,Kelong Fan,et al and XiyunYan.H-ferritin-nanocaged doxorubicin nanoparticles specifically target andkill tumors with a single-dose injection.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 111(41):14900-14905(2014)；中国专利申请：201410230829.0)。在本发明中，本发明人发现，无需任何标记和修饰，人H铁蛋白形成的笼状蛋白可以通过与BBB脑内皮细胞上的天然受体转铁蛋白受体1(Transferrin Receptor 1,TfR1)结合，通过TfR1介导的转胞吞作用来实现对血脑屏障的穿越。同时，因为人H-铁蛋白本身对肿瘤细胞具有靶向性，因此人H-铁蛋白不仅可以有效地穿越血脑屏障，同时可以对脑部病灶实现主动靶向。同时，本发明发现，人H-铁蛋白形成的笼状蛋白与TfR1结合以穿越BBB时，对于二者结合及BBB穿越重要的是展示在人H-铁蛋白壳外表面的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO：1-3所示的序列。同时包含SEQ ID NO：1-3所示序列的亚基，只要以自组装的形式形成笼状蛋白，且该序列展示在外表面，即可实现对TfR1的结合及对血脑屏障的有效穿越。
在一些实施方案中，本发明涉及以下各项：
1.一种能够穿越血脑屏障的纳米药物载体，其中所述载体包含全重链人铁蛋白。
2.全重链人铁蛋白或其功能片段在制备用于穿越血脑屏障的药物载体中的用途。
3.全重链人铁蛋白或其功能片段在制备用于穿越血脑屏障同时靶向脑部病灶或疾病的药物载体中的用途。
4.根据2或3所述的用途，其中所述药物载体携带药物成分，所述药物成分优选为抗脑瘤化疗药物，优选阿霉素；或者抗神经退行性疾病的药物，优选多奈哌齐或左旋多巴胺。
5.一种能够穿越血脑屏障的药物组合物，其中所述药物组合物包含1所述的载体和用于治疗脑部病灶或疾病的药物成分，所述药物成分优选为抗脑瘤化疗药物，优选阿霉素；或者抗神经退行性疾病的药物，优选多奈哌齐或左旋多巴胺。
6.根据3所述的用途或4所述的药物组合物，其中所述脑部病灶或疾病包括脑瘤或神经退行性疾病，所述脑瘤优选为神经胶质瘤，所述神经退行性疾病优选为阿尔兹海默氏症或帕金森氏症。
7.根据2或3所述的用途，其中所述全重链人铁蛋白通过受体介导的转胞吞作用穿越血脑屏障，所述受体优选为TfR1。
8.根据1所述的载体，其中所述全重链人铁蛋白为人铁蛋白的H亚基或其突变体自组装形成的具有空腔的笼状蛋白，所述空腔可用于装载药物成分。
9.根据8所述的载体，所述笼状蛋白的外表面与受体TfR1结合，所述突变在所述笼状蛋白的内表面。
10.根据8所述的载体，所述突变体不影响全重链人H铁蛋白与受体结合，仍保持空腔结构。
本发明的靶向性药物载体包含全重链人铁蛋白或其功能片段重建体或突变体，其穿越血脑屏障的方式为受体介导的转胞吞作用。本发明所述的药物载体将为疾病尤其是脑瘤或神经退行性疾病的治疗提供一种有效的纳米药物载体。
附图说明
图1表明人血脑屏障的主要组成成分-人脑内皮细胞hCMEC/D3(A)，以及人神经胶质瘤细胞U-87MG(B)均高表达人H铁蛋白的受体TfR1。
图2表明人H铁蛋白通过与其受体TfR1来与人脑内皮细胞hCMEC/D3(A)及神经胶质瘤细胞U-87MG(B)特异性结合。
图3表明人H铁蛋白可以有效的被人脑内皮细胞hCMEC/D3内化。人H铁蛋白与脑内皮细胞上高表达的TfR1结合后，首先定位在细胞膜上(A)，然后会被有效的内化到细胞内部(B)。
图4显示了人H铁蛋白在人脑内皮细胞hCMEC/D3中的路径。人H铁蛋白与脑内皮细胞结合后，会在TfR1的介导下，发生内吞，随后进入胞内体(endosome)。随后，大多数的人H铁蛋白仍旧在胞内体里面，而不是进入溶酶体(LAMP-1，溶酶体标记物)(A、B)。但是抗TfR1的抗体绝大多数都进入溶酶体(C、D)。标尺为10微米。***p<0.001；****p<0.0001.
图5是血脑屏障(BBB)模型结果显示，人H铁蛋白可以有效的通过受体TfR1介导的转胞吞作用穿越血脑屏障。
(A)体外血脑屏障示意图；
(B)人H铁蛋白与非特异性穿越的BSA的转胞吞作用比较。
图6显示了人H铁蛋白与人神经胶质瘤细胞U-87MG结合后(A)，会通过受体TfR1介导的内吞进入细胞内部，然后进入溶酶体中(B)。通过这个途径，H铁蛋白可以在神经胶质瘤细胞中有效的富集，并通过溶酶体途径将装载的药物释放出来。
图7表明人H铁蛋白在体内可以特异性靶向神经胶质瘤癌灶，箭头所指方向为神经胶质瘤癌灶。
图8显示H铁蛋白装载阿霉素，可以显著性的提高神经胶质瘤小鼠模型的生存期。与游离阿霉素(Free-Dox)组相比，其生存期显著性延长，**p<0.01。箭头为给药时间。游离阿霉素组平均生存期为15天，HFn-Dox给药组为30天。
图9显示嵌合人H铁蛋白仍旧可以与人脑内皮细胞内皮细胞特异性结合(A)，在人脑内皮细胞内不进入溶酶体(B)并有效的穿越体外BBB模型(C)
图10显示基于人H铁蛋白的内部氨基酸突变体不影响其与人脑内皮细胞的特异性结合。其中突变体1和突变体2均为人H铁蛋白功能性突变体，内部特定氨基酸突变后，影响其储存铁的功能。但是这些突变体不影响其与人脑内皮细胞的特异性结合。
图11显示了利用Native PAGE鉴定蛋白杂合体纯度的结果。
图12显示了利用SDS PAGE鉴定蛋白杂合体亚基比例的结果。
图13显示了利用ELISA鉴定杂合体与TfR1的亲和力的结果。A图和B图分别显示了OD630nm和亲和力的数据。
图14显示了C末端、N末端等6种改造蛋白表达产物的12％SDS PAGE电泳结果。
图15显示了ELISA测定六种改造蛋白与TFR1亲和力的结果。
图16示出了HFn上对于TfR1受体结合具有重要作用的残基，其中A图和B图为不同视角下具有重要作用的残基所处的位置(主要位于铁蛋白的三重轴附近，结构的N端)，其中彩色卡通显示的残基是不具有TfR1结合能力的LFn蛋白的晶体结构中三重轴区域，蓝色棍状显示的残基是对于TfR1受体结合具有重要作用的残基，这些残基均位于蛋白的外表面。
图17示出了嵌合人铁蛋白的氨基酸序列组成，其中黑色残基来源于LFn蛋白，属于框架序列，在上图中用彩色卡通显示；而带下划线部分是对于TfR1受体结合具有重要作用的残基，在上图中用蓝色棍状显示。
具体实施方式
定义：
人H铁蛋白是指由人铁蛋白的H亚基自组装形成的铁蛋白。
人L铁蛋白是指由人铁蛋白的L亚基自组装形成的铁蛋白。
杂合体人铁蛋白是指由人铁蛋白的H亚基和L亚基自组装形成的铁蛋白，且H/L亚基的比例不同于天然的人铁蛋白，例如H/L的比例为23:1～1:23。在一些实施方案中，H/L亚基的比例为1:5～15:1，在一些实施方案中，H/L亚基的比例为1:3～11:1，在一些实施方案中，H/L亚基的比例为1:1～5:1，在一些实施方案中，H/L亚基的比例为1:1～3:1，在一些实施方案中，H/L亚基的比例为15:1～3:1，在一些实施方案中，H/L亚基的比例为11:1～3:1。
H/L功能区域替换是指将H铁蛋白上与受体TfR1结合的区域，替换到L铁蛋白上，即，将H铁蛋白的功能区域移植到L铁蛋白上而实现H铁蛋白的功能。
笼状蛋白：由蛋白亚基以一定的空间对称结构形成的球状蛋白称为笼状蛋白。在本发明中的一些实施方案中，笼状蛋白是指由人铁蛋白的H亚基自组装形成的笼状蛋白，其所包含的人铁蛋白的H亚基数目并无任何限制，只要其是一定条件下自组装形成的笼状蛋白即可，在一些实施方案中，所包含的人铁蛋白的H亚基数目可以为3-30，优选6-28，更优选8-26、10-26、12-26、14-26、16-26、18-26、20-26、22-26，最优选24，以及所述范围内的任一个自然数。在一些实施方案中，如上所述，笼状蛋白是由人铁蛋白的H亚基与L亚基形成的杂合体，其组成比例不同于天然的人铁蛋白同时保持了人H铁蛋白的生物活性，如跨越BBB的能力。
可以装载在本发明的笼状蛋白中的药物没有任何限制，只要其不破坏所述笼状蛋白的结构和性质且能被笼状蛋白的内腔所容纳即可。在一些实施方案中，所述药物选自任何烷基化剂、顺铂、卡铂及其衍生物；抗生素类药物，比如阿霉素、道诺霉素、柔红霉素等；植物碱，比如长春花碱等；放射性药物，比如64Cu,235U等；神经递质类药物，比如碳酰胆碱、阿托品、东莨菪碱、多巴胺及其衍生物等；多巴胺受体激动剂，比如溴隐亭、培高利特、阿扑吗啡等麦角碱类衍生物及非麦角碱类衍生物；神经中枢抗胆碱药，比如苯海索、苯扎托品及丙环定等；胆碱受体激动剂类药物，比如毒蕈碱、毛果芸香碱等；γ分泌酶抑制剂，比如双氟酮类；抗氧剂，比如褪黑激素；麻醉剂，比如蒽胺等。相应地，由本发明的药物载体所能治疗或预防的疾病也仅受限于其中所包含的药物，即所包含的药物可以治疗或预防何种疾病，本发明的药物载体就可以治疗或预防何种疾病。在本发明的一些实施方案中，可以治疗或预防的疾病选自脑瘤、阿尔茨海默病、帕金森病、脑卒中、癫痫、亨廷顿病及肌萎缩侧索硬化症。可以治疗人体的恶性肿瘤和癌症，优选用于治疗结直肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、胃癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、前列腺癌以及各种造血系统癌如Hodgkin氏疾病、非Hodgkin氏淋巴癌、白血病等。
重构(reconstitute)是指通过基于工程的手段，将不同的基因序列重新组合到一起，并通过蛋白表达系统表达重组蛋白的过程。在本发明中，所述重构涉及将例如SEQ IDNO：1-3、20-25所示的氨基酸序列与支撑序列融合，以使SEQ ID NO：1-3、20-25所示的氨基酸序列都呈现于所形成的笼状蛋白的表面，而支撑序列位于笼状蛋白的内部。支撑序列是指与例如SEQ ID NO：1-3、20-25所示的序列融合并将其展示于笼状蛋白外表面的氨基酸序列。在一些实施方案中，SEQ ID NO：1-3、20-25所示的氨基酸序列分别被支撑序列分割。在一些实施方案中，SEQ ID NO：1的N末端前有1-5个氨基酸残基，优选地，有1、2或3个氨基酸残基，优选地，有1个氨基酸残基，优选地，该氨基酸残基为M。在一些实施方案中，所述支撑序列的序列如SEQ ID NO：4-6、26-31所示。在一些实施方案中，重构获得重组体中的序列按下述方式融合：SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：5-SEQ ID NO：3-SEQID NO：6。在一些实施方案中，重构获得的重组体的序列如SEQ ID NO：7或19所示。本领域技术人员知晓如何将SEQ ID NO：1-3、20-25所示的氨基酸序列展现于自组装形成的笼状蛋白外表面的方法，例如可参考分子克隆实验指南(Molecular Cloning 4th:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press)。所述支撑序列位于笼状蛋白的内部，其中可以存在多个氨基酸位点的突变而不影响笼状蛋白与TfR1的结合及转运，例如1、2、3、4、5或更多个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加。在一些实施方案中，SEQ ID NO：1-3、20-25所示的氨基酸可以存在1、2、3、4、5或更多个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加，而不影响其展示于自组装形成的笼状蛋白外表面及笼状蛋白与TfR1的结合及转运。在一些实施方案中，SEQ ID NO：1-3、20-25的变体序列具有与SEQ ID NO：1-3、20-25相同的功能，所述变体序列分别与SEQ ID NO：1-3、20-25所示的序列具有至少80％的序列同一性，例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。在一些实施方案中，上述支撑序列是人L亚基中位于笼状蛋白内部与人H亚基对应的序列，如人铁蛋白L亚基(SEQ ID No.12)第1-9，14-18，22-76，80-85，88-90，103-115，123-152，158-175位氨基酸序列区段或SEQ IDNo.26-31所示的序列。
人H铁蛋白的功能片段是指展示在人H铁蛋白表面，对结合受体起决定性作用的蛋白序列。在一些实施方案中，所述功能片段的序列如SEQ ID NO：1-3、20-25所示。在本发明的一些实施方案中还涉及所述功能片段的编码多核苷酸、载体。编码该序列片段的核苷酸称为功能性核苷酸。包含该多核苷酸的重组表达载体为功能性片段表达载体。
人H铁蛋白的突变体是指与天然人H铁蛋白相比存在氨基酸残基突变的产物。在一些实施方案中，所述突变位于人H铁蛋白(即笼状蛋白)的内部，即，所述突变不是展示于人H铁蛋白外表面的突变。所述突变体与天然的人H铁蛋白一样，可以识别其天然受体TfR1并经由TfR1转运而跨越BBB。在一些实施方案中，所述突变体与天然人H铁蛋白相比，可以存在一个或多个氨基酸位点的突变而不影响笼状蛋白与TfR1的结合及转运，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或更多个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加。在一些实施方案中，所述突变体与天然人H铁蛋白具有至少80％的序列同一性而不影响笼状蛋白与TfR1的结合及转运，例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。
序列同一性是指在序列比对和引入缺口(如果必要的话，以获得最大百分比同源性)后，多核苷酸或多肽序列突变体的残基与非变体序列的相同的百分比。由于序列的长度不一，当同样有一个或多个氨基酸残基或核苷酸发生突变时，如取代、缺失和/或添加，所导致的序列同一性差异是不同，而且，多数情况下，所计算获得的序列同一性并非是恰好的百分比整数数字，而可能是含有小数的数字。因此，上述序列同一性百分比也包括相应的实际计算而来的最接近的含有小数的百分比数字。
在一些实施方案中，所述突变是指保守氨基酸的替换。在一些实施方案中，保守取代可以由反映在以下三个表中的一个或多个中的氨基酸类别内的取代定义：
保守取代的氨基酸残基类别：
替代性保守氨基酸残基取代类别：
氨基酸残基的替代性物理和功能分类：
更保守的取代分组包括：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。
还可以使用描述于例如Creighton,1984,Proteins:Structure and MolecularProperties,Ver.2,1993,W.H.Freeman and Company中的原理制定另外的氨基酸组群。
本发明人经过广泛而深入的研究，在本发明人的前期工作(Kelong Fan,et aland Xiyun Yan.Magnetoferritin nanoparticles for targeting and visualizingtumour tissues.Nature Nanotechnol.7,459-464(2012)；Minmin Liang,Kelong Fan,etal and Xiyun Yan.H-ferritin-nanocaged doxorubicin nanoparticles specificallytarget and kill tumors with a single-dose injection.Proc.Natl.Acad.Sci.USA111(41):14900-14905(2014))和中国发明专利ZL201110122433.0以及专利申请201410230829.0的基础上，发现人H铁蛋白可以通过其受体TfR1介导的转胞吞作用来实现对血脑屏障(BBB)的穿越，同时对脑瘤具有主动靶向性。在此基础上，完成了本项发明。
其中人H铁蛋白的全长氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，在一些实施方案中，所使用的是人H铁蛋白的功能片段，所述功能片段有效融合于所在的亚基，以自组装的形式形成笼状蛋白，且所述序列展示在外表面，在一些实施方案中，所述功能片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1-3、20-25所示。在一些实施方案中，本发明对全重链人铁蛋白进行了改造，即获得了人H铁蛋白的突变体，所述突变体对上述氨基酸序列进行定点改造，不影响其与受体结合并穿越BBB。在一些实施方案中，突变体的突变位点位于形成的笼状蛋白的内部。在一些实施方案中，突变体的突变位点位于形成的笼状蛋白的外表面。在一些实施方案中，突变体的突变位点位于形成的笼状蛋白的内部和外表面。在一些实施方案中，这些突变体的序列如SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9所示。在一些实施方案中，突变体的突变位点位于支撑序列中。在一些实施方案中，支撑序列的氨基酸序列如SEQ ID No.4-6、26-31所示。
以下结合具体实施案例对本发明做进一步说明，以下实施例仅用于说明本发明而不限定本发明的范围。对于本领域技术人员来说，在本发明范围内所做的任何变更，修改或直接采用实施例中的同等条件而实施的例子，都应理解为在本发明涵盖的范围内。
下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。
实施例
实施例1人H铁蛋白通过受体TfR1与人脑内皮细胞特异性结合
为了研究人H铁蛋白是否与人脑内皮细胞有特异性的结合，选取人血脑屏障脑内皮细胞hCMEC/D3(EMD Millipore Corporation：SCC066)进行研究。在体外，首先，本发明证明在人血脑屏障脑内皮细胞hCMEC/D3上高表达H铁蛋白的受体TfR1，随后将人血脑屏障脑内皮细胞hCMEC/D3与荧光分子标记的人H铁蛋白进行孵育，应用流式细胞术及激光共聚焦的方法检测人H铁蛋白与肿瘤细胞的结合情况。
实验方法如下：
a)TfR1在人脑内皮细胞上的表达情况。
培养人血脑屏障脑内皮细胞hCMEC/D3至1×105左右(100×20mm培养皿，Corning,USA)。培养条件为：含有生长因子、皮质醇的EBM-2培养基(Gibco Life TechnologiesInc.,UK)，加入2.5％(v/v)的胎牛血清(Sigma-Aldrich)及抗生素青霉素(100U/mL,Sigma-Aldrich)及链霉素(100μg/mL,Sigma-Aldrich)，37℃，5％CO2条件下培养。胰酶消化，0.3％(w/v)的BSA/PBS(pH7.4)洗细胞三次，按照1:200的比例加入鼠抗人TfR1单克隆抗体(SantaCruz,Clone M-A712)，对照组加入鼠mIgG,4℃孵育45分钟。用上述0.3％的BSA/PBS洗细胞三次，然后按照1:500的比例加入Alexa488标记的羊抗鼠IgG(Thermo FisherScientific)，4℃孵育45分钟。用上述0.3％的BSA/PBS洗细胞三次，最后重悬于PBS(pH7.4)中，流式细胞术检测样品荧光(波长488nm)。结果如图1的A所示，结果表明人血脑屏障脑内皮细胞hCMEC/D3上高表达H铁蛋白受体TfR1。
b)人H铁蛋白与人脑内皮细胞的特异性结合。
按照说明书提供的标记方法，将NHS活化的FITC(购自Sigma)标记人H铁蛋白的外表面。人H铁蛋白制备方法参见申请人发明专利(专利号：ZL201110122433.0，氨基酸序列也可参见NCBI登录号NP_002023.2)。培养人血脑屏障脑内皮细胞hCMEC/D3至1×105(100×20mm,dish Corning,USA)左右，胰酶消化，0.3％(w/v)的BSA/PBS(pH7.4)洗细胞三次，加入50μg/ml的上述FITC标记的人H铁蛋白，对照组加入FITC标记的BSA，4℃孵育45分钟。然后再用上述0.3％的BSA/PBS洗细胞三次，最后重悬于PBS(pH7.4)中，流式细胞术检测样品荧光(波长488nm)。结果如图2的A所示，人H铁蛋白可以直接与高表达TfR1的人脑内皮细胞特异性结合。结合申请人之前的工作(Kelong Fan,et al and Xiyun Yan.Magnetoferritinnanoparticles for targeting and visualizing tumour tissues.NatureNanotechnol.7,459-464(2012))，TfR1为人H铁蛋白与人细胞结合的主要受体，由此，本发明人确定，人H铁蛋白可以通过TfR1的结合来特异性的与人血脑屏障脑内皮细胞hCMEC/D3结合。
实施例2人H铁蛋白进入人脑内皮细胞后的亚细胞定位
经典的TfR1在胞内的路径：与配体结合后，受体TfR1介导发生内吞，进入胞内体(endosome)，然后进入溶酶体(lysosome)。而若要实现对人血脑屏障的穿越，首先要解决的第一个问题是配体与TfR1结合后，是否进入溶酶体。本发明首次证实，在人脑内皮细胞中，大部分的H铁蛋白与溶酶体不共定位，而是以胞内体的形式存在，这样，为穿越血脑屏障提供了细胞内定位的支持。
具体实验方法如下：
a)人H铁蛋白可被人血脑屏障脑内皮细胞有效内吞
人血脑屏障脑内皮细胞hCMEC/D3爬片(BD Biosciences)，置于六孔板(孔直径34.8mm，Corning,USA)中如上所述培养至密度为60％左右时，开始实验。加入1μM上述FITC标记的H铁蛋白，37℃分别孵育5分钟和60分钟，用上述0.3％的BSA/PBS洗细胞三次，最后用4％多聚甲醛固定，PBS(pH7.4)洗三次后，DAPI(Roche Applied Science)室温染核10分钟。PBS再洗三次后，用防荧光淬灭封片剂封片。激光共聚焦(Olympus FluoView FV-1000,Tokyo,Japan)观察。结果见图3，A图表明FITC标记的H铁蛋白在时间比较短的时候(5分钟)，大部分仍旧与细胞膜上的TfR1结合。B图表明，随着时间延长，在孵育60分钟后，大部分的H铁蛋白以胞内体小泡的形式存在于脑内皮细胞中。由此，H铁蛋白可以被脑内皮细胞有效地摄入跟内吞。
b)人H铁蛋白在人血脑屏障脑内皮细胞中的共定位。
人血脑屏障脑内皮细胞hCMEC/D3爬片(BD Biosciences)，置于六孔板中培养至密度为60％左右时，开始实验。加入1μM上述FITC标记的H铁蛋白，对照组加入Alexa 488标记的鼠抗人TfR1单克隆抗体(1:200,Clone：M-A712,Santa Cruz)于培养箱中孵育4小时。PBS洗三次后用4％多聚甲醛固定5分钟。然后用0.1％Triton X-100对细胞进行通透处理。PBS再次洗后，细胞用5％羊血清(中杉金桥)室温封闭30分钟。然后在37℃孵育Alexa/>555标记的溶酶体标志分子LAMP1抗体(1:200,clone H4A3；Invitrogen)一个小时。最后用DAPI(1μg/mL,Roche Applied Science)室温染核10分钟。最后，用激光共聚焦显微镜(Olympus FluoView FV-1000,Tokyo,Japan)观察。结果如图4所示，FITC标记的H铁蛋白及Alexa/>488标记的抗体为绿色(图中显示为白色)，溶酶体的标志物分子LAMP-1为红色(图中显示为暗灰色)，如果溶酶体跟抗体或者铁蛋白共定位，则颜色在图中显示为亮白色。通过观察HFn在细胞内的行为，本发明人发现，H铁蛋白与血脑屏障脑内皮细胞膜蛋白上的受体结合后，由受体介导内吞，被转入胞内体，但是，与之前的结果不同的是，绝大多数的H铁蛋白在脑内皮细胞中并不进入溶酶体(图4的A和B，显示白色与暗灰色基本上不共定位，无亮白色点出现)。而抗TfR1的单克隆抗体与人H铁蛋白不同，抗体与血脑屏障脑内皮细胞上的受体TfR1结合后，被转运入胞内体，最终几乎全部的抗体都进入溶酶体中(图4的C和D，显示几乎所有的抗体均与溶酶体共定位，形成亮白色点，D为定量分析图)。这些现象为H铁蛋白穿越血脑屏障提供了细胞亚细胞结构定位的基础。
实施例3人H铁蛋白可以有效穿越人血脑屏障模型
a)血脑屏障模型的建立
人血脑屏障脑内皮细胞hCMEC/D3(2×104/孔)接种于明胶(10μg/cm2)预处理过的Transwell板(3μm孔径，Corning,USA)(培养条件同实施例1)。37摄氏度CO2培养箱培养至汇聚状态(2～3天)。显微镜下观察hCMEC/D3达汇合状态后，将培养基(EBM-2培养基)加入Transwell板上室中，使上下室液面差大于0.5cm。4h后若两室间仍能保持明显的液面差，则认为已经完全汇合。以未接种细胞的Transwell孔作为空白对照。此时，认为血脑屏障模型构建成功(图5的A)。
b)人H铁蛋白穿越血脑屏障
将等量(50μg/mL)的上述FITC标记的H铁蛋白及对照FITC标记的BSA溶解于EBM-2培养基(Gibco Life Technologies Inc.,UK)中。弃去血脑屏障模型中原有的培养基，然后在Transwell上室(模拟血管管腔)中加入含有等量上述FITC-H铁蛋白及FITC-BSA的EBM-2培养基，Transwell下室加入空白EBM-2培养基，使上下室保持液面相平。于细胞培养箱中培养6h后，测下室总体积(V)。然后从下室中分别取50μL样品，通过测定荧光密度(波长488nm)的方法，测定H铁蛋白或者BSA的浓度(C)。然后根据公式转胞吞效率％＝(C下室×V下室)/(C初始×V初始)×100％来计算转胞吞效率。结果如图5的B所示，相对于BSA来说，H铁蛋白可以显著性的穿越血脑屏障模型。
实施例4人H铁蛋白可以特异性靶向神经胶质细胞瘤
H铁蛋白穿越血脑屏障后，因为其受体TfR1在很多肿瘤细胞上高表达，因此，H铁蛋白同时具有对脑瘤病灶的靶向性。在本发明中，发明人利用人神经胶质细胞瘤U87-MG(ATCC:HTB-14)来检测H-铁蛋白对神经胶质瘤的靶向性。本发明人发现，不同于在脑内皮细胞中，H铁蛋白通过与受体TfR1特异性与神经胶质瘤结合后，会迅速被内化到溶酶体中，从而实现肿瘤细胞对H-铁蛋白的有效富集。在小鼠神经胶质瘤模型中，发明人发现，H铁蛋白对神经胶质瘤癌灶具有非常好的体内肿瘤靶向性。
具体实施例如下：
a)TfR1在人神经胶质瘤细胞上的表达情况。
培养人神经胶质瘤细胞U87-MG至1×105左右(培养条件如下：DMEM培养基(Sigma-Aldrich)，10％胎牛血清(Sigma-Aldrich)，青霉素(100U/mL,Sigma-Aldrich)及链霉素(100μg/mL,Sigma-Aldrich)，37℃，5％CO2条件下培养)，胰酶消化，上述0.3％的BSA/PBS洗细胞三次，按照1:200的比例加入鼠抗人TfR1单克隆抗体(Santa Cruz,Clone M-A712)，对照组加入鼠mIgG,4℃孵育45分钟。用上述0.3％的BSA/PBS洗细胞三次，然后按照1:500的比例加入Alexa488标记的羊抗鼠IgG(Thermo Fisher Scientific)，4℃孵育45分钟。用所述0.3％的BSA/PBS洗细胞三次，最后重悬于PBS(pH值7.4)中，流式细胞术检测样品荧光(波长488)。结果如图1B所示，人神经胶质瘤细胞U87-MG上高表达H铁蛋白受体TfR1。
b)人H铁蛋白与人神经胶质瘤细胞的特异性结合。
培养人神经胶质瘤细胞U87-MG至1×105左右，胰酶消化，上述0.3％的BSA/PBS洗细胞三次，加入50μg/ml的FITC标记的人H铁蛋白，对照组加入FITC标记的BSA，4℃孵育45分钟。然后再用上述0.3％的BSA/PBS洗细胞三次，最后重悬于PBS中，流式细胞术检测样品荧光(波长488)。结果如图2B所示，证明人H铁蛋白可以直接与高表达TfR1的人脑内皮细胞特异性结合。
c)H铁蛋白在人神经胶质瘤细胞U87-MG中的共定位。
人神经胶质瘤细胞U87-MG爬片(BD Biosciences)，置于六孔板(孔直径34.8mm，Corning,USA)中如上所述培养至密度为60％左右时，开始实验。加入1μM上述FITC标记的H铁蛋白,于培养箱中孵育4小时。PBS(pH7.4)洗三次后用4％多聚甲醛固定5分钟。然后用0.1％Triton X-100对细胞进行通透处理。PBS再次洗后，细胞用5％羊血清(中杉金桥)室温封闭30分钟。然后在37℃孵育Alexa555标记的溶酶体标志分子LAMP1抗体(1:200,clone H4A3；Invitrogen)一个小时。最后用DAPI(1μg/mL,Roche Applied Science)室温染核10分钟。最后，用激光共聚焦显微镜(Olympus FluoView FV-1000,Tokyo,Japan)观察。结果如图6所示，FITC标记的H铁蛋白为绿色(在图中显示为白色)，溶酶体的标志物分子LAMP-1为红色(在图中显示为暗灰色)。通过观察HFn在神经胶质瘤细胞内的行为，申请人发现，与血脑屏障脑内皮细胞中的定位不同，H铁蛋白在神经胶质瘤细胞U87-MG中，与受体TfR1结合后，由受体介导内吞，被转入胞内体，被转运入胞内体，最终几乎全部的抗体都进入溶酶体中(图6的A和B，B图中最后几乎所有的白点均与灰点共定位)。这些实验结果表明H铁蛋白穿越血脑屏障后，对脑瘤的病灶有特异性的靶向性，并能够在脑瘤细胞中进行有效的内化和富集。
d)H铁蛋白可以特异性靶向小鼠神经胶质瘤模型中的癌灶
人TfR1敲入小鼠(hTfR1-Balb/c)的构建。将人TfR1cDNA通过转基因技术，插入小鼠胚胎干细胞鼠TfR1第一个外显子ATG后面，并删除残余的小鼠TfR1外显子2和内含子的起始部分，实现人TfR1将鼠TfR1替代，即hTfR1敲入小鼠。该小鼠模型委托南京大学-南京生物医药研究院构建。通过对hTfR1敲入小鼠进行脑定位仪(MouseTMStereotaxic Instrument,Stoelting Co.)定位、微量注射器(10μL,Hamilton)微量注射(10μL)神经胶质瘤细胞(hTfR1-G422,人TfR1稳转细胞系，购自北京百奥思科生物医学技术有限公司)以及手术缝合的技术手段，发明人成功构建了小鼠神经胶质瘤模型。尾静脉注射10mg/Kg剂量的Cy5.5(GE Healthcare)标记的H铁蛋白及同等剂量的BSA(Sigma)，然后利用小动物成像系统IVIS(PerkinElmer)进行活体小动物成像。结果如图7所示，H铁蛋白可以特异性的靶向神经胶质瘤的癌灶位置，而作为对照的BSA则没有任何靶向性。这些实验结果表明，H铁蛋白在体内可以有效的穿越血脑屏障，并对神经胶质瘤癌灶具有非常好的靶向性。
实施例5人H铁蛋白装载化疗药物阿霉素可以特异性治疗小鼠神经胶质瘤
发明人接下来对神经胶质瘤荷瘤小鼠(同实施例4)进行了动物治疗实验。实验将原位神经胶质瘤模型小鼠(同实施例4)分为两组，每组5只。然后以阿霉素(1mg/Kg)分别在接种细胞9天、12天和15天对小鼠神经胶质瘤模型进行治疗。治疗结果如图8所示，结果表明装载阿霉素的H铁蛋白(HFn-Dox)可以显著性的改善小鼠神经胶质瘤原位癌模型的生存率(与游离阿霉素Free-Dox比，p<0.01)，极大的提高了生存期(30天)，而游离阿霉素组小鼠的生存期为15天。这些实验结果表明，H铁蛋白作为药物载体，可以穿越血脑屏障，并对神经胶质瘤具有明显的治疗效果。
实施例6人H铁蛋白功能性片段的鉴定与验证
为进一步验证人H铁蛋白的功能性片段，发明人通过基因工程的方法(参照分子克隆实验指南，Molecular Cloning 4th:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press)，将具有同样空间结构，而不具有穿越血脑屏障能力的人L铁蛋白(由人铁蛋白L亚基自组装形成，氨基酸序列如SEQ ID No.12所示，也可参见NCBI登录号NP_000137.2)的外表面氨基酸序列替换为SEQ ID NO：1-3。所获得的完整序列如下：
MTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMECALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFERLTLKHD(SEQ ID NO：7)，其中粗斜体为人H铁蛋白核心识别序列(依次编号为SEQ ID NO：1-3)，正常字体为人L铁蛋白支架序列(也称为支撑序列，除第一位的M(Met)残基外，其它三段序列依次编号为SEQ ID NO：4-6)。SEQ ID NO：3、2和1的融合形式为SEQ ID NO：11。SEQ ID NO：7所示的蛋白命名为嵌合人H铁蛋白。
通过重组表达、纯化(表达纯化方法参照发明人发明专利：ZL201110122433.0)，探讨嵌合人H铁蛋白穿越血脑屏障的能力。具体实施例如下：
嵌合人H铁蛋白与人脑内皮细胞的特异性结合参照实施例1b执行。结果如图9的A所示，人L铁蛋白因为与TfR1无相互作用，因此，与人脑内皮细胞不结合。
嵌合人H铁蛋白被人脑内皮细胞内吞及在细胞中的亚定位，参照实施例2执行。结果如图9的B所示，FITC标记的嵌合人H铁蛋白在图中显示为白色，溶酶体显示为灰色。绝大多数嵌合人H铁蛋白均不与溶酶体共定位。可见清晰的区分。
嵌合人H铁蛋白对体外血脑屏障模型的穿越效率参照实施例3执行。结果如图9的C所示，相对于人L铁蛋白，嵌合人H铁蛋白可显著性的穿越血脑屏障。
由这些结果得出，SEQ ID NO：1-3对人H铁蛋白识别TfR1并穿越BBB是必需的功能区域，将其展示在其他笼状蛋白表面是可行的。
本发明还获得了HFn的蛋白晶体结构，如图16所示。图16示出了HFn上对于TfR1受体结合具有重要作用的残基，其中A图和B图为不同视角下具有重要作用的残基所处的位置(主要位于铁蛋白的三重轴附近，结构的N端)，其中彩色卡通显示的残基是不具有TfR1结合能力的LFn蛋白的晶体结构中三重轴区域，蓝色棍状显示的残基是对于TfR1受体结合具有重要作用的残基，这些残基均位于蛋白的外表面。图17示出了本发明的另一种嵌合人铁蛋白的氨基酸序列(SEQ ID No.19)，其中黑色残基来源于LFn蛋白，属于框架序列(支撑序列)，在上图中用彩色卡通显示；而带下划线部分是对于TfR1受体结合具有重要作用的残基，在上图中用蓝色棍状显示。上述重要残基序列分别如SEQ ID No.20～25所示，框架序列如SEQ ID No.26～31所示。
实施例7人H铁蛋白内部突变不影响其对脑内皮细胞的靶向性
为进一步验证人H铁蛋白的功能性片段是在外表面，而内部突变对其功能无影响，本发明人通过基因工程的方法(参照分子克隆实验指南，Molecular Cloning 4th:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press)，对人H铁蛋白内部氨基酸进行突变，分别构建了突变体1(SEQ ID NO：8)与突变体2(SEQ ID NO：9)。其中突变体1为定点突变了人H铁蛋白亚基内部的活性位点，将63E突变为63K，66H突变为66G；突变体2为定点突变了人H铁蛋白亲水性通道，将131D突变为131A，134E突变为134A。这两个突变体均为功能性突变体，对人H铁蛋白的生理功能起决定性作用，但是突变位点都不在形成的笼状蛋白的外表面。为证实人H铁蛋白穿越BBB的能力是由笼状蛋白外表面的功能性序列决定，而与内部结构无关，本发明人探讨了突变体1与突变体2对人脑内皮细胞特异性结合的影响。
与人脑内皮细胞特异性结合的测定参照实施例1b执行。结果如图10所示，突变体1与突变体2对人脑内皮细胞的特异性结合均与人H铁蛋白无明显差异。这表明，笼状蛋白的内部蛋白结构只起到支撑作用，具有穿越血脑屏障能力的序列为人H铁蛋白外表面的功能性区域序列。
实施例8 HFn-LFn杂合体构建及亲和力测定
实验材料：
HFn：按实施例1所述方法制备，初始浓度为1.1mg/ml，用100K超滤管浓缩至5.7mg/ml。(缓冲液:1×TBS，20mM Tris-HCl+150mM NaCl pH8.0)
LFn：人L铁蛋白(LFn)的氨基酸序列参见NCBI登录号NP_000137.2，由基因工程手段制备，表达载体为pET30a，表达菌株为大肠杆菌BL21(按常规方法进行)。纯化方案：75℃20min+QFF自装柱(预装柱：GE Healthcare；XK 26/20column。填料：GE Healthcare；17-051001)+Hitrap 16/600Superdex 200pg分子筛纯化。蛋白浓度由BCA试剂盒(Thermoscientific；23250)定量，浓度为4.8mg/ml。(缓冲液:1×TBS，20mM Tris-Hcl+150mM NaClpH8.0)。
实验步骤：
1、混合：将HFn与LFn按照(纯H，11：1，7：1，5：1，3：1，1：1，1：3，1：5，1：7，1：11，纯L)的比例于20mM Tris pH 8.2溶液中进行混合，同时保证混合之后的蛋白浓度皆为1mg/ml(即H与L亚基的摩尔浓度之和约为48uM)。
2、解聚：将上述混合后的样品各取5ml，用0.2M HCl将溶液pH调整为3.0，之后向溶液中加入6.7g Gdn-HCl(盐酸胍)(溶解后约为7M)，将混匀之后的样品溶液(终体积约为10ml)放于37℃混匀仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司；WH-986)上孵育2h。
3、复聚：将上述孵育后的样品用Hitrap 26/10脱盐柱纯化，脱去Gdn-HCl，以使蛋白重新聚合(最终缓冲液:1×TBS，20mM Tris-Hcl+150mM NaCl pH8.0)。
4、蛋白浓度测定：BCA试剂盒测定样品的蛋白浓度。
5、蛋白杂合体纯度鉴定：将杂合之后的样品用4％Native-PAGE进行鉴定，观察杂合后样品中杂合体的纯度和分布情况。
6、蛋白杂合体亚基比例鉴定：将纯度单一的杂合体用12％SDS-PAGE进行鉴定，观察杂合体中的亚基比例。
7、鉴定杂合体与TFR1的亲和力：将上述合成后的杂合体用ELISA的方法鉴定其与TFR1的亲和力。步骤简述如下：①用抗原包被液(0.15M Na2CO3,0.35M NaHCO3,0.03M NaN3)将杂合样品稀释为40ug/ml，100ul/孔加入ELISA板中，4℃孵育过夜。②用5％脱脂牛奶(1×PBS稀释)封闭，300ul/孔，37℃湿盒2h。③用2ug/ml TFR1(北京义翘神州科技有限公司；11020-MM02)(蛋白稳定剂(湖州英创生物科技有限公司；PR-SS-002)稀释)孵育，100ul/孔，37℃湿盒2h。④用1ug/ml anti-TFR1一抗(鼠源，北京义翘神州科技有限公司；11020-MM02蛋白稳定剂稀释)孵育，100ul/孔，37℃湿盒2h。⑤抗小鼠二抗(抗小鼠IgG：(GEHealthcare；NA931V)(HRP偶联稳定剂稀释1:5000)孵育，100ul/孔，37℃湿盒1h。⑥加入TMB一步显色液(湖州英创生物科技有限公司；TMB-S-004)显色，100ul/孔，立即于630nm处测定光吸收值，1min/次，连续测定30min。注意：上述每一步之间都要用1×PBST洗3次，1×PBS洗2次板子。
实验结果与讨论：
1、蛋白杂合体纯度鉴定-Native PAGE，结果见图11。由图11可以看出，不同比例的各杂合体呈比例分布于未经处理的HFn与LFn之间，说明杂合体构建成功。杂合体中未出现纯合体的条带，说明当H亚基与L亚基共存的情况下，更倾向于形成H/L的二聚体或多聚体，而不是H/H或L/L的二聚体或多聚体。杂合条带较为紧凑，未成弥散状，说明杂合体主要以其设定比例的方式存在，而不是各种杂合比例不同的蛋白的组合，进一步说明在复聚的过程中H与L会尽最大可能与彼此杂合，而不是随意的组合，从而只能形成单一的固定比例的杂合体。此外，经裂解重聚处理后，纯H的重聚样品与未经处理的HFn电泳迁移率相同，纯L的重聚样品与未经处理的LFn电泳迁移率相同，说明该变性复性处理未对蛋白的整体结构造成显著影响。
2、蛋白杂合体亚基比例鉴定-SDS PAGE，结果见图12。由图12可以看出，杂合体中的亚基比例与原始设定比例相同，说明杂合体构建成功。
3、鉴定杂合体与TfFR1的亲和力-ELISA，结果见图13的A图和B图。由图13可见，随着杂合体中H亚基比例的升高，杂合体与TfR1的亲和力也随之升高且呈现非线性趋势，说明杂合体与TfR1的亲和力并非单纯取决于H亚基的比例，可能还与其存在形式相关。在H亚基与L亚基的比例从0至1:7的过程中，杂合体对TfR1几乎没有亲和力。而H亚基与L亚基的比例从1:5升至1:1的过程中，杂合体对TfR1的亲和力呈现了明显的上升。而H亚基与L亚基的比例3：1至纯H的过程中，杂合体与TfR1一直维持着较高的亲和力，上升幅度很小。推测除了H亚基在杂合体中的比例外，其亚基间的组合方式(H/H二聚体)可能也在与TfR1的结合过程中发挥着重要的作用。
实施例9 H/L功能区域替换及亲和力测定
尽管人类的H铁蛋白(HFn)和L铁蛋白(LFn)在一级序列上具有极高的同源性，但后者缺乏结合TfR1受体的能力。本实施例试图通过重组DNA技术，以HFn的部分序列替换LFn的相应序列，在大肠杆菌中表达纯化以得到一系列重组嵌合蛋白，之后测试这些蛋白与TfR1受体的亲和力变化来分析HFn上可能与TfR1受体的发生相互作用的区域。亲和力测试的ELISA结果表明HFn的N端可能参与了与TfR1受体的相互作用，同时，环(loop)区对二者的相互作用也有一定的贡献。
1.质粒的转化
1.1取大肠杆菌BL21感受态六管，分别加入1μL(100ng/μL)质粒N-loop-PET22b、C-loop-PET22b、NC-loop-PET22b、N-PET22b、C-PET22b、NC-PET22b(分别用限制性内切酶NdeI和BamH I将编码序列如SEQ ID No.13所示的N-loop、如SEQ ID NO.14所示的C-loop、如SEQID No.15所示的NC-loop、如SEQ ID No.16所示的N末端、如SEQ ID No.17所示的C末端和如SEQ ID No.18所示的NC融合序列的核苷酸序列亚克隆入PET22b质粒后获得，所述核苷酸序列按照大肠杆菌的密码子偏爱性进行优化)，冰浴0.5h。
N-loop：
MSSQIRQNYHQDSEAAVNRQINLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRIFLQDIKKPDCDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHKLATDKNDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGPEAGLGEYLFERLTLKHD(SEQ ID No.13)
C-loop
MSSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRALFQDIKKPDCDEWESGLNAMECALHLEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLRKMGAPEAGLGEYLFERLTLKHD(SEQ ID No.14)
NC-loop
MSSQIRQNYHQDSEAAVNRQINLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRIFLQDIKKPDCDEWESGLNAMECALHLEKKLNQALLDLHKLATDKNDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLRKMGAPEAGLGEYLFERLTLKHD(SEQ ID No.15)
N末端
MSSQIRQNYHQDSEAAVNRQINLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRIFLQDIKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHKLATDKNDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHRLGGPEAGLGEYLFERLTLKHD(SEQ ID No.16)
C末端
MSSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRALFQDIKKPAEDEWESGLNAMECALHLEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLRKMGAPEAGLGEYLFERLTLKHD(SEQ ID No.17)
NC融合
MSSQIRQNYHQDSEAAVNRQINLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRIFLQDIKKPAEDEWESGLNAMECALHLEKKLNQALLDLHKLATDKNDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLRKMGAPEAGLGEYLFERLTLKHD(SEQ ID No.18)
1.2 42℃热击85s，立即冰浴2min。
1.3向管中加入500μL LB培养基，37℃，220rpm震荡培养50min，使大肠杆菌恢复正常的生长状态。
1.4涂LB平板(含有0.1mg/mL的氨苄青霉素)，在37℃培养箱中正放培养1h，倒置培养过夜。
2.蛋白诱导表达
2.1每个平板挑一个单菌落菌，分别置于6mL加有0.1mg/mL氨苄青霉素的培养基中，37℃，220rpm震荡培养12-14h。
2.2分别取750μL培养菌液于750ml LB培养基(含0.1mg/mL氨苄青霉素)中，37℃，220rpm震荡培养12-14h。
2.3加入1mM IPTG诱导6h。
2.4 4000rpm离心30min，收集沉淀。
3.菌体破碎
收集的菌体沉淀重悬于30mL 20mM Tris-HCL pH 8.0中制成菌悬液，搅拌均匀后于高压细胞破碎机(聚能生物；JN-3000)1200巴压力下破碎，重复四次，将收集的破碎菌液在4℃，12000rpm离心30min，收集上清液。
4.热沉淀
将离心后的破碎菌液分装到锥形瓶中，于72℃下水浴15min，期间不断晃动锥形瓶使菌液受热均匀。热沉淀完成后立即置于冰上，待菌液冷却，离心机12000rpm离心10min，收集上清，为粗蛋白液。
5.硫酸盐沉淀
将上步所得粗蛋白液定量，每100mL上清中加入53g硫酸铵，置于4℃冰箱中搅拌2h，4℃12000rpm离心30min，收集沉淀。用30mL 20mM pH 8.2Tris重溶，4℃12000rpm离心30min，将上清用0.22μm滤器过滤。
6.脱盐
层析柱：HiPrep 26|10Desalting脱盐柱
柱体积：50mL
缓冲液：20mM Tris-HCl缓冲液pH 8.0
流速：10mL/min
用缓冲液平衡脱盐柱，待电导率完全平衡后上样，上样体积为10mL，1.5CV(柱体积)缓冲液进行洗脱，A280检测收集高峰物质，用15mL离心管收集，每管10mL。
7.阴离子交换
层析柱：QFastFlow自装柱
柱体积：35mL
缓冲液A:20mM Tris-HCl缓冲液pH 8.0
缓冲液B:20mM Tris-HCl+1M NaCl缓冲液pH 8.0
流速：5mL/min
用缓冲液A平衡阴离子交换柱，待电导率完全平衡后上样，上样体积为50mL，流速为1mL/min，上样完成后用2CV缓冲液A洗柱，15CV缓冲液B 0％-100％线性洗脱。A280检测收集高峰物质，用15mL离心管收集，每管10mL。将过阴离子交换后有目的蛋白的样品进行超滤浓缩，过分子筛进一步纯化。
8.分子筛
层析柱：HiLoad 16/60Superdex 200pg
柱体积：120.637mL
缓冲液A:20mM Tris-HCl缓冲液pH 8.0
流速：1mL/min
用缓冲液A平衡分子筛，待电导率完全平衡后经上样环上样，上样体积为2mL，流速为1mL/min，上样完成后1CV缓冲液A洗脱。A280检测收集高峰物质，用15mL离心管收集，每管2mL。
9.BCA法测定蛋白含量
(测得的纯化后蛋白的浓度)
10.SDS-PAGE
制备12％SDS-PAGE，恒流26mA，时间60min进行电泳。每个样品总蛋白含量5μg，样品100℃煮样10min。结果见图14。
11.ELISA测定六种改造蛋白与TFR1亲和力
蛋白包板浓度20μg/mL，4℃过夜；5％BSA 37℃封闭2h；孵育2μg/mL TfR1(人源，如上)37℃2h；孵育1μg/mL抗TfR1(鼠源，北京义翘神州科技有限公司；11020-MM02)一抗37℃2h；孵育HRP酶标二抗(抗小鼠IgG：(GE Healthcare；NA931V)1：5000)37℃2h；TMB一步显色，酶标仪OD630读数。结果见图15。
12.结论
根据SDS-PAGE和ELISA实验的结果，本发明得出表4所示的数据：
表4
蛋白名称 ELISA数值 目的蛋白纯度 折算后ELISA数值
HFn 0.95 0.95
N-loop 1.17 77.1％ 1.52
C-loop 0.31 43.7％ 0.71
NC-loop 1.23 60.8％ 2.02
N 0.88 67.6％ 1.30
C 0.1 59.6％ 0.17
NC 1.03 90.2％ 1.14
LFn 0.09 0.09
比较折算后N/C/NC/LFn的ELISA数值，发现：C端数值略高于LFn，对TfR1亲和力比较弱，N端数值较高，对TfR1亲和力影响最大。
比较N-loop/C-loop/NC-loop的ELISA数值发现N-loop亲和力明显高于N端亲和力，说明loop在TfR1亲和力方面有一定影响，其中N-loop的亲和力要高于C-loop，说明N端对于与TfR1亲和力影响是最大的。
因此，本发明人认为，每一部分对TfR1亲和力都有影响，N端对TfR1亲和力影响是显著的，loop也有一定的影响，三者的叠加明显具有最高亲和力。这再一次证实了实施例6中获得的功能性片段的效果。
参考文献：
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<110> 中科新蕴生物科技(北京)有限公司
<120> 穿越血脑屏障的纳米药物载体
<160> 31
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gly Gly Arg Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp
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Asn Val Asn Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys
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Asn Asp Pro
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly Ala Pro Glu Ser Gly
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Leu Ala Glu
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Glu Gly Val Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu
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Gly Tyr Glu Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人类(homo sapiens)
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145 150 155 160
Gly Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Thr Leu Lys His Asp
165 170 175
<210> 13
<211> 175
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Met Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp Ser Glu Ala Ala
1 5 10 15
Val Asn Arg Gln Ile Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu
20 25 30
Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu
50 55 60
Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ile Phe Leu Gln
65 70 75 80
Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala
85 90 95
Met Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu
100 105 110
Asp Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro His Leu Cys Asp
115 120 125
Phe Leu Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys
130 135 140
Met Gly Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu Gly Gly Pro Glu Ala
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Gly Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Thr Leu Lys His Asp
165 170 175
<210> 14
<211> 175
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Met Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu Ala Ala
1 5 10 15
Val Asn Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu
20 25 30
Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val
35 40 45
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
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Phe Leu Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys
130 135 140
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Gly Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Thr Leu Lys His Asp
165 170 175
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Met Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp Ser Glu Ala Ala
1 5 10 15
Val Asn Arg Gln Ile Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu
20 25 30
Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val
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Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ile Phe Leu Gln
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Met Thr Thr Ala Ser Thr Gln Ile Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp Ser
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Glu Ala Ala Val Asn Arg Gln Ile Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr
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Thr Tyr Leu Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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Pro Glu Ala Gly Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Thr Leu Lys
165 170 175
His Asp
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Thr Thr Ala Ser Thr
1 5
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1
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Arg Gln Ile
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Ile Phe Leu
1
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Asp Cys
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Gln Ile Arg Gln Asn Tyr
1 5
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Ser Leu Gly Phe Tyr
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Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val Ser His Phe Phe Arg
20 25 30
Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu Arg Leu Leu Lys Met
35 40 45
Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg
50 55
<210> 29
<211> 6
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Gln Asp Ile Lys Lys Pro
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala Met Lys Ala Ala Met Ala Leu
1 5 10 15
Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu Asp Leu His
20 25
<210> 31
<211> 53
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Asp Pro His Leu Cys Asp Phe Leu Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu
1 5 10 15
Val Lys Leu Ile Lys Lys Met Gly Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg
20 25 30
Leu Gly Gly Pro Glu Ala Gly Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu
35 40 45
Thr Leu Lys His Asp
50

Claims (16)

1.一种笼状蛋白，所述笼状蛋白包含多个亚基，所述多个亚基自组装为所述笼状蛋白，其中，所述亚基的序列如SEQ ID No.7或19所示。
2.如权利要求1所述的笼状蛋白，其中所述多个亚基为3-30个亚基。
3.一种人H铁蛋白突变体，其中，所述人H铁蛋白突变体的序列如SEQ ID NO：8或9所示。
4.如权利要求1所述的笼状蛋白，其中，笼状蛋白质具有穿越血脑屏障的能力。
5.如权利要求1或2所述的笼状蛋白，其中，所述笼状蛋白内部包含药物成分，所述药物成分选自烷基化剂、铂类、抗代谢类、肿瘤抗生素类药物、植物碱、抗雌激素类、放射性药物、神经递质类药物、多巴胺受体激动剂、神经中枢抗胆碱药、胆碱受体激动剂类药物、γ分泌酶抑制剂、抗氧剂、麻醉剂。
6.如权利要求5所述的笼状蛋白，其中，所述烷基化剂为亚硝基脲类；所述铂类为顺铂、卡铂；所述抗代谢类为胸苷酸合成酶抑制剂；所述肿瘤抗生素类药物为阿霉素、道诺霉素、柔红霉素；所述植物碱为长春花碱；所述抗雌激素类为他莫替芬；所述放射性药物为64Cu或235U；所述神经递质类药物为碳酰胆碱、阿托品、东莨菪碱、多巴胺；所述多巴胺受体激动剂为溴隐亭、培高利特、阿扑吗啡；所述神经中枢抗胆碱药为苯海索、苯扎托品及丙环定；所述胆碱受体激动剂类药物为毒蕈碱、毛果芸香碱；所述γ分泌酶抑制剂为双氟酮类；所述抗氧剂为褪黑激素；所述麻醉剂为蒽胺。
7.一种药物组合物，其包含权利要求1、2、4至6中任一项所述的笼状蛋白或权利要求3所述的人H铁蛋白突变体，以及药物成分。
8.如权利要求1或2所述的笼状蛋白或权利要求3所述的人H铁蛋白突变体，其用于制备药物载体。
9.如权利要求1、2、4至6中任一项所述的笼状蛋白或权利要求3所述的人H铁蛋白突变体在制备用于治疗或预防疾病的药物载体中的用途。
10.如权利要求1、2、4至6中任一项所述的笼状蛋白或权利要求3所述的人H铁蛋白突变体在制备用于治疗或预防疾病的穿越血脑屏障的药物载体中的用途。
11.如权利要求10所述的用途，其中，所述药物载体还同时靶向脑部病灶或疾病。
12.如权利要求9至11中任一项所述的用途，其中，所述疾病选自脑瘤、阿尔茨海默病、帕金森病、脑卒中、癫痫、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、胃癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、前列腺癌、Hodgkin氏疾病、非Hodgkin氏淋巴癌和白血病中的一种。
13.权利要求1、2、4至6中任一项所述的笼状蛋白或权利要求3所述的人H铁蛋白突变体在制备治疗和/或预防脑部疾病的药物组合物中的用途，所述药物组合物包含所述笼状蛋白或所述人H铁蛋白突变体，以及药物成分。
14.如权利要求13所述的用途，其中，所述脑部疾病选自脑瘤、阿尔茨海默病、帕金森病、脑卒中、癫痫、亨廷顿病及肌萎缩侧索硬化症。
15.如权利要求13所述的用途，其中，所述药物成分选自烷基化剂、铂类、抗代谢类、肿瘤抗生素类药物、植物碱、抗雌激素类、放射性药物、神经递质类药物、多巴胺受体激动剂、神经中枢抗胆碱药、胆碱受体激动剂类药物、γ分泌酶抑制剂、抗氧剂、麻醉剂。
16.如权利要求15所述的用途，其中，所述烷基化剂为亚硝基脲类；所述铂类为顺铂、卡铂及；所述抗代谢类为胸苷酸合成酶抑制剂；所述肿瘤抗生素类药物为阿霉素、道诺霉素、柔红霉素；所述植物碱为长春花碱；所述抗雌激素类为他莫替芬；所述放射性药物为64Cu或235U；所述神经递质类药物为碳酰胆碱、阿托品、东莨菪碱、多巴胺；所述多巴胺受体激动剂为溴隐亭、培高利特、阿扑吗啡；所述神经中枢抗胆碱药为苯海索、苯扎托品及丙环定；所述胆碱受体激动剂类药物为毒蕈碱、毛果芸香碱；所述γ分泌酶抑制剂为双氟酮类；所述抗氧剂为褪黑激素；所述麻醉剂为蒽胺。
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