CN110327461A

CN110327461A - 一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN110327461A
Application number: CN201910643389.4A
Authority: CN
Inventors: 曹文龙; 孔迪; 滕小锘; 易小萍; 张大鹤
Original assignee: Suzhou Shino Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Suzhou Womei Biology Co ltd
Priority date: 2019-07-17
Filing date: 2019-07-17
Publication date: 2019-10-15
Anticipated expiration: 2039-07-17
Also published as: CN110327461B

Abstract

本发明公开了一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗的制备方法及其应用，其包含：采用SEQID NO:1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的核酸分子或者与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的猪伪狂犬病毒相关蛋白。该疫苗使用真核表达，产品的抗原性、免疫原性与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，保护效果好，对动物没有致病性，并且本发明的疫苗可以通过生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，同时大大降低了疫苗生产成本。

Description

一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于动物疫苗技术领域，尤其涉及一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗的制备方法及其应用。

背景技术

伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PrV)引起的多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。猪是伪狂犬病毒的贮存宿主，病猪、带毒猪以及带毒鼠类为本病重要传染源。该病在猪呈暴发性流行，仔猪和其他易感动物多为急性致死性症状，具有明显的神经症状、死亡率高达100％；成年猪多为隐性感染，表现为繁殖障碍与呼吸道症状，妊娠母猪流产、死胎，公猪不育，育肥猪呼吸困难、生长停滞等，是危害全球养猪业的重大传染病之一。

伪狂犬病病毒属于疱疹病毒科(Herpesviridae)、猪疱疹病毒属，属于双股线性DNA病毒，病毒粒子呈椭圆或圆形外观，主要由3层核衣壳和囊膜组成。在已经发现的PrV11种糖蛋白中，可分为必需糖蛋白(gB、gD、gH和gL蛋白)和非必需糖蛋白(gC、gE、gG、gI、gK、gM和gN蛋白)两大类。gB蛋白是PrV的1个重要囊膜组分和中和抗原，对于其感染必不可少。gB蛋白与gC蛋白形成1种糖蛋白复合物可以介导病毒与肝素样受体的结合。gD蛋白参与病毒穿透过程，同时gD蛋白也是PrV主要的免疫原性蛋白之一，它刺激机体产生的抗gD抗体具有中和保护能力。gH和gL蛋白则是必须糖蛋白的组分。

疫苗接种是预防、控制甚至消灭伪狂犬病的主要措施之一。目前用于预防、控制猪伪狂犬病的疫苗较多都是传统的弱毒苗和灭活疫苗，有少数基因工程亚单位疫苗。但灭活疫苗存在自身免疫保护力较弱，且存在灭活不完全，造成散毒的风险；弱毒活疫苗存在毒株毒力返强的风险；亚单位疫苗存在疫苗生产成本高，免疫原性不及弱毒疫苗及灭活疫苗的问题。

发明内容

本发明旨在提供一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗的制备方法及其应用，以解决现有技术中的问题。

为达到上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种免疫组合物，包含：

采用序列如SEQ ID NO:1所示的核酸分子或者与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的猪伪狂犬病毒gB蛋白；采用序列如SEQ ID NO:3所示的核酸分子或者与SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的猪伪狂犬病毒gC蛋白；采用序列如SEQ ID NO:5所示的核酸分子或者与SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的猪伪狂犬病毒gD蛋白；采用序列如SEQ ID NO:7所示的核酸分子或者与SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的猪伪狂犬病毒gH蛋白；采用序列如SEQ ID NO:9所示的核酸分子或者与SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的猪伪狂犬病毒gL蛋白。

本发明进一步的技术方案是：所述的猪伪狂犬病毒gB蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；所述的猪伪狂犬病毒gC蛋白包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:4的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；所述的猪伪狂犬病毒gD蛋白包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:6的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；所述的猪伪狂犬病毒gH蛋白包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:8的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；所述的猪伪狂犬病毒gL蛋白包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或者与SEQID NO:10的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。

本发明的另一目的在于提供一种所述的免疫组合物用于生产用于在受试动物中诱导针对猪伪狂犬病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。

本发明的又一目的在于提供一种所述的免疫组合物用于生产用于预防动物受猪伪狂犬病毒感染的药剂的用途。

本发明还提供了一种免疫组合物的制备方法，包括以下步骤：

S1、将密码子优化后的猪伪狂犬病毒gB、gC、gD、gH、gL蛋白编码基因分别克隆到对应的真核表达载体中，得到与猪伪狂犬病毒gB、gC、gD、gH、gL蛋白编码基因对应的重组质粒载体；

S2、将所述重组质粒载体分别转染CHO细胞，通过培养、筛选、驯化分别得到对应的悬浮稳定高度表达的CHO细胞株；

S3、对S2步骤中的CHO细胞株进行发酵培养，纯化后得到对应的重组猪伪狂犬病毒gB、gC、gD、gH、gL蛋白；

S4、将S3步骤中重组猪伪狂犬病毒gB、gC、gD、gH、gL蛋白混合后加入到佐剂中，即得所述免疫组合物。

本发明还提供了一种蛋白组合物，其选自由以下组成的组：SEQ ID NO:2的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；SEQ ID NO:4的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:4的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；SEQ ID NO:6的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:6的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；SEQ IDNO:8的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:8的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；SEQID NO:10的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:10的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。

本发明的另一目的在于提供一种所述的蛋白组合物用于生产用于预防动物受猪伪狂犬病毒感染的药剂的用途。

本发明的另一目的在于提供蛋白组合物用于生产用于检测猪伪狂犬病毒相关诊断试剂的用途。

本发明解决了背景技术中存在的缺陷，本发明公开了一种CHO细胞表达的猪伪狂犬病毒重组亚单位疫苗的制备方法和应用，并证明该疫苗能够在动物体内产生较强的体液免疫，免疫后的动物能够抵御PrV感染，属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域，其目的在于提供一种免疫效果好、工艺更安全的猪伪狂犬病病毒基因工程亚单位疫苗，其目的还在于提供一种可大规模工业化生产的猪伪狂犬病毒重组亚单位疫苗的制备方法。本发明使用CHO细胞表达重组猪伪狂犬病病毒gB、gC、gD、gH、gL蛋白，生产过程不涉及全病毒培养，通过CHO细胞进行蛋白表达，产品的抗原性、免疫原性与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，表达糖基化修饰完善，最接近本身蛋白分子。对动物没有致病性，并且本发明的疫苗可以通过生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，大大降低了疫苗生产成本。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明；

图1为单个gB目的基因进行PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳结果，在2.3kbp附近的位置出现目的条带：1为目的基因，2为阴性对照，M为Marker；

图2为多个gB基因转化的菌落样品的PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，出现2.3kbp附近条带的样品为阳性样品：1至5为目的基因扩增，6为阴性对照；M为Marker；

图3为构建好的pCI-gB-GS载体图谱；

图4为单个gC目的基因进行PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳结果，在1.4kbp附近的位置出现目的条带：1为目的基因，2为阴性对照，M为Marker；

图5为多个gB基因转化的菌落样品的PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，出现1.4kbp附近条带的样品为阳性样品：1至5为目的基因扩增，6为阴性对照；M为Marker；

图6为构建好的pCI-gC-GS载体图谱；

图7为单个gD目的进行基因PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳结果，在1.1kbp附近的位置出现目的条带：1为目的基因，2为阴性对照，M为Marker；

图8为多个gD基因转化的菌落样品进行PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，出现1.1kbp附近条带的样品为阳性样品：1至5为目的基因扩增，6为阴性对照；M为Marker；

图9为构建好的pCI-gD-GS载体图谱；

图10为单个gH目的基因进行PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳结果，在2.0kbp附近的位置出现目的条带：1为目的基因，2为阴性对照，M为Marker；

图11为多个gH基因转化的菌落样品的PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，出现2.0kbp附近条带的样品为阳性样品：1至5为目的基因扩增，6为阴性对照；M为Marker；

图12为构建好的pCI-gH-GS载体图谱；

图13为单个gL目的基因进行PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳结果，在0.5kbp附近的位置出现目的条带：1为目的基因，2为阴性对照，M为Marker；

图14为多个gL基因转化的菌落样品的PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，出现0.5kbp附近条带的样品为阳性样品：1至5为目的基因扩增，6为阴性对照；M为Marker；

图15为构建好的pCI-gL-GS载体图谱；

图16为表达gB蛋白的细胞培养物进行SDS-PAGE凝胶电泳的结果：1为单独表达gB蛋白的细胞培养物上清，2为阴性对照，M为分子量标记；

图17为表达gC蛋白的细胞培养物进行SDS-PAGE凝胶电泳的结果：1为单独表达gC蛋白的细胞培养物上清，2为阴性，M为分子量标记；

图18为表达gD蛋白的细胞培养物进行SDS-PAGE凝胶电泳的结果：1为单独表达gD蛋白的细胞培养物上清，2为阴性，M为分子量标记；

图19为表达gH蛋白的细胞培养物进行SDS-PAGE凝胶电泳的结果：1为单独表达gH蛋白的细胞培养物上清，2为阴性，M为分子量标记；

图20为表达gL蛋白的细胞培养物进行SDS-PAGE凝胶电泳的结果：1为单独表达gL蛋白的细胞培养物上清，2为阴性，M为分子量标记；

图21为单独表达gB蛋白的重组CHO细胞培养物上清Western Blot检测结果：其中1为单独表达gB蛋白的重组CHO细胞培养物上清；2为阴性对照；M为分子量标记；

图22-图25分别为单独表达gC蛋白、gD蛋白、gH蛋白、gL蛋白的重组CHO细胞培养物上清Western Blot检测结果：1为重组CHO细胞培养物上清，2为阴性对照，M为分子量标记；

图26-图30分别为重组gB蛋白、重组gC蛋白、重组gD蛋白、重组gH蛋白、重组gL蛋白纯化后的结果；

图31为免疫实验结果。

具体实施方式

现在结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

本发明中gB、gC、gD、gH、gL蛋白序列可以是原始序列，增加以及截短的序列，使用真核表达载体pSV2-GS，pCI-GS，pcDNA4-GS，优选的用pCI-GS；CHO细胞系可以是为DG44，DXB11，CHO-K1，CHO-S细胞株，优选的CHO-S；佐剂选自MONTANIDE ISA 15、MONTANIDE ISA206VG、MONTANIDE GEL 01的一种或者两种以上的组合。

实施例1：重组真核表达载体pCI-gB-GS的构建

1.1、pUC-S1质粒载体的构建

密码子优化的gB基因来自南京金斯瑞生物科技有限公司，优化后的gB基因序列如SEQ ID NO:1所示。本实施例中，克隆步骤均采用的大肠杆菌克隆质粒载体优选pUC-57，将密码子优化的gB基因克隆到pUC-57载体上，构建了pUC-gB质粒载体。

1.2、gB基因扩增

以pUC-gB作为模板，gB-F、gB-R作为引物进行PCR扩增(其中gB-F的基因序列如SEQID NO.11所示，gB-R的基因序列如SEQ ID NO.12所示)，扩增体系见表1。反应条件为：94℃预变性5分钟；95℃变性45秒，60℃复性45秒，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸10分钟，4℃保藏。

表1 gB基因扩增体系

将PCR产物进行凝胶电泳鉴定目的基因大小，如图1所示，在2.3kbp的位置出现条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。

1.3、酶切

表达载体可以是pCI-DHFR或pSV2-DHFR或pcDNA4-D或pCI-GS,本实施例中选用表达载体pCI-GS，将pCI-GS质粒和纯化后的gB基因PCR产物分别使用XhoⅠ、KpnⅠ37℃酶切3小时，反应体系见表2、表3。酶切产物凝胶电泳后分别回收，用凝胶回收纯化试剂盒进行纯化。

表2 gB基因酶切反应体系

表3 pCI-GS质粒酶切反应体系

1.4、连接

将酶切过的pCI-GS质粒和gB基因酶切产物使用T4DNA连接酶16℃水浴连接过夜，连接体系见表4。

表4 gB基因与pCI-GS质粒连接体系

1.5、转化

取10μl连接产物加入100μl的DH5α感受态细胞，混匀，42℃热休克90秒，冰浴2分钟，加入900μl不含Amp的LB培养基，37℃培养1小时。取1.0ml菌液离心浓缩成100μl涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。

1.6、菌落PCR和测序鉴定

挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，gB-F和gB-R作为引物进行菌落PCR。将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图2所示，出现2.3kbp条带的样品为阳性样品。将菌落PCR鉴定阳性的菌液送测序公司测序，选择测序正确的菌液进行保存，得到真核表达载体pCI-gB-GS。构建好的pCI-gB-GS载体图谱如图3所示。

重组真核表达载体pCI-gC-GS、pCI-gD-GS、pCI-gH-GS和pCI-gL-GS按照本实施例步骤依次构建，其中引物gC-F的基因序列如SEQ ID NO.13所示、引物gC-R的基因序列如SEQID NO.14所示，构建好的pCI-gC-GS载体图谱如图6所示；引物gD-F的基因序列如SEQ IDNO.15所示、引物gD-R的基因序列如SEQ ID NO.16所示，构建好的pCI-gD-GS载体图谱如图9所示；引物gH-F的基因序列如SEQ ID NO.17所示、引物gH-R的基因序列如SEQ ID NO.18所示，构建好的pCI-gH-GS载体图谱如图12所示；引物gL-F的基因序列如SEQ ID NO.19所示，引物gL-R的基因序列如SEQ ID NO.20所示，构建好的pCI-gL-GS载体图谱如图15所示。

实施例2：重组CHO细胞的构建与筛选

1.细胞转染

1.1、准备细胞取对数生长期的CHO细胞，CHO细胞可以使CHO-DG44细胞或CHO-DXB11细胞或CHO-K1细胞或CHO-S细胞，本实施例中选用CHO-S细胞，取样计数，以1×10⁶cells/ml的细胞密度继续传代，维持种子，剩余细胞离心，1000rpm离心4分钟后，弃上清，用20ml左右的新鲜CHO-WM培养基重悬，再次离心，1000rpm离心4分钟，弃上清后用少量培养基重悬计数，最终将细胞密度调整为1.43×10⁷cells/ml。

1.2、质粒与细胞混合取实施例1中步骤1.6所得的pCI-gB-GS质粒载体5μg，加入至EP管中，添加0.7ml细胞，混合均匀后，静置15分钟。

1.3、电转280V 20ms电击2个脉冲，电击完成后，立刻将细胞转入至摇瓶中，悬浮培养，48h后观察细胞状态，换液培养，等细胞密度生长到0.6×10⁶cells/ml时，添加50μM MSX(L-methionine sulphoximine)加压筛选。

2.单克隆筛选

2.1、用苏州沃美生物技术有限公司的CHO细胞无血清无蛋白培养基CHO-WM细胞培养基+50μM MSX重新悬浮细胞，计数。

2.2、铺板稀释细胞至5个/mL，取200μl混匀的细胞加入到96孔板中，放置到37℃，5％CO₂细胞培养箱中孵育4-6h。记录单个细胞的孔。

2.3、待96孔板中单个细胞的孔长起来时，弃掉培养基，PBS洗一次，100μl 0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2mL CHO-WM培养基(含10％FBS+50μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将细胞转移至12孔板，待12孔板长满时，取上清，Elisa检测克隆是否为阳性，高效表达的阳性克隆继续扩大培养，冻存。

3.细胞摇瓶发酵

3.1、传代培养基的配置：使用CHO-WM培养基添加50μM MSX作为传代培养基，置于37℃水浴锅总预热至37℃。

3.2、从CO₂恒温摇床取出摇瓶细胞，进行计数。

3.3、稀释细胞至2.5-3.5×10⁵个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO₂恒温摇床中100rpm/min孵育过夜。

3.4、每隔24h计数细胞密度以及活力，测葡萄糖，当糖低于2g/L的时候，添加葡萄糖到4g/L；每天取1mL样品，上清用于检测蛋白表达情况。

以同样的方法对所得的pCI-gC-GS、pCI-gD-GS、pCI-gH-GS和pCI-gL-GS载体进行重组CHO细胞的构建与筛选的操作。

实施例3：SDS-PAGE检测

分别将收获的细胞培养物上清进行SDS-PAGE检测，同时使用空的CHO细胞作为阴性对照。具体操作如下：取40μl收获的细胞培养物，加入10μl的5×loading buffer，沸水浴5分钟，12000r/min离心1分钟，取上清进行SDS-PAGE凝胶(12％浓度凝胶)电泳，电泳后取凝胶经染色、脱色后观察目的条带。

所得表达gB蛋白的细胞培养物检测结果如图16所示，在分子量约90kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。

所得表达gC蛋白的细胞培养物检测结果如图17所示，在分子量约50kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。

所得表达gD蛋白的细胞培养物检测结果如图18所示，在分子量约50kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。

所得表达gH蛋白的细胞培养物检测结果如图19所示，在分子量约100kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。

所得表达gL蛋白的细胞培养物检测结果如图20所示，在分子量约18kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。

实施例4：Western Blot检测

分别将实施例3中SDS-PAGE电泳后的产物转印到NC(硝酸纤维素)膜上，用5％脱脂牛奶封闭2小时，猪源抗PrV多抗血清孵育2小时，漂洗，HRP标记的羊抗猪多克隆抗体二抗孵育2小时，漂洗，然后滴加增强型化学发光荧光底物，使用化学发光成像仪拍照。如图21-25所示，图中重组CHO上清样品有细胞条带，阴性对照没有目的条带，说明目的抗原蛋白在重组CHO细胞中得到正确表达。

实施例5：蛋白纯化

由于目的蛋白含有his标签，使用镍柱亲和层析纯化目的蛋白。按照以下步骤分别纯化五种目的蛋白。

1.Ni柱的再生和平衡：

1.1、0.5mol/L的NaOH反向冲洗Ni柱10min，冲洗结束后，用超纯水正向冲洗。

1.2、50mol/L的NiSO₄冲洗5柱体积。结束后，用超纯水正向冲洗。

1.3、用含有300mM咪唑PBS(pH＝7.4)缓冲液冲洗3个柱体积后继续用PBS缓冲液冲洗平衡5个柱体积。

2.Ni纯化过程:

PBS平衡Ni柱后，取培养的上清上样，上样结束后用PBS洗涤5个柱体积至基线平衡。然后分别使用含有30mM和150mM咪唑的PBS进行洗脱。

结果如图26-30所示，在150mM咪唑浓度的PBS溶液中洗脱出目的蛋白。

实施例6：猪伪狂犬病病毒重组亚单位疫苗制备

分别将适量纯化的猪伪狂犬病病毒重组gB蛋白、重组gC蛋白、重组gD蛋白、重组gH蛋白、重组gL蛋白混合后加入到MONTANIDE ISA 206VG佐剂中(蛋白混合物与佐剂的体积比为1:1)，使混合蛋白终浓度为100μg/mL，乳化，质检合格后置于4℃保存。佐剂可以是MONTANIDE ISA 15、MONTANIDE ISA 206VG、MONTANIDE GEL 01中的一种或任意两种的组合或三种的组合，本实施例中选取MONTANIDE ISA 206VG一种作为佐剂。

实施例7：猪伪狂犬病病毒重组亚单位疫苗的免疫实验

1.血清中和抗体检测

取PrV中和抗体效价≤1:4的仔猪16头，随机分为疫苗组与对照组，每组8头。疫苗组接种成品亚单位疫苗2mL，对照组注射同样体积的生理盐水，于免疫后14日采血，用中和试验法检测血清中和抗体。疫苗组8头仔猪有8头血清阳转，猪伪狂犬病毒中和抗体效价≥1:32。阴性对照组8头仔猪都为PrV抗体阴性，猪伪狂犬病毒中和抗体效价≤1:4。

2.免疫攻毒

上述两组16头仔猪，于免疫后28日，各滴鼻攻击PrVFa株病毒液1ml(10⁶PFU)，观察7日，对照组8头均发病，均观察到有消瘦和明显的呼吸症状、耳皮下毛细血管出血；其中6头横卧于地，做“划船”动作，角弓反张；观察7天内有4头死亡。疫苗组全部存活，未观察到明显病状，仔猪正常生长，说明产品合格。解剖对照组和免疫组猪，可以发现对照组猪有肺出血、角弓反张、肝脏表面有散在坏死点、肾弥漫性淤血点(图31所示)，免疫组猪解剖正常。

以上依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定。

序列表

<110> 苏州世诺生物技术有限公司

<120> 一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗的制备方法及其应用

<130> 11

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2325

<212> DNA

<213> 人工序列(人工合成)

<400> 1

aagcttgccg ccaccatgga aacagataca ctcctcctct gggtgctgct cctctgggtg 60

ccaggatcta caggagccgt gacaagggct gctagcgctt cccccgcccc cggcaccggc 120

gctacacctg acggcttctc cgccgaggaa agcctggaag agatcgacgg cgccgtgagc 180

cctggccctt ccgacgcccc cgatggagag tatggagacc tggacgctag gaccgctgtg 240

agggctgccg ccaccgagcg ggacaggttt tatgtgtgcc ctcctcctag cggcagcacc 300

gtcgtgaggc tcgaacctga gcaagcctgc cccgaatact cccagggaag gaacttcaca 360

gagggcatcg ccgtgctctt caaggagaac atcgcccccc acaaattcaa ggcccacatt 420

tattacaaga acgtgatcgt gacaacagtg tggagcggtt ctacctacgc cgccattacc 480

aataggttca cagacagggt gcctgtgcct gtccaggaaa ttaccgacgt gattgacagg 540

aggggcaagt gtgtcagcaa ggccgagtac gtgaggaaca accacaaagt caccgccttc 600

gacagggacg aaaaccccgt ggaagtcgac ctcaggccta gcaggctcaa cgccctggga 660

accaggggct ggcataccac caacgatacc tataccaaga tcggcgctgc tggcttttat 720

cacaccggca catccgtgaa ctgcatcgtg gaagaagtgg aggctaggtc cgtgtacccc 780

tatgactcct tcgctctgtc caccggagac atcgtgtaca tgagcccctt ctatggactg 840

agggaaggag cccatggcga acatatcggc tacgcccctg gcaggttcca acaggtggag 900

cattactacc ccattgacct ggacagccgg ctgagggctt ccgagtccgt gacaaggaat 960

ttcctgagga cccctcactt caccgtggcc tgggactggg cccccaagac caggagggtg 1020

tgttccctcg ccaaatggcg ggaagccgag gaaatgatca gggacgagac ccgggacggt 1080

tcttttaggt tcaccagcag ggccctggga gctagctttg tgtccgatgt gacccagctg 1140

gacctccagc gggtccacct gggagactgt gtgctgcggg aggcttccga ggctatcgac 1200

gccatttaca ggcggcggta caataacaca cacgtgctcg ccggagataa gcctgaagtg 1260

tatctggcca ggggcggctt tgtggtggcc tttcggcctc tgatctccaa cgagctggct 1320

cagctgtacg ccagggaact ggagaggctg ggcctggccg gagtggtggg ccccgcctcc 1380

cccgccgccg ccaggcgggc caggcggtcc cccggacctg ccggaacacc tgagcctccc 1440

gccgtgaacg gcacaggaca cctgaggatt accaccggtt ctgctgagtt cgctcggctg 1500

cagttcacct acgaccacat ccaggctcac gtgaatgaca tgctgagcag gattgccgct 1560

gcctggtgcg agctccagaa taaggatcgg accctctggg gcgagatgtc caggctcaat 1620

ccctccgccg tggccacagc tgctctgggc caaagggtca gcgccaggat gctgggcgac 1680

gtgatggcca tctccaggtg tgtcgaggtc cggggaggag tgtacgtgca aaatagcatg 1740

cgggtgcccg gagaacgggg cacatgctat agccggcccc tggtcacctt cgaacacaac 1800

ggcaccggcg tcattgaggg acagctcggc gacgacaacg agctgctgat cagcagggac 1860

ctgatcgagc cctgcaccgg caaccacagg cggtacttca agctgggcgg cggctatgtg 1920

tactacgaag actattccta tgtccggatg gtcgaggtgc ccgaaaccat ttccacacgg 1980

gtgaccctga acctcacact gctggaggac agggagttcc tgcccctgga ggtctacacc 2040

cgggaggagc tggctgacac cggcctcctc gactacagcg agattcagag gaggaaccaa 2100

ctgcacgccc tcaaattcta cgacattgac agggtggtga aggtcgacca caacgtggtg 2160

ctcctgaggg gcatcgccaa cttctttcaa ggcctgggcg atgtgggcgc tgccgtcgga 2220

aaagtggtgc tgggcgctac cggagctgtc atcagcgccg tgggaggaat ggtgtccttc 2280

ctgtccaacc cctttcatca ccatcaccat cactgatgag aattc 2325

<210> 2

<211> 766

<212> PRT

<213> 人工序列(人工合成)

<400> 2

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Ala Val Thr Arg Ala Ala Ser Ala Ser Pro Ala Pro

20 25 30

Gly Thr Gly Ala Thr Pro Asp Gly Phe Ser Ala Glu Glu Ser Leu Glu

35 40 45

Glu Ile Asp Gly Ala Val Ser Pro Gly Pro Ser Asp Ala Pro Asp Gly

50 55 60

Glu Tyr Gly Asp Leu Asp Ala Arg Thr Ala Val Arg Ala Ala Ala Thr

65 70 75 80

Glu Arg Asp Arg Phe Tyr Val Cys Pro Pro Pro Ser Gly Ser Thr Val

85 90 95

Val Arg Leu Glu Pro Glu Gln Ala Cys Pro Glu Tyr Ser Gln Gly Arg

100 105 110

Asn Phe Thr Glu Gly Ile Ala Val Leu Phe Lys Glu Asn Ile Ala Pro

115 120 125

His Lys Phe Lys Ala His Ile Tyr Tyr Lys Asn Val Ile Val Thr Thr

130 135 140

Val Trp Ser Gly Ser Thr Tyr Ala Ala Ile Thr Asn Arg Phe Thr Asp

145 150 155 160

Arg Val Pro Val Pro Val Gln Glu Ile Thr Asp Val Ile Asp Arg Arg

165 170 175

Gly Lys Cys Val Ser Lys Ala Glu Tyr Val Arg Asn Asn His Lys Val

180 185 190

Thr Ala Phe Asp Arg Asp Glu Asn Pro Val Glu Val Asp Leu Arg Pro

195 200 205

Ser Arg Leu Asn Ala Leu Gly Thr Arg Gly Trp His Thr Thr Asn Asp

210 215 220

Thr Tyr Thr Lys Ile Gly Ala Ala Gly Phe Tyr His Thr Gly Thr Ser

225 230 235 240

Val Asn Cys Ile Val Glu Glu Val Glu Ala Arg Ser Val Tyr Pro Tyr

245 250 255

Asp Ser Phe Ala Leu Ser Thr Gly Asp Ile Val Tyr Met Ser Pro Phe

260 265 270

Tyr Gly Leu Arg Glu Gly Ala His Gly Glu His Ile Gly Tyr Ala Pro

275 280 285

Gly Arg Phe Gln Gln Val Glu His Tyr Tyr Pro Ile Asp Leu Asp Ser

290 295 300

Arg Leu Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Arg Asn Phe Leu Arg Thr Pro

305 310 315 320

His Phe Thr Val Ala Trp Asp Trp Ala Pro Lys Thr Arg Arg Val Cys

325 330 335

Ser Leu Ala Lys Trp Arg Glu Ala Glu Glu Met Ile Arg Asp Glu Thr

340 345 350

Arg Asp Gly Ser Phe Arg Phe Thr Ser Arg Ala Leu Gly Ala Ser Phe

355 360 365

Val Ser Asp Val Thr Gln Leu Asp Leu Gln Arg Val His Leu Gly Asp

370 375 380

Cys Val Leu Arg Glu Ala Ser Glu Ala Ile Asp Ala Ile Tyr Arg Arg

385 390 395 400

Arg Tyr Asn Asn Thr His Val Leu Ala Gly Asp Lys Pro Glu Val Tyr

405 410 415

Leu Ala Arg Gly Gly Phe Val Val Ala Phe Arg Pro Leu Ile Ser Asn

420 425 430

Glu Leu Ala Gln Leu Tyr Ala Arg Glu Leu Glu Arg Leu Gly Leu Ala

435 440 445

Gly Val Val Gly Pro Ala Ser Pro Ala Ala Ala Arg Arg Ala Arg Arg

450 455 460

Ser Pro Gly Pro Ala Gly Thr Pro Glu Pro Pro Ala Val Asn Gly Thr

465 470 475 480

Gly His Leu Arg Ile Thr Thr Gly Ser Ala Glu Phe Ala Arg Leu Gln

485 490 495

Phe Thr Tyr Asp His Ile Gln Ala His Val Asn Asp Met Leu Ser Arg

500 505 510

Ile Ala Ala Ala Trp Cys Glu Leu Gln Asn Lys Asp Arg Thr Leu Trp

515 520 525

Gly Glu Met Ser Arg Leu Asn Pro Ser Ala Val Ala Thr Ala Ala Leu

530 535 540

Gly Gln Arg Val Ser Ala Arg Met Leu Gly Asp Val Met Ala Ile Ser

545 550 555 560

Arg Cys Val Glu Val Arg Gly Gly Val Tyr Val Gln Asn Ser Met Arg

565 570 575

Val Pro Gly Glu Arg Gly Thr Cys Tyr Ser Arg Pro Leu Val Thr Phe

580 585 590

Glu His Asn Gly Thr Gly Val Ile Glu Gly Gln Leu Gly Asp Asp Asn

595 600 605

Glu Leu Leu Ile Ser Arg Asp Leu Ile Glu Pro Cys Thr Gly Asn His

610 615 620

Arg Arg Tyr Phe Lys Leu Gly Gly Gly Tyr Val Tyr Tyr Glu Asp Tyr

625 630 635 640

Ser Tyr Val Arg Met Val Glu Val Pro Glu Thr Ile Ser Thr Arg Val

645 650 655

Thr Leu Asn Leu Thr Leu Leu Glu Asp Arg Glu Phe Leu Pro Leu Glu

660 665 670

Val Tyr Thr Arg Glu Glu Leu Ala Asp Thr Gly Leu Leu Asp Tyr Ser

675 680 685

Glu Ile Gln Arg Arg Asn Gln Leu His Ala Leu Lys Phe Tyr Asp Ile

690 695 700

Asp Arg Val Val Lys Val Asp His Asn Val Val Leu Leu Arg Gly Ile

705 710 715 720

Ala Asn Phe Phe Gln Gly Leu Gly Asp Val Gly Ala Ala Val Gly Lys

725 730 735

Val Val Leu Gly Ala Thr Gly Ala Val Ile Ser Ala Val Gly Gly Met

740 745 750

Val Ser Phe Leu Ser Asn Pro Phe His His His His His His

755 760 765

<210> 3

<211> 1422

<212> DNA

<213> 人工序列(人工合成)

<400> 3

aagcttgccg ccaccatgga aacagataca ctcctcctct gggtgctgct cctctgggtg 60

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aacgtgtccc tggtcctgta ccaccagccc gagttcggcc tgagcgctcc tcccgtgctg 780

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cggctgaggt ggttcgctga cgagcatccc gtggacgctg ccttcgtgac caatagcacc 900

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cacctgggag cctgcgctga acaccctgga ctcctgaacg tgcggtccgc taggcccctg 1260

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cctatcttcg aggacacaca gaggtacgac gcctccccca catccgtgtc ctggcctgtc 1380

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<210> 4

<211> 465

<212> PRT

<213> 人工序列(人工合成)

<400> 4

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Ala Ala Pro Ser Ser Thr Thr Ala Leu Gly Thr Thr

20 25 30

Pro Asn Gly Gly Gly Gly Gly Asn Ser Ser Ala Gly Glu Leu Ser Pro

35 40 45

Ser Pro Pro Ser Thr Pro Glu Pro Val Ser Gly Thr Thr Gly Ala Ala

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Ala Ser Thr Pro Ala Ala Val Ser Thr Pro Arg Val Pro Pro Pro Ser

65 70 75 80

Val Ser Arg Arg Lys Pro Gln Arg Asn Gly Asn Arg Thr Arg Val His

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Val Val Pro Arg Ala Gly Glu Thr Phe Glu Val Arg Phe Cys Arg Arg

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Gly Arg Phe Arg Ser Pro Asp Ala Asp Pro Glu Tyr Phe Asp Glu Pro

145 150 155 160

Pro Arg Pro Glu Leu Pro Arg Glu Arg Leu Leu Phe Ser Ser Ala Asn

165 170 175

Ala Ser Leu Ala His Ala Asp Ala Leu Ala Ser Ala Val Val Val Glu

180 185 190

Gly Glu Arg Ala Thr Val Ala Asn Val Ser Gly Glu Val Ser Val Arg

195 200 205

Val Ala Ala Ala Asp Ala Glu Thr Glu Gly Val Tyr Thr Trp Arg Val

210 215 220

Leu Ser Ala Asn Gly Thr Glu Val Arg Ser Ala Asn Val Ser Leu Val

225 230 235 240

Leu Tyr His Gln Pro Glu Phe Gly Leu Ser Ala Pro Pro Val Leu Phe

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Arg Ser Val Arg Leu Arg Trp Phe Ala Asp Glu His Pro Val Asp Ala

275 280 285

Ala Phe Val Thr Asn Ser Thr Val Ala Asp Glu Leu Gly Arg Arg Thr

290 295 300

Arg Val Ser Val Val Asn Val Thr Arg Ala Asp Val Pro Gly Leu Ala

305 310 315 320

Ala Ala Asp Asp Ala Asp Ala Leu Ala Pro Ser Leu Arg Cys Glu Ala

325 330 335

Val Trp Tyr Arg Asp Ser Val Ala Ser Gln Arg Phe Ser Glu Ala Leu

340 345 350

Arg Pro His Val Tyr His Pro Ala Ala Val Ser Val Arg Phe Val Glu

355 360 365

Gly Phe Ala Val Cys Asp Gly Leu Cys Val Pro Pro Glu Ala Arg Leu

370 375 380

Ala Trp Ser Asp His Ala Ala Asp Thr Val Tyr His Leu Gly Ala Cys

385 390 395 400

Ala Glu His Pro Gly Leu Leu Asn Val Arg Ser Ala Arg Pro Leu Ser

405 410 415

Asp Leu Asp Gly Pro Val Asp Tyr Thr Cys Arg Leu Glu Gly Met Pro

420 425 430

Ser Gln Leu Pro Ile Phe Glu Asp Thr Gln Arg Tyr Asp Ala Ser Pro

435 440 445

Thr Ser Val Ser Trp Pro Val Val Thr Ser Met His His His His His

450 455 460

His

465

<210> 5

<211> 1113

<212> DNA

<213> 人工序列(人工合成)

<400> 5

aagcttgccg ccaccatgga aacagataca ctcctcctct gggtgctgct cctctgggtg 60

ccaggatcta caggagccga tgtggatgcc gtgcctgccc ctacatttcc ccctcccgct 120

tacccctata ccgagagctg gcagctgacc ctcaccacag tccccagccc tttcgtcggc 180

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<210> 6

<211> 362

<212> PRT

<213> 人工序列(人工合成)

<400> 6

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Ala Asp Val Asp Ala Val Pro Ala Pro Thr Phe Pro

20 25 30

Pro Pro Ala Tyr Pro Tyr Thr Glu Ser Trp Gln Leu Thr Leu Thr Thr

35 40 45

Val Pro Ser Pro Phe Val Gly Pro Ala Asp Val Tyr His Thr Arg Pro

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Leu Glu Asp Pro Cys Gly Val Val Ala Leu Ile Ser Asp Pro Gln Val

65 70 75 80

Asp Arg Leu Leu Asn Glu Ala Val Ala His Arg Arg Pro Thr Tyr Arg

85 90 95

Ala His Val Ala Trp Tyr Arg Ile Ala Asp Gly Cys Ala His Leu Leu

100 105 110

Tyr Phe Ile Glu Tyr Ala Asp Cys Asp Pro Arg Gln Ile Phe Gly Arg

115 120 125

Cys Arg Arg Arg Thr Thr Pro Met Trp Trp Thr Pro Ser Ala Asp Tyr

130 135 140

Met Phe Pro Thr Glu Asp Glu Leu Gly Leu Leu Met Val Ala Pro Gly

145 150 155 160

Arg Phe Asn Glu Gly Gln Tyr Arg Arg Leu Val Ser Val Asp Gly Val

165 170 175

Asn Ile Leu Thr Asp Phe Met Val Ala Leu Pro Glu Gly Gln Glu Cys

180 185 190

Pro Phe Ala Arg Val Asp Gln His Arg Thr Tyr Lys Phe Gly Ala Cys

195 200 205

Trp Ser Asp Asp Ser Phe Lys Arg Gly Val Asp Val Met Arg Phe Leu

210 215 220

Thr Pro Phe Tyr Gln Gln Pro Pro His Arg Glu Val Val Asn Tyr Trp

225 230 235 240

Tyr Arg Lys Asn Gly Arg Thr Leu Pro Arg Ala Tyr Ala Ala Ala Thr

245 250 255

Pro Tyr Ala Ile Asp Pro Ala Arg Pro Ser Ala Gly Ser Pro Arg Pro

260 265 270

Arg Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro Lys Pro Glu Pro Ala Pro

275 280 285

Ala Thr Pro Ala Pro Pro Gly Arg Leu Pro Glu Pro Ala Thr Arg Asp

290 295 300

His Ala Ala Gly Gly Arg Pro Thr Pro Arg Pro Pro Arg Pro Glu Thr

305 310 315 320

Pro His Arg Pro Phe Ala Pro Pro Ala Val Val Pro Ser Gly Trp Pro

325 330 335

Gln Pro Ala Glu Pro Phe Pro Pro Arg Thr Thr Ala Ala Pro Gly Val

340 345 350

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<210> 7

<211> 1962

<212> DNA

<213> 人工序列(人工合成)

<400> 7

aagcttgccg ccaccatgga aacagataca ctcctcctct gggtgctgct cctctgggtg 60

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agcgacgatt acctggctca gctgagcgct gctcatgccg ctgctctggc tgctgtggtg 780

cagcctggcc cttactactt ctacagggct gccgtgcggc tgggagtggc cgcctttgtg 840

ttctccgagg ctgctaggag ggataggagg gcttccgctc ctgccctgct gagggtggag 900

agcgacgcta ggctgctctc ccggctgctg atgagggctg ccggatgccc tgctggattc 960

gccggactgt ttgatggaag ggccgaacgg gtccctgtgg ctcctgctga tcagctgcgg 1020

gccgcttgga ccttcggaga agatcctgct cctaggctgg acctggccag ggctaccgtc 1080

gccgaggctt ataggaggag cgtgcggggc aagccctttg accagcaggc cctgtttttc 1140

gccgtggctc tgctgctgag ggctggagga cctggcgatg ccagggaaac cctgctgagg 1200

acaaccgcta tgtgcacagc cgagagggct gctgctgctg ctgaactgac ccgggccgct 1260

ctgtccccta cagccgcttg gaacgagccc ttctccctcc tcgacgtgct gtccccctgt 1320

gctgtgagcc tgcggaggga tctgggaggc gatgccaccc tcgccaatct gggagctgct 1380

gctaggctgg ctctggctcc tgctggagct cctggagctg ctgccgccac cgatgaagga 1440

gccgaggagg aggaagatcc tgtcgctagg gccgctcctg aaatccccgc cgaagctctg 1500

ctcgctctcc ctctcagggg aggcgcttcc ttcgtgttca cacggaggcg gcccgattgc 1560

ggccctgcct ataccctggg cggcgtggat atcgccaatc ccctggtcct ggccctggtg 1620

tccaatgata gcgccgcctg cgactatacc gacaggatgc ccgagtccca gcatctgccc 1680

gctaccgaca accccagcgt ctgcgtgtat tgtgactgcg tcttcgtgag gtactccagc 1740

gccggaacca tcctggagac cgtgctgatc gaatccaagg atatggagga gcagctgatg 1800

gccggcgcca actccacaat ccccagcttc aaccccaccc tgcacggagg cgacgtgaag 1860

gctctcatgc tgtttcccaa cggcaccgtg gtggacctcc tctccttcac ctccaccagg 1920

ctggcccctg tgcatcacca tcaccatcac tgatgagaat tc 1962

<210> 8

<211> 645

<212> PRT

<213> 人工序列(人工合成)

<400> 8

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Ala Ala Leu Ala Arg Gly Ala Pro Gln Gly Gly Pro

20 25 30

Pro Ser Pro Gln Gly Gly Pro Ala Pro Thr Ala Ala Pro Ala Arg Gly

35 40 45

Pro Thr Leu Phe Val Leu Asp Gly Asp Gly Ser Ala Trp Phe Val Phe

50 55 60

Gln Leu Gly Gly Leu Gly Ala Leu Asn Asp Thr Arg Ile Arg Gly His

65 70 75 80

Leu Leu Gly Arg Tyr Leu Val Ser Tyr Gln Val Val Pro Pro Pro Val

85 90 95

Ser Ala Trp Tyr Phe Val Gln Arg Pro Arg Glu Arg Pro Arg Leu Ser

100 105 110

Gly Pro Pro Ser Gly Ala Glu Leu Val Ala Phe Asp Ala Pro Gly Val

115 120 125

Arg Arg Thr Tyr Thr Thr Ala Ala Val Trp Pro Ala Glu Val Ala Val

130 135 140

Leu Ala Asp Ala Glu Ala Arg Cys Pro Ala Ala Val Phe Asn Val Thr

145 150 155 160

Leu Gly Glu Ala Phe Leu Gly Leu Arg Val Ala Leu Arg Ser Phe Leu

165 170 175

Pro Leu Glu Val Ile Ile Ser Ala Glu Arg Met Arg Met Ile Ala Pro

180 185 190

Pro Ala Leu Gly Ser Asp Leu Glu Pro Pro Gly Pro Pro Ala Gly Arg

195 200 205

Phe His Val Tyr Thr Leu Gly Phe Leu Ser Asp Gly Ala Met His Gln

210 215 220

Thr Met Arg Asp Val Ala Ala Tyr Val His Glu Ser Asp Asp Tyr Leu

225 230 235 240

Ala Gln Leu Ser Ala Ala His Ala Ala Ala Leu Ala Ala Val Val Gln

245 250 255

Pro Gly Pro Tyr Tyr Phe Tyr Arg Ala Ala Val Arg Leu Gly Val Ala

260 265 270

Ala Phe Val Phe Ser Glu Ala Ala Arg Arg Asp Arg Arg Ala Ser Ala

275 280 285

Pro Ala Leu Leu Arg Val Glu Ser Asp Ala Arg Leu Leu Ser Arg Leu

290 295 300

Leu Met Arg Ala Ala Gly Cys Pro Ala Gly Phe Ala Gly Leu Phe Asp

305 310 315 320

Gly Arg Ala Glu Arg Val Pro Val Ala Pro Ala Asp Gln Leu Arg Ala

325 330 335

Ala Trp Thr Phe Gly Glu Asp Pro Ala Pro Arg Leu Asp Leu Ala Arg

340 345 350

Ala Thr Val Ala Glu Ala Tyr Arg Arg Ser Val Arg Gly Lys Pro Phe

355 360 365

Asp Gln Gln Ala Leu Phe Phe Ala Val Ala Leu Leu Leu Arg Ala Gly

370 375 380

Gly Pro Gly Asp Ala Arg Glu Thr Leu Leu Arg Thr Thr Ala Met Cys

385 390 395 400

Thr Ala Glu Arg Ala Ala Ala Ala Ala Glu Leu Thr Arg Ala Ala Leu

405 410 415

Ser Pro Thr Ala Ala Trp Asn Glu Pro Phe Ser Leu Leu Asp Val Leu

420 425 430

Ser Pro Cys Ala Val Ser Leu Arg Arg Asp Leu Gly Gly Asp Ala Thr

435 440 445

Leu Ala Asn Leu Gly Ala Ala Ala Arg Leu Ala Leu Ala Pro Ala Gly

450 455 460

Ala Pro Gly Ala Ala Ala Ala Thr Asp Glu Gly Ala Glu Glu Glu Glu

465 470 475 480

Asp Pro Val Ala Arg Ala Ala Pro Glu Ile Pro Ala Glu Ala Leu Leu

485 490 495

Ala Leu Pro Leu Arg Gly Gly Ala Ser Phe Val Phe Thr Arg Arg Arg

500 505 510

Pro Asp Cys Gly Pro Ala Tyr Thr Leu Gly Gly Val Asp Ile Ala Asn

515 520 525

Pro Leu Val Leu Ala Leu Val Ser Asn Asp Ser Ala Ala Cys Asp Tyr

530 535 540

Thr Asp Arg Met Pro Glu Ser Gln His Leu Pro Ala Thr Asp Asn Pro

545 550 555 560

Ser Val Cys Val Tyr Cys Asp Cys Val Phe Val Arg Tyr Ser Ser Ala

565 570 575

Gly Thr Ile Leu Glu Thr Val Leu Ile Glu Ser Lys Asp Met Glu Glu

580 585 590

Gln Leu Met Ala Gly Ala Asn Ser Thr Ile Pro Ser Phe Asn Pro Thr

595 600 605

Leu His Gly Gly Asp Val Lys Ala Leu Met Leu Phe Pro Asn Gly Thr

610 615 620

Val Val Asp Leu Leu Ser Phe Thr Ser Thr Arg Leu Ala Pro Val His

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His His His His His

645

<210> 9

<211> 525

<212> DNA

<213> 人工序列(人工合成)

<400> 9

aagcttgccg ccaccatgga aacagataca ctcctcctct gggtgctgct cctctgggtg 60

ccaggatcta caggaattcc gggtcctggt gtggcaggta acccgcgtgg cctggatgcc 120

atttttgaag caccggttac cccggcccct ccgacacgtc atccgcgtcg ggaagaactg 180

gagtgggatg atgaagatca tccgctgctg gatctggaac cgccggtggg tagccgctgt 240

catccgtata ttgcctacag tctgccgccg gatatgaatg ccgttaccag cgtggtggtg 300

aaaccgtatt gcagcccgcc ggaagttatc ctgtgggcaa gcggcaccgc ctatctggtg 360

aacccgtttg tggccattca ggcactggca gtgggtgaac cgctgaatga agccgccctg 420

aaagaactgg gtgaagtggc cgtgcacaaa gatagcctgc cgccgctgcg ttataatggt 480

ggtccgccgg ccgaacatca ccatcaccat cactgatgag aattc 525

<210> 10

<211> 166

<212> PRT

<213> 人工序列(人工合成)

<400> 10

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Ile Pro Gly Pro Gly Val Ala Gly Asn Pro Arg Gly

20 25 30

Leu Asp Ala Ile Phe Glu Ala Pro Val Thr Pro Ala Pro Pro Thr Arg

35 40 45

His Pro Arg Arg Glu Glu Leu Glu Trp Asp Asp Glu Asp His Pro Leu

50 55 60

Leu Asp Leu Glu Pro Pro Val Gly Ser Arg Cys His Pro Tyr Ile Ala

65 70 75 80

Tyr Ser Leu Pro Pro Asp Met Asn Ala Val Thr Ser Val Val Val Lys

85 90 95

Pro Tyr Cys Ser Pro Pro Glu Val Ile Leu Trp Ala Ser Gly Thr Ala

100 105 110

Tyr Leu Val Asn Pro Phe Val Ala Ile Gln Ala Leu Ala Val Gly Glu

115 120 125

Pro Leu Asn Glu Ala Ala Leu Lys Glu Leu Gly Glu Val Ala Val His

130 135 140

Lys Asp Ser Leu Pro Pro Leu Arg Tyr Asn Gly Gly Pro Pro Ala Glu

145 150 155 160

His His His His His His

165

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工引物(人工合成)

<400> 11

ataaagcttg ccgccaccat ggaaacagat acactc 36

<210> 12

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工引物(人工合成)

<400> 12

atagaattct catcagtgat ggtgatggtg atgaaagg 38

<210> 13

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工引物(人工合成)

<400> 13

ataaagcttg ccgccaccat ggaaacagat acactcctcc tctggg 46

<210> 14

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工引物(人工合成)

<400> 14

gaattctcat cagtgatggt gatggtgatg catgctggtc acgac 45

<210> 15

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工引物(人工合成)

<400> 15

ataaagcttg ccgccaccat ggaaacagat acactcc 37

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工引物(人工合成)

<400> 16

atagaattct catcagtgat ggtgatggtg atgccggtgc 40

<210> 17

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工引物(人工合成)

<400> 17

ataaagcttg ccgccaccat ggaaacagat acactcctcc tctg 44

<210> 18

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工引物(人工合成)

<400> 18

atagaattct catcagtgat ggtgatggtg atgcacaggg gcc 43

<210> 19

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工引物(人工合成)

<400> 19

ataaagcttg ccgccaccat ggaaacagat acactcctc 39

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工引物(人工合成)

<400> 20

atagaattct catcagtgat ggtgatggtg atgttcggcc 40

Claims

1.一种免疫组合物，其特征在于：包含：

2.根据权利要求1所述的免疫组合物，其特征在于，所述的猪伪狂犬病毒gB蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；所述的猪伪狂犬病毒gC蛋白包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:4的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；所述的猪伪狂犬病毒gD蛋白包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:6的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；所述的猪伪狂犬病毒gH蛋白包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:8的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；所述的猪伪狂犬病毒gL蛋白包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:10的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的免疫组合物用于生产用于在受试动物中诱导针对猪伪狂犬病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。

4.根据权利要求1或2所述的免疫组合物用于生产用于预防动物受猪伪狂犬病毒感染的药剂的用途。

5.一种免疫组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的一种免疫组合物的制备方法用于生产用于在受试动物中诱导针对猪伪狂犬病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。

7.根据权利要求5所述的一种免疫组合物的制备方法用于生产用于预防动物受猪伪狂犬病毒感染的药剂的用途。

8.一种蛋白组合物，其选自由以下组成的组：

SEQ ID NO:2的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；SEQ ID NO:4的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:4的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；SEQ ID NO:6的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:6的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；SEQ ID NO:8的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:8的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；SEQ ID NO:10的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:10的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。

9.根据权利要求8所述的一种蛋白组合物用于生产用于预防动物受猪伪狂犬病毒感染的药剂的用途。

10.根据权利要求8所述的一种蛋白组合物用于生产用于检测猪伪狂犬病毒相关诊断试剂的用途。