CN110314230A - 具有靶向性的聚多巴胺包覆普鲁士蓝纳米复合材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有靶向性的聚多巴胺包覆普鲁士蓝纳米复合材料及其制备方法。首先以普鲁士蓝纳米颗粒、多巴胺、双氨基PEG为原料，反应得到聚多巴胺包覆普鲁士蓝纳米复合材料；然后依次将靶向配体、抗癌药物修饰或负载在聚多巴胺包覆普鲁士蓝纳米复合材料上，由此制得的复合材料不仅具有较高的载药量和主动靶向性，而且对肿瘤组织表现出较高的选择性，可通过pH及近红外光照触发药物释放，小白鼠实验表明其对肿瘤抑制作用明显，有较好的应用前景。

Description

具有靶向性的聚多巴胺包覆普鲁士蓝纳米复合材料及其制备 方法

技术领域

本发明涉及功能复合材料及生物医药技术领域，具体涉及一种具有靶向性的聚多巴胺包覆普鲁士蓝纳米复合材料及其制备方法和在治疗肿瘤方面的应用。

背景技术

化疗是恶性肿瘤的主要治疗手段之一，然而传统化疗药物缺乏肿瘤选择性且毒副作用大，长期用药易使肿瘤产生耐药性造成化疗失败。光热疗法是一种治疗肿瘤的新方法，该疗法利用具有较高光热转换效率的材料，使其在注射进人体后通过靶向性识别技术聚集在肿瘤组织附近，并在外部光源(一般是近红外光)的照射下将光能转化为热能，从而选择性的杀死癌细胞。虽然光热疗法目前在肿瘤治疗方面发挥了重要作用，但仍存在自身弊端以及无法完全抑制肿瘤的缺点，因此发展两种或多种肿瘤治疗手段协同作用的联合治疗方法成为肿瘤治疗研究领域的热点。

药物载体是肿瘤治疗药物十分重要的组成部分，理想的药物载体必须同时满足以下三个条件：1)稳定，药物载体必须能够在体内长循环；2)靶向，药物载体能将药物定向投递至病灶部位或在病灶部位富集；3)药物分子能够从载体中释放出来并进入细胞质，最后杀死肿瘤细胞。目前公开报道的纳米载药体系一般只能满足其中一到两个条件，如通过在纳米药物载体表面覆盖PEG以增加其在体内的循环时间，通过在载体表面修饰具有靶向的生物分子或官能团实现靶向性，通过响应性条件(温度、pH、酶等)刺激释放药物避免其在正常组织的释放等(参见CN107412197A、CN104940951A、CN106822902A、CN106727284A等)。

普鲁士蓝纳米粒子可以作为药物载体，但是其性质不稳定、不易修饰，在生物系统中表现不好，尤其是在全身给药时(如在生理盐水中不稳定)。多巴胺是一种生物高分子材料，其表面含有邻苯二酚和氨基官能团，具有生物相容性好、易修饰等优点。聚多巴胺是一种光热性能非常好的材料，将其包覆在另一种光热性能良好的材料——普鲁士蓝外层，由此得到的聚多巴胺包覆普鲁士蓝材料具有更好的光热转换率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有靶向性的载药聚多巴胺包覆普鲁士蓝纳米复合材料，该复合材料的制备方法具体如下：(a)以普鲁士蓝、多巴胺、双氨基PEG为原料，在溶液中反应得到中间产物A(多巴胺包覆)；(b)以中间产物A和靶向配体为原料，在溶液中反应得到中间产物B(靶向配体修饰，产物即具有靶向性的聚多巴胺包覆普鲁士蓝纳米复合材料)；(c)以中间产物B和抗癌药物为原料，在溶液中反应得到目标产物——具有靶向性的载药聚多巴胺包覆普鲁士蓝纳米复合材料。

进一步的，步骤(a)具体过程如下：将普鲁士蓝、多巴胺分散在缓冲液M中，分别得到普鲁士蓝分散液和多巴胺溶液；将普鲁士蓝分散液和多巴胺溶液混合，反应得到固体颗粒；利用固体颗粒和缓冲液M配制固体颗粒悬浮液，将双氨基PEG加入到固体颗粒悬浮液中进行反应，得到中间产物A。

进一步的，所述缓冲液M具体为pH＝8.0-8.5的Tris-HCl溶液，配制得到的普鲁士蓝分散液、多巴胺溶液、固体颗粒悬浮液的浓度分别为0.5-1.5mg/L、1.0-2.5mg/L、0.5-2.0mg/L。

进一步的，步骤(a)中普鲁士蓝、多巴胺、双氨基PEG三者的质量用量比为1:1-5:1-20。

进一步的，步骤(a)中于常温下将多巴胺溶液缓慢滴加到普鲁士蓝分散液中进行反应，滴加混合时间为10-60min，反应时间为4-8h；双氨基PEG与固体颗粒悬浮液混合反应温度为常温，反应时间为6-12h；每一次反应完成后先离心分离，然后用纯化水反复洗涤离心所得固体。

进一步的，步骤(b)具体过程如下：将靶向配体分散在缓冲液N中，得到靶向配体分散液；将EDC、NHS溶解在缓冲液N中，得到EDC-NHS溶液；将靶向配体分散液与EDC-NHS溶液混合，反应一段时间后再加入中间产物A，继续反应一段时间即可。

进一步的，所述缓冲液N具体为pH＝6.8-7.4的PBS溶液，靶向配体分散液、EDC-NHS溶液的浓度分别为0.1-2mg/L、0.1-2mg/L。

进一步的，靶向配体、EDC、NHS、中间产物A的质量用量比为0.05-0.5:0.05-1:0.05-1:1。

进一步的，步骤(b)中于常温下将EDC-NHS溶液缓慢滴加到靶向配体分散液中活化0.5-12h，然后加入中间产物A常温反应12-48h，反应完成后离心分离，最后用纯化水反复洗涤离心所得固体。

进一步的，步骤(c)具体过程如下：将中间产物B分散在缓冲液M中，再加入抗癌药物，于避光、室温至40℃条件下搅拌反应12-24h，离心分离得固体，用缓冲液N反复洗涤固体并干燥。

进一步的，中间产物B与抗癌药物的质量用量比为1:1-2。

进一步的，所述靶向配体选自叶酸、生物素、透明质酸中的任意一种，所述抗癌药物选自阿霉素或其盐酸化合物、甲氨蝶呤、丝裂霉素、羟基脲、博来霉素中的至少一种。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明通过π-π堆积和氢键作用方式实现了对抗癌药物的包载，不仅载药量高而且靶向配体的引入赋予载体更好的主动靶向性，使载体表现出对肿瘤组织的高选择性，有效避免其在正常生理环境中的暴释以及药物泄露等不良效应。小白鼠实验证明，在癌细胞内的酸性环境以及近红外光照(808nm)条件下，实现了抗癌药物的大量、快速释放，表现出低的毒副作用和较好的治疗效果。除此之外，本发明的产物可用于化疗-光热联合疗法治疗肿瘤，实现较好的治疗效果。最后本发明方法反应条件温和，原料毒副作用低，可大规模工业化生产。

附图说明

图1为本发明实施例1不同阶段产物的SEM、TEM照片；

图2为本发明实施例1载药产物在不同pH、光照环境下的药物释放曲线；

图3为本发明实施例1载药前产物的光热性能图；

图4为本发明实施例1不同阶段产物的激光共聚焦显微镜图；

图5为本发明实施例1产物的体外细胞实验结果图；

图6为本发明实施例1产物的裸鼠生物学评价结果图。

具体实施方式

为使本领域普通技术人员充分理解本发明的技术方案和有益效果，以下结合具体实施例进行进一步说明。

声明：1.本发明所使用的原料如无特殊说明，均为普通市售。2.相关生物实验(如小白鼠实验)严格遵守我国及国际通行的法律法规、相关准则。

实施例1

首先参照文献(Chem.Commun.2012,48,11567-11569)的方法，合成普鲁士蓝纳米颗粒PBNPs。反应结束后，将反应液装入透析袋中透析3天，截留分子量3500Kda。透析结束后，经冷冻、干燥得到PBNPs固体粉末。

以Tris-HCl(0.01mol/L，pH＝8.0-8.5)溶液为溶剂，以普鲁士蓝纳米颗粒和多巴胺为溶质，分别配制普鲁士蓝的Tris-HCl溶液和多巴胺的Tris-HCl溶液。将10mL浓度为2.0g/L多巴胺的Tris-HCl溶液缓慢滴加到10mL浓度为1.0g/L普鲁士蓝的Tris-HCl溶液中，滴加时间约15min。滴加完成后室温反应6小时，离心分离，所得固体用纯化水反复洗涤5次。

将上一步得到的20mg纳米颗粒分散在20mL Tris-HCl(0.01mol/L，pH＝8.0-8.5)溶液中，再加入40mg双氨基PEG，室温反应8h后离心分离，所得固体用纯化水反复洗涤3-5次，得到聚多巴胺包覆的普鲁士蓝纳米复合材料。

将5mg叶酸(靶向配体)加入到10mL PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)溶液中，得到溶液一。常温下将10mg EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺)、6mg NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)加入到适量PBS溶液中，再将形成的混合溶液缓慢滴加到溶液一中活化4h，继续搅拌反应24h后离心分离，所得固体用纯化水反复洗涤3-5次，得到具有叶酸靶向的聚多巴胺包覆普鲁士蓝纳米复合材料。

将10mg具有叶酸靶向的聚多巴胺包覆普鲁士蓝纳米复合材料分散在10mL Tris-HCl(0.01mol/L，pH＝8.0-8.5)溶液中，再加入12mg阿霉素，37℃下避光搅拌反应24h后离心分离，所得固体用PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)溶液洗涤多次，直到洗涤液无色为止，最终得到具有叶酸靶向的载药聚多巴胺包覆普鲁士蓝纳米复合材料。计算可知，该复合材料的载药率为36％。

为充分了解产物的性能，分别进行了下列测试，具体如下：

一、结构表征

对制得的普鲁士蓝纳米颗粒(a)、多巴胺包覆普鲁士蓝纳米颗粒(b)、具有叶酸靶向的聚多巴胺包覆普鲁士蓝纳米复合材料(c)(载药前)进行了TEM分析测试，结果如图1所示。由图1可知，各个阶段得到的纳米颗粒均为正方形，尺寸约为40-50nm，大小均一、分散性较好，这说明包覆多巴胺及修饰双氨基PEG对普鲁士蓝纳米颗粒的形貌影响不大。

二、响应释放特性研究

将具有叶酸靶向的载药聚多巴胺包覆普鲁士蓝纳米复合材料分为四组(光照-pH＝7.4组、光照-pH＝5.5组、无光照-pH＝7.4组、无光照-pH＝5.5组)，每一组样品分别置于透析袋中(截留分子量：8000Da)，将透析袋两端密封后浸没于缓冲介质(参见前述所使用的缓冲液)中持续恒温振荡(37℃，60rpm)。其中pH＝7.4的缓冲介质中放置两组样品，pH＝5.5的缓冲介质中也放置两组样品，每一个pH条件下的两组样品又分别设置了光照组和无光照组。光照组分别于1、2、3、4、5、6、8、10、12小时给予光照600s处理(808nm，2 W/cm²)，无光照组在此期间遮光；光照组分别于1、1.17、2、2.17、3、3.17、4、4.17、5、5.17、6、6.17、8、8.17、10、10.17、12、12.17和24小时采样分析，无光照组分别于1、2、3、4、5、6、8、10、12和24小时采样分析，通过紫外-可见光谱检测阿霉素的吸收峰，从而计算出药物的释放量，结果如图2所示。

由图2可知，具有叶酸靶向的载药聚多巴胺包覆普鲁士蓝纳米复合材料在无近红外光照条件下，pH＝7.4时药物累积释放量为6.6％，pH＝5.5时药物累积释放量为17.1％；定时施加808nm的近红外光照射后，pH＝7.4和pH＝5.5的样品药物累计释放量分别提高到11.64％和28.66％。这表明该纳米复合材料具有显著的pH响应性和近红外光照响应性，在pH和光照双重作用下其负载的药物释放量得到了显著提高。

三、光热稳定性研究

将具有叶酸靶向的聚多巴胺包覆普鲁士蓝纳米复合材料配制成浓度梯度为0、5、10、20、40、100μg/mL的溶液，将各组溶液暴露于激光下辐照600s(808nm，2 W/cm²)，期间用红外热像仪记录溶液温度变化。此外，将浓度为100μg/mL的样品溶液暴露于激光下辐照600s，然后冷却600s，交替辐照-冷却5次，用红外热像仪记录溶液温度变化，结果如图3所示。

由图3可知，在照射强度为2 W/cm²、激光波长为808nm的前提下，随着溶液浓度和照射时间的增加，样品溶液的温度不断上升；当溶液浓度为100μg/mL、照射时间为600s时，溶液温度由22.5℃上升到53.5℃(图3-a)。另外，浓度为100μg/mL的样品经过连续的激光照射-自然冷却5个循环后，样品溶液升温趋势和降温趋势均呈现出较好的一致性(图3-b)。这说明具有叶酸靶向的聚多巴胺包覆普鲁士蓝纳米复合材料的光热稳定性很好，可用于光热治疗的连续或重复照射。

四、细胞吞噬实验

将细胞密度为2.0×10⁵个的HeLa细胞(CD44高表达的人宫颈癌细胞)置于共聚焦皿孵育12小时，然后将载药聚多巴胺包覆普鲁士蓝纳米复合材料(直接省去了实施例1中的叶酸包覆步骤制得)、具有叶酸靶向的载药聚多巴胺包覆普鲁士蓝纳米复合材料(实施例1终产物)加入到HeLa细胞中(DOX浓度为14.4μg/mL)，分别孵化2h和4h，先用PBS缓冲液冲洗细胞接着用4wt％多聚甲醛固定细胞最后用DAPI进行染色，通过荧光共聚焦显微镜观察细胞的变化，结果如图4所示。

图4中DAPI染色代表细胞核，DOX代表化疗药物阿霉素。根据细胞内颜色变化可以看出，随着孵育时间的变化修饰叶酸的复合材料中阿霉素的量不断增加，这说明修饰叶酸的复合材料更容易被细胞吞噬，即具有良好的靶向效果。

五、体外细胞实验

将HL-7702细胞(人正常肝细胞系)接种于96孔板中，密度为1.0×10⁴个细胞。每孔培养24h，然后用不同浓度的具有叶酸靶向的聚多巴胺包覆普鲁士蓝纳米复合材料孵育，孵育24h后用PBS缓冲液洗涤三次，接着加入100μL新鲜培养基、10μL CCK-8于37℃下继续孵育1h，最后测量450nm吸光度并计算细胞存活率。将HeLa细胞接种于96孔板中，密度为1.0×10⁴个细胞。每孔培养24h，然后用不同浓度的载药聚多巴胺包覆普鲁士蓝纳米复合材料(来源同细胞吞噬实验)、具有叶酸靶向的聚多巴胺包覆普鲁士蓝纳米复合材料及具有叶酸靶向的载药聚多巴胺包覆普鲁士蓝纳米复合材料分别孵育4h，先用PBS缓冲液洗涤三次，接着加入100μL新鲜培基，光照组暴露于激光下辐照600s(808nm，2 W/cm²)后孵育24h，再加入10μL CCK-8于37℃下继续孵育1h；无光照组孵育24h后加入10μL CCK-8于37℃下继续孵育1h。最后测量450nm吸光度并计算细胞存活率，结果如图5所示。

图5-a表明，将具有叶酸靶向的聚多巴胺包覆普鲁士蓝纳米复合材料加入HL-7702细胞中孵育24h，当其浓度高达200μg/mL时细胞的存活率仍保持在90％以上，这说明此纳米复合材料对细胞表现出低毒性。图5-b为纳米复合材料的体外抗肿瘤活性实验。以HeLa细胞为模型，当DOX的浓度为16.6μg/mL时，载体负载DOX的细胞存活率为45.2％，在没有载药、修饰叶酸的聚多巴胺包覆普鲁士蓝纳米复合材料中细胞的存活率为92.1％，而在808nm(2.0W/cm²、600s)光照条件下细胞存活率为38.2％；载药、未修饰叶酸的聚多巴胺包覆普鲁士蓝纳米复合材料在同样光照条件下细胞存活率为40.5％；载药、修饰叶酸的聚多巴胺包覆普鲁士蓝纳米复合材料在同样光照条件下细胞存活率为18.4％。这说明在具有叶酸靶向、化疗与光热联合治疗的条件下，复合材料的抗肿瘤活性最好。

六、小白鼠生物学评价

首先在小鼠皮下植入HeLa细胞，待肿瘤长到100mm³左右时将小鼠分成6组(各组含义参见表1)。将不同药液通过尾静脉注射进小白鼠体内进行治疗，其中DOX浓度为6mg/kg，载体PB@PDA@PEG-FA的浓度为10.7mg/kg，光照组注射4h后用808nm激光照射(2W/cm²、600s)。共治疗一次，用游标卡尺记录肿瘤细胞体积变14d的数据，结果如图6所示。

表1各组标记及其说明

图6表明，相对于PBS组、PBS+NIR组和PB@PDA@PEG-FA组，其他对照组肿瘤体积缩小或增长缓慢，PB@PDA@PEG-FA-DOX+NIR组肿瘤基本消失，PB@PDA@PEG-DOX+NIR、PB@PDA@PEG-FA+NIR和PB@PDA@PEG-FA-D OX组肿瘤增长非常缓慢，所有组小鼠的体重都没有明显减少。上述结果说明，在具有叶酸靶向、化疗与光热联合治疗的条件下，叶酸靶向的载药聚多巴胺包覆普鲁士蓝纳米复合材料具有更好的肿瘤抑制作用，并且产生更少的毒副作用。

Claims (10)

1.一种具有靶向性的聚多巴胺包覆普鲁士蓝纳米复合材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(a)以普鲁士蓝、多巴胺、双氨基PEG为原料，在溶液中进行反应，分离得到中间产物A；

(b)以中间产物A和靶向配体为原料，在溶液中进行反应，分离即可。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于该方法还包括步骤(c)：以步骤(b)所得产物和抗癌药物为原料，在溶液中进行反应，分离得到具有靶向性的载药聚多巴胺包覆普鲁士蓝纳米复合材料。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(a)具体过程如下：将普鲁士蓝、多巴胺分散在缓冲液M中，分别得到普鲁士蓝分散液和多巴胺溶液；将普鲁士蓝分散液和多巴胺溶液混合，反应得到固体颗粒；利用固体颗粒和缓冲液M配制固体颗粒悬浮液，将双氨基PEG加入到固体颗粒悬浮液中进行反应，得到中间产物A，其中普鲁士蓝、多巴胺、双氨基PEG的质量用量比为1:1-5:1-20。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述缓冲液M具体为pH＝8.0-8.5的Tris-HCl溶液，配制得到的普鲁士蓝分散液、多巴胺溶液、固体颗粒悬浮液的浓度分别为0.5-1.5mg/L、1.0-2.5mg/L、0.5-2.0mg/L。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(a)中于常温下将多巴胺溶液缓慢滴加到普鲁士蓝分散液中进行反应，滴加混合时间为10-60min，反应时间为4-8h；双氨基PEG与固体颗粒悬浮液混合反应温度为常温，反应时间为6-12h；每一次反应完成后先离心分离，然后用纯化水反复洗涤离心所得固体。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(b)具体过程如下：将靶向配体分散在缓冲液N中，得到靶向配体分散液；将EDC、NHS溶解在缓冲液N中，得到EDC-NHS溶液；将靶向配体分散液与EDC-NHS溶液混合，反应一段时间后再加入中间产物A，继续反应一段时间即可；其中靶向配体、EDC、NHS、中间产物A的质量用量比为0.05-0.5:0.05-1:0.05-1:1。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述缓冲液N具体为pH＝6.8-7.4的PBS溶液，靶向配体分散液、EDC-NHS溶液的浓度分别为0.1-2mg/L、0.1-2mg/L。

8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤(b)中于常温下将EDC-NHS溶液缓慢滴加到靶向配体分散液中活化0.5-12h，然后加入中间产物A常温反应12-48h，反应完成后离心分离，最后用纯化水反复洗涤离心所得固体。

9.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(c)具体过程如下：将步骤(b)所得产物分散在缓冲液M中，再加入抗癌药物，于避光、室温至40℃条件下搅拌反应12-24h，离心分离得固体，用缓冲液N反复洗涤固体并干燥；其中步骤(b)所得产物与抗癌药物的质量用量比为1:1-2。

10.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述靶向配体选自叶酸、生物素、透明质酸中的任意一种，所述抗癌药物选自阿霉素或其盐酸化合物、甲氨蝶呤、丝裂霉素、羟基脲、博来霉素中的至少一种。