CN110317251A - 降糖多肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种降糖多肽及其制备方法和应用,所述降糖多肽具有抑制α‑葡萄糖苷酶的活性，所述降糖多肽具有如下(1)或(2)的氨基酸序列：(1)、含有SEQ ID No:1所示的氨基酸序列；(2)、与(1)中的氨基酸序列具有至少80％的同源性，且具有(1)中氨基酸序列的功能。本发明的降糖多肽可通过天然分离富集、人工多肽合成或通过原核细胞或真核细胞表达纯化获得。此外，该降糖多肽对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶具良好的耐受性，对糖尿病的防治具有重要意义，同时也为提高胡萝卜的生产附加值提供了新的方向。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种降糖多肽，尤其涉及一种从胡萝卜中提取的可口服的抑制α-葡萄糖苷酶活性的降糖多肽，同时本发明还涉及该降糖多肽的制备方法和应用。
背景技术
糖尿病作为一种复合型慢性代谢疾病，具有多种并发症，会对人体的神经系统、泌尿系统以及视觉系统等产生重大的影响。对于糖尿病的临床治疗来说，主要包括两个方面，一方面是注射可以降低血糖的胰岛素；另一方面是口服降血糖药物，主要包括：胰岛素促泌剂、α-葡萄糖苷酶抑制剂、双胍类以及噻唑烷二酮类四种口服降糖药。α-葡萄糖苷酶抑制剂通过抑制肠道的α-糖苷酶的活性，延缓或阻止淀粉等多糖水解，从而抑制小肠中糖类的吸收，延缓D-葡萄糖释放和吸收，以一种非侵害型的方式有效地调节了血糖水平和胰岛素反应。目前α-葡萄糖苷酶抑制剂的药物多以阿卡波糖、米格列醇、伏格波列糖等有机小分子为主。已知的具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的天然植物提取物集中在黄酮类、皂甙类、植物酸类以及多糖。并且，现有文献报道的有豆科的白色扁豆、豇豆、大花田菁中存在抑制α-葡萄糖苷酶蛋白类活性成分，但具体的蛋白质及多肽信息并不明了。
胡萝卜(Daucus carota L.)，又称红萝卜或甘荀，素有“小人参”之称。富含碳水化合物、蛋白质、脂肪、维生素等营养成分，具有防癌抗癌、降压降脂、抗衰老等功效。另外，中国是世界上主要的胡萝卜生产国，胡萝卜作为传统的种植作物，易栽培、适应性强、种植范围广，目前利用胡萝卜肉质根已开发出如胡萝卜汁、胡萝卜酱等以胡萝卜为主要原料的营养食品和精提的β-胡萝卜素等保健品。现有针对胡萝卜的研究主要集中在β-胡萝卜素、果胶、槲皮素、酚类等，对于胡萝卜多肽的研究尚未发现。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一种降糖多肽及其制备方法和应用，本发明分离和鉴定到的胡萝卜中的具有抑制α-糖苷酶活性的降糖多肽(Daucus Carrot hypoglycemicpeptide，DCHP)对糖尿病的防治具有重要意义，同时也为提高胡萝卜的生产附加值提供了新的方向。
本说明书一个或多个实施例描述了一种能有效抑制α-葡萄糖苷酶活性的降糖多肽及其制备方法和应用。
根据第一方面，提供了一种降糖多肽，所述降糖多肽具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性，所述降糖多肽具有如下(1)或(2)的氨基酸序列：
(1)、含有SEQ ID No:1所示的氨基酸序列；
(2)、与(1)中的氨基酸序列具有至少80％的同源性，且具有(1)中氨基酸序列功能的如SEQ ID No:2-6所示氨基酸序列。
根据第二方面，提供了一种编码如第一方面所述的降糖多肽的基因，所述基因具有如下(3)或(4)的核苷酸序列：
(3)、含有SEQ ID No:7所示的核苷酸序列；
(4)、与(3)中的核苷酸序列具有至少80％的同源性，且具有(3)中核苷酸序列功能的如SEQ ID No:8-12所示核苷酸序列。
根据第三方面，提供了一种重组表达载体，包括第二方面所述的基因。
根据第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞内含有如第三方面所述的重组表达载体。
根据第五方面，提供了一种用于扩增如第二方面所述的基因的引物对，所述引物对中的正向引物如SEQ ID No:13所示，反向引物如SEQ ID No:14所示，其中，所述正向引物中包含有BamHⅠ的酶切位点，所述反向引物中包含有EcoRⅠ的酶切位点。
根据第六方面，提供了一种如第二方面所述的基因的制备方法，包括如下步骤：
以SEQ ID No:7-12所示的核苷酸序列为模板，在其5’端添加SEQ ID No:13所示的序列为正向引物，在其3’端添加SEQ ID No:14所示的序列为反向引物，进行扩增，以得到所述基因。
根据第七方面，提供了一种如第一方面所述的降糖多肽的制备方法，是从天然胡萝卜中提取，包括以下步骤：
将胡萝卜切丁、榨汁、离心、过滤，收集浓缩胡萝卜汁上样；
将浓缩胡萝卜汁上样通过阴离子交换柱进行分离后收集洗脱样品；
将洗脱样品浓缩后通过凝胶柱富集后收集具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性的降糖多肽。
根据第八方面，提供了一种如第一方面所述的降糖多肽的制备方法，所述方法包括：将第三方面所述的重组表达载体转染到第四方面所述的宿主细胞内表达纯化获得，其中，所述宿主细胞包含有原核细胞或真核细胞。
根据第九方面，提供了一种如第一方面所述的降糖多肽在制备降糖功能食品中的应用。
根据第十方面，提供了一种如第一方面所述的降糖多肽在制备口服降血糖药物中的应用。
本说明书实施例提供的降糖多肽具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性，且对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶具有良好的耐受性，因此，可通过制成胶囊口服药物或降糖食品来抑制肠道中α-葡萄糖苷酶的活性以达到降糖作用，所以对于糖尿病的防治来讲，具有重要的意义；另外本发明的降糖多肽可以从天然胡萝卜中通过分离纯化直接获取，这也为提高胡萝卜的生产附加值提供了新的方向。此外，本发明降糖多肽的制备简单、成本低、易于操作和实施，因此，具有非常广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为从胡萝卜中分离纯化并获取天然降糖多肽的过程展示图；
图2为重组降糖多肽的制备过程展示图；
图3为重组降糖多肽和天然降糖多肽在不同浓度下对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率的对比结果展示图；
图4为重组降糖多肽随时间增加后对α-葡萄糖苷酶抑制活力的统计结果展示图；
图5为重组降糖多肽在不同pH处理情况下，对α-葡萄糖苷酶抑制活力的结果展示图；
图6重组降糖多肽对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的耐受性结果展示图。
具体实施方式
应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”也包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
本说明书第一方案提供了一种降糖多肽，所述降糖多肽具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性，所述降糖多肽具有如下(1)或(2)的氨基酸序列：(1)、含有SEQ ID No:1所示的氨基酸序列；(2)、与(1)中的氨基酸序列具有至少80％的同源性，且具有(1)中氨基酸序列的功能。
SEQ ID No:1所示(具体序列为：Met Glu Ser Leu Leu Ser Cys Arg Gly GlyLys Ser Ser Trp Pro Glu Leu Val Gly Lys Glu Gly His Ile Ala Ala Ala Thr ValGlu Arg Glu Asn Arg His Val Arg Ala Thr Val Met Arg Glu Gly Ser Pro Thr ThrGln Asp Phe Arg Cys Asp Arg Val Trp Val Val Val Asn Asn Arg Gly Ile Val ValSer Pro Pro His Ile Gly)。
为方便描述，可以将SEQ ID NO：1所示序列称为天然降糖多肽或天然胡萝卜降糖多肽。
所述(2)中降糖多肽的氨基酸序列具体指：如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50个，也可以是1-30个，也可以是1-20个，也可以是1-10个，也可以是1-7个，也可以是1-5个，也可以是1-3个，也可以是1-2个)氨基酸而得到的，且具有如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列功能的一系列的氨基酸序列。所述(2)中的一系列的氨基酸序列可与SEQ ID No：1具有80％以上同源性。
在本发明中提供了多种与天然降糖多肽保持至少80％的同源性，且具有该天然降糖多肽氨基酸序列的功能的氨基酸序列。例如：在SEQ ID No:2所示的氨基酸序列中，具有90％以上同源性；例如在SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的氨基酸序列中，具有95％以上同源性；例如在SEQ ID No:5和SEQ ID No:6所示的氨基酸序列中，具有99％以上同源性。具体系列的氨基酸序列如下：
SEQ ID No:2所示(具体序列为：Met Glu Ser Leu Leu Ser Cys Arg Gly GlyLys Ser Ser Trp Pro Glu Leu Leu Gly Lys Glu Gly His Ile Ala Ala Ala Thr IleGlu Arg Glu Asn Arg Asn Val Arg Ala Thr Val Leu Lys Glu Gly Ser Pro Thr ThrGln Asp Phe Arg Cys Asp Arg Val Trp Val Val Val Asp Glu Arg Gly Ile Val ValSer Pro Pro His Ile Gly)
SEQ ID No:3所示(具体序列为：Met Glu Ser Leu Leu Ser Cys Arg Gly GlyLys Ser Ser Trp Pro Glu Leu Leu Gly Lys Glu Gly His Ile Ala Ala Ala Thr IleGlu Arg Glu Asn Arg Asn Val Arg Ala Thr Val Met Arg Glu Gly Ser Pro Thr ThrGln Asp Phe Arg Cys Asp Arg Val Trp Val Val Val Asn Asn Arg Gly Ile Val ValSer Pro Pro His Ile Gly)
SEQ ID No:4所示(具体序列为：Met Glu Ser Leu Leu Ser Cys Arg Gly GlyLys Ser Ser Trp Pro Glu Leu Leu Gly Lys Glu Gly His Ile Ala Ala Ala Thr ValGlu Arg Glu Asn Arg His Val Arg Ala Thr Val Met Arg Glu Gly Ser Pro Thr ThrGln Asp Phe Arg Cys Asp Arg Val Trp Val Val Val Asp Glu Arg Gly Ile Val ValSer Pro Pro His Ile Gly)
SEQ ID No:5所示(具体序列为：Met Glu Ser Leu Leu Ser Cys Arg Gly GlyLys Ser Ser Trp Pro Glu Leu Val Gly Lys Glu Gly His Ile Ala Ala Ala Thr ValGlu Arg Glu Asn Arg Asp Val Arg Ala Thr Val Leu Arg Glu Gly Ser Pro Thr ThrGln Asp Phe Arg Cys Asp Arg Val Trp Val Val Val Asn Asn Arg Gly Ile Val ValSer Pro Pro His Ile Gly)
SEQ ID No:6所示(具体序列为：Met Glu Ser Leu Leu Ser Cys Arg Gly GlyLys Ser Ser Trp Pro Glu Leu Val Gly Lys Glu Gly His Ile Ala Ala Ala Thr ValGlu Arg Glu Asn Arg His Val Arg Ala Thr Val Leu Lys Glu Gly Ser Pro Thr ThrGln Asp Phe Arg Cys Asp Arg Val Trp Val Val Val Asn Asn Arg Gly Ile Val ValSer Pro Pro His Ile Gly)
为方便描述，可以将SEQ ID NO：2-6所示氨基酸序列称为人工合成的降糖多肽。
本说明书第二方案提供了一种编码如第一方案中所述的降糖多肽的基因，所述基因具有如下(3)或(4)的核苷酸序列：(3)、含有SEQ ID No:7所示的核苷酸序列；(4)、与(3)中的核苷酸序列具有至少80％的同源性，且具有(3)中核苷酸序列的功能。
具体来讲，根据天然降糖多肽的氨基酸序列SEQ ID No:1，化学合成编码该天然降糖多肽的核苷酸序列如SEQ ID No:7所示(具体序列为：atggaatctc tgctgtcttgccgtggtggt aaatcttctt ggccggaact ggttggtaaa gaaggtcaca tcgctgctgc taccgttgaacgtgaaaacc gtcacgttcg tgctaccgtt atgcgtgaag gttctccgac cacccaggac ttccgttgcgaccgtgtttg ggttgttgtt aacaaccgtg gtatcgttgt ttctccgccg cacatcggtt ga)。
所述(4)中基因的核苷酸序列具体指：如SEQ ID No:7所示的核苷酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个(具体可以是1-50个，也可以是1-30个，也可以是1-20个，也可以是1-10个，也可以是1-7个，也可以是1-5个，也可以是1-3个，也可以是1-2个)碱基而得到的，且具有如SEQ ID No:7所示核苷酸序列功能的一系列的核苷酸序列。所述(4)中的一系列的核苷酸序列可与SEQ ID No：7具有80％以上同源性。
例如：在SEQ ID No:8所示的核苷酸序列中，具有90％以上同源性；例如在SEQ IDNo:9和SEQ ID No:10所示的核苷酸序列中，具有95％以上同源性；例如在SEQ ID No:11和SEQ ID No:12所示的核苷酸序列中，具有99％以上同源性。具体系列的核苷酸序列如下：
根据人工合成的降糖多肽的氨基酸序列SEQ ID No:2，化学合成编码该降糖多肽的核苷酸序列如SEQ ID No:8所示(具体序列为：atggaatctc tgctgtcttg ccgtggtggtaaatcttctt ggccggaact gcttggtaaa gaaggtcaca tcgctgctgc taccattgaa cgtgaaaaccgtaacgttcg tgctaccgtt ctgaaggaag gttctccgac cacccaggac ttccgttgcg accgtgtttgggttgttgtt gacgagcgtg gtatcgttgt ttctccgccg cacatcggtt ga)。
类似的，根据人工合成的降糖多肽的氨基酸序列SEQ ID No:3，化学合成编码该降糖多肽的核苷酸序列如SEQ ID No:9所示(具体序列为：atggaatctc tgctgtcttgccgtggtggt aaatcttctt ggccggaact gcttggtaaa gaaggtcaca tcgctgctgc taccattgaacgtgaaaacc gtaacgttcg tgctaccgtt atgcgtgaag gttctccgac cacccaggac ttccgttgcgaccgtgtttg ggttgttgtt aacaaccgtg gtatcgttgt ttctccgccg cacatcggtt ga)。
类似的，根据人工合成的降糖多肽的氨基酸序列SEQ ID No:4，化学合成编码该降糖多肽的核苷酸序列如SEQ ID No:10所示(具体序列为：atggaatctc tgctgtcttgccgtggtggt aaatcttctt ggccggaact gcttggtaaa gaaggtcaca tcgctgctgc taccgttgaacgtgaaaacc gtcacgttcg tgctaccgtt atgcgtgaag gttctccgac cacccaggac ttccgttgcgaccgtgtttg ggttgttgtt gacgagcgtg gtatcgttgt ttctccgccg cacatcggtt ga)。
类似的，根据人工合成的降糖多肽的氨基酸序列SEQ ID No:5，化学合成编码该降糖多肽的核苷酸序列如SEQ ID No:11所示(具体序列为：atggaatctc tgctgtcttgccgtggtggt aaatcttctt ggccggaact ggttggtaaa gaaggtcaca tcgctgctgc taccgttgaacgtgaaaacc gtgacgttcg tgctaccgtt ctgcgtgaag gttctccgac cacccaggac ttccgttgcgaccgtgtttg ggttgttgtt aacaaccgtg gtatcgttgt ttctccgccg cacatcggtt ga)。
类似的，根据人工合成的降糖多肽的氨基酸序列SEQ ID No:6，化学合成编码该降糖多肽的核苷酸序列如SEQ ID No:12所示(具体序列为：atggaatctc tgctgtcttgccgtggtggt aaatcttctt ggccggaact ggttggtaaa gaaggtcaca tcgctgctgc taccgttgaacgtgaaaacc gtcacgttcg tgctaccgtt ctgaaggaag gttctccgac cacccaggac ttccgttgcgaccgtgtttg ggttgttgtt aacaaccgtg gtatcgttgt ttctccgccg cacatcggtt ga)。
本说明书第三方案提供了一种重组表达载体，包括第二方案中所述的基因。
本说明书第四方案提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞内含有如第三方案中所述的重组表达载体。
本说明书第五方案提供了一种用于扩增如第二方案中所述的基因的引物对，所述引物对中的正向引物如SEQ ID No:13所示(具体序列为：ATGGATCCATGGAATCTCTGCTG)，反向引物如SEQ ID No:14所示(具体序列为：ATGAATTCTCAACCGATGTGCGG)，其中，所述正向引物中包含有BamHⅠ的酶切位点，所述反向引物中包含有EcoRⅠ的酶切位点。
本说明书第六方案提供了一种如第二方案中所述的基因的制备方法，包括如下步骤：
以SEQ ID No:7-12所示的核苷酸序列为模板，在其5’端添加SEQ ID No:13所示的序列为正向引物，在其3’端添加SEQ ID No:14所示的序列为反向引物，进行PCR扩增，以得到所述基因。
本说明书第七方案提供了一种如第一方案中所述的降糖多肽的制备方法，是从天然胡萝卜中提取，包括以下步骤：
将胡萝卜切丁、榨汁、离心、过滤，收集浓缩胡萝卜汁上样；
将浓缩胡萝卜汁上样通过阴离子交换柱进行分离后收集洗脱样品；
将洗脱样品浓缩后通过凝胶柱富集后收集具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性的降糖多肽。
本说明书第八方案提供了一种如第一方案中所述的降糖多肽的制备方法，所述方法包括：将第三方案中所述的重组表达载体转染到第四方案中所述的宿主细胞内表达纯化获得，其中，所述宿主细胞包含有原核细胞或真核细胞。
本说明书第九方案提供了一种如第一方案中所述的降糖多肽在制备降糖功能食品中的应用。
本说明书第十方案提供了一种如第一方案中所述的降糖多肽在制备口服降血糖药物中的应用。
下文以具体实施例对本发明上述的技术方案进行更具体地说明。
实施例1：天然胡萝卜降糖多肽的富集和制备
一种降糖多肽的制备方法，是从天然胡萝卜中提取，包括以下步骤：
将胡萝卜切丁，加入1倍体积的蒸馏水，室温下利用榨汁机榨汁。收集第一次汁液后，在高速离心机上13000rpm离心30min，收集上清液。将收集的上清液在4℃静置12h，使上清液中残余果渣沉降。将沉降后的上清液再次13000rpm离心30min，收集离心后的上清液。在第二次离心后的上清液中按照其与果胶酶粉末的重量比为1:10000的比例加入果胶酶粉末，搅拌均匀，37℃放置2h。将加入果胶酶粉末的上清液通过滤纸过滤后将滤液再次13000rpm离心30min，得到澄清的胡萝卜上清液。之后用3000Da超滤浓缩膜，截留3000Da以上成分，得到浓缩胡萝卜汁。将浓缩胡萝卜汁上样于用50mM Tris-HCl缓冲液平衡的Q-Sepharose4B阴离子交换柱，收集0.3-0.5M NaCl的洗脱样品，浓缩后上样于pH7.9(100mMNaCl、50mM Tris-HCl)缓冲液平衡好的Superdex 75prep grade凝胶柱，收集具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的组分，浓缩过滤除菌后于-80℃条件下保存，天然降糖多肽的分离纯化结果如图1所示。
在图1中，Lane1表示的是：天然胡萝卜上清液浓缩；Lane3表示的是：Q-Sepharose4B阴离子交换柱0.3M-0.5M NaCl洗脱样浓缩；Lane5表示的是：Superdex75凝胶柱纯化后浓缩样。
将纯化好的天然降糖多肽样品经DTT还原、烷基化处理、乙腈脱色后，37℃下胰酶过夜胶内酶解后转移酶解原液至新的EP管中，之后凝胶中加入100μL抽提液(60％ACN/0.1％TFA),超声15min后将提取液与酶解原液合并，冻干后取出。加入0.1％FA水溶液60μL进行复溶并进行LC-ESI-MS分析。质谱分析结果用BioworksBrowser 3.3软件检索UniProt数据库，对该蛋白质进行鉴定。通过鉴定后结果显示：通过实施例1的制备方法中获取的天然降糖多肽(Daucus Carrot hypoglycemic peptide，DCHP)的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
实施例2：重组降糖多肽DCHP的制备
重组降糖多肽DCHP的制备，是根据天然降糖多肽DCHP的氨基酸序列表SEQ ID NO：1，通过碱基优化，化学合成适合大肠杆菌表达的编码基因，并在大肠杆菌中表达纯化，获得具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的重组降糖多肽DCHP。具体包括以下步骤：
根据实施例1获取的天然降糖多肽的氨基酸序列SEQ ID NO：1，化学合成编码天然降糖多肽的核苷酸序列SEQ ID NO：7，然后在天然降糖多肽氨基酸序列的5’端添加BamHⅠ的正向引物如SEQ ID No:13所示，3’端添加EcoRⅠ的反向引物如SEQ ID No:14所示,然后以合成基因为模板，进行PCR扩增。PCR扩增的反应条件为：95℃5min，95℃30s，60℃30s，72℃30s，72℃10min，30个循环；PCR扩增后的PCR产物经以BamH I和EcoR I酶切位点克隆于pET-M-3C原核表达载体中，构建重组质粒，然后将重组载体转入E.Coli DH5α感受态细胞中，进行菌落PCR筛选，阳性克隆经测序分析确定。
将0.5μl浓度为200ng/μl重组载体pET-M-3C-DCHP，迅速转入100μl冻融状态的E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热击90s，均匀涂布于LB固体平板培养基(含100μg/mlAmp)表面，37℃倒置过夜培养。次日挑取单菌落于5ml LB(含100μg/mlAmp)液体培养基中，37℃、200rpm过夜震荡培养。然后将上述培养液按1％(v/v)的比例接种至1000ml新鲜的LB液体培养基(含100μg/mlAmp)中扩大培养至OD600＝0.6～0.8时，加入IPTG使其终浓度达到0.5mM，16℃过夜诱导表达；8000rpm离心收集菌体。用30mlpH7.9(5mM咪唑、500mM NaCl、20mM Tris-HCl)缓冲液重悬菌体，冰上超声裂解菌体，13000r/min离心30min，收集上清并上样至经相同缓冲液平衡好的Ni2+-NTA亲和层析柱，收集Elution样品浓缩至2ml后，再次上样至经pH7.9(100mM NaCl、50mM Tris-HCl)缓冲液平衡好的Superdex75prep grade凝胶柱进一步纯化，收集目的蛋白，过滤除菌后保存于-80℃，15％SDS-PAGE分析，检测目的蛋白，纯化结果如图2所示。
在图2中，Lane1表示的是pETM-DCHP/E.coli BL21全菌；Lane2表示的是pETM-DCHP/E.coli BL21超声破碎离心后的上清液；Lane3表示的是：上清液经Ni2+柱纯化收集样品；Lane4表示的是：经Superdex75凝胶柱纯化后浓缩样品。
实施例3：人工多肽的合成
本发明利用常用的人工合成多肽的手段，将天然降糖多肽的氨基酸序列中的一个或多个经过取代，进而演变成了一系列的新的氨基酸序列。而这种新的氨基酸序列不仅保持有与天然降糖多肽的氨基酸序列至少80％以上的同源性，而且还具有该天然降糖多肽的功能。
如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列中，是将SEQ ID No:1所示的氨基酸序列中第18/29/35/41/42/61/62号的氨基酸进行替换后形成的新的氨基酸序列，该序列具有与SEQID No:1的序列90％以上同源性。此时，对应编码如SEQ ID No:2所示的人工合成降糖多肽的核苷酸序列为SEQ ID No:8。
如SEQ ID No:3所示的氨基酸序列中，是将SEQ ID No:1所示的氨基酸序列中第18/29/35号的氨基酸进行替换后形成的新的氨基酸序列，该序列具有与SEQ ID No:1的序列95％以上同源性。此时，对应编码如SEQ ID No:3所示的人工合成降糖多肽的核苷酸序列为SEQ ID No:9。
如SEQ ID No:4所示的氨基酸序列中，是将SEQ ID No:1所示的氨基酸序列中第18/61/62号的氨基酸进行替换后形成的新的氨基酸序列，该序列具有与SEQ ID No:1的序列95％以上同源性。此时，对应编码如SEQ ID No:4所示的人工合成降糖多肽的核苷酸序列为SEQ ID No:10。
如SEQ ID No:5所示的氨基酸序列中，是将SEQ ID No:1所示的氨基酸序列中第35/41号的氨基酸进行替换后形成的新的氨基酸序列，该序列具有与SEQ ID No:1的序列99％以上同源性。此时，对应编码如SEQ ID No:5所示的人工合成降糖多肽的核苷酸序列为SEQ ID No:11。
如SEQ ID No:6所示的氨基酸序列中，是将SEQ ID No:1所示的氨基酸序列中第41/42号的氨基酸进行替换后形成的新的氨基酸序列，该序列具有与SEQ ID No:1的序列99％以上同源性。此时，对应编码如SEQ ID No:6所示的人工合成降糖多肽的核苷酸序列为SEQ ID No:12。
实施例4：降糖多肽对α-葡萄糖苷酶抑制活性测定
以4-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(pNPG)为底物，取一定量的降糖多肽溶液与50μl来源于酵母的α-葡萄糖苷酶(0.5U/ml)混合，用0.2mol/L磷酸缓冲液中(pH6.8)补足体积至462.5μl，于37℃恒温水浴保温10min，加入37.5μl pNPG溶液(2×10-3mol/L)，37℃反应10min，加入2.5ml0.1mol/LNa2CO3溶液(pH＝10.95)终止反应，在410nm处测其吸光值，以不加降糖多肽试样为空白对照。
在图3中，α-葡萄糖苷酶活力单位定义为：37℃下，pH为6.8的缓冲体系中，每分钟水解pNPG生成1μmol/LpNP所需要的酶量为一个活力单位；
降糖多肽对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率(％)＝(△A空白组－△A实验组)/△A空白组×100％)。
按照上述所述测定步骤，分别取重组降糖多肽和天然降糖多肽进行测定，根据不同浓度的降糖多肽对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率，利用SPSS软件作图，测定结果如图3所示。图3中所示的降糖多肽的IC50值是指降糖多肽达到抑制α-葡萄糖苷酶50％活性时的蛋白浓度。
实施例5：重组降糖多肽DCHP的热稳定性测定
取一定量的重组降糖多肽纯品溶于0.2mol/L的磷酸缓冲液(pH＝6.8)中，50℃下恒温水浴60min，然后快速冰浴冷却，标准条件下测定的样品对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，结果如图4所示。
实施例6：重组降糖多肽DCHP的pH稳定性测定
将一定量的重组降糖多肽纯品加入如下体系：pH2.0-3.0,0.2mol/L的Gly-HCl缓冲溶液；pH4.0-5.0,0.2mol/L的HAc-NaAc缓冲溶液；pH6.0-8.0，0.2mol/L的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液；pH9.0-10.0，0.2mol/L的Gly-NaOH缓冲溶液，(样品与缓冲液所加比例为1:1)室温放置30min，分别取样，在标准条件下测定不同pH处理下后样品对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，结果如图5所示。
实施例7：重组降糖多肽DCHP对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的耐受性
将一定量的重组降糖多肽纯品与胰蛋白酶(0.3mg/ml)和胰凝乳蛋白酶(0.3mg/ml)按照50:1的比例混合，在pH8.0的条件下，室温放置，分别在15min、30min、60min、120min时取样，通过SDS-PAGE凝胶电泳观察胡萝卜降糖多肽对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的耐受性。空白对照为等量的DCHP纯品。结果DCHP不会被胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶消化，结果如图6所示。
在图6中，lane1为空白对照，lane2-5依次为15min、30min、60min、120min时DCHP与胰蛋白酶的混合物，lane6-9依次为15min、30min、60min、120min时DCHP与胰凝乳蛋白酶的混合物。
可见，本发明的重组多肽DCHP对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶消化的耐受性，在近中性环境下，有很好抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用。
综上所述的实施例，本发明中的用于抑制α-葡萄糖苷酶活性的降糖多肽可在制备降糖功能食品及口服的降血糖药物中加以推广应用。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种降糖多肽，所述降糖多肽具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性，所述降糖多肽具有如下(1)或(2)的氨基酸序列：
(1)、含有SEQ ID No:1所示的氨基酸序列；
(2)、与(1)中的氨基酸序列具有至少80％的同源性，且具有(1)中氨基酸序列功能的如SEQ ID No:2-6所示氨基酸序列。
2.一种编码如权利要求1所述的降糖多肽的基因，所述基因具有如下(3)或(4)的核苷酸序列：
(3)、含有SEQ ID No:7所示的核苷酸序列；
(4)、与(3)中的核苷酸序列具有至少80％的同源性，且具有(3)中核苷酸序列功能的如SEQ ID No:8-12所示核苷酸序列。
3.一种重组表达载体，包括权利要求2所述的基因。
4.一种宿主细胞，所述宿主细胞内含有如权利要求3所述的重组表达载体。
5.一种用于扩增如权利要求2所述的基因的引物对，所述引物对中的正向引物如SEQID No:13所示，反向引物如SEQ ID No:14所示，其中，所述正向引物中包含有BamHⅠ的酶切位点，所述反向引物中包含有EcoRⅠ的酶切位点。
6.一种如权利要求2所述的基因的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
以SEQ ID No:7-12所示的核苷酸序列为模板，在其5’端添加SEQ ID No:13所示的序列为正向引物，在其3’端添加SEQ ID No:14所示的序列为反向引物，进行扩增，以得到所述基因。
7.一种如权利要求1所述的降糖多肽的制备方法，是从天然胡萝卜中提取，其特征在于，包括以下步骤：
将胡萝卜切丁、榨汁、离心、过滤，收集浓缩胡萝卜汁上样；
将浓缩胡萝卜汁上样通过阴离子交换柱进行分离后收集洗脱样品；
将洗脱样品浓缩后通过凝胶柱富集后收集具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性的降糖多肽。
8.一种如权利要求1所述的降糖多肽的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求3所述的重组表达载体转染到权利要求4所述的宿主细胞内表达纯化获得，其中，所述宿主细胞包含有原核细胞或真核细胞。
9.如权利要求1所述的降糖多肽在制备降糖功能食品中的应用。
10.如权利要求1所述的降糖多肽在制备口服降血糖药物中的应用。
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