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CN110290810A - 抗体佐剂缀合物 - Google Patents

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CN110290810A
CN110290810A CN201780084571.XA CN201780084571A CN110290810A CN 110290810 A CN110290810 A CN 110290810A CN 201780084571 A CN201780084571 A CN 201780084571A CN 110290810 A CN110290810 A CN 110290810A
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大卫·Y·杰克逊
迈克尔·纳撒尼尔·阿隆索
亚瑟·李
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Original Assignee
Bolt Biotherapeutics Inc
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Abstract

本发明提供了免疫缀合物，该免疫缀合物包含含有抗原结合结构域和Fc结构域的抗体构建体；佐剂部分；以及连接子，其中每个佐剂部分经由包含乙二醇基团或甘氨酸残基的连接子共价结合至抗体。还描述了用本发明的免疫缀合物治疗癌症的方法。

Description

抗体佐剂缀合物
以电子方式提交的材料的参考引用
以引用的方式全文并入本文的是与本申请同时提交的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表并且如下所标识：一个666字节的ASCII(文本)文件，名称为“736555_ST25.txt”，2017年12月13日创建。
背景技术
现已充分了解，肿瘤生长需要获得有利于免疫逃避的突变。即使如此，肿瘤发生导致突变抗原或新抗原积聚，这些抗原在体外刺激后易于被宿主免疫系统识别。免疫系统为何且如何无法识别新抗原正开始被阐明。Carmi等人的开创性研究(Nature,521：99-104(2015))表明，免疫忽视可通过经由抗体-肿瘤免疫复合物向活化树突状细胞递送新抗原来进行克服。在这些研究中，经由瘤内注射同时递送肿瘤结合抗体和树突状细胞佐剂导致稳健的抗肿瘤免疫。为了达到难以到达的肿瘤且扩展用于癌症患者及其他受试者的治疗选项，需要用于递送抗体和树突状细胞佐剂的新的组合物和方法。本发明解决了该需求及其他需求。
发明内容
在第一方面，本发明提供了一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含(a)抗体构建体，所述抗体构建体包含(i)抗原结合结构域和(ii)Fc结构域，(b)佐剂部分，以及(c)连接子，所述连接子包含乙二醇基团或甘氨酸残基，其中每个佐剂部分经由连接子共价结合至抗体构建体。
在另一方面，本发明提供了具有根据式II的结构的免疫缀合物：
其中是具有表示抗体的赖氨酸残基的残基的抗体，其中表示与Z的连接点；Adj是佐剂；下标r是1至10的整数；并且Z是具有乙二醇基团或甘氨酸残基的二价连接部分。
在又一方面，本发明提供了包含多种本发明的免疫缀合物的组合物。
在另一方面，本发明提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的根据本发明的免疫缀合物，或包含本发明的免疫缀合物的组合物。
附图说明
图1示出佐剂CL264的结构，其中圆圈指示可缀合至连接子的佐剂上的位置，具体地为佐剂的末端羧酸。
图2示出佐剂CL401的结构，其中圆圈指示可缀合至连接子的佐剂上的位置，具体地为佐剂的伯胺。
图3示出佐剂CL413的结构，其中圆圈指示可缀合至连接子的佐剂上的位置，具体地为佐剂的第一赖氨酸残基。
图4示出佐剂CL413的结构，其中圆圈指示可缀合至连接子的佐剂上的位置，具体地为佐剂的第二赖氨酸残基。
图5示出佐剂CL413的结构，其中圆圈指示可缀合至连接子的佐剂上的位置，具体地为佐剂的第三赖氨酸残基。
图6示出佐剂CL413的结构，其中圆圈指示可缀合至连接子的佐剂上的位置，具体地为佐剂的第四赖氨酸残基。
图7示出佐剂CL413的结构，其中圆圈指示可缀合至连接子的佐剂上的位置，具体地为佐剂的伯胺。
图8示出佐剂CL419的结构，其中圆圈指示可缀合至连接子的佐剂上的位置，具体地为佐剂的胺(图8的顶部部分的末端胺及图8的底部部分的仲胺)。
图9示出佐剂CL553的结构，其中圆圈指示可缀合至连接子的佐剂上的位置，具体地为佐剂的仲胺。
图10示出佐剂CL553的结构，其中圆圈指示可缀合至连接子的佐剂上的位置，具体地为佐剂的另一仲胺。
图11示出佐剂CL553的结构，其中圆圈指示可缀合至连接子的佐剂上的位置，具体地为佐剂的伯胺。
图12示出佐剂CL553的结构，其中圆圈指示可缀合至连接子的佐剂上的位置，具体地为佐剂的酰胺。
图13示出佐剂CL572的结构，其中圆圈指示可缀合至连接子的佐剂上的位置，具体地为伯胺(图13的顶部部分)和羰基(图13的底部部分)。
图14示出佐剂Pam2CSK4的结构，其中圆圈指示可缀合至连接子的佐剂上的位置，具体地为佐剂的末端羧酸。
图15示出佐剂Pam2CSK4的结构，其中圆圈指示可缀合至连接子的佐剂上的位置，具体地为佐剂的末端硫醇。
图16示出佐剂Pam2CSK的结构，其中圆圈指示可缀合至连接子的佐剂上的位置，具体地为佐剂的第二赖氨酸残基。
图17示出佐剂Pam2CSK的结构，其中圆圈指示可缀合至连接子的佐剂上的位置，具体地为佐剂的第三赖氨酸残基。
图18示出佐剂Pam2CSK的结构，其中圆圈指示可缀合至连接子的佐剂上的位置，具体地为佐剂的末端赖氨酸残基。
图19示出佐剂Pam3CSK4的结构，其中圆圈指示可缀合至连接子的佐剂上的位置，具体地为佐剂的末端羧酸。
图20示出佐剂Pam3CSK4的结构，其中圆圈指示可缀合至连接子的佐剂上的位置，具体地为佐剂的末端硫醇。
图21示出佐剂Pam3CSK4的结构，其中圆圈指示可缀合至连接子的佐剂上的位置，具体地为佐剂的第二赖氨酸残基。
图22示出佐剂Pam3CSK4的结构，其中圆圈指示可缀合至连接子的佐剂上的位置，具体地为佐剂的第三赖氨酸残基。
图23示出佐剂Pam3CSK4的结构，其中圆圈指示可缀合至连接子的佐剂上的位置，具体地为佐剂的末端赖氨酸残基。
具体实施方式
概述
本发明提供了具有多种优点的抗体-佐剂免疫缀合物，该抗体-佐剂免疫缀合物包含促进抗体依赖性细胞毒性、抗体依赖性细胞吞噬作用的抗体以及阻断充当免疫检查点分子的蛋白质所产生的癌症作用的抗体；促进树突状细胞活化和T细胞增殖的佐剂；以及促进抗肿瘤功效的抗体与佐剂之间的共价键。例如，人单核细胞在用本发明的抗体-佐剂免疫缀合物刺激过夜后发生DC分化，而采用已知刺激物(例如GM-CSF和IL-4)的DC分化方案则需要更长的时间。相比于用已知刺激物可实现的，抗体-佐剂免疫缀合物活化的细胞还表达高出几倍量的共刺激分子和炎性细胞因子。相比于用已知刺激物可实现的，抗体-佐剂免疫缀合物-活化的细胞表达较高量(例如，在一些情况下高出几倍的量)的共刺激分子和炎性细胞因子。
相比于非共价连接的抗体-佐剂免疫缀合物，共价连接的抗体-佐剂免疫缀合物(即其中抗体共价结合至连接子，该连接子共价结合至佐剂)更加定量且定性地有效引发免疫活化。此外，根据本发明连接的抗体-佐剂免疫缀合物比其他已知的免疫缀合物更有效。佐剂-抗体缀合物的全身施用允许同时靶向原发性肿瘤和相关联的转移而无需瘤内注射和外科手术切除。
定义
如本文所用，术语“免疫缀合物”是指共价结合至如本文所述的非天然存在的化学部分的抗体构建体或抗体。术语“免疫缀合物”和“抗体-佐剂免疫缀合物”在本文可互换使用。
如本文所用，短语“抗体构建体”是指包含抗原结合结构域和Fc结构域的多肽。抗体构建体可包括或者可为抗体。
如本文所用，短语“抗原结合结构域”是指特异性地结合特定抗原(例如互补位)的蛋白质或蛋白质的一部分，例如含有与抗原相互作用并赋予抗原结合蛋白质其对抗原的特异性和亲和性的氨基酸残基的抗原结合蛋白质的一部分。
如本文所用，短语“Fc结构域”是指抗体的片段结晶区或尾区。Fc结构域与Fc受体在细胞表面上相互作用。
如本文所用，短语“靶向结合结构域”是指特异性地结合第二抗原的蛋白质或蛋白质的一部分，该第二抗原不同于免疫缀合物的抗原结合结构域所结合的抗原。靶向结合结构域可在Fc结构域的C末端处缀合于抗体构建体。
如本文所用，术语“抗体”是指含有来自免疫球蛋白基因或其片段的抗原结合区(包括互补决定区(CDR))的多肽，该多肽特异性地结合并识别抗原。识别出的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及各种免疫球蛋白可变区基因。
示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。各个四聚体由两对相同的多肽链构成，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50kDa至70kDa)。每条链的N末端定义了主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，它们依次分别定义了免疫球蛋白的类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
IgG抗体是由四条肽链构成的约150kDa大分子。IgG抗体含有两条相同类的约50kDa的γ类重链以及两条相同的约25kDa的轻链，从而形成四聚四级结构。两条重链通过二硫键彼此连接并且连接至每条轻链。所得的四聚体具有两个相同的半部，它们一起形成类似Y的形状。叉部的各端含有相同的抗原结合位点。在人中存在四种IgG亚型(IgG1、2、3和4)，它们按其在血清中的丰度命名(IgG1丰度最大)。通常，抗体的抗原结合区在结合的特异性和亲和性中是最关键的。
二聚体IgA抗体为约320kDa。IgA具有两种亚型(IgA1和IgA2)并且可作为单体以及二聚体形式产生。IgA二聚体形式(分泌型或sIgA)丰度最大。
抗体可例如以完整的免疫球蛋白存在，或以经各种肽酶消化产生的大量充分表征的片段存在。因此，例如胃蛋白酶在绞链区中二硫键以下消化抗体以产生F(ab)'2，F(ab)2是Fab的二聚体，其本身是通过二硫键与VH-CH1连接的轻链。可以在温和条件下还原F(ab)'2，以断裂铰链区中的二硫键，从而使F(ab)'2二聚体转化成Fab′单体。Fab′单体基本上是带有部分绞链区的Fab(参见例如Fundamental Immunology(Paul编辑，第7版，2012)。尽管按照完整抗体的消化定义了多种抗体片段，此类片段也可通过化学方法或者通过使用重组DNA方法从头合成。因此，如本文所用，术语抗体还包括由修饰整个抗体所产生的抗体片段，使用重组DNA方法从头合成的抗体片段(例如单链Fv)，或者使用噬菌体展示文库鉴定的抗体片段(参见例如McCafferty等人，Nature,348：552-554(1990))。
术语“抗体”以最广泛的意义使用，并且具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的生物学活性即可。如本文所用，“抗体片段”及其所有语法上的变体被定义为包括抗原结合位点的完整抗体的一部分，或完整抗体的可变区，其中该部分没有完整抗体的Fc区的重链恒定结构域(即CH2、CH3和CH4，依赖于抗体同种型)。抗体片段的示例包括Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2和Fv片段；双体；任何抗体片段，即初级结构由连续氨基酸残基的一种不间断序列构成的多肽(本文称为“单链抗体片段”或“单链多肽”)，包括但不限于(1)单链Fv(scFv)分子；(2)仅含有一个轻链可变结构域的单链多肽，或含有轻链可变结构域的三个CDR而无相关联的重链部分的其片段；(3)仅含有一个重链可变区的单链多肽，或含有重链可变区的三个CDR而无相关联的轻链部分的其片段；(4)包含非人物种的单Ig结构域或其他特异性单结构域结合模块的纳米抗体；以及(5)由抗体片段形成的多特异性或多价结构。在包含一个或多个重链的抗体片段中，重链可含有存在于完整抗体的非Fc区中的任何恒定结构域序列(例如IgG同种型中的CH1)，并且/或者可含有存在于完整抗体中的任何铰链区序列，并且/或者可含有融合于或位于重链的铰链区序列或恒定结构域序列的亮氨酸拉链序列。
如本文所用，关于生物产品的术语“生物类似物”意指尽管有临床失活组分的微小差异，但该生物产品高度类似于参考产品，并且就产品的安全性、纯度和效能而言，该生物产品与参考产品之间不存在临床上有意义的差异。
如本文所用，术语“表位”意指抗原上的任何抗原决定簇，抗体的抗原结合位点(也称为互补位)结合于该抗原决定簇。表位决定簇通常由化学活性的表面分子簇构成，诸如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语还适用于这样的氨基酸聚合物，即其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
如本文所用，术语“佐剂”是指能够在暴露于佐剂的受试者中引发免疫应答的物质。
如本文所用，术语“佐剂部分”是指共价结合至如本文所述的抗体的佐剂。在免疫缀合物施用至受试者之后，佐剂部分可在结合至抗体时或从抗体切割(例如酶切割)下来之后引发免疫应答。
如本文所用，术语“模式识别受体”和“PRR”是指保守哺乳动物蛋白质类别的任何成员，这些蛋白质识别病原体相关联的分子模式(PAMP)或损伤相关联的分子模式(DAMP)，并且在先天免疫中充当关键的信号转导元件。模式识别受体被分为膜结合PRR、细胞质PRR和分泌PRR。膜结合PRR的示例包括Toll样受体(TLR)和C型凝集素受体(CLR)。细胞质PRR的示例包括NOD样受体(NLR)和Rig-I样受体(RLR)。
如本文所用，术语“Toll样受体”和“TLR”是指高度保守哺乳动物蛋白质家族的任何成员，这些蛋白质识别病原体相关联的分子模式并且在先天免疫中充当关键的信号转导元件。TLR多肽共享包括富含亮氨酸重复序列的胞外结构域、跨膜结构域、以及参与TLR信号转导的细胞内结构域的特征结构。
术语“Toll样受体1”和“TLR1”是指与可公开获得的TLR1序列(例如，对于人TLR1多肽为GenBank登录号AAY8564，或对于小鼠TLR1多肽为GenBank登录号AAG37302)共享至少70％；80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更大序列同一性的核酸或多肽。
术语“Toll样受体2”和“TLR2”是指与可公开获得的TLR2序列(例如，对于人TLR2多肽为GenBank登录号AAY85648，或对于小鼠TLR2多肽为GenBank登录号AAD49335)共享至少70％；80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更大序列同一性的核酸或多肽。
术语“Toll样受体3”和“TLR3”是指与可公开获得的TLR3序列(例如，对于人TLR3多肽为GenBank登录号AAC34134，或对于小鼠TLR3多肽为GenBank登录号AAK26117)共享至少70％；80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更大序列同一性的核酸或多肽。
术语“Toll样受体4”和“TLR4”是指与可公开获得的TLR4序列(例如，对于人TLR4多肽为GenBank登录号AAY82270，或对于小鼠TLR4多肽为GenBank登录号AAD29272)共享至少70％；80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更大序列同一性的核酸或多肽。
术语“Toll样受体5”和“TLR5”是指与可公开获得的TLR5序列(例如，对于人TLR5多肽为GenBank登录号ACM69034，或对于小鼠TLR5多肽为GenBank登录号AAF65625)共享至少70％；80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更大序列同一性的核酸或多肽。
术语“Toll样受体6”和“TLR6”是指与可公开获得的TLR6序列(例如，对于人TLR6多肽为GenBank登录号ABY67133，或对于小鼠TLR6多肽为GenBank登录号AAG38563)共享至少70％；80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更大序列同一性的核酸或多肽。
术语“Toll样受体7”和“TLR7”是指与可公开获得的TLR7序列(例如，对于人TLR7多肽为GenBank登录号AAZ99026，或对于小鼠TLR7多肽为GenBank登录号AAK62676)共享至少70％；80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更大序列同一性的核酸或多肽。
术语“Toll样受体8”和“TLR8”是指与可公开获得的TLR8序列(例如，对于人TLR8多肽为GenBank登录号AAZ95441，或对于小鼠TLR8多肽为GenBank登录号AAK62677)共享至少70％；80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更大序列同一性的核酸或多肽。
术语“Toll样受体7/8”和“TLR7/8”是指同时作为TLR7激动剂和TLR8激动剂的核酸或多肽。
术语“Toll样受体9”和“TLR9”是指与可公开获得的TLR9序列(例如，对于人TLR9多肽为GenBank登录号AAF78037，或对于小鼠TLR9多肽为GenBank登录号AAK28488)共享至少70％；80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更大序列同一性的核酸或多肽。
术语“Toll样受体10”和“TLR10”是指与可公开获得的TLR10序列(例如，对于人TLR10多肽为GenBank登录号AAK26744)共享至少70％；80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更大序列同一性的核酸或多肽。
术语“Toll样受体11”和“TLR11”是指与可公开获得的TLR11序列(例如，对于小鼠TLR11多肽为GenBank登录号AAS83531)共享至少70％；80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或更大序列同一性的核酸或多肽。
“TLR激动剂”是直接或间接地结合至TLR(例如TLR7和/或TLR8)以诱导TLR信号转导的物质。TLR信号转导的任何可检测到的差异可以指示激动剂刺激或活化TLR。信号转导差异可表现为例如如下变化：靶基因的表达，信号转导组分的磷酸化，下游元件诸如NK-κB的细胞内定位，特定组分(诸如IRAK)与其他蛋白质或细胞内结构的缔合，或组分诸如激酶(诸如MAPK)的生物化学活性。
如本文所用，术语“氨基酸”是指可引入肽、多肽、或蛋白质中的任何单体单元。氨基酸包括天然存在的α-氨基酸和它们的立体异构体，以及非天然(非天然存在的)氨基酸和它们的立体异构体。给定氨基酸的“立体异构体”是指具有相同分子式和分子内化学键，但具有不同化学键和原子三维排布结构的异构体(例如L-氨基酸和对应的D-氨基酸)。
天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及被稍后修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。天然存在的α-氨基酸包括但不限于丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、谷氨酰胺(Gln)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)，以及它们的组合。天然存在的α-氨基酸的立体异构体包括但不限于D-丙氨酸(D-Ala)、D-半胱氨酸(D-Cys)、D-天冬氨酸(D-Asp)、D-谷氨酸(D-Glu)、D-苯丙氨酸(D-Phe)、D-组氨酸(D-His)、D-异亮氨酸(D-Ile)、D-精氨酸(D-Arg)、D-赖氨酸(D-Lys)、D-亮氨酸(D-Leu)、D-甲硫氨酸(D-Met)、D-天冬酰胺(D-Asn)、D-脯氨酸(D-Pro)、D-谷氨酰胺(D-Gln)、D-丝氨酸(D-Ser)、D-苏氨酸(D-Thr)、D-缬氨酸(D-Val)、D-色氨酸(D-Trp)、D-酪氨酸(D-Tyr)，以及它们的组合。
非天然(非天然存在的)氨基酸包括但不限于以类似于天然存在的氨基酸的方式作用的L-或D-构型的氨基酸类似物、氨基酸模拟物、合成氨基酸、N-取代的甘氨酸和N-甲基氨基酸。例如，“氨基酸类似物”可为具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即结合至氢、羧基基团和氨基基团的碳)但具有经修饰侧链基团或经修饰肽主链的非天然氨基酸，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。“氨基酸模拟物”是指化合物的结构与氨基酸的一般化学结构不同，但其以与天然存在的氨基酸类似的方式作用。氨基酸可在本文以通常已知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUBBiochemical Nomenclature Commission)所推荐的单字母符号被提及。
如本文所用，术语“免疫检查点抑制剂”是指抑制免疫检查点分子的活性的任何调节剂。免疫检查点抑制剂可包括但不限于免疫检查点分子结合蛋白质、小分子抑制剂、抗体、抗体衍生物(包括Fc融合体、Fab片段和scFvs)、抗体-药物缀合物、反义寡核苷酸、siRNA、核酸适配体、肽和肽模拟物。
如本文所用，术语“连接部分”是指共价结合化合物或材料中的两个或更多个部分的官能团。例如，连接部分可用于在免疫缀合物中共价结合佐剂部分与抗体。
可用于使连接部分与蛋白质及其他材料连接的化学键包括但不限于酰胺、胺、酯、氨基甲酸酯、脲、硫醚、硫代氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯和硫脲。“二价”连接部分含有用于连接两个官能团的两个连接点；多价连接部分可具有用于连接另外官能团的另外的连接点。例如，二价连接部分包括二价聚合物部分，诸如二价聚(乙二醇)、二价聚(丙二醇)和二价聚(乙烯醇)。
如本文所用，当术语“任选地存在”用于指化学结构(例如“R”或“Q”)时，如果该化学结构不存在，最初与化学结构所成的结合直接对相邻原子进行。
如本文所用，术语“连接子”是指共价结合化合物或材料中的两个或更多个部分的官能团。例如，连接子可用于在免疫缀合物中共价结合佐剂部分与抗体构建体。
如本文所用，术语“烷基”是指具有所指定碳原子数的直链或支化的饱和脂族基团。烷基可包括任意数量的碳，诸如C1-2、C1-3、C1-4、C1-5、C1-6、C1-7、C1-8、C1-9、C1-10、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C3-4、C3-5、C3-6、C4-5、C4-6和C5-6。例如，C1-6烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基等。烷基也可指具有多至30个碳原子的烷基基团，诸如但不限于庚基、辛基、壬基、癸基等。烷基基团可为取代或未取代的。“取代的烷基”基团可被选自以下的一种或多种基团所取代：卤、羟基、氨基、氧代基(＝O)、烷基氨基、酰氨基、酰基、硝基、氰基和烷氧基。术语“亚烷基”是指二价烷基基团。
如本文所用，术语“杂烷基”是指如本文所述的烷基基团，其中一个或多个碳原子任选地且独立地被选自N、O和S的杂原子所取代。术语“杂亚烷基”是指二价杂烷基基团。
如本文所用，术语“碳环”是指含有3至12个环原子或指定原子数的饱和或部分不饱和的单环、稠合二环、或桥联多环集合。碳环可包括任意数量的碳，诸如C3-6、C4-6、C5-6、C3-8、C4-8、C5-8、C6-8、C3-9、C3-10、C3-11和C3-12。饱和单环碳环包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环辛基。饱和二环和多环碳环包括例如降冰片烷、[2.2.2]二环辛烷、十氢萘和金刚烷。碳环基团也可为部分地不饱和的，在环中具有一个或多个双键或三键。部分不饱和的代表性碳环基团包括但不限于环丁烯、环戊烯、环己烯、环己二烯(1,3-和1,4-异构体)、环庚烯、环庚二烯、环辛烯、环辛二烯(1,3-、1,4-和1,5-异构体)、降冰片烯和降冰片二烯。
不饱和的碳环基团也包括芳基基团。术语“芳基”是指具有任何合适的环原子数和任何合适的环数的芳族环体系。芳基基团可包括任何合适的环原子数，诸如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个环原子，以及6至10、6至12、或6至14个环成员。芳基基团可以是单环的，稠合形成二环或三环基团，或经化学键连接形成联芳基基团。代表性的芳基基团包括苯基、萘基和联苯基。其他芳基基团包括具有亚甲基连接子基团的苄基。一些芳基基团具有6至12个环成员，诸如苯基、萘基或联苯基。其他芳基基团具有6至10个环成员，诸如苯基或萘基。
“二价”碳环是指具有用于共价连接分子或材料中的两个部分的两个连接点的碳环基团。碳环可为取代或未取代的。“取代的碳环”基团可被选自以下的一种或多种基团所取代：卤、羟基、氨基、烷基氨基、酰氨基、酰基、硝基、氰基和烷氧基。
如本文所用，术语“杂环”是指杂环烷基基团和杂芳基基团。“杂芳基”自身或作为另一个取代基的一部分，是指含有5至16个环原子的单环或稠合二环或三环芳族环集合，其中1至5个环原子是杂原子诸如N、O或S。另外的杂原子也可以是可用的，包括但不限于B、Al、Si和P。杂原子可被氧化形成诸如但不限于-S(O)-和-S(O)2-的部分。杂芳基基团可包括任何环原子数，诸如3至6、4至6、5至6、3至8、4至8、5至8、6至8、3至9、3至10、3至11、或3至12环成员。任何合适的杂原子数可包含在杂芳基基团中，诸如1、2、3、4、或5、或1至2、1至3、1至4、1至5、2至3、2至4、2至5、3至4、或3至5。杂芳基基团可包括基团诸如吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、三唑、四唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、三嗪(1,2,3-、1,2,4-和1,3,5-异构体)、噻吩、呋喃、噻唑、异噻唑、噁唑和异噁唑。杂芳基基团也可稠合到芳族环体系诸如苯环上以形成成员，包括但不限于苯并吡咯诸如吲哚和异吲哚、苯并吡啶诸如喹啉和异喹啉、苯并吡嗪(喹喔啉)、苯并嘧啶(喹唑啉)、苯并哒嗪诸如酞嗪和噌啉、苯并噻吩、以及苯并呋喃。其他杂芳基基团包括被化学键连接的杂芳基环，诸如联吡啶。杂芳基基团可为取代或未取代的。“取代的杂芳基”基团可被选自以下的一种或多种基团所取代：卤、羟基、氨基、氧代基(＝O)、烷基氨基、酰氨基、酰基、硝基、氰基和烷氧基。
杂芳基基团可经由环上的任何位置连接。例如，吡咯包括1-、2-和3-吡咯，吡啶包括2-、3-和4-吡啶，咪唑包括1-、2-、4-和5-咪唑，吡唑包括1-、3-、4-和5-吡唑，三唑包括1-、4-和5-三唑，四唑包括1-和5-四唑，嘧啶包括2-、4-、5-和6-嘧啶，哒嗪包括3-和4-哒嗪，1,2,3-三嗪包括4-和5-三嗪，1,2,4-三嗪包括3-、5-和6-三嗪，1,3,5-三嗪包括2-三嗪，噻吩包括2-和3-噻吩，呋喃包括2-和3-呋喃，噻唑包括2-、4-和5-噻唑，异噻唑包括3-、4-和5-异噻唑，噁唑包括2-、4-和5-噁唑，异噁唑包括3-、4-和5-异噁唑，吲哚包括1-、2-和3-吲哚，异吲哚包括1-和2-异吲哚，喹啉包括2-、3-和4-喹啉，异喹啉包括1-、3-和4-异喹啉，喹唑啉包括2-和4-喹唑啉，噌啉包括3-和4-噌啉，苯并噻吩包括2-和3-苯并噻吩，并且苯并呋喃包括2-和3-苯并呋喃。
“杂环基”自身或作为另一个取代基的一部分是指具有3至12个环成员和1至4个N、O和S杂原子的饱和环系。另外的杂原子也可以是可用的，包括但不限于B、Al、Si和P。杂原子可被氧化形成诸如但不限于-S(O)-和-S(O)2-的部分。杂环基基团可包括任何环原子数，诸如3至6、4至6、5至6、3至8、4至8、5至8、6至8、3至9、3至10、3至11、或3至12环成员。任何合适的杂原子数可包含在杂环基基团中，诸如1、2、3、或4、或1至2、1至3、1至4、2至3、2至4、或3至4。杂环基基团可包括基团诸如氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、氮杂环戊烷、氮杂环辛烷、奎宁环、吡唑烷、咪唑啉、哌嗪(1,2-、1,3-和1,4-异构体)、环氧乙烷、氧杂环丁烷、四氢呋喃、噁烷(四氢吡喃)、环氧己烷、硫杂环丙烷、硫杂环丁烷、硫杂环戊烷(四氢噻吩)、硫杂环己烷(四氢噻喃)、噁唑烷、异噁唑啉、噻唑烷、异噻唑烷、二氧戊环、二硫戊环、吗啉、硫代吗啉、二氧杂环己烷、或二噻烷。杂环基基团也可稠合到芳族或非芳族环体系上以形成成员，包括但不限于二氢吲哚。杂环基基团可为未取代或取代的。“取代的杂环基”基团可被选自以下的一种或多种基团所取代：卤、羟基、氨基、氧代基(＝O)、烷基氨基、酰氨基、酰基、硝基、氰基和烷氧基。
杂环基基团可经由环上的任何位置连接。例如，氮丙啶可为1-或2-氮丙啶，氮杂环丁烷可为1-或2-氮杂环丁烷，吡咯烷可为1-、2-或3-吡咯烷，哌啶可为1-、2-、3-或4-哌啶，吡唑烷可为1-、2-、3-或4-吡唑烷，咪唑啉可为1-、2-、3-或4-咪唑啉，哌嗪可为1-、2-、3-或4-哌嗪，四氢呋喃可为1-或2-四氢呋喃，噁唑烷可为2-、3-、4-或5-噁唑烷，异噁唑啉可为2-、3-、4-或5-异噁唑啉，噻唑烷可为2-、3-、4-或5-噻唑烷，异噻唑烷可为2-、3-、4-或5-异噻唑烷，并且吗啉可为2-、3-或4-吗啉。
如本文所用，术语“卤”和“卤素”自身或作为另一个取代基的一部分是指氟、氯、溴、或碘原子。
如本文所用，术语“羰基”自身或作为另一个取代基的一部分是指–C(O)–，即碳原子与氧双键结合且结合具有羰基的部分中的两个其他基团。
如本文所用，术语“氨基”是指–NR3部分，其中每个R基团是H或烷基。氨基部分可被离子化形成对应的铵阳离子。
如本文所用，术语“羟基”是指–OH部分。
如本文所用，术语“氰基”是指碳原子与氮原子三键结合(即–C≡N部分)。
如本文所用，术语“羧基”是指–C(O)OH部分。羧基部分可被离子化形成对应的羧酸根阴离子。
如本文所用，术语“酰氨基”是指–NRC(O)R或–C(O)NR2部分，其中每个R基团是H或烷基。
如本文所用，术语“硝基”是指–NO2部分。
如本文所用，术语“氧代基”是指氧原子与化合物双键结合(即O＝)。
如本文所用，术语“治疗”、“处理”是指任何成功治疗或改善损伤、病变、病症或症状(例如认知损害)的标记，包括任何主观或客观参数，诸如减轻；缓解；减少症状或使患者对症状、损伤、病变或病症更具耐受性；降低症状进展的速度；降低症状或病症的频率或持续时间；或者在一些情况下防止症状发作。症状的治疗或改善可基于任何客观参数或主观参数；包括例如身体检查的结果。
如本文所用，术语“癌症”是指包括实体癌、淋巴瘤和白血病的病症。不同类型癌症的示例包括但不限于肺癌(例如非小细胞肺癌或NSCLC)、卵巢癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肝癌(即肝肿瘤)、肾癌(即肾细胞癌)、膀胱癌、乳腺癌、甲状腺癌、胸膜癌、胰腺癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、肛门癌、胆管癌、胃肠类癌肿瘤、食道癌、胆囊癌、阑尾癌、小肠癌、胃(胃部)癌、中枢神经系统癌、皮肤癌(例如黑素瘤)、绒毛膜癌、头颈癌、血癌、成骨肉瘤、纤维肉瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、黑素瘤、B细胞淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、小细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、单核细胞白血病、髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、以及多发性骨髓瘤。
如本文所用，术语“有效量”和“治疗有效的量”是指对所施用的对象产生治疗效果的物质(诸如免疫缀合物)的剂量。确切剂量将取决于治疗目的，并且将由本领域的技术人员使用已知技术确定(参见例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷,1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations(1999)；Goodman&Gilman’s The PharmacologicalBasis of Therapeutics，第11版,2006,Brunton编辑,McGraw-Hill；以及Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,第21版,2005,Hendrickson编辑，Lippincott,Williams&Wilkins)。
如本文所用，术语“受试者”是指动物诸如哺乳动物，包括但不限于灵长类(例如人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔子、大鼠、小鼠等。在某些实施方案中，受试者是人。
如本文所用，术语“施用”是指肠胃外、静脉内、腹膜内、肌内、瘤内、病灶内、鼻内或皮下施用、口服施用、作为栓剂施用、局部接触、鞘内施用、或将缓释装置(例如小型渗透泵)植入受试者。
如本文所用，结构是具有表示抗体的赖氨酸残基的残基的抗体，其中表示与连接子的连接点。因此，Ab是含有所述至少一个赖氨酸残基的抗体的其余部分。表示与连接子的连接点的结构可表示与Z、Z1或G2的连接点，其在本文有所描述并且分别存在于式II、式III和式IV的免疫缀合物中。
如本文所用，用于修饰数值的术语“约”和“大约”指示围绕该确切值的近距范围。如果“X”是值，“约X”或“大约X”将指示0.9X至1.1X，例如0.95X至1.05X或0.99X至1.01X的值。任何所提及的“约X”或“大约X”具体地至少指示值X、0.95X、0.96X、0.97X、0.98X、0.99X、1.01X、1.02X、1.03X、1.04X和1.05X。因此，“约X”和“大约X”旨在教导和提供对权利要求限制的书面描述支持，例如“0.98X”。
抗体佐剂缀合物
本发明提供了免疫缀合物，该免疫缀合物含有包含抗原结合结构域和Fc结构域的抗体构建体；佐剂部分；以及连接子，其中每个佐剂部分经由连接子共价结合至抗体。
如本文所述的免疫缀合物可提供意料不到地增加的抗原递呈细胞(APC)的活化响应。可在体外或体内检测该活化的增加。在一些情况下，增加的APC活化可以实现规定APC活化水平的缩减时间形式进行检测。例如，在体外测定中，％APC活化可在其他浓度和条件相同的情况下用未缀合抗体和TLR激动剂的混合物在接收相同或类似APC活化百分比所需时间的1％、10％、或50％之内以当量剂量用免疫缀合物来实现。在一些情况下，免疫缀合物可以缩减的时间量活化APC(例如树突状细胞)和/或NK细胞。例如，在一些情况下，抗体TLR激动剂混合物可在用混合物温育2、3、4、5、1-5、2-5、3-5、或4-7天之后活化APC(例如树突状细胞)和/或NK细胞和/或诱导树突状细胞分化；然而相比之下，在其他浓度和条件相同的情况下，本文所述的免疫缀合物可在4小时、8小时、12小时、16小时、或1天之内活化和/或诱导分化。另选地，增加的APC活化可以实现APC活化的量(例如，APC百分比)、水平(例如，如由合适的标记的上调水平所测量)、或速度(例如，如由活化所需的温育时间所检测)的所需免疫缀合物的降低的浓度的形式进行检测。
本发明的免疫缀合物必须包括Fc区。当缀合至本发明的佐剂时，非FcR结合蛋白质不活化骨髓细胞。
在一个实施方案中，相比于现有技术的免疫缀合物(例如，美国专利8,951,528所公开的免疫缀合物)，本发明的免疫缀合物提供了超过5％的活性增加。在另一个实施方案中，相比于现有技术的免疫缀合物，本发明的免疫缀合物提供超过10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％的活性增加。活性的增加可通过任何合适的方式进行评估，其中许多是本领域的普通技术人员已知的并且可包括髓细胞活化或通过细胞因子分泌评估。
在一个实施方案中，本发明的免疫缀合物提供改善的药物与佐剂比率。在一些实施方案中，每个免疫缀合物的平均佐剂部分数量的范围为约1至约10。期望的药物与佐剂比率可由普通技术人员根椐所需治疗效果来确定。例如，可期望大于1.2的药物与佐剂比率。在一个实施方案中，可期望大于0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、或9.0的药物与佐剂比率。在另一个实施方案中，可期望小于10.0、9.0、8.0、7.0、6.0、5.0、4.0、3.8、3.6、3.4、3.2、3.0、2.8、2.6、2.4、2.2、2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、0.8、0.6、0.4或0.2的药物与佐剂比率。药物与佐剂的比率可通过任何合适的方式进行评估，其中许多是本领域的普通技术人员已知的。
在一些实施方案中，免疫缀合物具有根据式II的结构：
其中是具有表示抗体的赖氨酸残基的残基的抗体，其中表示与Z的连接点；Adj是佐剂；下标r是1至10的整数；并且Z是具有乙二醇基团或甘氨酸残基的二价连接部分。Z优选地经由酰胺键、C–N单键、C–O单键、或C–C单键结合至佐剂，并且经由酰胺键或C–N单键结合至抗体。在一些实施方案中，Z结合至佐剂的氮基团和抗体的氮基团。如本文所用，术语“氮基团”是指佐剂或抗体中存在的未取代或取代的胺原子。在此类实施方案中，Z经由酰胺键、C–N单键、或它们的组合结合至相邻氮基团。
佐剂
在一些实施方案中，佐剂部分是引发免疫应答的化合物。在一些实施方案中，佐剂部分是模式识别受体(“PRR”)激动剂。任何能够活化模式识别受体(PRR)的佐剂可安置于本发明的免疫缀合物中。如本文所用，术语“模式识别受体”和“PRR”是指保守哺乳动物蛋白质类别的任何成员，这些蛋白质识别病原体相关联的分子模式(“PAMP”)或损伤相关联的分子模式(“DAMP”)，并且在先天免疫中充当关键的信号转导元件。模式识别受体被分为膜结合PRR、细胞质PRR和分泌PRR。膜结合PRR的示例包括Toll样受体(“TLR”)和C型凝集素受体(“CLR”)。细胞质PRR的示例包括NOD样受体(“NLR”)和Rig-I样受体(“RLR”)。在一些实施方案中，免疫缀合物可具有超过一个不同的PRR佐剂部分。
在某些实施方案中，本发明的免疫缀合物中的佐剂部分是Toll样受体(TLR)激动剂。合适的TLR激动剂包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、或它们的任何组合(例如TLR7/8激动剂)。任何能够活化Toll样受体(TLR)的佐剂可安置于本发明的免疫缀合物中。Toll样受体(TLR)是造成引发脊椎动物中先天免疫应答原因的I型跨膜蛋白质。TLR识别多种细菌、病毒和真菌的病原体相关联的分子模式并且充当抗入侵病原体的第一道防线。TLR由于细胞表达和它们所引发的信号转导途径的差异而引发重叠但不同的生物学应答。一旦结合(例如，通过天然刺激或合成TLR激动剂)，TLR引发信号转导级联，从而导致经由衔接蛋白质骨髓分化初次应答基因88(MyD88)来活化NF-κB并且募集IL-1受体相关联的激酶(IRAK)。IRAK的磷酸化随后导致TNF-受体相关联的因子6(TRAF6)募集，其导致NF-κB抑制剂I-κB磷酸化。因此，NF-κB进入细胞核并启动基因转录，其启动子含有NF-κB结合位点，诸如细胞因子。用于TLR信号转导的另外的调节模式包括经由TRIF和TRAF3对TRAF6进行含有TIR结构域衔接子诱导干扰素β(TRIF)依赖性诱导并且活化MyD88非依赖性途径，从而导致干扰素响应因子三(IRF3)磷酸化。类似地，MyD88依赖性途径也活化若干IRF家族成员，包括IRF5和IRF7，而TRIF依赖性途径也活化NF-κB途径。
TLR3激动剂的示例包括聚肌苷-聚胞苷酸(聚(I:C))、聚腺苷酸-聚尿苷酸(聚(A:U))、以及聚(I)-聚(C12U)。
TLR4激动剂的示例包括脂多糖(LPS)和单磷酰脂质A(MPLA)。
TLR5激动剂的示例包括鞭毛蛋白。
TLR9激动剂的示例包括单链CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)。三类主要的刺激CpGODN基于人外周血单核细胞(PBMC)，特别是B细胞和类浆细胞树突状细胞(pDC)上的结构特征和活性来鉴定。这三类是A类(D型)、B类(K型)和C类。
Nod样受体(NLR)激动剂的示例包括iE-DAP、D-γ-Glu-mDAP、L-Ala-γ-D-Glu-mDAP、具有C18脂肪酸链的胞壁酰二肽、胞壁酰二肽、胞壁酰三肽和N-糖基化胞壁酰二肽的酰化衍生物。
RIG-I样受体(RLR)激动剂的示例包括5’ppp-dsrna(5’-pppGCAUGCGACCUCUGUUUGA-3’[SEQ ID NO:1]:3’-CGUACGCUGGAGACAAACU-5’[SEQ ID NO:2])和聚(脱氧腺苷酸-脱氧胸苷酸)(聚(dA:dT))
另外的免疫刺激化合物诸如胞质DNA和独特细菌核酸(称为环状二核苷酸)可由可充当胞质DNA传感物的干扰素基因刺激物(“STING”)识别。ADU-SlOO可为STING激动剂。STING激动剂的非限制性示例包括：环状[G(2’,5’)pA(2’,5’)p](2’2’-cGAMP)、环状[G(2’,5’)pA(3’,5’)p](2’3’-cGAMP)、环状[G(3’,5’)pA(3’,5’)p](3’3’-cGAMP)、环状二腺苷单磷酸(c-二-AMP)、2',5'-3',5'-c-二AMP(2’3’-c-二-AMP)、环状二鸟苷单磷酸(c-二-GMP)、2',5'-3',5'-c-二GMP(2’3’-c-二-GMP)、环状二肌苷单磷酸(c-二-IMP)、环状二尿苷单磷酸(c-二-UMP)、KIN700、KIN1148、KIN600、KIN500、KINlOO、KIN101、KIN400、KIN2000、或SB-9200可被识别。
任何能够活化TLR7和/或TLR8的佐剂可安置于本发明的免疫缀合物中。TLR7激动剂和TLR8激动剂的示例由例如Vacchelli等人(OncoImmunology,2:8,e25238,DOI:10.4161/onci.25238(2013))和Carson等人(美国专利申请公布2013/0165455，该专利全文以引用方式并入本文)描述。TLR7和TLR8均表达于单核细胞和树突状细胞中。在人中，TLR7也表达于类浆细胞树突状细胞(pDC)和B细胞中。TLR8主要表达于骨髓源性细胞，即单核细胞、粒细胞和骨髓树突状细胞中。TLR7和TLR8能够检测细胞内“外源”单链RNA的存在，作为对病毒侵入作出反应的方式。用TLR8激动剂处理表达TLR8的细胞可导致产生高水平的IL-12、IFN-γ、IL-1、TNF-α、IL-6及其他炎性细胞因子。类似地，用TLR7激动剂刺激表达TLR7的细胞(诸如pDC)可导致产生高水平的IFN-α及其他炎性细胞因子。TLR7/TLR8结合和所得的细胞因的产生可活化树突状细胞及其他抗原递呈细胞，从而驱动各种不同先天性和获得性免疫应答机制，导致肿瘤破坏。
TLR7、TLR8或TLR7/8激动剂的示例包括但不限于：嘎德莫特(1-(4-氨基-2-乙氨基甲基咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-2-甲基丙-2-醇)、咪喹莫特(R837)(TLR7激动剂)、洛索立宾(TLR7激动剂)、IRM1(1-(2-氨基-2-甲基丙基)-2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并-[4,5-c]喹啉-4-胺)、IRM2(2-甲基-1-[2-(3-吡啶-3-基丙氧基)乙基]-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺)(TLR8激动剂)、IRM3(N-(2-[2-[4-氨基-2-(2-甲氧基乙基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]乙氧基]乙基)-N-甲基环己甲酰胺)(TLR8激动剂)、CL097(2-(乙氧基甲基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺)(TLR7/8激动剂)、CL307(TLR7激动剂)、CL264(TLR7激动剂)、瑞喹莫德(TLR7/8激动剂)、3M-052/MEDI9197(TLR7/8激动剂)、SD-101(N-[(4S)-2,5-二氧代基-4-咪唑烷基]-脲)(TLR7/8激动剂)、motolimod(2-氨基-N,N-二丙基-8-[4-(吡咯烷-1-羰基)苯基]-3H-1-苯并氮杂卓-4-酰胺)(TLR8激动剂)、CL075(3M002，2-丙基噻唑并[4,5-c]喹啉-4-胺)(TLR7/8激动剂)、以及TL8-506(2-氨基-8-(3-氰基苯基)-3H-1-苯并氮杂卓-4-羧酸乙酯)(TLR8激动剂)。
TLR2激动剂的示例包括但不限于试剂，包括N-α-棕榈酰-S-[2,3-双(棕榈酰氧基)-(2RS)-丙基]-L-半胱氨酸、棕榈酰-Cys((RS)-2,3-二(棕榈酰氧基)-丙基)(“Pam3Cys”)，例如Pam3Cys、Pam3Cys-Ser-(Lys)4(也称为“Pam3Cys-SKKKK”和“Pam3CSK4”)、三酰基脂质A(“OM-174”)、脂磷壁酸(“LTA”)、肽聚糖、以及CL419(S-(2,3-双(棕榈酰氧基)-(2RS)丙基)-(R)-半胱氨酰精胺)。
TLR2/6激动剂的示例是Pam2CSK4(S-[2,3-双(棕榈酰氧基)-(2RS)-丙基]-[R]-半胱氨酰-[S]-丝氨酰-[S]-赖氨酰-[S]-赖氨酰-[S]-赖氨酰-[S]-赖氨酸x3CF3COOH)。
TLR2/7激动剂的示例包括CL572(S-(2-肉豆寇酰氧基乙基)-(R)-半胱氨酰4-((6-氨基-2-(丁基氨基)-8-羟基-9H-嘌呤-9-基)甲基)苯胺)、CL413(S-(2,3-双(棕榈酰氧基)-(2RS)丙基)-(R)-半胱氨酰-(S)-丝氨酰-(S)-赖氨酰-(S)-赖氨酰-(S)-赖氨酰-(S)-赖氨酰4-((6-氨基-2-(丁基氨基)-8-羟基-9H-嘌呤-9-基)甲基)苯胺)、以及CL401(S-(2,3-双(棕榈酰氧基)-(2RS)丙基)-(R)-半胱氨酰4-((6-氨基-2(丁基氨基)-8-羟基-9H-嘌呤-9-基)甲基苯胺)。
图1至23示出TLR激动剂CL264、CL401、CL413、CL419、CL553、CL572、Pam3CSK4和Pam2CSK4可连接至本发明的免疫缀合物并同时维持其佐剂活性。具体地，连接子应当连接到佐剂上的位置呈圆圈。
在一些实施方案中，佐剂部分是咪唑并喹啉化合物。可用的咪唑并喹啉化合物的示例包括美国专利5,389,640；6,069,149；和7,968,562中所述的那些，这些专利据此全文以引用方式并入。
在一些实施方案中，佐剂(“Adj”)为式：
其中每个J独立地为氢、OR4、或R4；每个R4独立地为氢，或包括1至8个(即1、2、3、4、5、6、7或8个)碳单元的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、或杂芳烷基基团；Q任选地存在并且为包括1至8个(即1、2、3、4、5、6、7或8个)碳单元的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、或杂芳烷基基团；并且虚线表示佐剂的连接点。
在某些实施方案中，Q是存在的。在某些实施方案中，佐剂(“Adj”)为式：
其中每个R4独立地选自氢，或包括1至8个(即1、2、3、4、5、6、7或8个)碳单元的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基基团，并且虚线表示佐剂的连接点。
在一些实施方案中，佐剂(“Adj”)为式：
其中J为氢、OR4、或R4；每个R4独立地为氢，或包括1至8个(即1、2、3、4、5、6、7或8个)碳单元的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基基团；Q选自包括1至8个(即1、2、3、4、5、6、7或8个)碳单元的烷基、或杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基基团；并且虚线表示佐剂的连接点。
在某些实施方案中，佐剂(“Adj”)为式：
其中每个R4独立地选自氢，或包括1至8个(即1、2、3、4、5、6、7或8个)碳单元的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基基团，并且虚线表示佐剂的连接点。
在一些实施方案中，佐剂(“Adj”)为式：
其中每个R4独立地为氢，或包括1至8个(即1、2、3、4、5、6、7或8个)碳单元的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、或杂芳烷基基团；Q为包括1至8个(即1、2、3、4、5、6、7或8个)碳单元的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、或杂芳烷基基团；并且虚线表示佐剂的连接点。
在一些实施方案中，佐剂(“Adj”)为式：
其中每个J独立地为氢、OR4、或R4；每个R4独立地为氢，或包括1至8个(即1、2、3、4、5、6、7或8个)碳单元的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、或杂芳烷基基团；每个U独立地为CH或N，其中至少一个U为N；每个下标t独立地为1至3的整数(即1、2或3)；Q任选地存在并且为包括1至8个(即1、2、3、4、5、6、7或8个)碳单元的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、或杂芳烷基基团；并且虚线表示佐剂的连接点。
在某些实施方案中，Q是存在的。在某些实施方案中，佐剂(“Adj”)为式：
其中R4选自氢，或包括1至8个(即1、2、3、4、5、6、7或8个)碳单元的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基基团，Q为包括1至8个(即1、2、3、4、5、6、7或8个)碳单元的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、或杂芳烷基基团；并且虚线表示佐剂的连接点。
在一些实施方案中，佐剂(“Adj”)为式：
其中J为氢、OR4、或R4；每个R4独立地为氢，或包括1至8个(即1、2、3、4、5、6、7或8个)碳单元的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、或杂芳烷基基团；R5为氢，或包括1至10个(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)碳单元的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、或杂芳烷基基团；Q为包括1至8个(即1、2、3、4、5、6、7或8个)碳单元的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、或杂芳烷基基团；并且虚线表示佐剂的连接点。
在某些实施方案中，佐剂(“Adj”)为式：
其中J为氢、OR4、或R4；每个R4独立地选自氢，或包括1至8个(即1、2、3、4、5、6、7或8个)碳单元的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基和杂芳烷基基团；U为CH或N；V为CH2、O、或NH；每个下标t独立地为1至3的整数(即1、2或3)；并且虚线表示佐剂的连接点。
在一些实施方案中，佐剂(“Adj”)为式：
其中R1选自H和C1-4烷基；R3选自C1-6烷基和2-至6-元杂烷基，其各自任选地被选自卤、羟基、氨基、氧代基(＝O)、烷基氨基、酰氨基、酰基、硝基、氰基和烷氧基的一个或多个成员所取代；X选自O和CH2；每个Y独立地为CHR2，其中R2选自H、OH和NH2，下标n为1至12的整数(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)；并且虚线表示佐剂的连接点。另选地，R1与其所连接的氮原子可形成包括5-至8-元杂环的连接部分。在一些实施方案中，下标n是1至6的整数(即1、2、3、4、5或6)。在某些实施方案中，下标n是1至3的整数(即1、2或3)。
在一些实施方案中，佐剂(“Adj”)为式：
其中W选自O和CH2；R1选自H和C1-4烷基；每个Y独立地为CHR2，其中R2选自H、OH和NH2；下标n为1至12的整数(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)；并且虚线表示佐剂的连接点。另选地，R1与其所连接的氮原子可形成包括5-至8-元杂环的连接部分。在一些实施方案中，下标n是1至6的整数(即1、2、3、4、5或6)。在某些实施方案中，下标n是1至3的整数(即1、2或3)。
在一些实施方案中，佐剂(“Adj”)为式：
其中W选自O和CH2；R1选自H和C1-4烷基；每个Y独立地为CHR2，其中R2选自H、OH和NH2；下标n为1至12的整数(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)；并且虚线表示佐剂的连接点。另选地，R1与其所连接的氮原子可形成包括5-至8-元杂环的连接部分。在一些实施方案中，下标n是1至6的整数(即1、2、3、4、5或6)。在某些实施方案中，下标n是1至3的整数(即1、2或3)。
在一些实施方案中，佐剂(“Adj”)为式：
其中W选自O和CH2；X选自O和CH2；每个Y独立地为CHR2，其中R2选自H、OH和NH2；下标n为1至12的整数(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)；并且虚线表示佐剂的连接点。在一些实施方案中，下标n是1至6的整数(即1、2、3、4、5或6)。在某些实施方案中，下标n是1至3的整数(即1、2或3)。
在一些实施方案中，佐剂(“Adj”)为式：
其中R1选自H和C1-4烷基；R2选自H、OH和NH2；并且虚线表示佐剂的连接点。
在一些实施方案中，佐剂(“Adj”)为式：
其中R1选自H和C1-4烷基；R2选自H、OH和NH2；并且虚线表示佐剂的连接点。
在一些实施方案中，佐剂(“Adj”)为式：
其中J为氢、OR4、或R4；每个R4独立地为氢，或包括1至8个(即1、2、3、4、5、6、7或8个)碳单元的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、或杂芳烷基基团；并且虚线表示佐剂的连接点。
在一些实施方案中，佐剂(“Adj”)为式：
其中每个R4独立地为氢，或包括1至8个(即1、2、3、4、5、6、7或8个)碳单元的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、或杂芳烷基基团，并且虚线表示佐剂的连接点。
在某些实施方案中，佐剂(“Adj”)为：
其中虚线表示佐剂的连接点。
在一些实施方案中，佐剂不为荧光团。在一些实施方案中，佐剂不为放射性诊断化合物。在一些实施方案中，佐剂不为放射性治疗化合物。在一些实施方案中，佐剂不为微管蛋白抑制剂。在一些实施方案中，佐剂不为DNA交联剂/烷化剂。在一些实施方案中，佐剂不为拓扑异构酶抑制剂。
连接子
本发明免疫缀合物含有共价结合佐剂部分与抗体的连接部分。在一些实施方案中，免疫缀合物具有根据式I的结构：
其中A是抗体中的未修饰氨基酸侧链或抗体中的修饰氨基酸侧链；Ab是含有氨基酸侧链A的抗体的其余部分；Z是连接部分；Adj是佐剂部分；并且下标r是1至10的整数。
在相关方面，本发明提供了包含多种如本文所述的免疫缀合物的组合物。在一些实施方案中，每个免疫缀合物的平均佐剂部分数量的范围为约1至约10(例如约1至约4)。
缀合物中的佐剂部分可使用用于蛋白质修饰的各种化学方法来共价结合至抗体，并且该上述连接部分由蛋白质官能团(即氨基酸侧链)与具有反应性连接子基团的试剂反应所引起。各种不同此类试剂在本领域中是已知的。此类试剂的示例包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)酯和N-羟基硫代琥珀酰亚胺基(磺基-NHS)酯(胺反应性)；碳二亚胺(胺和羧基反应性)；羟甲基膦(胺反应性)；马来酰亚胺(硫醇反应性)；卤化乙酰胺，诸如N-碘乙酰亚胺(硫醇反应性)；芳基叠氮化物(伯胺反应性)；氟化芳基叠氮化物(经由碳-氢(C-H)插入反应)；五氟苯基(PFP)酯(胺反应性)；四氟苯基(TFP)酯(胺反应性)；亚氨酸酯(胺反应性)；异氰酸酯(羟基反应性)；乙烯基砜(硫醇、胺和羟基反应性)；吡啶基二硫化物(硫醇反应性)；以及二苯甲酮衍生物(经由C-H键插入反应性)。另外试剂包括但不限于Hermanson,Bioconjugate Techniques，第2版，Academic Press,2008中所述的那些。
连接子可具有任何合适的长度，使得当连接子共价结合至抗体构建体和佐剂部分时，抗体构建体和佐剂部分的作用得以维持。连接子可具有约或更大，例如约或更大、约或更大、约或更大、约或更大、约或更大、约或更大、或约或更大的长度。另选地或除此之外，连接子可具有约或更小，例如约或更小、约或更小、约或更小、约或更小、约或更小、约或更小、或约或更小的长度。因此，连接子可具有由任何两个前述端值所界定的长度。连接子可具有约至约例如约至约约至约约至约约至约约至约约至约约至约约至约约至约约至约约至约约至约约至约或约至约的长度。在某些实施方案中，连接子具有约至约的长度。
在一些实施方案中，连接子在生理条件下不可裂解。
在一些实施方案中，免疫缀合物具有根据式II的结构：
其中是具有表示抗体的赖氨酸残基的残基的抗体，其中表示与Z的连接点；Adj是佐剂；下标r是1至10的整数；并且Z是具有乙二醇基团或甘氨酸残基的二价连接部分。Z优选地经由酰胺键、C–N单键、C–O单键、或C–C单键结合至佐剂，并且经由酰胺键或C–N单键结合至抗体。在一些实施方案中，Z结合至佐剂的氮基团和抗体的氮基团。在此类实施方案中，Z经由酰胺键、C–N单键、或它们的组合结合至相邻氮基团。
在某些实施方案中，本发明提供了具有根据式IIa的结构的免疫缀合物：
其中：
Ab是抗体；
下标r是1至10的整数；并且
Z是包含乙二醇基团或甘氨酸残基的二价连接部分。Z优选地经由酰胺键、C–N单键、C–O单键、或C–C单键结合至佐剂，并且经由酰胺键或C–N单键结合至抗体。在一些实施方案中，Z结合至佐剂的氮基团和抗体的氮基团。在此类实施方案中，Z经由酰胺键、C–N单键、或它们的组合结合至相邻氮基团。
在一些实施方案中，Z包含聚(乙二醇)基团。在某些实施方案中，Z包含至少2个乙二醇基团(例如至少3个乙二醇基团、至少4个乙二醇基团、至少5个乙二醇基团、至少6个乙二醇基团、至少7个乙二醇基团、至少8个乙二醇基团、至少9个乙二醇基团、至少10个乙二醇基团、至少11个乙二醇基团、至少12个乙二醇基团、至少13个乙二醇基团、至少14个乙二醇基团、至少15个乙二醇基团、至少16个乙二醇基团、至少17个乙二醇基团、至少18个乙二醇基团、至少19个乙二醇基团、至少20个乙二醇基团、至少21个乙二醇基团、至少22个乙二醇基团、至少23个乙二醇基团、至少24个乙二醇基团、或至少25个乙二醇基团。在某些实施方案中，Z包含二(乙二醇)基团、三(乙二醇)基团、或四(乙二醇)基团、5个乙二醇基团、6个乙二醇基团、8个乙二醇基团、12个乙二醇基团、24个乙二醇基团、或25个乙二醇基团。
在一些实施方案中，Z包含甘氨酸残基。在某些实施方案中，Z包含至少2个甘氨酸残基(例如至少3个甘氨酸残基、至少4个甘氨酸残基、至少5个甘氨酸残基、至少6个甘氨酸残基、至少7个甘氨酸残基、至少8个甘氨酸残基、至少9个甘氨酸残基、至少10个甘氨酸残基、至少11个甘氨酸残基、至少12个甘氨酸残基、至少13个甘氨酸残基、至少14个甘氨酸残基、至少15个甘氨酸残基、至少16个甘氨酸残基、至少17个甘氨酸残基、至少18个甘氨酸残基、至少19个甘氨酸残基、至少20个甘氨酸残基、至少21个甘氨酸残基、至少22个甘氨酸残基、至少23个甘氨酸残基、至少24个甘氨酸残基、或至少25个甘氨酸残基。在某些实施方案中，Z包含2个甘氨酸残基、3个甘氨酸残基、4个甘氨酸残基、5个甘氨酸残基、6个甘氨酸残基、8个甘氨酸残基、12个甘氨酸残基、24个甘氨酸残基、或25个甘氨酸残基。
在一些实施方案中，Z还包含二价亚环己基基团。
在一些实施方案中，免疫缀合物具有根据式IIIa的结构：
其中是具有表示抗体的赖氨酸残基的残基的抗体，其中表示与Z1的连接点，其中Z1包含至少一个乙二醇基团或至少一个甘氨酸残基。
在一些实施方案中，免疫缀合物具有根据式IIIb的结构：
其中是具有表示抗体的赖氨酸残基的残基的抗体，其中表示与Z1的连接点，其中Z1包含至少一个乙二醇基团或至少一个甘氨酸残基，其中Z1包含至少一个乙二醇基团或至少一个甘氨酸残基。
在一些实施方案中，免疫缀合物具有根据式IV的结构：
或其可药用盐，其中是具有表示抗体的赖氨酸残基的残基的抗体，其中表示与G2的连接点，Adj是佐剂，G1是CH2、C＝O、或化学键，G2是CH2、C＝O、或化学键，L是连接子，并且下标r是1至10的整数(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在式IV的免疫缀合物的某些实施方案中，抗体不含硫醇修饰的赖氨酸侧链。
在一些实施方案中，L选自：
其中R任选地存在并且为包括1至8个碳单元的线性或支化的、环状或直链的、饱和或不饱和的烷基、杂烷基、芳基、或杂芳基链；a是1至40的整数；每个A独立地选自任何氨基酸；下标c是1至25的整数；虚线表示与G1的连接点；并且波形线表示与G2的连接点。在某些实施方案中，a是2至25的整数。在某些实施方案中，c是2至8的整数。
在一些实施方案中，免疫缀合物具有根据式IVa的结构：
或其可药用盐，其中Ab如本文所定义；Adj是佐剂；G1是CH2、C＝O、或化学键；R任选地存在并且为包括1至8个碳单元的线性或支化的、环状或直链的、饱和或不饱和的烷基、杂烷基、芳基、或杂芳基链；下标a是1至40的整数；并且下标r是1至10的整数(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在某些实施方案中，a是2至25的整数。
在一些实施方案中，免疫缀合物具有根据式IVb的结构：
或其可药用盐，其中Ab如本文所定义；Adj是佐剂；G1是CH2、C＝O、或化学键；下标a是1至40的整数；并且下标r是1至10的整数(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在某些实施方案中，a是2至25的整数。
在一些实施方案中，免疫缀合物具有根据式IVc的结构：
或其可药用盐，其中Ab如本文所定义；Adj是佐剂；G1是CH2、C＝O、或化学键；R任选地存在并且为包括1至8个碳单元的线性或支化的、环状或直链的、饱和或不饱和的烷基、杂烷基、芳基、或杂芳基链；每个A独立地选自任何氨基酸；下标c是1至25的整数；并且下标r是1至10的整数(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在某些实施方案中，c是2至8的整数。
在一些实施方案中，免疫缀合物具有根据式IVd的结构：
或其可药用盐，其中Ab如本文所定义；Adj是佐剂；G1是CH2、C＝O、或化学键；R任选地存在并且为包括1至8个碳单元的线性或支化的、环状或直链的、饱和或不饱和的烷基、杂烷基、芳基、或杂芳基链；下标c是1至25的整数；并且下标r是1至10的整数(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在某些实施方案中，c是2至8的整数。
在一些实施方案中，免疫缀合物具有根据式IVe的结构：
或其可药用盐，其中Ab如本文所定义；Adj是佐剂；G1是CH2、C＝O、或化学键；R任选地存在并且为包括1至8个碳单元的线性或支化的、环状或直链的、饱和或不饱和的烷基、杂烷基、芳基、或杂芳基链；并且下标r是1至10的整数(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。
因此，免疫缀合物可具有根据式Va–式Vff的结构：
或其可药用盐，其中Ab如本文所定义；Adj是佐剂；并且下标r是1至10的整数(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在某些实施方案中，下标r是1至4的整数(即1、2、3或4)。
例如，免疫缀合物可具有根据式VIa-VIj的结构：
其中n是1至40的范围内的整数，并且r是1至10的整数(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在某些实施方案中，下标r是1至4的整数(即1、2、3或4)。在一些实施方案中，n是2至25的整数。在某些实施方案中，n是2至8的范围内的整数
在第二方面，本发明提供了由式VII的一种或多种化合物和式VIII的抗体产生式IV的免疫缀合物的改善的方法，该方法包括以下步骤：
其中是具有表示抗体的赖氨酸残基的残基的抗体，Adj是佐剂；G1是CH2、C＝O、或化学键；G2是CH2、C＝O、或化学键；L是连接子；E是酯；并且下标r是1至10的整数(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在某些实施方案中，下标r是1至4的整数(即1、2、3或4)。
可使用任何合适的连接子，前提条件是其可通过酯结合至抗体(式VII的化合物)。例如，连接子(“L”)可具有下式其中R任选地存在并且为包括1至8个(即1、2、3、4、5、6、7或8)碳单元的线性或支化的、环状或直链的、饱和或不饱和的烷基、杂烷基、芳基、或杂芳基链；下标a是1至40的整数；虚线表示与G1的连接点；并且波形线表示与G2的连接点。在一些实施方案中，下标a是1至25的整数。在一些实施方案中，下标a是2至25的整数。在一些实施方案中，下标a是2至8的整数。在某些实施方案中，R是存在的并且为包括1至8个(即1、2、3、4、5、6、7或8)碳单元的线性或支化的、环状或直链的、饱和或不饱和的烷基、杂烷基、芳基、或杂芳基链。
连接子(“L”)可具有下式其中下标a是1至40的整数；虚线表示与G1的连接点；并且波形线表示与G2的连接点。在一些实施方案中，下标a是1至25的整数。在一些实施方案中，下标a是2至25的整数。在一些实施方案中，下标a是2至8的整数。
连接子(“L”)还可具有下式其中R任选地存在并且为包括1至8个(即1、2、3、4、5、6、7或8)碳单元的线性或支化的、环状或直链的、饱和或不饱和的烷基、杂烷基、芳基、或杂芳基链；每个A独立地选自任何氨基酸；下标c是1至25的整数；虚线表示与G1的连接点；并且波形线表示与G2的连接点。在一些实施方案中，下标c是2至25的整数。在一些实施方案中，下标c是1至8的整数。在一些实施方案中，下标c是2至8的整数。在某些实施方案中，R是存在的并且为包括1至8个(即1、2、3、4、5、6、7或8)碳单元的线性或支化的、环状或直链的、饱和或不饱和的烷基、杂烷基、芳基、或杂芳基链。
连接子(“L”)还可具有下式其中R任选地存在并且为包括1至8个(即1、2、3、4、5、6、7或8)碳单元的线性或支化的、环状或直链的、饱和或不饱和的烷基、杂烷基、芳基、或杂芳基链；下标c是1至25的整数；虚线表示与G1的连接点；并且波形线表示与G2的连接点。在一些实施方案中，下标c是2至25的整数。在一些实施方案中，c是1至8的整数。在一些实施方案中，c是2至8的整数。在某些实施方案中，R是存在的并且为包括1至8个(即1、2、3、4、5、6、7或8)碳单元的线性或支化的、环状或直链的、饱和或不饱和的烷基、杂烷基、芳基、或杂芳基链。
连接子(“L”)可具有下式其中R任选地存在并且为包括1至8个(即1、2、3、4、5、6、7或8)碳单元的线性或支化的、环状或直链的、饱和或不饱和的烷基、杂烷基、芳基、或杂芳基链；下标a是1至40的整数；虚线表示与G1的连接点；并且波形线表示与G2的连接点。在一些实施方案中，下标a是1至25的整数。在一些实施方案中，下标a是2至25的整数。在一些实施方案中，下标a是2至8的整数。在某些实施方案中，R是存在的并且为包括1至8个(即1、2、3、4、5、6、7或8)碳单元的线性或支化的、环状或直链的、饱和或不饱和的烷基、杂烷基、芳基、或杂芳基链。
连接子(“L”)可具有下式其中下标a是1至40的整数；虚线表示与G1的连接点；并且波形线表示与G2的连接点。在一些实施方案中，下标a是1至25的整数。在一些实施方案中，下标a是2至25的整数。在一些实施方案中，下标a是2至8的整数。
连接子(“L”)还可具有下式其中R任选地存在并且为包括1至8个(即1、2、3、4、5、6、7或8)碳单元的线性或支化的、环状或直链的、饱和或不饱和的烷基、杂烷基、芳基、或杂芳基链；每个A独立地选自任何氨基酸；下标c是1至25的整数；虚线表示与G1的连接点；并且波形线表示与G2的连接点。在一些实施方案中，下标c是2至25的整数。在一些实施方案中，下标c是1至8的整数。在一些实施方案中，下标c是2至8的整数。在某些实施方案中，R是存在的并且为包括1至8个(即1、2、3、4、5、6、7或8)碳单元的线性或支化的、环状或直链的、饱和或不饱和的烷基、杂烷基、芳基、或杂芳基链。
连接子(“L”)还可具有下式其中R任选地存在并且为包括1至8个(即1、2、3、4、5、6、7或8)碳单元的线性或支化的、环状或直链的、饱和或不饱和的烷基、杂烷基、芳基、或杂芳基链；下标c是1至20的整数；虚线表示与G1的连接点；并且波形线表示与G2的连接点。在一些实施方案中，下标c是2至25的整数。在一些实施方案中，下标c是1至8的整数。在一些实施方案中，下标c是2至8的整数。在某些实施方案中，R是存在的并且为包括1至8个(即1、2、3、4、5、6、7或8)碳单元的线性或支化的、环状或直链的、饱和或不饱和的烷基、杂烷基、芳基、或杂芳基链。
在一些实施方案中，式VII的化合物选自：
其中G1是CH2、C＝O、或化学键；G2是CH2、C＝O、或化学键；R任选地存在并且为包括1至8个碳单元的线性或支化的、环状或直链的、饱和或不饱和的烷基、杂烷基、芳基、或杂芳基链；下标a是1至40的整数；每个A独立地选自任何氨基酸；下标c是1至25的整数，并且E是酯。在某些实施方案中，下标a是2至25的整数。在某些实施方案中，下标c是2至8的整数。
如先前所讨论，可存在形成免疫缀合物的多种方式。每种现有技术方法存在不利影响。本发明方法包括使被修饰成包括连接子的佐剂与抗体(式VIII的化合物)的赖氨酸侧链缀合的一步法。该方法可以通过使用酯。酯可为能够连接式VII的化合物与抗体(式VIII的化合物)的赖氨酸侧链的任何合适的酯。
例如，式VII的酯可为下式的N-羟基琥珀酰亚胺(“NHS”)酯：
其中波形线表示与G2的连接点。
式VII的酯也可为下式的磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯：
其中M是任何阳离子并且波形线表示与G2的连接点。例如，抗衡阳离子(“M”)可为质子、铵、季铵、碱金属阳离子、碱土金属阳离子、过渡金属阳离子、稀土金属阳离子、主族元素阳离子、或它们的组合。
式VII的酯也可为下式的苯酚酯：
其中每个R2独立地选自氢或氟并且波形线表示与G2的连接点。
式VII的酯也可为下式的苯酚酯：
其中波形线表示与G2的连接点。
在一些实施方案中，使式VIII的抗体和式VII的酯在任何合适的含水缓冲液中组合。合适的含水缓冲液的示例性列表是磷酸盐缓冲盐水、硼酸盐缓冲盐水和tris缓冲盐水。
使用四氟苯基(“TFP”)或五氟苯基(“PFP”)特别有效地合成本发明的免疫缀合物。
抗体
免疫缀合物中的抗体可为异源抗体。术语“异源抗体”或“同种抗体”是指不来自于所考虑个体(例如带有肿瘤并就医的个体)，但来自于相同物种，或来自于不同物种但已被工程化成用于降低、减少或避免识别为异种抗体(例如非自身)的抗体。例如，“异源抗体”可为人源化抗体。除非另外特别说明，如本文所用，“抗体”和“异源抗体”是指免疫球蛋白G(IgG)或免疫球蛋白A(IgA)。
如果人个体的癌细胞与不由该同一人所产生的抗体(例如，抗体由第二人个体产生，抗体由另一物种诸如小鼠产生，抗体是由另一物种所产生的人源化抗体等)接触，则抗体被视为异源(相对于第一个体)。识别人抗原(例如，癌症特异性抗原，富集于癌细胞之中和/或之上的抗原等)的人源化小鼠单克隆抗体被视为“同种抗体”(异源抗体)。
在一些实施方案中，抗体是多克隆异源IgG抗体。在一些实施方案中，抗体存在于具有多种结合特异性的多克隆IgG抗体的混合物中。在一些情况下，混合物中的抗体特异性地结合不同靶分子，并且在一些情况下混合物中的抗体特异性地结合相同靶分子的不同表位。因此，抗体的混合物可在一些情况下包含超过一种本发明的免疫缀合物(例如，佐剂部分可共价结合至混合物(例如多克隆IgG抗体的混合物)中的抗体，从而导致本发明的抗体-佐剂缀合物的混合物)。抗体的混合物可收集自2个或更多个个体(例如，3个或更多个个体、4个或更多个个体、5个或更多个个体、6个或更多个个体、7个或更多个个体、8个或更多个个体、9个或更多个个体、10个或更多个个体等)。在一些情况下，收集的血清被用作同种抗体的来源，其中血清可来自于任何数量的个体，其中没有一者为第一个体(例如，血清可收集自2个或更多个个体、3个或更多个个体、4个或更多个个体、5个或更多个个体、6个或更多个个体、7个或更多个个体、8个或更多个个体、9个或更多个个体、10个或更多个个体等)。在一些情况下，将抗体在使用之前从血清分离或纯化。可在从不同个体收集抗体之前或之后进行纯化。
在免疫缀合物中的抗体包含来自血清的IgG的情况下，一些(例如，大于0％但小于50％)、一半、大部分(大于50％但小于100％)、或甚至所有的抗体(即来自血清的IgG)的靶抗原将是未知的。然而，混合物中的至少一种抗体将识别所关注靶抗原的机会较高，因为此类混合物含有对各种不同靶抗原有特异性的各种不同抗体。
在一些实施方案中，抗体是多克隆异源IgA抗体。在一些实施方案中，抗体存在于具有多种结合特异性的多克隆IgA抗体的混合物中。在一些情况下，混合物中的抗体特异性地结合不同靶分子，并且在一些情况下混合物中的抗体特异性地结合相同靶分子的不同表位。因此，抗体的混合物可在一些情况下包含超过一种本发明的免疫缀合物(例如，佐剂部分可共价结合至混合物(例如多克隆IgA抗体的混合物)中的抗体，从而导致本发明的抗体-佐剂缀合物的混合物)。抗体的混合物可收集自2个或更多个个体(例如，3个或更多个个体、4个或更多个个体、5个或更多个个体、6个或更多个个体、7个或更多个个体、8个或更多个个体、9个或更多个个体、10个或更多个个体等)。在一些情况下，收集的血清被用作同种抗体的来源，其中血清可来自于任何数量的个体，其中没有一者为第一个体(例如，血清可收集自2个或更多个个体、3个或更多个个体、4个或更多个个体、5个或更多个个体、6个或更多个个体、7个或更多个个体、8个或更多个个体、9个或更多个个体、10个或更多个个体等)。在一些情况下，将抗体在使用之前从血清分离或纯化。可在从不同个体收集抗体之前或之后进行纯化。
在免疫缀合物中的抗体包含来自血清的IgA的情况下，一些(例如，大于0％但小于50％)、一半、大部分(大于50％但小于100％)、或甚至所有的抗体(即来自血清的IgA)的靶抗原将是未知的。然而，混合物中的至少一种抗体将识别所关注靶抗原的机会较高，因为此类混合物含有对各种不同靶抗原有特异性的各种不同抗体。
在一些情况下，免疫缀合物中的抗体包括静脉内免疫球蛋白(IVIG)和/或来自(例如富集自，纯化自，例如亲和纯化自)IVIG的抗体。IVIG是含有收集自多个(例如，有时1,000以上至60,000个)正常和健康血液供体的血浆(例如，在一些情况下不具有任何其他蛋白质)的IgG(免疫球蛋白G)的血液制品。IVIG是可商购获得的。IVIG含有高百分比的天然人单体IVIG，并且具有较低IgA含量。当静脉内施用时，IVIG改善若干病症。因此，美国食品和药品管理局(United States Food and Drug Administration，FDa)已批准使用IVIG用于多种疾病，包括(1)川崎病；(2)免疫介导的血小板减少症；(3)原发性免疫缺陷；(4)造血干细胞移植(对年龄大于20岁的那些)；(5)慢性B细胞淋巴细胞白血病；以及(6)儿科HIV 1型感染。在2004年，FDA批准了肾移植受体的Cedars-Sinai IVIG方案，使得此类受体可接受任何健康供体的活供体肾，而不考虑血液类型(ABO不相容)或组织匹配。IVIG的这些及其他方面描述于例如美国专利申请公布2010/0150942；2004/0101909；2013/0177574；2013/0108619；以及2013/0011388；它们据此全文以引用方式并入。
在一些情况下，抗体是所定义亚型的单克隆抗体(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、或IgA2)。如果使用抗体的组合，抗体可来自于相同亚型或不同亚型。例如，抗体可为IgG1抗体。本领域的技术人员可获得不同相对比例的不同亚型的各种组合。在一些情况下，特定亚型、或不同亚型的特定组合可在癌症治疗或肿瘤尺寸降低中特别有效。因此，本发明的一些实施方案提供了免疫缀合物，其中抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，单克隆抗体是人源化的。
在一些实施方案中，抗体结合至癌细胞的抗原。例如，抗体可结合在癌细胞表面上以至少10；100；1,000；10,000；100,000；1,000,000；2.5×106；5×106；或1×107个或更多个拷贝的量存在的靶抗原。
在一些实施方案中，相比于非癌细胞上对应的抗原，抗体以较高的亲和力结合至癌细胞或免疫细胞上的抗原。例如，相比于识别非癌细胞或非免疫细胞上对应的野生型抗原，抗体可优先地识别存在于癌细胞或免疫细胞上的含有多态性的抗原。在一些情况下，抗体以比非癌细胞或非免疫细胞更大的亲合力结合癌细胞或免疫细胞。例如，癌细胞或免疫细胞可表达较高密度的抗原，因此提供多价抗体与癌细胞或免疫细胞的较高亲和力结合。
在一些情况下，抗体不显著结合非癌抗原(例如，抗体以比靶癌抗原低至少10；100；1,000；10,000；100,000；或1,000,000倍的亲和力(较高Kd)结合一种或多种非癌抗原)。在一些情况下，抗体所结合的靶癌抗原富集于癌细胞上。例如，靶癌抗原可以比对应的非癌细胞高至少2、5、10；100；1,000；10,000；100,000；或1,000,000倍的水平存在于癌细胞的表面上。在一些情况下，对应的非癌细胞是不过度增殖或换句话讲呈癌性的相同组织或来源的细胞。一般来讲，相对于其他可用抗原，特异性结合至癌细胞的抗原(靶抗原)的受试者IgG抗体优先地结合至该特定抗原。然而，靶抗原不需要特定于癌细胞或甚至相对于其他细胞(例如，靶抗原可由其他细胞表达)而言富集于癌细胞中。因此，在短语“特异性结合至癌细胞的抗原的抗体”中，术语“特异性”是指抗体的特异性并且不指抗原在该特定细胞类型中的独特性。
经修饰Fc区
在一些实施方案中，免疫缀合物中的抗体含有经修饰Fc区，其中修饰调节Fc区与一种或多种Fc受体的结合。
术语“Fc受体”或“FcR”是指结合至抗体的Fc区的受体。存在三类主要的Fc受体：结合至IgG的FcγR，结合至IgA的FcαR，以及结合至IgE的FcεR。FcγR家族包括若干成员，诸如FcγI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16A)、FcγRIIIB(CD16B)。Fcγ受体的区别在于其对IgG的亲和力，并且还对IgG亚型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)具有不同亲和力。
在一些实施方案中，相比于Fc区中缺乏突变的天然抗体，免疫缀合物中的抗体(例如，经由连接子缀合至TLR激动剂诸如TLR7/8激动剂的抗体)在Fc区中含有导致与一种或多种Fc受体(例如FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)和/或FcγRIIIB(CD16b))调节的结合(例如，增加的结合或降低的结合)的一种或多种修饰(例如，氨基酸插入、缺失和/或取代)。在一些实施方案中，免疫缀合物中的抗体在Fc区中含有一种或多种修饰(例如，氨基酸插入、缺失和/或取代)，使抗体Fc区与FcγRIIB的结合降低。在一些实施方案中，相比于Fc区中缺乏突变的天然抗体，免疫缀合物中的抗体在抗体的Fc区中含有使抗体与FcγRIIB的结合降低，同时维持与FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)，和/或FcRγIIIA(CD16a)相同的结合或具有与FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)，和/或FcRγIIIA(CD16a)增加的结合的一种或多种修饰(例如，氨基酸插入、缺失和/或取代)。在一些实施方案中，免疫缀合物中的抗体在Fc区中含有一种或多种修饰，使抗体Fc区与FcγRIIB的结合增加。
在一些情况下，调节的结合由相对于抗体的天然Fc区而言抗体的Fc区中的突变来提供。突变可处于CH2结构域、CH3结构域、或它们的组合中。“天然Fc区”与“野生型Fc区”同义，并且包含与天然存在的Fc区的氨基酸序列相同或与存在于天然抗体(例如利妥昔单抗)中的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1 Fc区；天然序列人IgG2 Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；和天然序列人IgG4 Fc区以及它们天然存在的变体。天然序列Fc包括各种同种异型的Fc(参见例如Jefferis等人，mAbs,1(4)：332-338(2009))。
在一些实施方案中，导致调节的结合一种或多种Fc受体的Fc区的突变可包括一种或多种以下突变：SD(S239D)、SDIE(S239D/I332E)、SE(S267E)、SELF(S267E/L328F)、SDIE(S239D/I332E)、SDIEAL(S239D/I332E/A330L)、GA(G236A)、ALIE(A330L/I332E)、GASDALIE(G236A/S239D/A330L/I332E)、V9(G237D/P238D/P271G/A330R)、以及V11(G237D/P238D/H268D/P271G/A330R)和/或以下氨基酸处的一种或多种突变：E233、G237、P238、H268、P271、L328和A330。用于调节Fc受体结合的另外的Fc区修饰描述于例如美国专利申请公布2016/0145350以及美国专利7,416,726和5,624,821中。
在一些实施方案中，相比于天然非修饰Fc区，免疫缀合物的抗体的Fc区被修饰成具有Fc区的改变糖基化模式。
人免疫球蛋白在各重链的Cγ2结构域中的Asn297残基处糖基化。该N-连接的低聚糖由芯七糖、N-乙酰葡糖胺4甘露糖3(GlcNAc4Man3)构成。已知用内切糖苷酶或PNGase F移除七糖导致抗体Fc区的构象变化，这可显著地降低抗体与活化FcγR的结合亲和力并且导致效应子功能降低。芯七糖通常用半乳糖、等分GlcNAc、岩藻糖或唾液酸加以修饰，其有差别地影响与活化和抑制性FcγR的Fc结合。另外，已经表明，α2,6-唾液酸化增强体内抗炎剂活性，同时去岩藻糖基化导致改善的FcγRIIIa结合并且抗体依赖性细胞毒性和抗体依赖性吞噬作用增加10倍。特异性糖基化模式可因此用于控制炎症效应子功能。
在一些实施方案中，用于改变糖基化模式的修饰是突变。例如Asn297处的取代。在一些实施方案中，Asn297被突变成谷氨酰胺(N297Q)。调节FcγR-调节的信号转导的用抗体控制免疫应答的方法描述于例如美国专利号7,416,726以及美国2007/0014795和美国2008/0286819中。
在一些实施方案中，免疫缀合物的抗体被修饰成含有具有非天然存在的糖基化模式的工程化Fab区。例如，杂交瘤可被遗传工程化成分泌具有允许增加的FcRγIIIa结合和效应子功能的特定突变的无岩藻糖基化mAb、去唾液酸化mAb或去糖基化Fc。在一些实施方案中，免疫缀合物的抗体被工程化成无岩藻糖基化(例如无岩藻糖基化利妥昔单抗，可得自Invivogen，hcd20-mab13)。
在一些实施方案中，免疫缀合物中抗体的整个Fc区与不同的Fc区交换，使得抗体的Fab区缀合至非天然Fc区。例如，通常包含IgG1 Fc区的利妥昔单抗的Fab区可缀合至IgG2、IgG3、IgG4、或IgA，或者通常包含IgG4 Fc区的纳武单抗的Fab区可缀合至IgG1、IgG2、IgG3、IgA1或IgG2。在一些实施方案中，具有非天然Fc结构域的Fc修饰抗体还包含调节所述Fc结构域的稳定性的一种或多种氨基酸修饰，诸如IgG4 Fc内的S228P突变。在一些实施方案中，具有非天然Fc结构域的Fc修饰抗体还包含调节Fc与FcR的结合的本文所述的一种或多种氨基酸修饰。
在一些实施方案中，当相比于天然非修饰抗体时，调节Fc区与FcR的结合的修饰并不改变抗体的Fab区与其抗原的结合。在其他实施方案中，当相比于天然非修饰抗体时，调节Fc区与FcR的结合的修饰还增加抗体的Fab区与其抗原的结合。
抗体靶标
在一些实施方案中，抗体能够结合选自以下的一种或多种靶标(例如特异性结合至选自以下的靶标)：5T4、ABL、ABCF1、ACVR1、ACVR1B、ACVR2、ACVR2B、ACVRL1、ADORA2A、聚集蛋白聚糖、AGR2、AICDA、AIF1、AIGI、AKAP1、AKAP2、AMH、AMHR2、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL3、ANGPTL4、ANPEP、APC、APOCl、AR、芳香酶、ATX、AX1、AZGP1(锌-a-糖蛋白)、B7.1、B7.2、B7-H1、BAD、BAFF、BAG1、BAI1、BCR、BCL2、BCL6、BCMA、BDNF、BLNK、BLR1(MDR15)、BIyS、BMP1、BMP2、BMP3B(GDFIO)、BMP4、BMP6、BMP8、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2、BPAG1(网蛋白)、BRCA1、C19orflO(IL27w)、C3、C4A、C5、C5R1、CA9、CANT1、CAPRIN-1、CASP1、CASP4、CAV1、CCBP2(D6/JAB61)、CCL1(1-309)、CCLI1(嗜酸细胞活化趋化因子)、CCL13(MCP-4)、CCL15(MIP-Id)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19(MIP-3b)、CCL2(MCP-1)、MCAF、CCL20(MIP-3a)、CCL21(MEP-2)、SLC、exodus-2、CCL22(MDC/STC-I)、CCL23(MPIF-I)、CCL24(MPIF-2/嗜酸细胞活化趋化因子-2)、CCL25(TECK)、CCL26(嗜酸细胞活化趋化因子-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CCL3(MIP-Ia)、CCL4(MIPIb)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCNA1、CCNA2、CCND1,CCNE1,CCNE2,CCR1(CKR1/HM145)、CCR2(mcp-IRB/RA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBI1)、CCR8或CDw198(CMKBR8/TERI/CKR-L1)、CCR9(GPR-9-6)、CCRL1(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)、CD164、CD19、CDIC、CD2、CD20、CD21、CD200、CD-22、CD24、CD27、CD28、CD3、CD33、CD35、CD37、CD38、CD3E、CD3G、CD3Z、CD4、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45RB、CD47、CD52、CD69、CD72、CD74、CD79A、CD79B、CD8、CD80、CD81、CD83、CD86、CD137、CD152、CD274、CDH1(E钙粘合素)、CDH1O、CDH12、CDH13、CDH18、CDH19、CDH2O、CDH5、CDH7、CDH8、CDH9、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK9、CDKN1A(p21Wap1/Cip1)、CDKN1B(p27Kip1)、CDKN1C、CDKN2A(p16INK4a)、CDKN2B、CDKN2C、CDKN3、CEBPB、CERI、CHGA、CHGB、几丁质酶、CHST1O、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、CLDN3、CLDN7(紧密连接蛋白-7)、CLN3、CLU(丛集素)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CNR1、COL18A1、COLIA1、COL4A3、COL6A1、CR2、Cripto、CRP、CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(GCSF)、CTAG1B(NY-ESO-1)、CTL8、CTNNB1(b-连环蛋白)、CTSB(组织蛋白酶B)、CX3CL1(SCYD1)、CX3CR1(V28)、CXCL1(GRO1)、CXCL1O(IP-IO)、CXCLI1(1-TAC/IP-9)、CXCL12(SDF1)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL2(GRO2)、CXCL3(GRO3)、CXCL5(ENA-78/LIX)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR4、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、CYB5、CYC1、CYSLTR1、DAB2IP、DES、DKFZp451J0118、DNCL1、DPP4、E2F1、Engel、Edge、Fennel、EFNA3、EFNB2、EGF、EGFR、ELAC2、ENG、Enola、ENO2、ENO3、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHA9、EPHA10、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、EPHRIN-A1、EPHRIN-A2、EPHRINA3、EPHRIN-A4、EPHRIN-A5、EPHRIN-A6、EPHRIN-B1、EPHRIN-B2、EPHRIN-B3、EPHB4、EPG、ERBB2(HER2)、EREG、ERK8、雌激素受体、Earl、ESR2、F3(TF)、FADD、法尼基转移酶、FasL、FASNf、FCER1A、FCER2、FCGR3A、FGF、FGF1(aFGF)、FGF10、FGF1 1、FGF12、FGF12B、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF2(bFGF)、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF8、FGF9、FGFR3、FIGF(VEGFD)、FIL1(EPSILON)、FBL1(ZETA)、FLJ12584、FLJ25530、FLRT1(纤连蛋白)、FLT1、FLT-3、FOLR1、FOS、FOSL1(FRA-1)、FY(DARC)、GABRP(GABAa)、GAGEB1、GAGEC1、GALNAC4S-6ST、GATA3、GD2、GDF5、GFI1、GGT1、GM-CSF、GNAS1、GNRH1、GPC3、GPR2(CCR10)、GPR31、GPR44、GPR81(FKSG80)、GRCC1O(C1O)、GRP、GSN(凝溶胶蛋白)、GSTP1、HAVCR2、HDAC、HDAC4、HDAC5、HDAC7A、HDAC9、Hedgehog、HGF、HIF1A、HIP1、组胺和组胺受体、HLA-A、HLA-DRA、HLA-E、HM74、HMOXI、HSP90、HUMCYT2A、ICEBERG、ICOSL、ID2、IFN-a、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、EFNA6、BFNA7、IFNB1、IFNγ、IFNW1、IGBP1、IGF1、IGFIR、IGF2、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP6、DL-1、ILIO、ILIORA、ILIORB、IL-1、IL1R1(CD121a)、IL1R2(CD121b)、IL-IRA、IL-2、IL2RA(CD25)、IL2RB(CD122)、IL2RG(CD132)、IL-4、IL-4R(CD123)、IL-5、IL5RA(CD125)、IL3RB(CD131)、IL-6、IL6RA,(CD126)、IR6RB(CD130)、IL-7、IL7RA(CD127)、IL-8、CXCR1(IL8RA)、CXCR2,(IL8RB/CD128)、IL-9、IL9R(CD129)、IL-10、IL10RA(CD210)、IL10RB(CDW210B)、IL-11、IL11RA、IL-12、IL-12A、IL-12B、IL-12RB1、IL-12RB2、IL-13、IL13RA1、IL13RA2、IL14、IL15、IL15RA、IL16、IL17、IL17A、IL17B、IL17C、IL17R、IL18、IL18BP、IL18R1、IL18RAP、IL19、ILIA、ILIB、ILIF10、ILIF5、IL1F6、ILIF7、IL1F8、DL1F9、ILIHYI、ILIR1、IL1R2、ILIRAP、ILIRAPLI、ILIRAPL2、ILIRL1、IL1RL2、ILIRN、IL2、IL20、IL20RA、IL21R、IL22、IL22R、IL22RA2、IL23、DL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL30、IL3RA、IL4、1L4、IL6ST(糖蛋白130)、ILK、INHA、INHBA、INSL3、INSL4、IRAK1、IRAK2、ITGA1、ITGA2、ITGA3、ITGA6(α6整合素)、ITGAV、ITGB3、ITGB4(β4整合素)、JAG1、JAK1、JAK3、JTB、JUN、K6HF、KAI1、KDR、KITLG、KLF5(GC Box BP)、KLF6、KLK10、KLK12、KLK13、KLK14、KLK15、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK9、KRT1、KRT19(角蛋白19)、KRT2A、KRTHB6(毛发特异性II型角蛋白)、L1CAM、LAG3、LAMA5、LEP(瘦素)、Lewis Y抗原、Lingo-p75、Lingo-Troy、LRRC15、LPS、LTA(TNF-b)、LTB、LTB4R(GPR16)、LTB4R2、LTBR、MACMARCKS、MAG或OMgp、MAGEA3、MAGEA6、MAP2K7(c-Jun)、MCP-1、MDK、MIB1、中期因子、MIF、MISRII、MJP-2、MSLN、MK、MKI67(Ki-67)、MMP2、MMP9、MS4A1、MSMB、MT3(金属硫连接蛋白-UI(metallothionectin-UI))、mTOR、MTSS1、MUC1(粘蛋白)、MYC、MYD88、NCK2、神经蛋白聚糖、NFKBI、NFKB2、NGFB(NGF)、NGFR、NgR-Lingo、NgRNogo66、(Nogo)、NgR-p75、NgR-Troy、NMEI(NM23a)、NOTCH、NOTCH1、NOX5、NPPB、NROB1、NROB2、NRID1、NR1D2、NR1H2、NR1H3、NR1H4、NR112、NR113、NR2C1、NR2C2、NR2E1、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR2F6、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR4A3、NR5A1、NR5A2、NR6A1、NRP1、NRP2、NT5E、NTN4、ODZI、OPRDI、P2RX7、PAP、PART1、PATE、PAWR、PCA3、PCDGF、PCNA、PDGFA、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PECAMI、聚乙二醇化的门冬酰胺酶、PF4(CXCL4)、PGF、PGR、肌酸酶蛋白聚糖、PIAS2、PI3激酶、PIK3CG、PLAU(uPA)、PLG、PLXDCI、PKC、PKC-β、PPBP(CXCL7)、PPID、PR1、PRKCQ、PRKD1、PRL、PROC、PROK2、PSAP、PSCA、PSMA、PTAFR、PTEN、PTGS2(COX-2)、PTN、PVRIG、RAC2(P21Rac2)、RANK、RANK配体、RARB、RGS1、RGS13、RGS3、RNFI1O(ZNF144)、Ron、ROBO2、ROR1、RXR、S100A2、SCGB 1D2(亲脂素B)、SCGB2A1(乳腺珠蛋白2)、SCGB2A2(乳腺珠蛋白1)、SCYE1(内皮单核细胞活化细胞因子)、SDF2、SERPENA1、SERPINA3、SERPINB5(乳腺丝抑蛋白)、SERPINEI(PAI-I)、SERPINFI、SHIP-1、SHIP-2、SHB1、SHB2、SHBG、SfcAZ、SLC2A2、SLC33A1、SLC43A1、SLIT2、SPP1、SPRR1B(Spr1)、ST6GAL1、STAB1、STATE、STEAP、STEAP2、TB4R2、TBX21、TCP1O、TDGF1、TEK、TGFA、TGFB1、TGFB1I1、TGFB2、TGFB3、TGFBI、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、THIL、THBS1(血小板反应蛋白-1)、THBS2、THBS4、THPO、TIE(Tie-1)、TIMP3、组织因子、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TNF、TNF-a、TNFAIP2(B94)、TNFAIP3、TNFRSFI1A、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF21、TNFRSF5、TNFRSF6(Fas)、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFSF1O(TRAIL)、TNFSF1 1(TRANCE)、TNFSF12(APO3L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFRSF14(HVEM)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、TNFSF4(OX40配体)、TNFSF5(CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSF8(CD30配体)、TNFSF9(4-1BB配体)、TOLLIP、Toll样受体、TOP2A(拓扑异构酶IIα)、TP53、TPM1、TPM2、TRADD、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、TRKA、TREM1、TREM2、TROP2、TRPC6、TSLP、TWEAK、酪氨酸酶、uPAR、VEGF、VEGFB、VEGFC、多功能蛋白聚糖、VHL C5、VLA-4、WT1、Wnt-1、XCL1(淋巴细胞趋化因子)、XCL2(SCM-Ib)、XCRI(GPR5/CCXCR1)、YY1、ZFPM2、CLEC4C(BDCA-2，DLEC，CD303，CLECSF7)、CLEC4D(MCL，CLECSF8)、CLEC4E(巨噬细胞诱导的性C型凝集素)、CLEC6A(树突状细胞相关凝集素-2)、CLEC5A(MDL-1，CLECSF5)、CLEC1B(CLEC-2)、CLEC9A(DNGR-1)、CLEC7A(树突状细胞相关凝集素-1)、CLEC11A、PDGFRa、SLAMF7、GP6(GPVI)、LILRA1(CD85I)、LILRA2(CD85H，ILT1)、LILRA4(CD85G，ILT7)、LILRA5(CD85F，ILT11)、LILRA6(CD85b，ILT8)、LILRB1、NCR1(CD335，LY94，NKp46)、NCR3(CD335，LY94，NKp46)、NCR3(CD337，NKp30)、OSCAR、TARM1、CD300C、CD300E、CD300LB(CD300B)、CD300LD(CD300D)、KIR2DL4(CD158D)、KIR2DS、KLRC2(CD159C，NKG2C)、KLRK1(CD314，NKG2D)、NCR2(CD336，NKp44)、PILRB、SIGLEC1(CD169，SN)、SIGLEC5、SIGLEC6、SIGLEC7、SIGLEC8、SIGLEC9、SIGLEC10、SIGLEC11、SIGLEC12、SIGLEC14、SIGLEC15(CD33L3)、SIGLEC16、SIRPA、SIRPB1(CD172B)、TREM1(CD354)、TREM2和KLRF1(NKp80)。
在一些实施方案中，抗体结合至FcRγ-偶联受体。在一些实施方案中，FcRγ-偶联受体选自GP6(GPVI)、LILRA1(CD85I)、LILRA2(CD85H，ILT1)、LILRA4(CD85G，ILT7)、LILRA5(CD85F，ILT11)、LILRA6(CD85b，ILT8)、LILRB1、NCR1(CD335，LY94，NKp46)、NCR3(CD335，LY94，NKp46)、NCR3(CD337，NKp30)、OSCAR和TARM1。
在一些实施方案中，抗体结合至DAP12-偶联受体。在一些实施方案中，DAP12-偶联受体选自CD300C、CD300E、CD300LB(CD300B)、CD300LD(CD300D)、KIR2DL4(CD158D)、KIR2DS、KLRC2(CD159C、NKG2C)、KLRK1(CD314，NKG2D)、NCR2(CD336，NKp44)、PILRB、SIGLEC1(CD169，SN)、SIGLEC5、SIGLEC6、SIGLEC7、SIGLEC8、SIGLEC9、SIGLEC10、SIGLEC11、SIGLEC12、SIGLEC14、SIGLEC15(CD33L3)、SIGLEC16、SIRPB1(CD172B)、TREM1(CD354)和TREM2。
在一些实施方案中，抗体结合至带有hemITAM的受体。在一些实施方案中，带有hemITAM的受体是KLRF1(NKp80)。
在一些实施方案中，抗体能够结合选自以下的一种或多种靶标：CLEC4C(BDCA-2，DLEC，CD303，CLECSF7)、CLEC4D(MCL，CLECSF8)、CLEC4E(巨噬细胞诱导性C型凝集素)、CLEC6A(树突状细胞相关凝集素-2)、CLEC5A(MDL-1，CLECSF5)、CLEC1B(CLEC-2)、CLEC9A(DNGR-1)和CLEC7A(树突状细胞相关凝集素-1)。在一些实施方案中，抗体能够结合CLEC6A(树突状细胞相关凝集素-2)或CLEC5A。在一些实施方案中，抗体能够结合CLEC6A(树突状细胞相关凝集素-2)。
在一些实施方案中，抗体能够结合选自以下的一种或多种靶标(例如特异性结合至选自以下的靶标)：ATP5I(Q06185)、OAT(P29758)、AIFM1(Q9Z0X1)、AOFA(Q64133)、MTDC(P18155)、CMC1(Q8BH59)、PREP(Q8K411)、YMEL1(O88967)、LPPRC(Q6PB66)、LONM(Q8CGK3)、ACON(Q99KI0)、ODO1(Q60597)、IDHP(P54071)、ALDH2(P47738)、ATPB(P56480)、AATM(P05202)、TMM93(Q9CQW0)、ERGI3(Q9CQE7)、RTN4(Q99P72)、CL041(Q8BQR4)、ERLN2(Q8BFZ9)、TERA(Q01853)、DAD1(P61804)、CALX(P35564)、CALU(O35887)、VAPA(Q9WV55)、MOGS(Q80UM7)、GANAB(Q8BHN3)、ERO1A(Q8R180)、UGGG1(Q6P5E4)、P4HA1(Q60715)、HYEP(Q9D379)、CALR(P14211)、AT2A2(O55143)、PDIA4(P08003)、PDIA1(P09103)、PDIA3(P27773)、PDIA6(Q922R8)、CLH(Q68FD5)、PPIB(P24369)、TCPG(P80318)、MOT4(P57787)、NICA(P57716)、BASI(P18572)、VAPA(Q9WV55)、ENV2(P11370)、VAT1(Q62465)、4F2(P10852)、ENOA(P17182)、ILK(O55222)、GPNMB(Q99P91)、ENV1(P10404)、ERO1A(Q8R180)、CLH(Q68FD5)、DSG1A(Q61495)、AT1A1(Q8VDN2)、HYOU1(Q9JKR6)、TRAP1(Q9CQN1)、GRP75(P38647)、ENPL(P08113)、CH60(P63038)和CH10(Q64433)。在前述列表中，登录号示出于括号中。
在一些实施方案中，抗体结合至选自以下的抗原：CCR8、CDH1、CD19、CD20、CD29、CD30、CD38、CD40、CD47、EpCAM、MUC1、MUC16、EGFR、HER2、SLAMF7和gp75。在一些实施方案中，抗原选自CCR8、CD19、CD20、CD47、EpCAM、MUC1、MUC16、EGFR和HER2。在一些实施方案中，抗体结合至选自以下的抗原：Tn抗原和Thomsen-Friedenreich抗原。在一些实施方案中，抗体结合至选自以下的抗原：EGFR、CCR8和HER2。在某些实施方案中，抗体结合至HER2。
在一些实施方案中，抗体或Fc融合蛋白选自：阿巴伏单抗、阿巴西普(也称为ORENCIATM)、阿昔单抗(也称为REOPROTM，c7E3 Fab)、阿达木单抗(也称为HUMIRATM)、阿德木单抗、阿仑单抗(也称为CAMPATHTM，MabCampath或Campath-1H)、阿妥莫单抗、阿非莫单抗、马安莫单抗、anetumumab、anrukizumab、阿泊珠单抗、阿西莫单抗、阿塞珠单抗、阿特利珠单抗、阿托木单抗、巴匹珠单抗、巴利昔单抗(也称为SIMULECTTM)、巴维昔单抗、贝妥莫单抗(也称为LYMPHOSCANTM)、贝利单抗(也称为LYMPHO-STAT-BTM)、柏替木单抗、贝索单抗、贝伐单抗(也称为AVASTINTM)、比西单抗、溴烯比妥、比伐妥珠单抗、坎帕斯、康纳单抗(也称为ACZ885)、莫坎妥珠单抗、卡罗单抗(也称为PROSTASCINTTM)、卡妥索单抗(也称为REMOVABTM)、西利珠单抗(也称为CIMZIATM)、赛妥珠单抗、西妥昔单抗(也称为ERBITUXTM)、克立昔单抗、达西珠单抗、达昔单抗、达克珠单抗(也称为ZENAPAXTM)、地诺单抗(也称为AMG162)、地莫单抗、阿托度单抗、多利昔珠单抗(dorlixizumab)、duntumumab、durimulumab、durmulumab、依美昔单抗、依库丽单抗(也称为SOLIRISTM)、埃巴单抗、依决洛单抗(也称为Mab17-1A，PANOREXTM)、依法利珠单抗(也称为RAPTIVATM)、依芬古单抗(也称为MYCOGRABTM)、伊斯利莫、培戈赖莫单抗、西依匹莫单抗、西艾匹莫单抗、epitumomab、依帕珠单抗、厄利珠单抗、厄马索单抗(也称为REXOMUNTM)、依那西普(也称为ENBRELTM)、伊瑞西珠(也称为etaratuzumab，VITAXINTM，ABEGRINTM)、艾韦单抗、法索单抗(也称为NEUTROSPECTM)、法拉莫单抗、泛维珠单抗、冯特利珠单抗(也称为HUZAFTM)、加利昔单抗、gantenerumab、加维莫单抗(也称为ABXCBLTM)、吉妥单抗(也称为MYLOTARGTM)、戈利木单抗(也称为CNTO 148)、戈利昔单抗、伊巴利珠单抗(也称为TNX-355)、替伊莫单抗(也称为ZEVALINTM)、伊戈伏单抗、英西单抗、英夫利昔单抗(也称为REMICADETM)、伊诺莫单抗、奥英妥珠单抗、易普利姆玛(也称为MDX-010，MDX-101)、伊妥木单抗、凯利昔单抗、拉贝珠单抗、来马索单抗、lebrilizumab、乐地单抗、来沙木单抗(也称为HGS-ETR2，ETR2-ST01)、lexitumumab、利韦单抗、林妥珠单抗、鲁卡木单抗、鲁昔单抗、马帕木单抗(也称为HGSETR1，TRM-1)、马司莫单抗、马妥珠单抗(也称为EMD72000)、美泊利单抗(也称为BOSATRIATM)、美替木单抗、马妥珠单抗、明瑞莫单抗、米妥莫单抗、莫罗木单抗、莫维珠单抗(也称为NUMAXTM)、莫罗单抗(也称为OKT3)、他那可单抗、伊那莫单抗、那他珠单抗(也称为TYSABRITM，ANTEGRENTM)、奈巴库单抗、奈瑞莫单抗、尼妥珠单抗(也称为THERACIM hR3TM，THERA-CIM-hR3TM，THERALOCTM)、巯诺莫单抗(也称为VERLUMATM)、ocrelizumab、奥度莫单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗(也称为XOLAIRTM)、奥戈伏单抗(也称为OVAREXTM)、奥昔珠单抗、帕吉昔单抗、帕利珠单抗(也称为SYNAGISTM)、帕尼单抗(也称为ABX-EGF，VECTIBIXTM)、帕考珠单抗、pemtumomab(也称为THERAGYNTM)、帕妥珠单抗(也称为2C4，OMNITARGTM)、培克珠单抗、平妥莫单抗、普立昔单抗、普托木单抗、兰尼单抗(也称为LUCENTISTM)、瑞西巴库、瑞加韦单抗、瑞利珠单抗、利妥昔单抗(也称为RITUXANTM，MabTHERATM)、罗维珠单抗、芦利珠单抗、沙妥莫单抗、司韦单抗、西罗珠单抗、希普利珠单抗(也称为MEDI-507)、索土珠单抗、司他莫鲁(也称为MYO-029)、硫索单抗(也称为LEUKOSCANTM)、替他珠单抗、他度珠单抗、他利珠单抗、帕他普莫单抗、替非珠单抗(也称为AUREXISTM)、阿替莫单抗、替奈昔单抗、替利珠单抗、替西木单抗、托珠单抗(也称为ACTEMRATM)、托利珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗(也称为HERCEPTINTM)、替西木单抗(也称为CP-675,206)、西莫白介素单抗、妥韦单抗、乌珠单抗、优特克单抗(也称为CNTO 1275)、伐利昔单抗、维妥珠单抗、维帕莫单抗、维西珠单抗(也称为NUVIONTM)、伏洛昔单抗(也称为M200)、伏妥莫单抗(也称为HUMASPECTTM)、扎鲁目单抗、扎木单抗(也称为HuMAX-CD4)、齐拉木单抗、阿佐莫单抗、达雷木单抗、elotuxumab、obintunzumab、奥拉木单抗、本妥昔单抗、阿帕西普(afibercept)、阿巴西普、贝拉西普、阿柏西普、依那西普、咯咪珀咯、SBT-040(美国2017/0158772中所列的序列)。在一些实施方案中，抗体是曲妥珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、扎鲁目单抗、尼妥珠单抗、或马妥珠单抗。在某些实施方案中，抗体是曲妥珠单抗。
检查点抑制剂
任何合适的免疫检查点抑制剂被设想用于本文所公开的免疫缀合物。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂使一种或多种免疫检查点蛋白质的表达或活性降低。在另一个实施方案中，免疫检查点抑制剂降低一种或多种免疫检查点蛋白质与其配体之间的相互作用。使免疫检查点分子的表达和/或活性降低的抑制性核酸也可用于本文所公开的方法中。
大部分检查点抗体被设计成不具有效应子功能，原因是它们不试图杀伤细胞，而是阻断信号转导。本发明的免疫缀合物可回加活化骨髓免疫所需的“效应子功能”。因此，对于大部分检查点抗体抑制剂，该发现将至关重要。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4，也称为CD152)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白质(GITR，也称为TNFRSF18)、可诱导T细胞共刺激因子(ICOS，也称为CD278)、CD96、脊髓灰质炎病毒受体-相关分子2(PVRL2，也称为CD112R)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1，也称为CD279)、程序性细胞死亡1配体1(PD-L1，也称为B7-H3和CD274)、程序性细胞死亡配体2(PD-L2，也称为B7-DC和CD273)、淋巴细胞活化基因-3(LAG-3，也称为CD223)、B7-H4、杀伤细胞免疫球蛋白受体(KIR)、肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4，也称为OX40和CD134)及其配体OX40L(CD252)、吲哚胺2,3-双氧化酶1(IDO-1)、吲哚胺2,3-双氧化酶2(IDO-2)、癌胚抗原相关细胞黏附分子1(CEACAM1)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA，也称为CD272)、T-细胞膜蛋白3(TIM3)、腺苷A2A受体(A2Ar)、以及T细胞活化的V结构域Ig抑制剂(VISTA蛋白质)。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是CTLA4、PD-1或PD-L1的抑制剂。
在一些实施方案中，抗体选自：易普利姆玛(也称为)、派姆单抗(也称为)、纳武单抗(也称为)、阿特朱单抗(也称为)、阿利库单抗(也称为)和度伐单抗(也称为ImfinziTM)。在一些实施方案中，抗体选自：易普利姆玛(也称为)、派姆单抗(也称为)、纳武单抗(也称为)和阿特朱单抗(也称为)。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是CTLA4的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA4的抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA4的单克隆抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA4的人或人源化抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂使一种或多种免疫检查点蛋白质诸如CTLA4的表达或活性降低。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-1的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1的抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1的单克隆抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-1的人或人源化抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂使一种或多种免疫检查点蛋白质诸如PD-1的表达或活性降低。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-L1的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-L1的抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-L1的单克隆抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-L1的人或人源化抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂使一种或多种免疫检查点蛋白质诸如PD-L1的表达或活性降低。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂使PD-1与PD-L1之间的相互作用降低。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-L2的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-L2的抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-L2的单克隆抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗PD-L2的人或人源化抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂使一种或多种免疫检查点蛋白质诸如PD-L2的表达或活性降低。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂使PD-1与PD-L2之间的相互作用降低。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是LAG-3的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗LAG-3的抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗LAG-3的单克隆抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗LAG-3的人或人源化抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂使一种或多种免疫检查点蛋白质诸如LAG-3的表达或活性降低。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是B7-H4的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗B7-H4的抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗B7-H4的单克隆抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗B7-H4的人或人源化抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂使一种或多种免疫检查点蛋白质诸如B7-H4的表达或活性降低。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是KIR的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗KIR的抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗KIR的单克隆抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗KIR的人或人源化抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂使一种或多种免疫检查点蛋白质诸如KIR的表达或活性降低。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是TNFRSF4的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗TNFRSF4的抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗TNFRSF4的单克隆抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗TNFRSF4的人或人源化抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂使一种或多种免疫检查点蛋白质诸如TNFRSF4的表达或活性降低。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是OX40L的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗OX40L的抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗OX40L的单克隆抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗OX40L的人或人源化抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂使一种或多种免疫检查点蛋白质诸如OX40L的表达或活性降低。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂使TNFRSF4与OX40L之间的相互作用降低。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是IDO-1的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗IDO-1的抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗IDO-1的单克隆抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗IDO-1的人或人源化抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂使一种或多种免疫检查点蛋白质诸如IDO-1的表达或活性降低。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是IDO-2的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗IDO-2的抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗IDO-2的单克隆抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗IDO-2的人或人源化抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂使一种或多种免疫检查点蛋白质诸如IDO-2的表达或活性降低。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是CEACAM1的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗CEACAM1的抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗CEACAM1的单克隆抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗CEACAM1的人或人源化抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂使一种或多种免疫检查点蛋白质诸如CEACAM1的表达或活性降低。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是BTLA的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗BTLA的抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗BTLA的单克隆抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗BTLA的人或人源化抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂使一种或多种免疫检查点蛋白质诸如BTLA的表达或活性降低。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是TIM3的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗TIM3的抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗TIM3的单克隆抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗TIM3的人或人源化抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂使一种或多种免疫检查点蛋白质诸如TIM3的表达或活性降低。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是A2Ar的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗A2Ar的抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗A2Ar的单克隆抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗A2Ar的人或人源化抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂使一种或多种免疫检查点蛋白质诸如A2Ar的表达或活性降低。
在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是VISTA蛋白质的抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗VISTA蛋白质的抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗VISTA蛋白质的单克隆抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗VISTA蛋白质的人或人源化抗体。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂使一种或多种免疫检查点蛋白质诸如VISTA蛋白质的表达或活性降低。
生物类似物
本发明的免疫缀合物可能对于高度类似或生物类似于可商购获得的或“创新”抗体构建体的抗体构建体有效。生物类似物免疫缀合物将可能与可商购获得的抗体一样有效地引发髓细胞活化。
DAR比率
本发明的免疫缀合物提供了所期望的DAR比率。例如，DAR比率为约1。
同种型修饰
就期望的应用而言，当抗体(诸如利妥昔单抗)的IgG1 Fc区与IgG1 AF、IgG1 NQ、IgG2、IgG3、IgG4或IgA2交换并且然后形成为本发明的免疫缀合物时，可调节并通常改善免疫缀合物的活性。
约30％的人IgG在Fab区内糖基化，并且本发明的免疫缀合物中的抗体可含有具有非天然存在的糖基化模式的工程化Fab区。例如，杂交瘤可被遗传工程化成分泌具有允许增加的FcRγIIIa结合和效应子功能的特定突变的无岩藻糖基化mAb、去唾液酸化mAb或去糖基化Fc。
用于形成免疫缀合物的抗体可含有工程化(即非天然存在的)半胱氨酸残基，其特征在于针对用于共价结合佐剂部分与抗体的试剂的反应性改变(例如增强)。在某些实施方案中，工程化半胱氨酸残基具有0.6至1.0的范围内的硫醇反应值。在许多情况下，工程化抗体将比亲本抗体更具反应性。
一般来讲，工程化残基是不作为二硫桥的一部分的“游离”半胱氨酸残基。术语“硫醇反应值”是游离半胱氨酸氨基酸的反应性的定量表征。如本文所用，术语“硫醇反应值”是指与硫醇反应性试剂反应的工程化抗体中游离半胱氨酸氨基酸的百分比，并且转换为最大值1。例如，以100％收率与硫醇反应性试剂(诸如马来酰亚胺)反应形成修饰抗体的工程化抗体中的半胱氨酸残基具有1.0的硫醇反应值。以80％收率与硫醇反应性试剂反应的工程化到相同或不同亲本抗体中的另外半胱氨酸残基具有0.8的硫醇反应值。特定半胱氨酸残基的硫醇反应值的测定可通过ELISA测定、质谱、液相色谱、放射自显影、或其他定量分析性测试进行。
工程化半胱氨酸残基可位于抗体重链或抗体轻链中。在某些实施方案中，工程化半胱氨酸残基位于重链的Fc区中。例如，抗体轻链中第L-15、L-43、L-110、L-144和L-168位或者抗体重链中第H-40、H-88、H-119、H-121、H-122、H-175和H-179位的氨基酸残基可用半胱氨酸残基替代。这些位置每侧约5个氨基酸残基内的位置也可用半胱氨酸残基替代，即L-10至L-20；L-38至L-48；L-105至L-115；L-139至L-149；L-163至L-173；H-35至H-45；H-83至H-93；H-114至H-127；和H-170至H-184，以及选自以下的Fc区中的位置：H-268至H-291；H-319至H-344；H-370至H-380；和H-395至H-405，以提供形成免疫缀合物的可用半胱氨酸工程化抗体。其他工程化抗体描述于例如美国专利7,855,275；8,309,300；和9,000,130中，这些专利据此以引用方式并入。
除抗体之外，可选的蛋白质支架可用作免疫缀合物的一部分。术语“可选的蛋白质支架”是指非免疫球蛋白衍生的蛋白质或肽。此类蛋白质和肽通常适用于工程化并且可被设计成赋予对给定抗原的单特异性、双特异性或多特异性。对可选的蛋白质支架的工程化可使用若干方法进行。可使用已知特异性的序列被接枝到支架的可变环上的环接枝法。序列随机化和诱变可用于开发突变体的文库，其可使用各种展示平台(例如噬菌体展示)鉴定新型结合剂进行筛选。位点特异性诱变也可用作类似方法的一部分。可选的蛋白质支架以多种尺寸存在，范围是从具有最小次级结构的小肽到类似尺寸的大蛋白质到全尺寸抗体。支架的示例包括但不限于胱氨酸结小蛋白(也称为打结素)、环状胱氨酸结小蛋白(也称为环肽)、高亲和性多聚体、亲和体、人纤粘蛋白第十III型结构域、DARPins(设计的锚蛋白重复序列)和抗运载蛋白(也称为脂笼蛋白质类)。具有已知特异性的天然存在的配体也可被工程化成赋予给定靶标新型特异性。可被工程化的天然存在的配体的示例包括EGF配体和VEGF配体。工程化蛋白质可产生为单体蛋白质或多聚体，这取决于所需的结合策略和特异性。蛋白质工程化策略可用于融合可选的蛋白质支架与Fc结构域。
抗体佐剂缀合物的制备
用于形成本发明的免疫缀合物的反应在足以共价结合佐剂部分与抗体的条件下进行。一般来讲，反应通过使抗体与佐剂-连接子化合物接触进行，使得抗体中的氨基酸侧链与佐剂连接子化合物反应。在一些实施方案中，当形成免疫缀合物时，佐剂-连接子化合物和抗体以近似等摩尔量使用。在一些实施方案中，当形式免疫缀合物时，使用过量的佐剂-连接子化合物。例如，用于形成免疫缀合物的反应混合物可含有相对于抗体而言约1.1至约50摩尔当量的佐剂-连接子化合物。
反应可在任何合适的温度下进行。一般来讲，反应在约4℃至约40℃的温度下进行。反应可在例如约25℃或约37℃下进行。反应可在任何合适的pH下进行。一般来讲，反应在约4.5至约10的pH下进行。反应可在例如约5至约9的pH下进行。在一些实施方案中，反应在接近中性pH(即约pH 7)下进行。在一些实施方案中，反应在7.2至7.5的范围的pH下进行。反应可进行任何合适的时间长度。一般来讲，反应混合物在合适的条件下温育约1分钟与若干小时之间的任意时间。反应可进行例如约1分钟、或约5分钟、或约10分钟、或约30分钟、或约1小时、或约2小时、或约4小时、或约8小时、或约12小时、或约24小时、或约48小时、或约72小时。本发明的方法中可采用其他反应条件，这取决于免疫缀合物中抗体的身份以及用于安置佐剂部分的试剂。
用于形成抗体佐剂缀合物的反应混合物可含有生物缀合反应中通常所用的另外的试剂种类。例如，在某些实施方案中，反应混合物可含有缓冲剂(例如，2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)、3-吗啉丙烷-1-磺酸(MOPS)、2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇(TRIS)、磷酸钾、磷酸钠、磷酸盐缓冲盐水、柠檬酸钠、醋酸钠和硼酸钠)、共溶剂(例如，二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、乙醇、甲醇、四氢呋喃、丙酮和乙酸)、盐(例如，NaCl、KCl、CaCl2、以及Mn2+和Mg2+的盐)、洗涤剂/表面活性剂(例如，非离子表面活性剂诸如N,N-双[3-(D-葡糖酰氨基)丙基]胆酰胺、聚氧乙烯(20)十六烷基醚、二甲基癸基氧化膦、支化的辛基苯氧基聚(氧乙烯)乙醇、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯等；阴离子表面活性剂，诸如胆酸钠、N-月桂酰肌氨酸、十二烷基硫酸钠等；阳离子表面活性剂，诸如十六烷基三甲基溴化铵、三甲基(十四烷基)溴化铵等；或两性离子表面活性剂，诸如酰氨磺基甜菜碱、3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基-铵基]-1-丙烷磺酸等)、螯合剂(例如，乙二醇-双(2-氨基乙醚)-N,N,N′,N′-四乙酸(EGTA)、2-({2-[双(羧甲基)氨基]乙基}(羧甲基)氨基)乙酸(EDTA)、以及1,2-双(邻-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA))、以及还原剂(例如，二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇(BME)和三(2-羧乙基)膦(TCEP))。缓冲剂、共溶剂、盐、洗涤剂/表面活性剂、螯合剂和还原剂可以任何合适的浓度使用，这可容易的由本领域的普通技术人员确定。一般来讲，缓冲剂、共溶剂、盐、洗涤剂/表面活性剂、螯合剂和还原剂以约1μM至约1M的范围内的浓度包含在反应混合物中。例如，缓冲剂、共溶剂、盐、洗涤剂/表面活性剂、螯合剂、或还原剂可以约1μM、或约10μM、或约100μM、或约1mM、或约10mM、或约25mM、或约50mM、或约100mM、或约250mM、或约500mM、或约1M的浓度包含在混合物中。
免疫缀合物的配制和施用
在相关方面，本发明提供了包含多种上述免疫缀合物的组合物。在一些实施方案中，每个免疫缀合物的平均佐剂部分数量的范围为约1至约10。每个免疫缀合物的平均佐剂部分数量的范围可例如为约1至约10，或约1至约6，或约1至约4。每个免疫缀合物的平均佐剂部分数量可为约0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、或4.2。在一些实施方案中，每个免疫缀合物的平均佐剂部分数量为约4。在一些实施方案中，每个免疫缀合物的平均佐剂部分数量为约2。在一些情况下，抗体共价结合至单个佐剂部分。在一些情况下，抗体共价结合至2个或更多个佐剂部分(例如，3个或更多个，4个或更多个，或5个或更多个佐剂部分)。在一些情况下，抗体共价结合至1至10个佐剂部分(例如，1至8、1至5、1至3、2至10、2至8、2至5、2至3、或3至8个佐剂部分)。在一些情况下，抗体共价结合至2至10个佐剂部分(例如，2至8、2至5、2至3、或3至10、或3至8个佐剂部分)。在抗体共价结合至超过一个佐剂部分的一些情况下，所连接的佐剂部分可以相同或不同。例如，在一些情况下，两个或更多个佐剂部分可以相同(例如，相同佐剂部分的两个不同分子可各自在抗体的不同位点处连接至抗体)。在一些情况下，抗体共价结合至2个或更多个不同佐剂部分(例如，3个或更多个，4个或更多个，或5个或更多个不同佐剂部分)。例如，当生成本发明的免疫缀合物时，可使一种或多种抗体与包含两种或更多种(例如，3种或更多种、4种或更多种、或5种或更多种)不同佐剂-连接子化合物的混合物进行接触，使得一种或多种抗体中的氨基酸侧链与佐剂-连接子化合物反应，因此导致各自共价结合至两个或更多个不同佐剂部分的一种或多种免疫缀合物。
相比于由连接至抗体中的赖氨酸残基所得的异质缀合产物，位点特异性抗体缀合允许佐剂精确的放置到抗体上和均一DAR。位点特异性免疫缀合物可通过抗体的各种修饰来产生。用于位点特异性缀合的方法包括以下方法，但不限于本文所述的那些方法。一种用于位点特异性缀合的方法涉及引入序列，该序列随后被酶识别，从而导致化学改性。例如，酶FGE识别序列Cys-X-Pro-X-Arg。修饰抗体连同FGE在哺乳动物培养物中共表达产生在工程化位点处含有醛标记的抗体。可使用识别天然存在的序列或残基的其他酶，以使化学反应性基团转化，从而允许位点特异性缀合。细菌转谷酰胺酶(BTG)可催化在谷氨酰胺残基与伯胺之间形成键；细菌酶分选酶A可通过识别基序来催化转肽反应。非天然氨基酸也可引入抗体序列中，其可随后反应生成位点特异性缀合物。天然存在的残基诸如氨基酸硒代半胱氨酸可引入抗体中，并且随后与适当的反应性基团(包括但不限于用于位点特异性缀合的马来酰亚胺和碘乙酰胺)反应。另一种方法是引入添加到抗体构建体的重链或轻链中的工程化半胱氨酸残基。编码重链和/或轻链的载体被修饰成引入半胱氨酸残基的密码子序列。缀合通过如下方式进行：首先还原抗体并且然后再氧化，以再生抗体的天然二硫键，从而导致反应性硫醇脱去封端。一旦与佐剂-连接子反应，所得的产物含有具有工程化到抗体中的半胱氨酸残基的数量所定义的DAR的免疫缀合物的同质群体。例如，第205位轻链中引入的从缬氨酸到半胱氨酸的突变(V205C突变)导致了具有在定义位点(V205C)处缀合的佐剂的产物。
在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种可药用的赋形剂。例如，本发明的免疫缀合物可被配制成肠胃外施用，诸如静脉内(IV)施用或施用到体腔或器官内腔中。另选地，免疫缀合物可经肿瘤内注射。注射用制剂通常包含溶解于可药用载体中的免疫缀合物的溶液。在可接受的载体中，并且可采用的溶剂是水和林格氏溶液、等渗氯化钠。此外，无菌固定油可常规地用作溶剂或悬浮介质。为此，可采用任何温和的固定油，包括合成单甘油酯或甘油二酯。此外，脂肪酸诸如油酸同样可用于制备注射剂。这些溶液是无菌的，并且通常不含不期望的物质。这些制剂可通过常规公知的灭菌技术进行灭菌。制剂可含有如近似生理条件所需的可药用的辅助物质，诸如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂例如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中免疫缀合物的浓度可以广泛地变化，并且将根据所选择的特定施用模式和患者的需求，主要地基于流体体积、粘度、体重等进行选择。在某些实施方案中，用于注射的溶液制剂中免疫缀合物的浓度在约0.1％(重量/重量)至约10％(重量/重量)的范围内。
在另一方面，本发明提供了用于治疗癌症的方法。该方法包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的免疫缀合物(例如，上述组合物)。例如，该方法可包括施用免疫缀合物，以向受试者提供约100ng/kg至约50mg/kg的剂量。免疫缀合物剂量的范围可为约5mg/kg至约50mg/kg，约10μg/kg至约5mg/kg，或约100μg/kg至约1mg/kg。免疫缀合物剂量可为约100μg/kg、200μg/kg、300μg/kg、400μg/kg、或500μg/kg。免疫缀合物剂量可为约1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、或10mg/kg。免疫缀合物剂量也可在这些范围之外，这取决于特定免疫缀合物以及要治疗的癌症的类型和严重程度。施用频次的范围可为每周单剂量至多剂量，或更频繁。在一些实施方案中，将免疫缀合物施用每月约一次至每周约五次。在一些实施方案中，将免疫缀合物施用每周一次。
本发明的一些实施方案提供了用于治疗上述癌症的方法，其中癌症是头颈癌。头颈癌(以及头颈鳞状上皮细胞癌)是指以口腔、咽喉、唾液腺、鼻旁窦和鼻腔以及颈上部淋巴结的鳞状上皮细胞癌为特征的多种癌症。头颈癌占美国所有癌症的约3％至5％。这些癌症在超过50岁的男性和人中更为常见。烟草(包括无烟烟草)和醇使用是头颈癌，特别是口腔、口咽、喉咽和喉的那些的最重要风险因素。百分之八十五的头颈癌与烟草使用有关。在本发明的方法中，免疫缀合物可用于靶向多种恶性细胞。例如，免疫缀合物可用于靶向唇、口腔、咽、喉、鼻腔、或鼻窦的鳞状上皮细胞。免疫缀合物可用于靶向黏液表皮样癌细胞、人腺样囊性癌细胞、腺癌细胞、小细胞未分化性癌细胞、鼻腔神经胶质瘤细胞、何杰金淋巴瘤细胞和非何杰金淋巴瘤细胞。在一些实施方案中，用于治疗头颈癌的方法包括施用含有如下抗体的免疫缀合物：能够结合EGFR(例如，西妥昔单抗、帕尼单抗、马妥珠单抗和扎鲁目单抗)、PD-1(例如派姆单抗)和/或MUC1。
本发明的一些实施方案提供了用于治疗上述癌症的方法，其中癌症是乳腺癌。乳腺癌可起源于乳腺的不同区域，并且多种不同类型的乳腺癌已被表征。例如，本发明的免疫缀合物可用于治疗导管原位癌；浸润性导管癌(例如小管癌；髓样癌；粘液癌；乳头状癌；或乳腺筛状癌)；小叶原位癌；浸润性小叶癌；炎性乳腺癌；以及其他形式的乳腺癌。在一些实施方案中，用于治疗乳腺癌的方法包括施用含有如下抗体的免疫缀合物：能够结合HER2(例如曲妥珠单抗、margetuximab)、糖蛋白NMB(例如glembatumumab)和/或MUC1。
本公开的非限制性方面的示例
单独或与一个或多个其他方面或实施方案组合的本文所述的本发明主题的方面，包括实施方案可以是有利的。不限制前述描述，下文提供了本公开编号1至21的某些非限制性方面。如本领域的技术人员在阅读本公开时将显而易见，单独编号的方面每者可被使用或与任何前述或以下单独编号的方面组合。这旨在为所有此类方面的组合提供支持，并且不限于以下明确提供的方面的组合：
1.一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含(a)抗体构建体，所述抗体构建体包含(i)抗原结合结构域和(ii)Fc结构域，(b)佐剂部分，以及(c)连接子，所述连接子包含乙二醇基团或甘氨酸残基，其中每个佐剂部分经由所述连接子共价结合至所述抗体构建体。
2.根据方面1所述的免疫缀合物，其中所述抗体构建体还包含靶向结合结构域。
3.根据方面1所述的免疫缀合物，其中所述抗体构建体是抗体。
4.根据方面1至3中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗原结合结构域结合至癌细胞的抗原。
5.根据方面1至4中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗原结合结构域结合至选自以下的抗原：CCR8、CDH1、CD19、CD20、CD29、CD30、CD38、CD40、CD47、EpCAM、MUC1、MUC16、EGFR、VEGF、HER2、SLAMF7、PDGFRa和gp75。
6.根据方面3至5中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体是IgG1抗体。
7.根据方面3至6中任一项所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有根据式II的结构：
其中是具有表示所述抗体的赖氨酸残基的残基的抗体，其中表示与Z的连接点；Adj是佐剂；下标r是1至10的整数；并且Z是具有乙二醇基团或甘氨酸残基的二价连接部分。
8.根据方面7所述的免疫缀合物，其中Z包含聚(乙二醇)基团。
9.根据方面7或8所述的免疫缀合物，其中Z包含甘氨酸残基。
10.根据方面7至9中任一项所述的免疫缀合物，其中Z还包含二价亚环己基基团。
11.根据方面10所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有根据式IIIa的结构：
其中Z1包含至少一个乙二醇基团或至少一个甘氨酸残基。
12.根据方面10所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有根据式IIIb的结构：
其中Z1包含至少一个乙二醇基团或至少一个甘氨酸残基。
13.根据方面7至9中任一项所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有根据式IV的结构：
或其可药用盐，其中是具有表示所述抗体的赖氨酸残基的残基的抗体，其中表示与G2的连接点，Adj是佐剂，G1是CH2、C＝O、或化学键，G2是CH2、C＝O、或化学键，L是连接子，并且下标r是1至10的整数。
14.根据方面13所述的免疫缀合物，其中L选自：
其中R任选地存在并且为包括1至8个碳单元的线性或支化的、环状或直链的、饱和或不饱和的烷基、杂烷基、芳基、或杂芳基链；a是1至40的整数；每个A独立地选自任何氨基酸；下标c是1至25的整数；虚线表示与G1的连接点；并且波形线表示与G2的连接点。
15.根据方面13或14所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有根据式IVa的结构：
或其可药用盐，其中Ab如本文所定义；Adj是佐剂；G1是CH2、C＝O、或化学键；R任选地存在并且为包括1至8个碳单元的线性或支化的、环状或直链的、饱和或不饱和的烷基、杂烷基、芳基、或杂芳基链；下标a是1至40的整数；并且下标r是1至10的整数。
16.根据方面13或14所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有根据式IVb的结构：
或其可药用盐，其中Ab如本文所定义；Adj是佐剂；G1是CH2、C＝O、或化学键；下标a是1至40的整数；并且下标r是1至10的整数。
17.根据方面13或14所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有根据式IVc的结构：
或其可药用盐，其中Ab如本文所定义；Adj是佐剂；G1是CH2、C＝O、或化学键；R任选地存在并且为包括1至8个碳单元的线性或支化的、环状或直链的、饱和或不饱和的烷基、杂烷基、芳基、或杂芳基链；每个A独立地选自任何氨基酸；下标c是1至25的整数；并且下标r是1至10的整数。
18.根据方面17所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有根据式IVd的结构：
或其可药用盐，其中Ab如本文所定义；Adj是佐剂；G1是CH2、C＝O、或化学键；R任选地存在并且为包括1至8个碳单元的线性或支化的、环状或直链的、饱和或不饱和的烷基、杂烷基、芳基、或杂芳基链；下标c是1至25的整数；并且下标r是1至10的整数。
19.根据方面13或14所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有根据式IVe的结构：
或其可药用盐，其中Ab如本文所定义；Adj是佐剂；G1是CH2、C＝O、或化学键；R任选地存在并且为包括1至8个碳单元的线性或支化的、环状或直链的、饱和或不饱和的烷基、杂烷基、芳基、或杂芳基链；并且下标r是1至10的整数。
20.一种组合物，所述组合物包含多种根据方面1至19中任一项所述的免疫缀合物。
21.一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的根据方面1至19中任一项所述的免疫缀合物或根据方面20所述的组合物。
实施例
实施例1：免疫缀合物I-III的制备
使咪唑并喹啉1(1-(4-氨基丁基)-2-丙基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺)与2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-((2-((2-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-2-氧代乙基)氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)环己烷-1-羧酸酯反应形成NHS-Gly2-CC-1，如以下方案1所示。在方案2中示出，咪唑并喹啉1以类似的方式转化为NHS-EG-CC-1。在方案3中示出，使咪唑并喹啉1和醛2在硼氢化钠的存在下反应，并且所得的中间体用N-羟基琥珀酰亚胺酯化形成NHS-EG-1。
方案1
方案2
方案3
使抗体以1mg/mL至5mg/mL重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，与10倍摩尔过量的NHS-Gly2-CC-1、NHS-EG-CC-1、或NHS-EG-1在室温下反应30分钟。根据制造商的说明书(EMDMillipore)，采用具有Ultracel-100膜的平衡Amicon Ultra离心过滤单元用PBS洗涤3次，从过量的试剂和副产物中纯化所得的免疫缀合物。
佐剂与抗体的平均比率经由MALDI-TOF来测定。使样品脱盐并且使用Zeba Spin脱盐柱(ThermoFisher Scientific)经缓冲液交换到去离子水中。首先，将基质(芥子酸)点样到MALDI样品靶板上并允许干燥。接着，将样品与牛血清白蛋白(BSA)标准物(0.25pM至1pMBSA)以1:1比率混合或不与之混合，并点样到具有基质样品的平板上。一旦基质和样品层均被干燥，将样品在AB Sciex TOF/TOF 5800上进行分析。具有阴离子电离的高质量检测器(CovalX)允许在完全完整IgG抗体(～150,000kDa)范围内蛋白质尺寸下的敏感性和分辨率增强。
观察到人单核细胞在用免疫缀合物刺激过夜后发生DC分化，而采用已知刺激物(例如GM-CSF和IL-4)的DC分化方案需要更长的活化时间。
实施例2：用五氟苯基(“PFP”)酯制备免疫缀合物IV
方案4
该实施例提供使用PFP酯方法合成免疫缀合物的指导。佐剂的酯修饰以及经修饰佐剂与抗体的缀合示于以上方案4中。将环己烷反式-1,4-二羧酸酯(1g)溶解于10mL的二甲基甲酰胺(“DMF”)中，并且添加1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐)(“HATU”)(1mmol)，接着是1mL的N-乙基-N-(丙-2-基)丙-2-胺(“DIPEA”)。添加化合物1(311mg)并将混合物在20℃下搅拌过夜。将反应混合物用50mL二氯甲烷(“DCM”)稀释并且用20mL的1N HCl洗涤。使DCM层蒸发至干并将产物在硅胶上用含有1％乙酸的中的0％至10％MeOH的DCM溶液洗脱进行纯化。使纯级分浓缩，以提供220mg的经纯化的酸3。将化合物3(100mg)溶解于THF中并添加100mg的HATU，接着是200μL的DIPEA。添加两当量的氨基-PEG2-叔丁基-羧酸酯并在20℃下搅拌一小时。使混合物浓缩至干并且添加10毫升含4N HCl的二氧杂环己烷。使混合物浓缩至干，并且通过制备型HPLC纯化粗产物4，以提供40mg的化合物4。
如下所述使化合物4转化为PFP酯5。将化合物4(35mg)添加至含50mg的PFP的5mLTHF中，并且添加5mL DMF，接着是20mg的DCC。添加DMAP(2mg至3mg)，并且将溶液在20℃下搅拌过夜。使反应浓缩并通过快速色谱(用0％至10％MeOH洗脱)进行纯化，以在从1:2的乙腈水冻干之后提供17mg的PFP酯5。
将PFP酯5(相对于IgG而言6摩尔当量)添加至20mg的IgG抗体(具体地，抗CD20抗体利妥昔单抗)(10mg/mL溶于PBS)中并且在37℃下温育过夜。使所得的免疫缀合物IV经缓冲液交换到PBS(pH 7.2)中以移除过量的小分子量试剂，并且在nanodrop上测定浓度。得到15mg的免疫缀合物IV(75％收率)。使产物在4℃下储存。2.2的DAR经由LC/MS分析来测定。除期望的DAR和高收率之外，产物还具有较少杂质，如由SEC分析所测定的。
实施例3：用NHS酯制备免疫缀合物V
方案5
佐剂的酯修饰以及经修饰佐剂与抗体的缀合示于以上方案5中。使化合物1(150mg)溶解于20mL的四氢呋喃(“THF”)中并且添加10mL的饱和碳酸氢钠水溶液。随后，一次性添加50mg的琥珀酸酐并且将混合物在室温下搅拌一小时。缓慢添加二十毫升的1NHCl，并且用2×50mL二氯甲烷萃取混合物。使合并的有机萃取物蒸发至干。将粗产物(6)在4克硅胶柱上用0％至15％MeOH(1％乙酸)洗脱15分钟进行纯化。将纯级分合并，并且蒸发，以提供190mg的纯化合物6。
将化合物6(150mg)溶解于10mL的DMF中，并且添加1当量的HATU，接着是2当量的DIPEA。添加1.5当量的甘氨酸-OtBu并搅拌过夜。使DMF蒸发并且用含5mL的1N HCl的二氧杂环己烷处理残余物30分钟。使溶剂蒸发，并且将粗制化合物7在4克硅胶柱上用0％至10％MeOH洗脱10分钟而快速纯化。使纯级分蒸发，提供110mg的化合物7；使纯材料溶解于DMF中并且重复以上过程，以提供60mg的纯化合物8。
使纯化合物8(30mg)溶解于5mL的DMF中，并且添加1.5当量的NHS，接着是5mL的THF。添加DCC(1.5当量)，并且将混合物在室温下搅拌过夜。使溶剂蒸发，并且将粗制NHS酯在硅胶上用含0％至10％MeOH的DCM洗脱10分钟而快速纯化。将纯级分(由TLC测定)合并，并且蒸发，以在从乙腈水冻干之后提供1mg的纯NHS-化合物8。
将纯NHS酯溶解于DMSO中制备20mM溶液，并且将6当量添加至2mL的IgG抗体(具体地抗CD20抗体利妥昔单抗)(10mg/mL溶于PBS)。使缀合反应在室温下温育过夜，并且经缓冲液交换到新鲜PBS中以移除过量的佐剂。使经纯化的免疫缀合物V无菌过滤并在4℃下储存。收率为约16mg。除具有高收率之外，LC/MS分析还示出高纯度水平，低聚集水平，以及所期望的DAR比率。
实施例4：用TFP酯制备免疫缀合物VI
方案6
该实施例提供使用TFP酯方法合成具有不同连接子的免疫缀合物的指导。佐剂的酯修饰以及经修饰佐剂与抗体的缀合示于以上方案6中。使化合物1(311mg，1mmol)溶解于10mL的DMF中，并且然后添加0.3mL的DIPEA。使NHS-PEG5-酸(1.2当量)溶解于5mL的二氯甲烷中，并且一次性添加化合物1。将混合物在室温下搅拌过夜，并且然后浓缩至干。粗制残余物经由硅胶色谱在4克柱上用含有1％乙酸的0％至10％MeOH的DCM溶液洗脱10分钟进行纯化，以在浓缩纯级分之后提供260mg(57％收率)的化合物9。
将化合物9(50mg)溶解于10mL DMF中，并且添加1.5当量的TFP，接着是1.2当量的DCC和5mg的DMAP。将反应搅拌过夜，浓缩至干，并且在4克硅胶柱上用含0％至10％MeOH的DCM洗脱进行纯化，以在从1:2的乙腈水冻干之后提供35mg的纯化合物10。
将TFP酯(10)溶解于DMSO中制备20mM储备液，并且添加至20mg的IgG抗体(具体地抗CD20抗体利妥昔单抗)(10mg/mL溶于PBS)。允许缀合反应在室温下过夜进行。使所得的免疫缀合物VI经缓冲液交换(GE，PD10脱盐柱)到PBS(pH 7.4)中。将经纯化的免疫缀合物使用2μm注射过滤器无菌过滤并且在4℃下储存。LC/MS分析证实，该过程提供了2.9个佐剂/抗体的DAR。SEC分析指示出最小量的聚集体(即小于2％)。
实施例5：用TFP酯制备免疫缀合物VIII
方案7
该实施例提供使用TFP方法合成含有PEG叔胺连接子的免疫缀合物的指导。将化合物11(200mg)溶解于甲醇(20mL)中，并且添加3当量的3-(2-(3-氧代丙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯，接着是1.1当量的NaCNBH4。将混合物在室温下搅拌3小时，并且浓缩至干。添加三氟乙酸(TFA，10mL)并且将反应在室温下搅拌2小时。在真空下蒸发TFA并且通过制备型HPLC在C-18柱上纯化粗产物。将产物用梯度为10％至90％乙腈的水溶液(0.1％TFa)洗脱20分钟，以在冻干合并的纯级分之后提供85mg的经纯化的酸12(由LC/MS证实)。
将化合物12(80mg)溶解于二氯甲烷/二甲基甲酰胺(5mL，1:1)中，并且添加2当量的TFP，接着是1.2当量的EDCI。将反应在室温下搅拌过夜。粗制TFP酯产物13经由快速色谱在4克硅胶柱上用0％至10％异丙醇洗脱10分钟进行纯化。浓缩纯级分并且从30％乙腈水溶液冻干残余物，以提供为米黄色固体的45mg的经纯化的TFP酯化合物13。分子量和纯度由LC/MS(m/z＝647.7)加以证实。
与抗体缀合：将化合物TFP酯13溶解于无水DMSO中制备20mM储备液，并且将8摩尔当量(相对于抗体)添加至IgG1抗体(具体地抗CD20抗体利妥昔单抗)(10mg/mL溶于PBS)。将缀合反应在4℃下温育过夜。使所得的免疫缀合物VIII经缓冲液交换到PBS(pH 7.2)中以移除过量的小分子量试剂。通过在Nanodrop 1000分光光度计上280nm处测量抗体来测定最终浓度。得到15mg的免疫缀合物VIII(75％)，将其在4℃下储存直至使用。
观察到最少聚集体(小于1％)，如由SEC分析所检测。产物具有2.2的DAR比率，如经由LC/MS所测定的。使经纯化的免疫缀合物VIII过滤通过0.2μM无菌过滤器并且在-20℃下储存。
实施例6：用TFP酯制备免疫缀合物IX
方案8
该实施例提供使用TFP酯方法合成具有不同连接子的免疫缀合物的指导。使化合物1(150mg)溶解于20mL THF中并且添加10mL的饱和碳酸氢钠水溶液。一次性添加琥珀酸酐(50mg)并将混合物在室温下搅拌1小时。缓慢添加20mL的1N HCl，并且用2X50mL二氯甲烷萃取混合物，并且使合并的有机萃取物蒸发至干。粗产物14在4克硅胶柱上用0％至15％MeOH(1％乙酸)洗脱15分钟进行纯化。将纯级分合并，并且蒸发，以提供180mg的纯化合物14。
将一百五十mg的化合物14溶解于DMF(10mL)中，并且添加1当量的HATU，接着是2当量的DIPEA。添加一点五当量的甘氨酸-OtBu并搅拌过夜。使DMF蒸发并且在搅拌下用含5mL1N HCl的二氧杂环己烷处理残余物30分钟。使溶剂蒸发，并且将粗制残余物在4克硅胶柱上用0％至10％异丙醇洗脱15分钟进行快速纯化。蒸发纯级分，提供110mg的纯化物15。
将化合物15(50mg)溶解于10mL DMF中，并且添加1.5当量的TFP，接着是1.2当量的DCC和2mg的DMAP。将反应搅拌过夜，浓缩至干，并且在硅胶(4g柱)上用0％至10％IPA的DCM溶液洗脱进行纯化，以在从1:3的乙腈水冻干之后提供32mg的纯TFP酯化合物16。
与抗体缀合：将TFP酯化合物16溶解于无水DMSO中制备20mM储备液，并且将5摩尔当量(相对于抗体)添加至20mg抗体(10mg/mL溶于PBS)。将缀合反应在4℃下温育6小时。使所得的免疫缀合物IX经缓冲液交换到PBS(pH 7.4)中以移除过量的小分子量杂质。通过在Nanodrop 1000分光光度计上280nm处测量吸光度来测定最终蛋白质浓度。收率为15mg(75％，基于回收的蛋白质)。SEC分析检测到小于1％的最少聚集体并且DAR经由LC/MS分析测定为2.8个佐剂/抗体。使经纯化的免疫缀合物过滤通过0.2μM无菌过滤器并且在-20℃下储存直至需要。
实施例7：用TFP酯制备免疫缀合物X
方案9
该实施例提供使用TFP方法合成具有不同连接子的免疫缀合物的指导。使化合物1(155mg，0.5mmol)溶解于10mL的DMF中，并且添加0.2mL的DIPEA。在独立的容器中，将1.2当量的PEG2-二羧酸一甲基酯溶解于5mL的DMF中，并且添加2当量DIPEA，接着是HATU(1.2当量)。将混合物添加至1并且在室温下搅拌1小时。使反应在真空下浓缩至干并且将残余物溶解于THF(5mL)中。添加等体积的水，接着是2mL的1M LiOH水溶液。将混合物搅拌过夜，并且然后添加10mL的1N HCl。将酸化混合物用二氯甲烷萃取2x，经硫酸钠干燥，浓缩至干，并且经由硅胶色谱纯化。将产物用0％至10％甲醇洗脱10分钟。将纯级分合并，并且浓缩，以提供为浅黄色固体的110mg的纯化合物17。
将化合物17(50mg)溶解于二氯甲烷/二甲基甲酰胺(5mL，1:1)中，并且添加2当量的TFP，接着是1.5当量的EDCI。将反应在环境温度下搅拌过夜，并且使反应浓缩至干。粗制TFP酯18经由快速色谱在4克硅胶柱上用0％至10％异丙醇洗脱10分钟进行纯化。浓缩纯级分并且从30％乙腈的水溶液冻干残余物，以提供为白色固体的41mg的经纯化的TFP酯18。分子量和纯度由LC/MS加以证实。
与抗体缀合：将TFP酯18溶解于无水DMSO中制备20mM储备液，并且将8摩尔当量(相对于抗体)添加至20mL的IgG抗体(具体地抗CD20抗体利妥昔单抗)(10mg/mL溶于PBS)。将缀合反应在4℃下温育过夜。使所得的免疫缀合物X经缓冲液交换到PBS(pH 7.2)中以移除过量的小分子量杂质。通过在Thermo Nanodrop 1000分光光度计上280nm处测量吸光度来测定最终浓度。收率为16mg的缀合免疫缀合物X，或基于回收蛋白质为70％。通过SEC分析检测到最少聚集体(小于1％)，并且经由LC/MS分析测定2.3的DAR。使经纯化的免疫缀合物过滤通过0.2μM无菌过滤器并且在-20℃下储存。
实施例8：用TFP酯制备免疫缀合物XI和XII
方案10
该实施例提供使用TFP酯方法合成具有不同连接子的免疫缀合物的指导。将化合物19(方案10)偶联至包含有2或8个PEG单元的聚乙二醇(PEG)连接子，以便延伸佐剂与抗体之间的距离。PEG连接子延伸物的连接使用先前所述用于连接子连接和TFP活化的方案进行。简而言之，将100mg的化合物19溶解于10mL的DMF中，并且添加0.2mL的DIPEA，接着是HATU(1.2当量)。在1小时之后，添加适当的氨基PEG连接子(n＝2或8)并且在室温下搅拌另外的2小时。使反应混合物在真空下浓缩至干，并且残余物经由制备型HPLC在C-18柱上用10％至90％乙腈的水溶液洗脱30分钟进行纯化。使纯级分合并，并且冻干，以提供呈透明玻璃态物质的65mg和45mg的中间体20或21。
使用先前描述的方案，使化合物20和21转化为对应的TFP酯22和23。简而言之，使游离酸20或21(50mg)溶解于二氯甲烷/二甲基甲酰胺(5mL，1:1)中，并且添加2当量的TFP，接着是1.5当量的EDCI。将混合物在室温下搅拌过夜并浓缩至干，以提供粗制TFP酯22和23。粗制TFP酯经由快速色谱在硅胶上纯化并用0％至10％异丙醇洗脱10分钟。浓缩纯级分并且从30％乙腈的水溶液冻干残余物，以提供为透明固体的经纯化的TFP酯22和23。纯化合物的分子量和纯度由LC/MS加以证实。
与抗体缀合：使用先前所述的方案，使TFP酯22和23缀合至IgG1抗体(具体地抗CD20抗体利妥昔单抗)。将TFP酯溶解于无水DMSO中制备20mM储备液，并且将8摩尔当量(相对于抗体)添加至20mg的IgG抗体(10mg/mL溶于PBS)。将缀合反应在4℃下温育12小时。使所得的免疫缀合物XI和XII经缓冲液交换到PBS(pH 7.4)中以移除过量的小分子量杂质。通过在Nanodrop 1000分光光度计上280nm处测量吸光度来测定最终蛋白质浓度。收率为75％(基于回收的蛋白质)。存在SEC分析检测的最少聚集体，并且经由LC/MS分析测定1.0和1.7个佐剂/抗体的DAR。使经纯化的免疫缀合物过滤通过0.2μM无菌过滤器并且在-20℃下储存直至需要。
本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利以相同程度在此引入作为参考，正如每个参考文献都独立且具体地被指出以便按引用方式并入并且全文在这里提出。
除非本文另外指明或上下文明显矛盾以外，使用的术语“一个”和“一种”以及“所述”和“至少一种”和类似指示物在描述本发明的语境中(尤其是以下权利要求书的语境)理解为涵盖单数和复数。除非本文另外指明或上下文明显矛盾以外，使用的术语“至少一种”后面的一个或多个项目的列表(例如“A和B中的至少一种”)理解为意指选自所列项目中的一个项目(A或B)或所列项目中两个或更多个的任何组合(A和B)。除非另外指明，术语“包括”、“具有”、“包含”和“含有”被理解为是开放式术语(即意味着“包括但不限于”)。除非本文另外指明，在本文中对值的范围的引用仅旨在用作个别地指出属于该范围内的各个单独值的简易法，且各个单独的值结合到说明书中，如同其在本文中被个别地引用。除非本文另外指明或上下文另外明显矛盾，本文所述的所有方法能以任何合适的次序进行。除非另外声明，否则本文中所提供的任何及全部示例的使用或者示例性用语(例如“诸如”)的使用仅是为了更好地阐明本发明，而不构成对本发明范围的限制。本说明中的语言都不应理解为指示任何未要求保护的元素是实现本发明所必需的。
本文描述了本发明优选的实施方案，包括发明人已知用于实施本发明的最佳模式。本领域的普通技术人员在阅读前述描述时，那些优选的实施方案的变型形式可变为显而易见的。发明人期望技术人员适当地采用此类变化，且发明人预期本发明将以这里具体描述以外的其他方式实施。因此，如适用的法律所允许，本发明包括如所附权利要求中所述的主题的所有修改方案和等价方案。此外，除非本文另有说明或上下文另外明显矛盾，上述要素所有可能变化的任意组合包括在发明中。
序列表
<110> 博尔特生物治疗药物有限公司(BOLT BIOTHERAPEUTICS, INC.)
<120> 抗体佐剂缀合物
<130> 736555
<150> US 62/433,742
<151> 2016-12-13
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> NNN = 3 个磷酸盐
<400> 1
nnngcaugcg accucuguuu ga 22
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221>
<223> 合成的
<400> 2
ucaaacagag gucgcaugc 19

Claims (21)

1.一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含
(a)抗体构建体，所述抗体构建体包含(i)抗原结合结构域和(ii)Fc结构域，
(b)佐剂部分，以及
(c)连接子，所述连接子包含乙二醇基团或甘氨酸残基，
其中每个佐剂部分经由所述连接子共价结合至所述抗体构建体。
2.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中所述抗体构建体还包含靶向结合结构域。
3.根据权利要求1所述的免疫缀合物，其中所述抗体构建体是抗体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗原结合结构域结合至癌细胞的抗原。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗原结合结构域结合至选自以下的抗原：CCR8、CDH1、CD19、CD20、CD29、CD30、CD38、CD40、CD47、EpCAM、MUC1、MUC16、EGFR、VEGF、HER2、SLAMF7、PDGFRa和gp75。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的免疫缀合物，其中所述抗体是IgG1抗体。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有根据式II的结构：
其中
是具有表示所述抗体的赖氨酸残基的残基的抗体，其中表示与Z的连接点；
Adj是佐剂；
下标r是1至10的整数；并且
Z是具有乙二醇基团或甘氨酸残基的二价连接部分。
8.根据权利要求7所述的免疫缀合物，其中Z包含聚(乙二醇)基团。
9.根据权利要求7或8所述的免疫缀合物，其中Z包含甘氨酸残基。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的免疫缀合物，其中Z还包含二价亚环己基基团。
11.根据权利要求10所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有根据式IIIa的结构：
其中是具有表示所述抗体的赖氨酸残基的残基的抗体，其中表示与Z1的连接点，其中Z1包含至少一个乙二醇基团或至少一个甘氨酸残基。
12.根据权利要求10所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有根据式IIIb的结构：
其中是具有表示所述抗体的赖氨酸残基的残基的抗体，其中表示与Z1的连接点，其中Z1包含至少一个乙二醇基团或至少一个甘氨酸残基。
13.根据权利要求7至9中任一项所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有根据式IV的结构：
或其可药用盐，其中是具有表示所述抗体的赖氨酸残基的残基的抗体，其中表示与G2的连接点，Adj是佐剂，G1是CH2、C＝O、或化学键，G2是CH2、C＝O、或化学键，L是连接子，并且下标r是1至10的整数。
14.根据权利要求13所述的免疫缀合物，其中L选自：
其中R任选地存在并且为包括1至8个碳单元的线性或支化的、环状或直链的、饱和或不饱和的烷基、杂烷基、芳基、或杂芳基链；a是1至40的整数；每个A独立地选自任何氨基酸；下标c是1至25的整数；虚线表示与G1的连接点；并且波形线表示与G2的连接点。
15.根据权利要求13或14所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有根据式IVa的结构：
或其可药用盐，其中Ab如本文所定义；Adj是佐剂；G1是CH2、C＝O、或化学键；R任选地存在并且为包括1至8个碳单元的线性或支化的、环状或直链的、饱和或不饱和的烷基、杂烷基、芳基、或杂芳基链；下标a是1至40的整数；并且下标r是1至10的整数。
16.根据权利要求13或14所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有根据式IVb的结构：
或其可药用盐，其中Ab如本文所定义；Adj是佐剂；G1是CH2、C＝O、或化学键；下标a是1至40的整数；并且下标r是1至10的整数。
17.根据权利要求13或14所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有根据式IVc的结构：
或其可药用盐，其中Ab如本文所定义；Adj是佐剂；G1是CH2、C＝O、或化学键；R任选地存在并且为包括1至8个碳单元的线性或支化的、环状或直链的、饱和或不饱和的烷基、杂烷基、芳基、或杂芳基链；每个A独立地选自任何氨基酸；下标c是1至25的整数；并且下标r是1至10的整数。
18.根据权利要求17所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有根据式IVd的结构：
或其可药用盐，其中Ab如本文所定义；Adj是佐剂；G1是CH2、C＝O、或化学键；R任选地存在并且为包括1至8个碳单元的线性或支化的、环状或直链的、饱和或不饱和的烷基、杂烷基、芳基、或杂芳基链；下标c是1至25的整数；并且下标r是1至10的整数。
19.根据权利要求13或14所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物具有根据式IVe的结构：
或其可药用盐，其中Ab如本文所定义；Adj是佐剂；G1是CH2、C＝O、或化学键；R任选地存在并且为包括1至8个碳单元的线性或支化的、环状或直链的、饱和或不饱和的烷基、杂烷基、芳基、或杂芳基链；并且下标r是1至10的整数。
20.一种组合物，所述组合物包含多种根据权利要求1至19中任一项所述的免疫缀合物。
21.一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至19中任一项所述的免疫缀合物或根据权利要求20所述的组合物。
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