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CN110331169A - 一种高效快速筛选基因调控区域中功能位点的方法及应用 - Google Patents

一种高效快速筛选基因调控区域中功能位点的方法及应用 Download PDF

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CN110331169A CN201910601762.XA CN201910601762A CN110331169A CN 110331169 A CN110331169 A CN 110331169A CN 201910601762 A CN201910601762 A CN 201910601762A CN 110331169 A CN110331169 A CN 110331169A
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Abstract

本发明公开了一种高效快速筛选基因非编码调控区域中功能位点的方法及应用。本发明将Cre/lox和CRISPR/Cas9技术结合，将体外构建外源突变引入到基因组内，达到原位突变的效果，从而来对基因非编码区域（如增强子等）的功能位点进行高效和快速的筛选。通过CRISPR/Cas9技术在基因组中调控区域引入点突变，虽然可以达到原位突变的效果，但其后期筛选的工作量大，另外有些突变位点的并不适合sgRNA的设计，受PAM序列的区域限制。本发明突破了上述限制，可在基因调控区域内任意位点进行点突变。另外本技术可同时引入两个或多个位点的突变，以及基因调控区域内特定序列的切除，大大降低了基因非编码调控区域研究的难度。

Description

一种高效快速筛选基因调控区域中功能位点的方法及应用
技术领域
本发明属于基因转录水平调控研究领域，更具体地，涉及一种高效快速筛选基因调控区域中功能位点的方法及应用。
背景技术
在基因调控序列的研究中，功能区域（如增强子）的DNA长度一般都在几千碱基左右，有时需要找出确切的功能位点，即集中到几个碱基。为了找出功能位点，需要在基因组引入突变，从而检测该位点的重要性。
传统的方法是将该区域的DNA片段克隆入荧光素酶载体中，通过荧光素酶信号的变化来反应突变位点的重要性，但这种方法只是在体外检测，并未达到原位突变检测的效果。
目前，已有研究报道通过CRISPR/Cas9技术引入特定位点的突变来研究增强子（enhancer）的功能位点，但这项技术存在着一定的缺陷：1. NGG PAM序列的区域限制性，即有些位点的序列不适合用来作为PAM序列，就无法设计sgRNA靶向该位点进行突变。2.CRISPR/Cas9技术存在脱靶性的问题。3. CRISPR/Cas9技术成功率低，只有1%左右。4. 因其成功率低，后期需要大量的筛选工作。这些问题都大大增加了基因调控区域研究的难度。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种高效快速筛选基因调控区域中功能位点的方法。
本发明将Cre/lox和CRISPR/Cas9技术结合，将外源突变引入到基因组内，达到原位突变的效果，从而来对基因非编码区域（如增强子等）的功能位点进行高效和快速的筛选。通过引入抗性基因从而可进行药物筛选，可大大降低单纯通过CRISPR/Cas9引入点突变的筛选的工作量，同时也突破了NGG PAM序列的区域限制性，可在基因调控区域内（即lox位点之间）任意位点进行点突变。另外本技术可同时引入两个或多个位点的突变，以及基因调控区域内特定序列的切除，大大降低了基因调控区域研究的难度。
具体的，本发明是通过以下技术方案实现的：
（1）基因调控序列上游区域和下游区域的克隆
基因调控序列（以增强子enhancer为例，以下同），通过PCR技术将增强子的上游和下游区域约0.3-1kb的区域（如图1）分别克隆出来，用于之后质粒构建。
（2）质粒P、质粒B、质粒-lox-enh-wt、质粒lox-enh-mut的构建（步骤a-c）（质粒具体结构如图2所示）
a）首先将lox位点（lox71和lox2272）分别添加到puromycin/blasticidin-TK融合基因和未突变的增强子（enh-wt）两端；
所述puromycin/blasticidin-TK融合基因包含puromycin/blasticidin（嘌呤霉素/杀稻瘟菌素）抗性基因和胸苷激酶基因（TK自杀基因）。puromycin/blasticidin抗性基因可用于对相应抗性细胞进行筛选（即阳性筛选），TK基因可用于反向筛选。
b）对于质粒P和质粒B来说，还需要将步骤（1）中已克隆的增强子上游区域和下游区域分别插入到已连接lox位点的puromycin/blasticidin-TK融合基因的两端，作为CRISPR/Cas9介导的同源重组的同源DNA片段；
c）以构建好的质粒lox-enh-wt为模板，选取可能的功能位点，通过点突变PCR，获得点突变增强子的质粒，即质粒lox-enh-mut，该质粒可以含一个或多个突变位点。
（3）分别设计靶向增强子起始位点和末端位点的sgRNA-1和sgRNA-2（图3）；将设计好的sgRNA连入px330载体（Cas9和sgRNA表达载体），用于后续的CRISPR/Cas9介导的基因编辑。
（4）通过CRISPR/Cas9和Cre/lox技术的结合来介导基因调控区域的原位点突变；
该步骤为整个方法的核心技术，其设计思路如下（图4）：
首先通过CRISPR/Cas9介导的同源重组，将质粒中同源片段（增强子的上游和下游区域）之间的DNA和基因组中同源片段之间的DNA互换，即将两端有lox位点的puromycin/blasticidin-TK融合基因的外源DNA片段替换基因组中的增强子，从而得到增强子被敲除的基因组同时两个lox位点和抗性基因也随同源重组插入到基因组中。增强子替换后的细胞同时具有puromycin和blasticidin抗性，可通过加入药物puromycin和blasticidin，筛选将替换成功的细胞筛选出来。
然后通过Cre/lox系统，在Cre酶的作用下，将质粒中lox位点之间的未突变性增强子或突变型增强子去替换基因组中相应的lox位点间的puromycin /blasticidin-TK融合基因，未替换成功的细胞因基因组中含有TK自杀基因，加入药物GCV后会被杀死，而替换成功的细胞会存活下来，用于接下来增强子功能位点的筛选。
该步骤具体过程如下（a-f）（图5）：
a）取质粒P、质粒B、px330-sgRNA-1和px330-sgRNA-2各2.5μg，通过lipofectamine3000转染试剂盒转入在6cm培养皿中铺好的细胞内；
b）转染后的细胞放入培养箱内，培养5-7天；
c）往培养基中加入puromycin（4μg/ml）和blasticidin（10μg/ml），筛选具有puromycin和blasticidin抗性的细胞；
d）将抗性细胞以0.5个/孔的浓度稀释到96孔板中，用于阳性单克隆细胞株的培养；
e）设计引物，通过PCR和sanger测序检测出阳性单克隆细胞株（即增强子敲除，同时具有puromycin和blasticidin抗性的细胞株），并将阳性单克隆扩大培养，用于下一步Cre/lox介导的突变型或未突变型增强子替换；
f）用lipofectamine3000转染试剂盒将Cre质粒分别与质粒lox-enh-wt或lox-enh-mut转染入步骤5中筛选出的细胞（相应Cre质粒可从addgene网站上购买，针对不同物种的细胞选用相应的启动子驱动表达的质粒）。经过4-5天的培养，加入药物GCV（5μg/ml）进行5天的筛选，去除含有TK基因的细胞。通过Cre/lox介导的基因重组，从而使质粒中lox71和lox2272之间的未突变性增强子（enh-wt）或突变型增强子（enh-mut）去替换基因组中相应的两个lox位点鉴定puromycin/blasticidin-TK融合基因，而未替换的细胞因为含有TK自杀基因，加入药物GCV后会被杀死，从而构建未突变增强子的细胞株和含突变位点增强子的细胞株。同理，每个突变位点可构建一个相应的细胞株。
（5）提取未突变增强子的细胞株和不同突变位点增强子的细胞株的RNA，用荧光定量PCR去检测增强子所调控的基因在不同细胞株里的表达，基因表达量明显下调的细胞株所对应的位点即为功能性位点，即该位点突变后会导致基因的表达降低。
附图说明
附图1是基因组中调控序列（增强子）示意图。
附图2是需要构建的相关质粒：质粒P、质粒B、质粒-lox-enh-wt、质粒lox-enh-mut的示意图。
附图3是sgRNA设计位点，sgRNA-1位于增强子起始点，sgRNA-2位于增强子终止点。
附图4是. CRISPR/Cas9和Cre/lox结合介导的原位突变的设计思路。
附图5是. 核心步骤4（CRISPR/Cas9和Cre/lox结合介导的原位突变）的主要操作过程。
附图6是.PCR和sanger测序验证增强子enhancer-H的敲除。
附图7是增强子en-H敲除和复原（即通过Cre/lox放回到基因组中）对Ikzf1表达的影响。
附图8是通过qPCR检测不同突变位点对Ikzf1基因表达的影响。
附图 9是通过qPCR和western blot检测A和C位点单独突变和同时突变对Ikzf1基因表达的影响。
本发明的有益效果包括：
（1）本发明将Cre/lox和CRISPR/Cas9技术结合，将外源突变引入到基因组内，达到原位突变的效果，可更准确的检测该位点对所调控基因的影响。
（2）本发明通过引入抗性基因从而可进行药物筛选，可大大降低单纯通过CRISPR/Cas9引入点突变的筛选的工作量，同时也突破了NGG PAM序列的区域限制性，可在基因调控区域内（即lox位点之间）任意位点进行点突变，从而可对基因非编码调控区域（如增强子等）的功能位点进行高效和快速的筛选。
（3）本发明可同时引入两个或多个位点的突变，以及基因调控区域内特定序列的切除，可同时研究两个或多个位点以及某段DNA的在基因转录调控方面的功能，大大降低了基因调控区域研究的难度。
具体实施方式
下面实施例只为进一步说明本发明，不以任何形式限制本发明。
以小鼠的Ikzf1基因为例，增强子enhancer-H已经被鉴定出是Ikzf1基因表达所必需的，其长度大约4kb，位于小鼠基因组的11染色体上，Chr11:11740650-11744587。通过上诉方法找出了增强子enhancer-H上的两个关键的功能位点。
具体研究步骤如下：
（1）通过PCR技术将Ikzf1增强子enhancer-H上游区域1kb （Chr11:11739626-11740650）和下游区域1kb （Chr11:11744587-11745598）的克隆出来；
（2）质粒P、质粒B、质粒-lox-enh-wt、质粒lox-enh-mut的构建（步骤a-c）（质粒具体结构如图2所示）
a）首先将lox位点（lox71和lox2272）分别添加到puromycin/blasticidin-TK融合基因和未突变的增强子（enh-wt）两端；
b）对于质粒P和质粒B来说，还需要将步骤（1）中已克隆的增强子上游区域1kb和下游区域1kb分别插入到已连接lox位点的puromycin/blasticidin-TK融合基因的两端；
c）以构建好的质粒lox-enh-wt为模板，选取可能的功能位点（位点A~R），通过点突变PCR，获得点突变增强子的质粒，即质粒lox-enh-mut，共18个含单个突变位点的质粒。（后续还可构建同时突变两个位点的质粒）
（3）分别设计靶向增强子起始位点和末端位点的sgRNA-1和sgRNA-2（其序列如下表）；将设计好的sgRNA连入px330载体（Cas9和sgRNA表达载体），用于后续的CRISPR/Cas9介导的基因编辑。
（4）通过CRISPR/Cas9和Cre/lox技术的结合来介导基因调控区域的原位点突变；
该步骤具体过程如下（a-f）：
a）取质粒P、质粒B、px330-sgRNA-1和px330-sgRNA-2各2.5μg，通过lipofectamine3000转染试剂盒转入在6cm培养皿中铺好的细胞内；
b）转染后的细胞放入培养箱内，培养5-7天；
c）往培养基中加入puromycin（4μg/ml）和blasticidin（10μg/ml），筛选具有puromycin和blasticidin抗性的细胞；
d）将抗性细胞以0.5个/孔的浓度稀释到96孔板中，用于阳性单克隆细胞株的培养；
e）设计引物，通过PCR和sanger测序检测出阳性单克隆细胞株（即增强子敲除，同时具有puromycin和blasticidin抗性的细胞株），并将阳性单克隆扩大培养，用于下一步Cre/lox介导的突变型或未突变型增强子替换；
f）用lipofectamine3000转染试剂盒将Cre质粒分别与质粒lox-enh-wt或lox-enh-mut转染入步骤5中筛选出的细胞（相应Cre质粒可从addgene网站上购买，针对不同物种的细胞选用相应的启动子驱动表达的质粒）。经过4-5天的培养，加入药物GCV（5μg/ml）进行5天的筛选，去除含有TK基因的细胞。通过Cre/lox介导的基因重组，从而使质粒中lox71和lox2272之间的未突变性增强子（enh-wt）或突变型增强子（enh-mut）去替换基因组中相应的两个lox位点鉴定puromycin/blasticidin-TK融合基因，而未替换的细胞因为含有TK自杀基因，加入药物GCV后会被杀死，从而构建未突变增强子的细胞株和含突变位点增强子的细胞株（A~R共18株含单个突变位点的细胞株）。
（5）提取未突变增强子的细胞株和不同突变位点增强子的细胞株的RNA，用荧光定量PCR去检测增强子所调控的基因在不同细胞株里的表达，基因表达量明显下调的细胞株所对应的位点即为功能性位点，即该位点突变后会导致基因的表达降低。
在小鼠RLM11细胞中通过上述方法将enhancer-H敲除后，并通过PCR及sanger测序验证敲除的效果，其结果如图6，分别lox71和lox2272的结合部位设计引物，将DNA片段1、2和3分别克隆出来，然后进行测序检测。图6（1）位PCR引物设计的位置，图6（2）为PCR的检测结果，在原基因组（wt）中可以检测到enhancer-H（en-H），检测不到DNA片段1、2和3；而在enhancer-H（en-H）敲除后的基因组检测不到enhancer-H，可以检测到三个结合部位DNA片段1、2和3。图6（3）为三个结合部位DNA片段1、2和3的测序结果，进一步确认enhancer-H的敲除和lox位点及puromycin/blasticidin抗性基因的插入。
我们从RNA和蛋白水平检测Ikzf1基因的表达情况，在图7中可以看出，当enhancer-H敲除后（enH-KO），Ikzf1基因表达量明显降低，而后通过Cre/lox将未突变的enhancer-H放回到基因组内（lox-enH(wt)），Ikzf1的表达量有恢复的原来的水平，同时也可以看出lox位点插入基因组增强子的两端内并未对增强子的作用产生影响。
接下来我们lox-enH-wt质粒的基础上构建了含不同突变位点（A~R）的多个质粒，即lox-enh-mut（A~R）通过上述所描述的Cre/lox的方法，我们构建了含不同位点突变的多个细胞株，提取不同细胞株的RNA，然后通过qPCR检测这些细胞株中Ikzf1基因的表达量（如图8），发现A位点和C位点突变后，影响了Ikzf1的表达，下降比较明显，初步认为A位点和C位点为功能性位点，可能是调控Ikzf1基因转录因子结合的位点。如图9所示，之后我们又通过western进一步验证了qPCR的结果，基本一致，同时通过上述方法也可同时构建A和C位点同时突变的细胞株，A和C位点同时突变的细胞株对Ikzf1的表达量影响更大其表达下降的量更多。
在整个过程中所需的引物如下表1、2和3所列出：
表1. QPCR引物
表2. enhancer-H敲除后验证的PCR引物
表3. CRISPR/Cas9 介导的基因编辑的sgRNA引物序列
sgRNA-1 TTCTAGGCTGTTGAGGCCGT
sgRNA-2 GGGAAAGGCCCTCATATCTC
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (3)

1.一种高效快速筛选基因调控区域中功能位点的方法，其特征在于：将Cre/lox和CRISPR/Cas9技术结合，将外源构建的突变引入到基因组内，达到原位突变的效果，同时也可进行多位点同时突变，从而来对基因非编码区域的功能位点进行高效和快速的筛选。
2.根据权利要求1所述的一种高效快速筛选基因调控区域中功能位点的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）基因调控序列上游区域和下游区域的克隆
基因调控序列（以增强子enhancer为例，以下同），通过PCR技术将增强子的上游和下游区域约0.3-1kb的区域（如图1）分别克隆出来，用于之后质粒构建；
（2）质粒P、质粒B、质粒-lox-enh-wt、质粒lox-enh-mut的构建（步骤a-c）（质粒具体结构如图2所示）
a）首先将lox位点（lox71和lox2272）分别添加到puromycin/blasticidin-TK融合基因和未突变的增强子（enh-wt）两端；
所述puromycin/blasticidin-TK融合基因包含puromycin/blasticidin（嘌呤霉素/杀稻瘟菌素）抗性基因和胸苷激酶基因（TK自杀基因）；
puromycin/blasticidin抗性基因可用于对相应抗性细胞进行筛选（即阳性筛选），TK基因可用于反向筛选；
b）对于质粒P和质粒B来说，还需要将步骤（1）中已克隆的增强子上游区域和下游区域分别插入到已连接lox位点的puromycin/blasticidin-TK融合基因的两端，作为CRISPR/Cas9介导的同源重组的同源DNA片段；
c）以构建好的质粒lox-enh-wt为模板，选取可能的功能位点，通过点突变PCR，获得点突变增强子的质粒，即质粒lox-enh-mut，该质粒可以含一个或多个突变位点；
（3）分别设计靶向增强子起始位点和末端位点的sgRNA-1和sgRNA-2（图3）；将设计好的sgRNA连入px330载体（Cas9和sgRNA表达载体），用于后续的CRISPR/Cas9介导的基因编辑；
（4）通过CRISPR/Cas9和Cre/lox技术的结合来介导基因调控区域的原位点突变；
该步骤为整个方法的核心技术，其设计思路如下（图4）：
首先通过CRISPR/Cas9介导的同源重组，将质粒中同源片段（增强子的上游和下游区域）之间的DNA和基因组中同源片段之间的DNA互换，即将两端有lox位点的puromycin/blasticidin-TK融合基因的外源DNA片段替换基因组中的增强子，从而得到增强子被敲除的基因组同时两个lox位点和抗性基因也随同源重组插入到基因组中；
增强子替换后的细胞同时具有puromycin和blasticidin抗性，可通过加入药物puromycin和blasticidin，筛选将替换成功的细胞筛选出来；
然后通过Cre/lox系统，在Cre酶的作用下，将质粒中lox位点之间的未突变性增强子或突变型增强子去替换基因组中相应的lox位点间的puromycin /blasticidin-TK融合基因，未替换成功的细胞因基因组中含有TK自杀基因，加入药物GCV后会被杀死，而替换成功的细胞会存活下来，用于接下来增强子功能位点的筛选；
该步骤具体过程如下（a-f）（图5）：
a）取质粒P、质粒B、px330-sgRNA-1和px330-sgRNA-2各2.5μg，通过lipofectamine3000转染试剂盒转入在6cm培养皿中铺好的细胞内；
b）转染后的细胞放入培养箱内，培养5-7天；
c）往培养基中加入puromycin（4μg/ml）和blasticidin（10μg/ml），筛选具有puromycin和blasticidin抗性的细胞；
d）将抗性细胞以0.5个/孔的浓度稀释到96孔板中，用于阳性单克隆细胞株的培养；
e）设计引物，通过PCR和sanger测序检测出阳性单克隆细胞株（即增强子敲除，同时具有puromycin和blasticidin抗性的细胞株），并将阳性单克隆扩大培养，用于下一步Cre/lox介导的突变型或未突变型增强子替换；
f）用lipofectamine3000转染试剂盒将Cre质粒分别与质粒lox-enh-wt或lox-enh-mut转染入步骤5中筛选出的细胞（相应Cre质粒可从addgene网站上购买，针对不同物种的细胞选用相应的启动子驱动表达的质粒）；
经过4-5天的培养，加入药物GCV（5μg/ml）进行5天的筛选，去除含有TK基因的细胞；
通过Cre/lox介导的基因重组，从而使质粒中lox71和lox2272之间的未突变性增强子（enh-wt）或突变型增强子（enh-mut）去替换基因组中相应的两个lox位点鉴定puromycin/blasticidin-TK融合基因，而未替换的细胞因为含有TK自杀基因，加入药物GCV后会被杀死，从而构建未突变增强子的细胞株和含突变位点增强子的细胞株；
同理，每个突变位点可构建一个相应的细胞株；
（5）提取未突变增强子的细胞株和不同突变位点增强子的细胞株的RNA，用荧光定量PCR去检测增强子所调控的基因在不同细胞株里的表达，基因表达量明显下调的细胞株所对应的位点即为功能性位点，即该位点突变后会导致基因的表达降低。
3.根据权利要求1所述的一种高效快速筛选基因调控区域中功能位点的方法，其特征在于：通过Cre/lox和CRISPR/Cas9技术结合，将体外构建外源突变引入到基因组内，达到原位突变的效果，从而来对基因非编码区域（如增强子等）的功能位点进行高效和快速的筛选，大大降低了基因调控区域研究的难度。
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