CN110290797A

CN110290797A - 用于预防和治疗真菌感染的单剂量方法

Info

Publication number: CN110290797A
Application number: CN201780081612.XA
Authority: CN
Inventors: K.巴蒂扎尔; P.达鲁瓦拉; J.B.洛克; V.王; T.桑迪森
Original assignee: Seachaid Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Seachaid Pharmaceuticals LLC
Priority date: 2016-11-01
Filing date: 2017-10-30
Publication date: 2019-09-27
Also published as: WO2018085200A1; US20230181689A1; EP3534927A4; EP3534927A1; US20190307843A1

Abstract

本文提供了在有此需要的人受试者中治疗、减轻或预防真菌感染或其相关病况的方法。该方法包括施用单剂量的包含CD101和任何药学上可接受的赋形剂或由其组成的药物组合物，其中所述单剂量治疗基本上减少或消除了真菌感染。

Description

用于预防和治疗真菌感染的单剂量方法

背景

本发明的特征在于用于治疗真菌感染和与之相关的病况的方法。

真菌感染例如由假丝酵母属(Candida)和曲霉属(Aspergillus)引起的感染可为严重且危及生命的感染，其代表了重大的公共健康问题，特别是在高度脆弱的群体(包括老年人、手术后、危重疾病和其他具有严重医学病况的住院患者)中。由于对现有抗真菌药物的抗性渐增，迫切需要开发新的和更有效的抗真菌剂来治疗这些严重感染。棘白菌素是用于治疗真菌感染的最重要类别的抗真菌剂的成员。这些化合物通过经由抑制1,3-β-D-葡聚糖合酶酶复合物的催化亚基来阻止1,3-β-D-葡聚糖的产生，从而靶向细胞壁。美国食品和药物管理局批准用于治疗真菌感染的三种棘白菌素(卡泊芬净、阿尼芬净和米卡芬净)仅可用于静脉内制剂中。此外，这些抗真菌剂必须在多日内每天施用，使得将患者过渡到家庭环境具有挑战性。此外，不遵守这种多日方案可能会导致抗药性真菌感染报告的增加。因此，本领域需要改进的预防和治疗真菌感染的方法。

发明内容

本发明涉及通过施用单剂量的盐或中性形式的CD101治疗人受试者中的真菌感染的方法。

在第一方面，本发明的特征在于一种治疗人受试者中的病况或病症的方法。该方法包括向受试者施用单剂量的药物组合物或由向受试者施用单剂量的药物组合物组成，所述药物组合物包含CD101盐或其中性形式和一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中所述单剂量包括足以治疗所述病况或病症的量的CD101盐或其中性形式。

在相关方面，本发明的特征在于一种预防人受试者中的病况或病症的方法。该方法包括向受试者施用单剂量的药物组合物或由向受试者施用单剂量的药物组合物组成，所述药物组合物包含CD101盐或其中性形式和一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中所述单剂量包括足以预防所述病况或病症的量的CD101盐或其中性形式。

在第一或第二方面中，可以口服施用所述单剂量。在一个特定实施方案中，所述单剂量包括口服施用的50mg至1200mg(例如100±50mg、200±50mg、300±50mg、400±50mg、500±50mg、600±50mg、700±50mg、750±50mg、800±100mg、900±100mg、1000±100mg或1100±100mg)的CD101盐或其中性形式。

在第一或第二方面中，可以静脉内施用所述单剂量。在一个实施方案中，所述单剂量包括静脉内施用的50mg至1200mg(例如100±50mg、200±50mg、300±50mg、400±50mg、500±50mg、600±50mg、700±50mg、750±50mg、800±100mg、900±100mg、1000±100mg或1100±100mg)的CD101盐或其中性形式。

在第一或第二方面中，可以皮下施用所述单剂量。在一个实施方案中，所述单剂量包括皮下施用的50mg至1200mg(例如100±50mg、200±50mg、300±50mg、400±50mg、500±50mg、600±50mg、700±50mg、750±50mg、800±100mg、900±100mg、1000±100mg或1100±100mg)的CD101盐或其中性形式。

在第一或第二方面中，可以肌内施用所述单剂量。在一个实施方案中，所述单剂量包括肌内施用的50mg至1200mg(例如100±50mg、200±50mg、300±50mg、400±50mg、500±50mg、600±50mg、700±50mg、750±50mg、800±100mg、900±100mg、1000±100mg或1100±100mg)的CD101盐或其中性形式。

在任何上述实施方案中，所治疗的疾病或病况可选自假丝酵母血症、侵袭性假丝酵母病、甲癣、炎性肠病、曲霉菌病和肺囊虫属(Pneumocystis)感染。

在任何上述实施方案中，所治疗的疾病或病况可以是真菌感染。在一个实施方案中，真菌感染是假丝酵母属感染。在另一个实施方案中，真菌感染是曲霉属感染。在一些实施方案中，真菌感染是肺囊虫属感染。

在任何上述实施方案中，单剂量的施用可基本上消除或预防真菌感染。

在任何上述方法的实施方案中，所述受试者未接受任何同时的抗真菌治疗。或者，所述受试者在施用所述药物组合物后21天、28天、35天、42天或56天内未接受任何抗真菌治疗。

在任何上述实施方案中，所述药物组合物可由CD101盐或其中性形式和一种或多种药学上可接受的赋形剂组成。

在任何上述方法中，CD101可以用盐或中性形式的化合物2(本文所述)或通过引用掺入本文的美国专利号9,217,014中描述的化合物替代。例如，CD101可以用美国专利号9,217,014中描述的化合物替代，所述化合物选自化合物6、化合物7、化合物12、化合物15、化合物17、化合物23、化合物24及其药学上可接受的盐。

在另一方面，本发明的特征在于预防或治疗受试者中的生物膜的方法。该方法包括向受试者施用包含CD101盐或其中性形式和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

在该方面的一些实施方案中，受试者中的生物膜是假丝酵母属生物膜(例如，白色假丝酵母(Candida albicans)生物膜或耳道假丝酵母(Candida auris)生物膜)。在一些实施方案中，生物膜附着于受试者的粘膜。

在另一方面，本发明的特征在于一种预防导管上的生物膜生长或杀伤附着于导管的生物膜的方法，其包括将导管浸没在包含CD101盐或其中性形式的水溶液中，或将包含CD101盐或其中性形式的水溶液流过导管的内腔。

在该方面的一些实施方案中，导管上的生物膜是假丝酵母属生物膜(例如，白色假丝酵母生物膜或耳道假丝酵母生物膜)。

定义

出于本发明的目的，以下缩写和术语定义如下。

如本文所用，术语“约”是指为特定值的±10％的值范围。例如，“约150mg”包括150mg的±10％，或135mg至165mg。这样的范围执行期望的功能或实现期望的结果。例如，“约”可以指所述量的小于10％内、小于5％内、小于1％内、小于0.1％内和小于0.01％内的量。除了在实施例中或另有说明时，本文所用的表示成分或反应条件的量的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。

如本文所用，术语“与......相关”和“与......关联”是指可在已经发展真菌感染或有发展真菌感染风险的个体中诊断的症状、病况、疾病、综合征或病症。例如，真菌感染可为相关病况的致病因素、加剧相关病况而不一定是原因的因素或相关病况的症状或结果。此外，真菌感染可以在相对于相关病况的任何时间点发生(例如，在相关病况发作之前、与之同时或之后)。

如本文所用，术语“CD101盐”是指式1化合物的盐。CD101具有以下结构(下文)，其中在其盐形式中CD101的叔铵离子正电荷用负反离子(例如乙酸根)平衡。CD101的结构如下所示。

如本文所用，术语“化合物2”是指式2化合物的盐，或其中性形式。化合物2具有以下结构(下文)，其中在其盐形式中式2化合物的叔铵离子正电荷用负反离子(例如乙酸根)平衡。化合物2的结构如下所示。

CD101和化合物2是半合成的棘白菌素化合物，其抑制1,3-β-D-葡聚糖的合成，1,3-β-D-葡聚糖是酵母形式的假丝酵母属物种的真菌细胞壁和曲霉属菌丝的活跃细胞生长区域的必需组分。1,3-β-D-葡聚糖的合成取决于1,3-β-D-葡聚糖合酶的活性，1,3-β-D-葡聚糖合酶是其中催化亚基由FKS1、FKS2和FKS3基因编码的酶复合物。对这种酶的抑制导致假丝酵母属种(Candida spp.)的快速、浓度依赖性杀真菌活性。如本文所用，术语“CD101中性形式”包括CD101的两性离子形式，其中式1或2的化合物不具有净正电荷或负电荷。两性离子在碱性介质(例如pH 9)中相对于CD101或其盐以较高的比例存在。在一些实施方案中，两性离子也可以其盐形式存在。

如本文所用，术语“CD101中性形式”或“化合物2中性形式”包括CD101的两性离子形式，其中式1或2的化合物不具有净正电荷或负电荷。两性离子在碱性介质(例如pH 9)中相对于CD101、化合物2或其盐以较高比例存在。在一些实施方案中，两性离子也可以其盐形式存在。

宿主生物的“定殖”包括真菌在人受试者身体的任何部分中或上的非暂时性停留。如本文所用，在任何微生物生态位中的病原真菌(机会性或非机会性)的“减少定殖”包括在受试者身体的定殖部分减少病原体的停留时间和/或减少病原体的数量(或浓度)。

“同时的抗真菌治疗”意指在施用单剂量CD101之前或之后12小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天或1周内施用的任何额外剂量的抗真菌剂(例如，CD101或其他抗真菌剂)，所述时间内的施用在治疗靶向真菌感染中会赋予治疗益处(例如，系统活性的)，同时CD101在受试者中处于治疗有效浓度。在一些情况下，单剂量治疗在施用之前或之后的1-21天内不与任何其他抗真菌治疗组合。例如，可以向患有真菌感染的受试者施用单剂量的CD101(例如，口服、静脉内、皮下或肌内)，并且所述单剂量有效地治疗真菌感染，而不需要在用CD101单剂量治疗之前、与之同时或之后进行额外的抗真菌治疗。

“生态失调”或“微生物生态失调”是指人受试者身体的任何部分上或中的微生物群(例如，真菌和细菌)的状态，其中生态网络的正常多样性和/或功能被破坏。例如，这种被破坏的状态可能是由于真菌多样性的减少、一种或多种真菌病原体或致病有机体(pathobiont)的过度生长、或者转变为不再为宿主受试者提供必需功能并因此不再促进健康的生态微生物网络。如本文所用，术语“致病有机体”或“机会病原体”是指仅当受试者中存在某些遗传和/或环境条件时才能够引起疾病的共生真菌。

“剂量”意指施用于人受试者的CD101(式1)的量。

如本文所用，术语“剂型”或“单位剂型”是指适合作为单位剂量的物理上离散的单位，例如丸剂、片剂、囊片、硬胶囊或软胶囊，每个单位含有预定量的药物。

“有效”量意指治疗或预防真菌感染或与真菌感染相关的疾病所需的药物量。用于实施本文所述方法用于由真菌感染引起或促成的病况的治疗性或预防性治疗的药物的有效量根据施用方式、受试者的年龄、体重和一般健康状况而变化。最终，主治医师将决定适当的量和剂量方案。该量称为“有效”量。

“感染”或“真菌感染”意指微生物生态失调，其特征在于一种或多种真菌(例如，真菌病原体或机会性病原体)过度生长或定殖于人受试者身体的任何部分，所述真菌的减少可为宿主提供益处。例如，感染可包括通常存在于人受试者身体中或上的真菌物种的过度生长或定殖，或者感染可包括通常不存在于人受试者身体中或上的真菌物种的定殖。在某些情况下，感染可包括对人体某些部位(例如，GI道)固有但是当在身体的其他部位(例如，超出GI道的组织)中发现时则是有害的真菌对身体的一部分的定殖。更一般地，感染可以是微生物群的存在对宿主身体有害的任何情况。

如本文所用，术语“微生物群”是指在人体中和上存在(持续或瞬时地)的微生物群落。

如本文所用，术语“生物膜”是指由异源真菌(例如假丝酵母属)和菌丝组成的三维结构，其可附着于各种表面，例如粘膜或导管内部。生物膜可以在医疗装置的表面上形成并引起生物膜装置相关的感染。例如，在留置装置(例如血管导管)上具有生物膜可引起危及生命的感染。

如本文所用，“胃肠外施用”和“胃肠外地施用”是指除肠内和局部施用之外的施用方式，例如注射，并且包括但不限于静脉内、肌内、胸膜内、血管内、心包内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。

如本文所用的，术语“盐”指通常用于制药工业的任何药学上可接受的盐，例如非毒性酸加成盐、金属盐或金属复合物。酸加成盐包括有机酸例如乙酸、乳酸、棕榈酸、马来酸、柠檬酸、胆酸、癸酸、辛酸、月桂酸、戊二酸、葡糖醛酸、甘油酸、乙醇酸、乙醛酸、异柠檬酸、异戊酸、乳酸、苹果酸、草酰乙酸、草酰琥珀酸、丙酸、丙酮酸、抗坏血酸、琥珀酸、苯甲酸、棕榈酸、辛二酸、水杨酸、酒石酸、甲磺酸、甲苯磺酸和三氟乙酸，和无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸。代表性的碱或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙和镁等。

如本文所用，CD101的“单剂量”或“单剂量治疗”(例如，盐或中性形式的CD101)是指通过在6周、8周或12周期间施用不超过一个剂量的包括盐或中性形式的CD101和一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物来治疗(例如，基本上消除)受试者中的真菌感染。期需地，单剂量施用足以治疗真菌感染而无需“同时的抗真菌治疗”。

“受试者”或“患者”意指人。正在接受真菌感染治疗的人受试者是由医生诊断为可具有这种病况的情形的受试者。可以通过任何合适的手段进行诊断。本领域技术人员将理解，可对本发明的受试者进行标准测试或者本发明的受试者可在未经检查的情况下由于存在一种或多种风险因素(例如年龄、遗传学或家族史)而已经被鉴定为高风险受试者。

如本文所用，术语“基本上消除”真菌感染是指在一个或多个身体部分中以足以恢复正常的真菌群体(例如大约在健康个体中发现的量)和/或允许个体受益(例如，以足以可持续地消退症状的量减少定殖)的量，减少一种或多种机会性或非机会性致病性真菌的定殖(参见上文定义)(例如，达相对于起始量的约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或％100)。例如，真菌感染可由通常存在于人体上但已经生长至高于健康水平的机会病原体的过度生长引起，在这种情况下，可以通过将真菌物种减少到通常在健康个体中发现的水平而不必消除真菌物种来消除感染。或者，例如，真菌病原体或机会病原体可以定殖其通常不驻留的身体的一部分，因此，当根除真菌群时，感染得到治疗。

如本文所用，术语“基本上预防”是指在一个或多个身体部分中以足以维持正常的真菌群体(例如大约在健康个体中发现的量)、预防真菌感染的发作和/或预防与感染相关的症状或病况的量，预防一种或多种机会性或非机会性致病性真菌的定殖增加(例如，达相对于起始量的约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、％100或超过％100)。例如，在免疫受损的受试者(例如癌症、HIV/AIDS或服用免疫抑制剂的受试者)中，或在接受长期抗生素治疗的受试者中，受试者可以接受预防性治疗以基本上预防真菌感染，同时准备好以进行侵入性医疗程序(例如，准备好以进行手术，例如接受移植、干细胞疗法、移植物、假体，接受长期或频繁的静脉导管插入术，或在重症监护室接受治疗)。

如本文所用，术语“治疗”是指施用药物组合物用于预防和/或治疗目的。“预防疾病”是指对尚未患病但对特定疾病易感或有其他风险的受试者进行预防性治疗。“治疗疾病”或用于“治疗性治疗”是指对已经患有疾病的受试者施用治疗以改善或稳定受试者的病况。因此，在权利要求和实施方案中，治疗是为了治疗或预防目的对受试者进行的施用。

从以下详细说明、附图和权利要求中，本发明的其他特征和优点将显而易见。

附图简述

图1是显示CD101皮下施用后肾集落形成单位的减少的图。

图2是显示静脉内和皮下施用后的总CD101暴露的图。

图3是显示用烟曲霉(Aspergillus fumigatu)感染并用2mg/kg CD101(IV或IP)治疗的小鼠中随时间的存活百分比的图。

图4是显示各种抗真菌剂对耳道假丝酵母临床分离株的活性的表。

图5是显示在皮下施用单次30mg/kg剂量后10天内两只食蟹猴中CD101的血浆水平的图。

图6是显示用耳道假丝酵母感染并用20mg/kg CD101(IP)、20mg/kg氟康唑(PO)或0.3mg/kg两性霉素B(IP)治疗的小鼠中随时间的存活百分比的图。

图7A和7B是显示与未处理对照相比CD101(0.25或1μg/ml)(图7A)和氟康唑(1或4μg/ml)(图7B)对粘附期白色假丝酵母生物膜的代谢活性的影响的柱状图。

图8A-8E是共焦扫描激光显微照片，其显示CD101和氟康唑对粘附期白色假丝酵母生物膜的影响(预防)：由白色假丝酵母形成的生物膜的自上而下的三维视图(顶部图)和侧视图(底部图)，所述生物膜用以下处理：无药物(对照；图8A)，0.25μg/ml CD101(图8B)、1μg/ml CD101(图8C)、1μg/ml氟康唑(图8D)和4μg/ml氟康唑(图8E)。

图8F和8G是柱状图，其显示暴露于CD101(图8F)和氟康唑(图8G)的白色假丝酵母生物膜的厚度。

图9A和9B是柱状图，其显示与未处理对照相比CD101(0.25或1μg/ml)(图9A)和氟康唑(1或4μg/ml)(图9B)对成熟期白色假丝酵母生物膜的代谢活性的影响。

图10A-10E是共焦扫描激光显微照片，其显示CD101和氟康唑对成熟期白色假丝酵母生物膜的影响(治疗)：生物膜的自上而下的三维视图(顶部图)和侧视图(底部图)，所述生物膜暴露于：无药物(图10A)、0.25μg/ml CD101(图10B)、1μg/ml CD101(图10C)、1μg/ml氟康唑(图10D)和4μg/ml氟康唑(图10E)。箭头显示凸起/破碎的细胞。

图10F和10G是柱状图，其显示暴露于：CD101(图10F)和氟康唑(图10G)的白色假丝酵母生物膜的厚度。

图11A-11F是显示CD101(0.25μg/ml)对白色假丝酵母生物膜形成的时间影响的图像。图像对于用以下处理的生物膜从0h立即捕获并跟踪至16h：无药物(图11A和11B)、低放大倍数x20下的CD101(图11C和11D)以及高放大倍数x63下的CD101(图11E和11F)。箭头显示凸起、变形和破碎的细胞。

图12A和12B是显示CD101(0.25μg/ml)对3h形成的白色假丝酵母生物膜的时间影响的图像。在3h生物膜形成后加入CD101，并将图像在加入CD101后立即捕获(图12A)并跟踪至16h(图12B)，放大倍数，x63。箭头显示凸起、变形和破碎的细胞。

图13是显示用单次皮下施用CD101预防性治疗并用白色假丝酵母感染的嗜中性粒细胞减少症小鼠的肾真菌负荷的图。

图14A是显示用CD101预防性治疗并用烟曲霉感染的嗜中性粒细胞减少症小鼠中随时间的存活百分比的图。

图14B是显示在10-mg/kg皮下剂量注射后小鼠中CD101的药代动力学曲线的图。

图14C是显示在感染时超过MIC(0.03μg/mL)的游离药物血浆浓度与产生更大的CFU减少的更高的游离药物血浆浓度之间的相关性的图。

图15显示了实施例11的研究设计的概要。

图16A是显示在整个研究中具有外阴阴道假丝酵母病的大鼠的平均组重量的线图。x轴上的箭头表示雌二醇治疗天数。

图16B是显示在整个研究中相对于感染当天(第0天)的重量具有外阴阴道假丝酵母病的大鼠的平均组重量的线图。x轴上的箭头表示雌二醇治疗天数。

图17是显示在10mg/kg静脉内和皮下剂量注射后外阴阴道假丝酵母病(VVC)的大鼠模型中CD101的药代动力学曲线的图。

图18是显示在用白色假丝酵母529L局部阴道感染后在感染后第+1天(24h)/治疗之前阴道灌洗负荷的散点图。

图19是显示感染后第+2天(48h)的阴道灌洗负荷的散点图。

图20是显示感染后第+3天(72h)的阴道灌洗负荷的散点图。

图21是显示感染后第+5天(120h)的阴道灌洗负荷的散点图。

图22是显示感染后第+7天(168h)的阴道灌洗负荷的散点图。

图23是显示感染后第+9天(216h)的阴道灌洗负荷的散点图。

图24A是柱状图，其显示在用白色假丝酵母529L局部阴道感染并用溶媒、CD101或氟康唑施用后在研究持续时间内各组大鼠的平均每日阴道灌洗负荷(误差棒是几何标准偏差)。

图24B是散点图，其显示了在用白色假丝酵母529L局部阴道感染并用溶媒、CD101或氟康唑施用后在研究持续时间内每只大鼠的每日阴道灌洗负荷。

图24C是线图，其显示在用白色假丝酵母529L局部阴道感染并用溶媒、CD101或氟康唑施用后在研究持续时间内各组大鼠的每日阴道灌洗负荷(误差棒是几何标准偏差)。

图25A是显示感染后第+9天(216h)的几何平均终末阴道组织负荷(阴道、子宫和子宫角)的柱状图(误差棒是几何标准偏差)。

图25B是显示感染后第+9天(216h)的终末阴道组织负荷(阴道、子宫和子宫角)的散点图。

图26显示单次IP剂量CD101后小鼠中CD101的血浆浓度。在72小时内在七个时间点获得样品。每个符号代表三只小鼠的平均值和标准偏差。C_max代表峰浓度，AUC为0至无穷大，T_1/2表示β消除半衰期。

图27A显示针对白色假丝酵母的CD101剂量-反应曲线。每个符号代表三只小鼠的平均值和标准偏差。在0处的水平虚线代表治疗开始时小鼠肾中生物体的负荷。该线下方的数据点代表杀菌活性(cidal activity)，高于该线的点代表净增长。

图27B显示针对光滑假丝酵母(C.glabrata)的CD101剂量-反应曲线。

图27C显示针对近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)的CD101剂量-反应曲线。

图28A显示总和游离药物AUC/MIC与对白色假丝酵母的治疗效果之间的关系。AUC测量为整个治疗过程(168h)内的总AUC或游离AUC。每个符号代表三只小鼠的平均真菌负荷。在0处的水平虚线代表治疗开始时小鼠肾中生物体的负荷。该线下方的数据点代表杀菌活性，高于该线的点代表净增长。通过数据的曲线是基于希尔(hill)方程的最佳拟合线，并且针对每个生物体组显示了决定系数(R2)。

图28B显示总和游离药物AUC/MIC与对光滑假丝酵母的治疗效果之间的关系。

图28C显示总和游离药物AUC/MIC与对近平滑假丝酵母的治疗效果之间的关系。

图29A显示24h平均游离药物AUC/MIC(fAUC/MIC)与对白色假丝酵母的治疗效果之间的关系。每个符号代表三只小鼠的平均真菌负荷。在0处的水平虚线代表治疗开始时小鼠肾中生物体的负荷。该线下方的数据点代表杀菌活性，高于该线的点代表净增长。通过数据的曲线是基于希尔方程的最佳拟合线，并且针对每个生物体组显示了决定系数(R2)。还示出了最大效果(Emax)、50％最大效果(ED50)和线的斜率(N)。

图29B显示24h平均游离药物AUC/MIC(fAUC/MIC)与对光滑假丝酵母的治疗效果之间的关系。

图29C显示24h平均游离药物AUC/MIC(fAUC/MIC)与对近平滑假丝酵母的治疗效果之间的关系。

图30显示用烟曲霉菌株AF293感染后的动物重量。x轴上的箭头显示免疫抑制日。

图31显示在感染前0天、1天、3天或5天用CD101以5mg/kg、10mg/kg或20mg/kg治疗或感染前0或1天用比较物米卡芬净以2mg/kg治疗的肺曲霉菌病鼠模型的存活率的KaplanMeir曲线。

图32显示相对于抗真菌活性的健康成年人中未结合的CD101血浆浓度。

图33显示在5mg/kg IV CD101剂量后大鼠各种器官中CD101的组织分布和CD101的相关半衰期。

图34显示5mg/kg CD101 SC和两性霉素B在感染烟曲霉(ATCC 13073)的嗜中性粒细胞减少症ICR雌性小鼠的存活率上的效力。星号(*)表示与溶媒对照组相比存活率增加50％或更多(≥50％)。

图35显示10mg/kg CD101 SC和两性霉素B在感染烟曲霉(ATCC 13073)的嗜中性粒细胞减少症ICR雌性小鼠的存活率上的效力。星号(*)表示与溶媒对照组相比存活率增加50％或更多(≥50％)。

图36显示20mg/kg CD101 SC和两性霉素B在感染烟曲霉(ATCC 13073)的嗜中性粒细胞减少症ICR雌性小鼠的存活率上的效力。星号(*)表示与溶媒对照组相比存活率增加50％或更多(≥50％)。

图37是显示CD101 IP 20mg/kg施用后CD101血浆和上皮衬里液(ELF)浓度-时间曲线的图。

图38是显示在肺曲霉菌病中在感染前一天作为单剂量给予预防性CD101 IP20mg/kg或泊沙康唑(PO；2或10mg/kg)的小鼠的存活率的图。

图39是显示CD101 IP 20mg/kg施用后CD101血浆(总药物和游离药物)和ELF浓度-时间曲线的图。

图40是显示相对于感染前第-4天的小鼠重量在整个研究中小鼠的平均组重量的图。

图41是显示感染前一天用20mg/kg和60mg/kg的单剂量CD101IP治疗或感染前一天用比较物泊沙康唑2mg/kg和10mg/kg治疗的肺曲霉菌病鼠模型的存活率的Kaplan Meier曲线的图。

图42是显示用单剂量的CD101、米卡芬净或泊沙康唑治疗的肺曲霉菌病的鼠模型的几何平均终末肺负荷的图。

图43是显示用单剂量的CD101或米卡芬净治疗的肺曲霉菌病的鼠模型的几何平均终末肺负荷的图。

详细说明

本文提供了在有此需要的人受试者中治疗、减轻或预防真菌感染或其相关病况的方法。该方法包括施用单剂量的药物组合物，该药物组合物包含CD101和任何药学上可接受的赋形剂或由其组成，其中所述单剂量治疗基本上减少或消除了真菌感染。

I.治疗应用

本发明的特征在于在有此需要的人受试者中治疗、减轻或预防真菌感染的方法，其中所述真菌感染与在宿主受试者的一个或多个身体区域或组织中或上真菌物种的水平或组成的破坏有关(例如，假丝酵母属感染、曲霉属感染或肺囊虫属感染)。此外，该方法可用于治疗与真菌感染相关的症状、表现、病况或疾病。在某些情况下，真菌感染可以是主要诊断(例如，症状或病况的根本原因)，继发于另一种病况或疾病(例如，另一种病况的症状或结果)；或其组合。真菌感染可与宿主受试者的一个或多个身体区域或组织上的一种或多种真菌物种和/或真菌物种的定殖有关。

本发明的方法可以治疗真菌感染，例如，通过在一个或多个身体部分中以足以恢复正常的真菌群体(例如大约在健康个体中发现的量)和/或允许个体受益(例如，以足以可持续地消退症状的量减少定殖)的量，减少一种或多种机会性或非机会性致病性真菌的定殖(例如，达相对于起始量的约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或％100)来进行。例如，真菌感染可由通常存在于人体上但已经生长至高于健康水平的机会病原体的过度生长引起，在这种情况下，可以通过将真菌物种减少到通常在健康个体中发现的水平而不必消除真菌物种来消除感染。或者，例如，真菌病原体或机会病原体可以定殖其通常不驻留的身体的一部分，因此，当根除真菌群时，感染得到治疗。

本发明的方法可以预防真菌感染，例如，通过在一个或多个身体部分中以足以维持正常的真菌群体(例如大约在健康个体中发现的量)、预防真菌感染的发作和/或预防与感染相关的症状或病况的量，预防一种或多种机会性或非机会性致病性真菌的定殖增加(例如，相对于起始量预防约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、％100或超过％100的增加)来进行。例如，在免疫受损的受试者(例如癌症、HIV/AIDS或服用免疫抑制剂的受试者)中，或在接受长期抗生素治疗的受试者中，受试者可以接受预防性治疗以基本上预防真菌感染，同时准备好以进行侵入性医疗程序(例如，准备好以进行手术，例如接受移植、干细胞疗法、移植物、假体，接受长期或频繁的静脉导管插入术，或在重症监护室接受治疗)。

在某些情况下，本文提供的方法可用于治疗与局限于人体的一个或多个部分的真菌感染或真菌过度生长相关或部分相关的真菌感染。在某些情况下，真菌物种可以是属于子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、微孢子门(Microsporidia)或接合菌门(Zygomycota)的任何物种。真菌感染或过度生长可包括一种或多种真菌物种，例如白色假丝酵母、热带假丝酵母(C.tropicalis)、近平滑假丝酵母、光滑假丝酵母、耳道假丝酵母、克鲁斯假丝酵母(C.krusei)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、球形马拉色菌(Malassezia globose)、限制性马拉色菌(M.restricta)或汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、串珠状赤霉(Gibberella moniliformis)、甘蓝链格孢菌(Alternaria brassicicola)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、杰氏肺囊虫(P.jirovecii)、管鼻蝠肺囊虫(P.murina)、穴兔肺囊虫(P.oryctolagi)、魏氏肺囊虫(P.wakefieldiae)和棒曲霉(Aspergillusclavatus)。真菌物种可以被认为是病原体或机会病原体。此外，真菌物种可以在人体内或人体上固有地发现(例如，无论水平或浓度如何，可持续地存在)，或者它可以在人体内或人体上瞬时存在。

在某些情况下，真菌感染是由假丝酵母属的真菌引起的(即假丝酵母属感染)。例如，假丝酵母属感染可以由假丝酵母属中的真菌引起，所述真菌选自白色假丝酵母、光滑假丝酵母、都柏林假丝酵母(C.dubliniensis)、克鲁斯假丝酵母、耳道假丝酵母、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母、拟平滑假丝酵母(C.orthopsilosis)、吉利蒙假丝酵母(C.guilliermondii)、皱褶假丝酵母(C.rugose)和葡萄牙假丝酵母(C.lusitaniae)。可通过本发明的方法治疗的假丝酵母属感染包括但不限于假丝酵母血症、口咽假丝酵母病、食管假丝酵母病、粘膜假丝酵母病、生殖器假丝酵母病、外阴阴道假丝酵母病、直肠假丝酵母病、肝假丝酵母病、肾假丝酵母病、肺假丝酵母病、脾假丝酵母病、耳霉菌病、骨髓炎、脓毒性关节炎、心血管假丝酵母病(例如心内膜炎)和侵袭性假丝酵母病。

可以通过本文描述的方法治疗或预防的耳道假丝酵母的临床分离株描述于实施例部分(例如，实施例7)和Lee等人,J Clin Microbiol.49:3139-42,2011,Kathuria等人,JClin Microbiol.53:1823-30,2015,和Vallabhaneni等人,MMWR Morb Mortal WklyRep.65:1234-1237,2016，其各自通过引用以其整体掺入本文。例如，Kathuria的图2描述了耳道假丝酵母的临床分离株，其如表1所示。

表1

在某些情况下，真菌感染是由曲霉属中的真菌引起的(即曲霉属感染)。例如，曲霉属感染可以由曲霉属中的真菌引起，该真菌选自烟曲霉、黄曲霉(A.flavus)、土曲霉(A.terreus)、黑曲霉(A.niger)、亮白曲霉(A.candidus)、棒曲霉(A.clavatus)和赭曲霉(A.ochraceus)。可通过本发明的方法治疗的曲霉属感染的实例包括但不限于曲霉菌病(例如，侵袭性曲霉菌病、中枢神经系统曲霉菌病或肺曲霉菌病)。在一些情况下，真菌感染也可以是皮肤真菌感染，其可以由小孢子菌属(Microsporum)、表皮癣菌属(Epidermophyton)或毛癣菌属(Trichophyton)中的真菌引起。

在某些情况下，本发明的方法可用于治疗肺囊虫属感染，其指的是由肺囊虫属中的真菌引起的感染。肺囊虫属中的真菌包括卡氏肺囊虫(P.carnii)、杰氏肺囊虫(P.jirovecii)、管鼻蝠肺囊虫(P.murina)、穴兔肺囊虫(P.oryctolagi)和魏氏肺囊虫(P.wakefieldiae)。可通过本发明的方法治疗的肺囊虫属感染的实例包括但不限于杰氏肺囊虫肺炎(也称为卡氏肺囊虫肺炎、肺囊虫属肺炎或PCP)。

此外，本文提供的方法可用于治疗例如头癣、体癣、脚癣、甲癣、甲周癣(perionychomycosis)、花斑癣(pityriasis versicolor)、鹅口疮、阴道假丝酵母病、呼吸道假丝酵母病、胆道假丝酵母病、食管假丝酵母病、尿道假丝酵母病、系统假丝酵母病、粘膜皮肤假丝酵母病、曲霉菌病、毛霉菌病、副球孢子菌病、北美芽生菌病、组织胞浆菌病、球孢子菌病、孢子丝菌病、真菌性鼻窦炎和慢性鼻窦炎。或者，可施用本文所述的治疗方案和药物组合物以治疗受试者的血流感染或器官感染(例如，肺、肾或情人感染)。

在某些情况下，真菌感染可以是抗药性真菌感染，其是用抗真菌药物治疗难以治疗的真菌感染。在这种感染中，引起感染的真菌对用一种或多种抗真菌药物治疗具有抗性(例如假丝酵母属的抗真菌药物抗性菌株)。真菌对其可具有抗性的抗真菌药物包括但不限于唑类化合物、棘白菌素、多烯化合物和氟胞嘧啶。

II.治疗适应症

本文提供的治疗方法可以与(i)具有真菌感染或其相关病况的一种或多种适应症、症状或体征的人受试者或(ii)具有发展真菌感染或其相关病况的高风险的人受试者(例如，住院患者、肠移植受者、低出生体重婴儿、具有遗传易感性的个体)一起使用。本文公开的方法可单独使用或在多部分治疗计划中使用，以治疗、减轻或预防与有需要或有风险的人受试者中的真菌感染或相关病况相关的病况、疾病或症状。

在某些情况下，可以基于标准诊断评估鉴定已经发展或有发展真菌感染风险的个体。此类评估可包括测试从个体获得的任何适当的生物样品，其中可检测到真菌感染的迹象或指标，包括生物流体、粪便样品、组织或细胞(例如，体液，例如血液和血液成分(例如，血清和血浆)、支气管灌洗痰、唾液、尿液、羊水、淋巴液、胆汁、渗出液、腹膜液、脑脊液、细胞裂解液的上清液、裂解细胞、细胞提取物和核提取物；组织(包括来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官的组织)、组织样品、活检和/或抽吸物)。感染指标可以是宿主来源的(例如，细胞因子或抗体)或微生物来源的(例如，通过粪便CFU、粘膜活检或16S测序检测的病原体相关分子或真菌细胞)。

可以在受试者的身体中或身体上直接或间接地检测真菌感染的指征。例如，感染的直接迹象包括但不限于检测到不期望的真菌致病有机体或病原体(例如假丝酵母属物种)的过度生长，如通过组织活检上的粘附微生物物种或其他生物样品提取物(例如生物流体、粪便样品、组织或细胞(例如体液例如血液和血液成分(例如血清和血浆))、支气管灌洗痰、唾液、尿液、羊水、淋巴液、胆汁、渗出液、腹膜液、脑脊液、细胞裂解液的上清液、裂解细胞、细胞提取物和核提取物；组织(包括来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官的组织)、组织样品、活检和/或抽吸物)中的非粘附物种测量的，其中使用本领域熟知的方法(例如，基于培养的方法或非培养方法)检测微生物。真菌感染可以通过与健康个体相比某些真菌分类群、属(例如假丝酵母属)或种(例如，热带假丝酵母、白色假丝酵母)的丰度的变化(例如，增加或减少)来指示。或者，真菌感染可以通过与健康个体相比真菌物种总群体的总体丰度或多样性(例如，组成)的变化(例如，增加或减少)来指示。

III.药物制剂

本发明的特征在于通过施用单剂量的药物组合物(例如，通过口服、皮下或静脉内施用)来治疗或预防真菌感染或其相关病况的方法，所述药物组合物包括盐或中性形式的CD101或由其组成。药物组合物可以用药学上可接受的稀释剂、载体和/或赋形剂施用人。取决于施用模式和剂量，将本文所述方法的药物组合物配制成合适的药物组合物以允许容易递送。根据需要，单剂量可呈单位剂型。包含在本发明的单剂量中的活性成分(例如，盐或中性形式的CD101)的量使得提供在指定范围内的合适剂量(例如，50至800mg或500mg至1200mg的剂量的盐或中性形式的CD101)。

由盐或中性形式的CD101组成或包括盐或中性形式的CD101的药物组合物可以配制用于例如口服施用、静脉内施用或皮下施用。在某些情况下，可配制由盐或中性形式的CD101组成或包括盐或中性形式的CD101的药物组合物用于口服施用。在某些情况下，可配制由盐或中性形式的CD101组成或包括盐或中性形式的CD101的药物组合物用于皮下施用。在某些情况下，可配制由盐或中性形式的CD101组成或包括盐或中性形式的CD101的药物组合物用于静脉内施用(例如注射或输注)。对于可注射制剂，各种有效的药物载体是本领域已知的(参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第22版,(2012)和ASHP Handbook on Injectable Drugs,第18版,(2014))。

本发明药物组合物中可接受的载体和赋形剂在所用剂量和浓度下对受者无毒。可接受的载体和赋形剂可包括缓冲剂例如磷酸盐、柠檬酸盐、HEPES和TAE、抗氧化剂例如抗坏血酸和甲硫氨酸、防腐剂例如氯化六甲基铵、十八烷基二甲基苄基氯化铵、间苯二酚和苯扎氯铵、蛋白质例如人血清白蛋白、明胶、葡聚糖和免疫球蛋白、亲水性聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮、氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和赖氨酸以及碳水化合物例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖和山梨糖醇。可根据常规药学实践配制组合物。制剂中化合物的浓度将根据许多因素(包括待施用药物的剂量和施用途径)而变化。

口服制剂

本发明的药物组合物(例如，盐或中性形式的CD101)可以以口服制剂的形式制备。口服使用的制剂可包括片剂、囊片、胶囊、糖浆或口服液体剂型，其在与无毒的药学上可接受的赋形剂混合物中含有活性成分。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂或填充剂(例如蔗糖、山梨糖醇、糖、甘露醇、微晶纤维素、淀粉(包括马铃薯淀粉)、碳酸钙、氯化钠、乳糖、磷酸钙、硫酸钙或磷酸钠)；制粒和崩解剂(例如包括微晶纤维素的纤维素衍生物、包括马铃薯淀粉的淀粉、交联羧甲基纤维素钠、藻酸盐或海藻酸)；粘合剂(例如蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、阿拉伯树胶、海藻酸、海藻酸钠、明胶、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、硅酸铝镁、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇)；和润滑剂、助流剂和抗粘合剂(例如硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油或滑石)。其他药学上可接受的赋形剂可以是着色剂、调味剂、增塑剂、保湿剂、缓冲剂等。口服使用的制剂还可以单位剂型提供为咀嚼片、非咀嚼片、囊片、胶囊(例如作为其中活性成分与惰性固体稀释剂混合的硬明胶胶囊，或作为其中活性成分与水或油介质混合的软明胶胶囊)。

或者，本发明的药物组合物可与赋形剂一起配制，所述赋形剂改善化合物的口服生物利用度。例如，本发明的剂型可与中链(C8至C12)脂肪酸(或其药学上可接受的盐)例如癸酸、辛酸、月桂酸或其药学上可接受的盐或其混合物一起配制用于口服施用。制剂可任选地包括中链(C8至C12)烷醇等赋形剂。或者，本发明化合物可用一种或多种中链烷基糖(例如，烷基(C8至C14)β-D-麦芽糖苷、烷基(C8至C14)β-D-葡萄糖苷、辛基β-D-麦芽糖苷、辛基β-D-吡喃麦芽糖苷、癸基β-D-麦芽糖苷、十四烷基β-D-麦芽糖苷、辛基β-D-葡萄糖苷、辛基β-D-吡喃葡萄糖苷、癸基β-D-葡萄糖苷、十二烷基β-D-葡萄糖苷、十四烷基β-D-葡萄糖苷)和/或中链糖酯(例如，蔗糖单癸酸酯、蔗糖单辛酸酯、蔗糖单月桂酸酯和蔗糖单十四烷酸酯)一起配制用于口服施用。

本文公开的方法还可以进一步包括施用盐或中性形式的CD101的速释、延长释放或延迟释放制剂。

胃肠外制剂

本发明的药物组合物(例如，盐或中性形式的CD101)可以以液体溶液或悬浮液的形式配制，并通过胃肠外途径(例如皮下、静脉内或肌内)施用。药物组合物可以配制用于注射或输注。用于胃肠外施用的药物组合物可以使用无菌溶液或任何药学上可接受的液体作为溶媒来配制。药学上可接受的溶媒包括但不限于无菌水、生理盐水或细胞培养基(例如Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、α-改良的Eagles培养基(α-MEM)、F-12培养基)。制剂方法是本领域已知的，参见例如Gibson(编辑)Pharmaceutical Preformulation andFormulation(第2版)Taylor&Francis Group,CRC Press(2009)。

IV.剂量和施用

本文所述的方法通过施用单剂量的包含CD101(例如，盐或中性形式的CD101)的药物组合物来提供真菌感染的治疗，其中所述单剂量以足以治疗真菌感染而无需额外剂量的抗真菌剂的量施用。在某些情况下，施用单剂量的CD101(例如，盐或中性形式的CD101)，而不在一段时间内(例如，施用单剂量CD101之前或之后的1分钟、30分钟、1小时、2小时、12小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、1周内)同时施用另外的抗真菌剂(例如，CD101或另一种抗真菌剂)，所述同时施用会在CD101在受试者中处于治疗有效浓度的同时赋予治疗益处(例如，系统活性的)。在某些情况下，单剂量治疗在施用之前或之后的1-21天内不与任何其他抗真菌治疗组合。例如，可以向患有真菌感染的受试者施用(例如口服、静脉内、皮下或肌内)单剂量的CD101，并且所述单剂量有效地治疗真菌感染，而不需要在用CD101单剂量治疗之前、期间或之后进行额外的抗真菌治疗。在某些情况下，个体可已经历过在单剂量治疗之前的任何时间用不同的抗真菌剂(例如，不赋予治疗益处的抗真菌剂)治疗的先前但不成功的尝试(例如，在抗真菌剂抗性真菌感染的情况下)，并且用包括CD101(例如盐或中性形式的CD101)的单剂量制剂治疗足以有效治疗感染。

本发明中的CD101(例如盐或中性形式的CD101)的剂量取决于包括施用途径、待治疗的疾病和身体特征(例如人受试者的年龄、重量、一般健康状况)在内的因素。剂量可以由医师根据常规因素(例如疾病的程度和受试者(例如人)的不同参数)进行调整。通常，包含在一个或多个剂量内的CD101的量(例如盐或中性形式的CD101)可以是有效降低人受试者中真菌感染和相关病况的风险或治疗所述真菌感染和相关病况而不引起显著毒性的量。

本发明的药物组合物可以治疗有效量施用于人受试者。待施用的药物的优选剂量可能取决于诸如病症的类型和程度、特定人受试者的总体健康状况、施用的具体化合物，用于配制化合物的赋形剂以及行其施用途径等变量。

在某些情况下，单剂量可包括CD101(例如，盐或中性形式的CD101)的口服制剂，并且可以以约50mg至约1200mg(例如75±25mg、100±25mg、150±50mg、200±50mg、250±50mg、300±50mg、350±50mg、400±50mg、500±100mg、600±100mg、700±100mg、1800±100mg、1900±50mg、1000mg±500mg或1500±500mg)的剂量施用。在其他情况下，CD101(例如盐或中性形式的CD101)的单剂量可以包括胃肠外制剂(例如，静脉内、皮下或肌内)，并且可以以约50-1200mg(例如75±25mg、100±25mg、150±50mg、200±50mg、250±50mg、300±50mg、350±50mg、400±50mg、450±50mg、500±100mg、600±100mg、700±100mg、800±100mg、900±50mg、1000mg±100mg或1100±100mg)的剂量施用。

在本文所述的任何方法中，用CD101(例如盐或中性形式的CD101)进行的单剂量治疗的施用时机取决于人受试者的医学和健康状况。在某些情况下，人受试者有发展真菌感染或相关病况的风险，并且在发展真菌感染的症状或体征之前接受用CD101(例如盐或中性形式的CD101)进行的单剂量治疗。在某些情况下，人受试者已经发展出真菌感染或相关病况，并接受用CD101(例如盐或中性形式的CD101)进行的单剂量治疗。CD101(例如盐或中性形式的CD101)的单剂量的施用时机可以由医师优化，以在人受试者中降低真菌感染的风险或治疗真菌感染。

实施例

实施例1：皮下注射CD101

单剂量皮下(SC)施用可以进一步将CD101的效用扩展超出其他棘白菌素的效用，扩展到门诊环境中的抗真菌治疗和预防。进行临床前研究以评估使用SC施用CD101用于这些目的的可行性。

方法

在播散性假丝酵母病的免疫活性DBA/2小鼠模型中研究CD101SC的效力。通过IV注射(100μL,5.0log CFU/小鼠)用白色假丝酵母SC5314(ATCC:MYA-2876，显示在小鼠中致病的氟康唑敏感性人临床分离株)攻击小鼠(5/组)并用CD101 SC(1、3或10mg/kg)治疗。通过IP施用的米卡芬净在相同的三个剂量下作为阳性对照进行测试。在攻击后24小时，收获肾并针对CFU计数进行处理。在治疗和时间匹配的溶媒组之间进行所有比较。使用ICR小鼠也在类似的播散性假丝酵母病模型中测试了CD101 SC(5mg/kg)，在由相同的白色假丝酵母SC5314菌株(IV注射，100μL，4.5log CFU/小鼠，参见实施例10)感染前在第-4天(150mg/kg)和第-1天(100mg/kg)通过环磷酰胺使所述小鼠具有嗜中性粒细胞减少症。

通过在食蟹猴中进行的IV施用途径进行的先前毒理学研究表明，CD101在高达至少30mg/kg时是安全且耐受良好的，高达至少30mg/kg在CD101初始输注到血流中时产生非常高的全身暴露。因此，SC施用的CD101的仅局部耐受性(和PK)需要评估。为此目的，在单次30mg/kg SC剂量后观察雄性和雌性猴子长达10天。在同一研究中，为了确定SC施用后CD101的药代动力学，收集全血样品并在剂量后约0.25、0.5、1、2、4、8、24、36和48小时以及3、4、5、7和10天时收获血浆。然后通过液相色谱和串联质谱检测(LC-MS/MS)定量血浆浓度。通过比较来自SC的浓度-时间曲线下的计算面积(AUC)与来自相同剂量的IV施用的AUC来计算SC给药的生物利用度。

结果

在DBA/2小鼠效力研究(图1)中，在感染后2小时，溶媒治疗的小鼠显示平均肾CFU为3.8log CFU，其在24小时时增加至6.1log CFU。与溶媒对照相比，用CD101 SC(1、3和10mg/kg)治疗的组显示肾CFU显著降低。接受3或10mg/kg CD101 SC的动物显示完全CFU清除，并且1mg/kg组中的5只动物中的4只在24小时内完全清除CFU负荷。使用相同的治疗剂量时，米卡芬净在CFU降低上也显示出良好的剂量反应，但仅在10mg/kg剂量下观察到完全清除，表明在相当的剂量下它不如CD101有效。

大鼠和猴子的早期药代动力学研究表明CD101皮下施用具有良好的耐受性，尽管这些初步研究旨在表征较低剂量(≤5mg/kg)的药代动力学。因此，设计了独立的研究来评估作为高度浓缩溶液(100mg/mL；30mg/kg)的CD101的SC剂量在两只食蟹猴中的耐受性。图5显示在皮下施用单次30mg/kg剂量后10天内两只食蟹猴中CD101的血浆水平。药物在数小时内达到最大浓度，然后在10天的过程中保持几乎恒定。表2进一步显示了猴子中SC施用的CD101的各种药代动力学特征。表3显示了猴子研究中使用的CD101的SC制剂。

表2

表3

组分	功能	浓度
			CD101乙酸盐	活性成分	100mg/mL
甘露糖醇	张度剂	11.4mg/mL
			HCl	pH调节	根据需要以调整至pH 5.6
NaOH	pH调节	根据需要以调整至pH 5.6
			注射用水	介质	适量至1.0mL

在猴子SC耐受性/PK研究中，单次高剂量30mg/kg CD101后未发现刺激或局部(注射部位)不良反应的迹象。在施用后进行进一步的随访观察达10天后，对体重或食物消耗也没有影响。

从相同的猴子SC耐受性/PK研究中，以30mg/kg SC施用CD101后的药代动力学曲线显示，在10天期间测量的总暴露量与相同剂量的IV施用后的总暴露量相当(80％生物利用度)(图2)，表明来自SC施用的高/等效生物利用度。在24小时后达到SC施用的最大血浆浓度，并且在剂量后的整个第一周内持续。注射后一周浓度开始下降，估计的终末半衰期高达约124小时。表4进一步显示了皮下和静脉内施用的CD101的各种药代动力学特征。

表4

实施例2：通过单次静脉内剂量的CD101治疗患有假丝酵母血症的人受试者的真菌感染

使用标准诊断程序将人受试者诊断为患有假丝酵母血症。受试者接受单剂量50-800mg(例如75±25mg、100±25mg、150±50mg、200±50mg、250±50mg、300±50mg、350±50mg、400±50mg、450±50mg、500±100mg、600±100mg、700±100mg、800±100mg、900±50mg、1000mg±100mg或1100±100mg)的通过静脉内输注施用的CD101的乙酸盐治疗。在施用单剂量CD101治疗之前或之后的一至三周内，没有向受试者提供其他抗真菌治疗。在单次静脉内施用CD101后(例如，一至三周后)，在随访中评估受试者并确认假丝酵母血症感染得到消退。

实施例3：通过单次皮下剂量的CD101治疗患有侵袭性假丝酵母病的人受试者中的真菌感染

使用标准诊断程序将人受试者诊断为患有侵袭性假丝酵母病。受试者接受单剂量50-1200mg(例如75±25mg、100±25mg、150±50mg、200±50mg、250±50mg、300±50mg、350±50mg、400±50mg、450±50mg、500±100mg、600±100mg、700±100mg、800±100mg、900±50mg、1000mg±100mg或1100±100mg)的通过皮下注射施用的CD101的乙酸盐治疗。在施用单剂量CD101治疗之前或之后的一至三周内，没有向受试者提供其他抗真菌治疗。在单次皮下施用CD101后(例如，一至三周后)，在随访中评估受试者并确认侵袭性假丝酵母病感染得到消退。

实施例4：通过单次口服剂量的CD101治疗患有曲霉菌病的人受试者中的真菌感染

使用标准诊断程序诊断将人受试者诊断为患有曲霉菌病。受试者接受50mg–1200mg(例如75±25mg、100±25mg、150±50mg、200±50mg、250±50mg、300±50mg、350±50mg、400±50mg、450±50mg、500±100mg、600±100mg、700±100mg、800±100mg、900±50mg、1000mg±100mg或1100±100mg)的在口服制剂中(例如，在丸剂、胶囊或液体制剂中)施用的CD101的乙酸盐治疗。在施用单剂量CD101治疗之前或之后的一至三周内，没有向受试者提供其他抗真菌治疗。在单次口服施用CD101后(例如，一至三周后)，在随访中评估受试者并确认曲霉菌病感染得到消退。

实施例5：CD101在曲霉菌病和唑类抗性播散性假丝酵母病的小鼠模型中的效力

方法

使用唑类抗性假丝酵母病和曲霉菌病的嗜中性粒细胞减少症小鼠模型中评估CD101的体内效力。从人血液中分离的白色假丝酵母的唑类抗性菌株(R357；对氟康唑[Flu]、伏立康唑和泊沙康唑具有抗性，但对两性霉素B[AmB]和棘白菌素敏感)用于小鼠假丝酵母病模型。将烟曲霉(Aspergillus fumigatus)(ATCC 13073)的测试菌株用于小鼠曲霉菌病模型。通过环磷酰胺使小鼠具有嗜中性粒细胞减少症，且然后通过将白色假丝酵母(10⁵CFU/小鼠)或烟曲霉(10⁴CFU/小鼠)注射入尾静脉来感染。在感染后2小时开始施用测试物品。在小鼠假丝酵母病模型中，每组5只小鼠的组接受一个剂量的AmB(3mg/kg IV)、Flu(口服20mg/kg)或CD101(通过腹膜内施用[IP]3、10或30mg/kg)。在感染后72小时，使小鼠安乐死并测量肾组织中的白色假丝酵母计数(CFU/g)。在小鼠曲霉菌病模型中，每组10只小鼠的组接受一个剂量的AmB(2mg/kg IP)或CD101(2mg/kg IV和IP)。每天监测存活10天。分别在假丝酵母病和曲霉菌病模型中通过单因素ANOVA、随后Dunnett氏检验和Fisher's Exact检验，评价溶媒和测试物品组之间的差异的显著性。

结果

与单一IP剂量后给药后贯穿至少72小时的溶媒相比，一个剂量的CD101 3mg/kg产生白色假丝酵母CFU的>99.9％(或>3-log；P<0.001)减少。AmB显示相似但较不稳健的效力(CFU减少>99％或>2-log；P<0.05)，而氟康唑不太有效(CFU减少83.9％或<2-log)。在曲霉菌病模型中，施用2mg/kg IV或IP的CD101显示与AmB 2mg/kg IP相似的效力，两者均具有比溶媒显著更长的存活期(P<0.05；图3)。结论

在唑类抗性假丝酵母病的嗜中性粒细胞减少症小鼠模型中，单个剂量的CD1013mg/kg与溶媒相比产生白色假丝酵母负荷的显著减少(P<0.001)，表明效力如果不是更好的话，也与相同剂量的AmB的效力相当。

实施例6：CD101针对耳道假丝酵母临床分离株的效力

材料和方法

生物体和抗真菌剂

评估从日本、韩国、印度和Center for Medical Mycology获得的耳道假丝酵母临床分离株(n＝14)。使用以下由Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI，文件M38-A2和M27-A3)批准用于酵母和霉菌的假丝酵母QC菌株：近平滑假丝酵母ATCC 22019，克鲁斯假丝酵母ATCC 6258。测试化合物在用于MIC测定前新鲜制备且包括：CD101、5-氟胞嘧啶(5FC)、两性霉素B(AMB)、阿尼芬净(ANID)、卡泊芬净(CAS)、氟康唑(FLU)、伊曲康唑(ITRA)、米卡芬净(MICA)、泊沙康唑(POSA)和伏立康唑(VORI)。

最小抑制浓度(MIC)测定

根据CLSI M38-A2和M27-A3方法进行的液体培养基微量稀释MIC测定用于评估真菌菌株对所选抗真菌剂的敏感性。简而言之，将耳道假丝酵母菌株接铺板在Sabouraud葡萄糖琼脂(SDA)上，并在37℃下孵育2天。然后将耳道假丝酵母细胞收获，然后在生理盐水(0.85％NaCl，通过离心)中洗涤。使用血细胞计数器制备MIC测定接种物。以50和/或100％抑制在孵育24和/或48小时后读取MIC测定(图4)。为了检查接种物计数，将耳道假丝酵母工作分生孢子悬浮液的10倍稀释液铺板至SDA培养基上。在测定菌落计数前，将接种物板在37℃下孵育2天。

实施例7：CD101、卡泊芬净(CAS)、米卡芬净(MICA)和氟康唑(FLU)针对耳道假丝酵母临床分离株的效力和FKS1HS1序列分析

本研究是确定临床耳道假丝酵母分离株对CD101、卡泊芬净(CAS)、米卡芬净(MICA)和氟康唑(FLU)的体外敏感性，和分析FKS1内热点1(HS1)的序列。

材料和方法

耳道假丝酵母分离株。在本研究中使用获得自University of Delhi(Delhi,India)的VP Chest Institute的三十八种耳道假丝酵母菌株(表5)。在测试前，使菌株在酵母提取物蛋白胨葡萄糖(YPD)琼脂板上生长。

表5

耳道假丝酵母抗真菌敏感性测试(AFST)。根据CLSI文件M27-A3(CLSI，2008)中描述的指南，对每种菌株一式两份进行抗真菌敏感性测试。近平滑假丝酵母ATCC 22019和克鲁斯假丝酵母ATCC 6258用作质量控制菌株。CD101、CAS、MICA和FLU作为标准粉末获得自其制造商，并通过将化合物溶解于水(CAS，MICA)或100％二甲基亚砜(DMSO)(CD101，FLU)中来制备储备溶液。

FKS1 HS1 PCR/测序.在T100热循环仪(Bio-Rad)中在30-μl反应体积中使用EmeraldAmp MAX PCR Master Mix(TaKaRa)实施FKS1HS1PCR。PCR混合物含有1μl各引物：10μM的Cspp_F2275(5’-AATGGGCTGGTGCTCAACAT-3’)和Cspp_R3070(5’-CCTTCAATTTCAGATGGAACTTGATG-3’)。将轻触过测试单菌落的无菌牙签浸入PCR反应混合物中，且然后进行FKS1HS1PCR。时间-温度概况包括在94℃下初始变性3分钟，随后35个循环的在94℃下30秒，在53℃下30秒和在72℃下90秒。扩增子在GelStar Nucleic Acid GelStain(Lonza)染色的1％琼脂糖凝胶上显现，通过使用ZR DNA测序清洁试剂盒(ZymoResearch)纯化，并通过Genewiz测序。通过SeqMan Pro 14(DNASTAR Lasergene)分析测序结果。

结果

耳道假丝酵母抗真菌敏感性测试(AFST)。CD11、CAS、MICA和FLU的耳道假丝酵母分离株的MIC(μg/ML)分布显示于表6中。所有耳道假丝酵母分离株(38种)都对氟康唑具有抗性。四(4)种分离株对所有测试的棘白菌素(CD101、CAS，MICA)都具有抗性。CD101表现出与MICA相似的活性。

FKS1HS1PCR/测序.耳道假丝酵母分离株FKS1HS1序列分析的结果显示于表6中。三十四(34)种棘白菌素敏感的分离株在FKS1HS1区域内呈现野生型(WT)基因型。显示对棘白菌素的敏感性降低的四(4)种分离株(表6中的菌株#：16、25、27和30)在白色假丝酵母中在等效于FKS1HS1 S645的位置表现出丝氨酸至苯丙氨酸的氨基酸取代。

表6.耳道假丝酵母菌株的体外抗真菌敏感性概况和FKS1HS1特征(*CAS逆反效应->16μg/ml；**CAS逆反效应丢失，无法读取MIC，真菌生长减少<50％)

结论

高氟康唑抗性在耳道假丝酵母的临床分离株中是常见的。大多数耳道假丝酵母株对棘白菌素敏感。然而，大多数菌株在48小时时对卡泊芬净突破(breakthrough)，但用CD101或其他棘白菌素则不是如此。这些耳道假丝酵母分离株中对棘白菌素的敏感性高度降低与FKS1HS1区域内的氨基酸取代(丝氨酸至苯丙氨酸，等效于白色假丝酵母S645的位置)相关。

实施例8：CD101在播散性假丝酵母病的鼠模型中治疗耳道假丝酵母感染中的效力

方法

雌性6-8周龄的第-1天小鼠在感染前3天用环磷酰胺(200mg/kg)免疫抑制，在感染后1天用150mg/kg免疫抑制。在感染当天，用3×10⁷耳道假丝酵母芽生孢子通过侧尾静脉接种小鼠。将小鼠随机分成5组(对集落形成单位(CFU)而言n＝5，对存活率而言n＝10)：通过腹膜内(IP)注射施用的CD101 20mg/kg、口服(PO)施用的氟康唑20mg/kg、两性霉素B0.3mg/kg IP和溶媒对照。在感染后2小时(第1天)和再次在研究的第4天施用治疗，总共2个剂量。每天监测小鼠并产生存活曲线。在研究的第8天处死CFU组。从每只小鼠取出一个肾，匀浆，在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上铺板，并在35℃孵育2天以测定CFU。监测剩余的存活小鼠直至研究结束(第14天)。

结果

与氟康唑、两性霉素B和溶媒治疗组相比，CD101显示肾CFU平均降低3log，这在统计学上是显著的(分别为P＝0.03、0.03和0.04)。在研究结束时，CD101、氟康唑、两性霉素B、溶媒和未治疗组中小鼠的存活百分比分别为80％、0％、30％、20％和0％(图6)。

结论

总之，我们的研究结果表明CD101在假丝酵母病的播散性模型中具有针对耳道假丝酵母感染的强效抗真菌活性。另外，用CD101治疗导致总体存活百分比显著更高。

实施例9：评估CD101预防和治疗白色假丝酵母生物膜的能力并通过时延摄影探索其时间影响

在本研究中，我们确定了CD101对白色假丝酵母在体外形成的生物膜的预防和治疗的影响，并使用时间时延显微术(TLM)实时评估了CD101(在有效浓度)对生物膜形成的影响。

材料和方法

测试化合物

将CD101粉末储存物在水或酵母氮源基础(Yeast Nitrogen Base，YNB)培养基中复溶，并在YNB中稀释至最终工作浓度0.25μg/ml和1μg/ml。没有CD101的YNB平行制备并用作对照。氟康唑用作比较物。

测试培养基

YNB和Sabouraud葡萄糖琼脂(SDA)培养基

CD101(粉末和复溶溶液)在不使用时储存在-80℃。

菌株

白色假丝酵母SC-5314用于本研究。

CD101对假丝酵母属生物膜的活性

在该研究中，使用生物膜模型(Chandra等人,Nature Protocols 3:1909,2008)在体外生长生物膜，并且确定了CD101对粘附期生物膜(代表生物膜的预防)或成熟期生物膜(代表对生物膜的治疗)的影响。

针对粘附期(预防)或成熟期(治疗)生物膜的活性

使用导管相关生物膜模型(Chandra等人,Nature Protocols 3:1909,2008；Chandra等人,J.Bacteriol.183:5385,2001；Chandra等人,J.Dental Research 80:903,2001)在有机硅弹性体(SE)盘上形成生物膜。对于针对粘附期生物膜的活性(预防)的评估，将假丝酵母属细胞粘附在导管盘上90min。接下来，将盘与CD101(0.25或1μg/ml浓度)一起孵育24h以允许生物膜形成。对于针对成熟期生物膜的活性(治疗)的评估，将假丝酵母属细胞粘附到导管盘上90min，然后转移到新鲜培养基中并再孵育24h以允许形成生物膜。然后将成熟的生物膜暴露于CD101(0.25或1μg/ml浓度)另外24h。在所有实验中使用与氟康唑或仅培养基孵育的盘作为对照。

在粘附和成熟期生物膜中药物暴露结束时，通过使用XTT测定法测量它们的代谢活性来定量生物膜(Chandra等人,Nature Protocols 3:1909,2008；Chandra等人,J.Bacteriol.183:5385,2001；Chandra等人,J.Dental Research 80:903,2001)。在与药物一起孵育后，将盘转移到含有具有XTT和甲萘醌的磷酸盐缓冲盐水的新鲜平板中，在37℃下孵育3小时并在492nm下读取光密度。将单独批次的生物膜用荧光染料(FUN1^TM,CONA)染色并在共焦扫描激光显微镜(CSLM)下观察以评估生物膜结构和厚度(Chandra等人,NatureProtocols 3:1909,2008；Chandra等人,J.Bacteriol.183:5385,2001)。

时延显微术

从上述实验获得的有效CD101浓度用于使用TLM实时监测其对生物膜形成的影响，TLM涉及以特定时间间隔捕获单帧的实时图像，允许时间监测药物和假丝酵母属生物膜之间发生的相互作用。捕获的图像按时间顺序组合，产生描绘随时间推移而发生的事件序列的动画。简而言之，将具有白色假丝酵母的盘(如上所述粘附90min)置于35-mm直径的玻璃底培养皿(MatTek Corp.,Ashland,MA)中。接下来，将CD101(溶解在生长培养基中)加入培养皿中，并在37℃孵育以形成生物膜。在连接到Retiga EXi Aqua照相机(Q-imagingVancouver British Columbia)的Leica DMI 6000B倒置显微镜上立即从0h捕获该相互作用的相差图像，并跟踪至16-17h。为了确定成熟中生物膜中的结构变化，使用Metamorph成像软件(Molecular Devices,Downington,PA)进行生物膜的一系列水平(xy)光学切片的采集和分析。仅用培养基孵育的盘用作对照。

统计分析

使用GraphPad Prism 6软件进行所有数据的统计分析。使用非配对t检验将药物处理组与对照未处理组进行比较。P值<0.05被认为是显著的。

结果

针对粘附期生物膜的活性(预防)

我们的代谢活性和CSLM结果显示CD101在两种测试浓度(0.25和1μg/ml)下都阻止了稳健生物膜的形成。代谢活动的评估显示，与未处理的白色假丝酵母相比，用CD101处理的白色假丝酵母形成显著更少的生物膜(图7A，P<0.05)。相比之下，氟康唑在测试的两种浓度下都不抑制生物膜形成(1和4μg/ml，图7B，P>0.05)。CSLM图像显示未处理的对照的生物膜的高度异质结构，其中细胞/菌丝嵌入细胞外基质中(图8A)，而暴露于两种浓度的CD101仅显示粘附细胞的残余物，并没有成熟生物膜(图8B和8C)。相比之下，氟康唑不抑制生物膜形成(图8D和8E)。另外，与未处理的对照相比，暴露于CD101显著降低了生物膜的厚度(36μm对比4μm，P<0.05，图8F)，而氟康唑对生物膜厚度没有影响(图8G)。

对成熟期生物膜的活性(治疗)

代谢活性和CSLM结果显示CD101在两种测试浓度(0.25和1μg/ml)下对成熟生物膜具有活性。与未处理的生物膜形成的那些相比，暴露于CD101的成熟白色假丝酵母生物膜表现出显著更低的代谢活性(图9A，P<0.05)。相比之下，氟康唑的任一浓度(1和4μg/ml)均未影响这些生物膜(图9B，与未处理的对照相比P>0.05)。CSLM分析显示未处理的对照的生物膜的高度异质结构(图10A)，而用CD101处理的生物膜被根除并显示出凸起的变形/破碎的细胞(图10B和10C)。相比之下，氟康唑在所使用的两种浓度下都不影响假丝酵母属生物膜(图10D和10E)。另外，与未处理的对照相比，CD101显著降低了生物膜的厚度(43μm对比24μm，P<0.05，图10F)，而氟康唑没有影响(图10G)。

时延

时延影片显示未处理的生物膜形成高度异质的生物膜结构，其中细胞/菌丝嵌入细胞外基质中(图11A和11B中的筛选帧)。相比之下，暴露于0.25μg/ml CD101的生物膜仅显示生长发育不良的粘附细胞，其不能生长成成熟生物膜(图11C-11F)。在高放大率下，清晰可见凸起、变形和破裂的细胞(箭头，图11D和11F)。还对3h形成的生物膜研究了CD101(0.25μg/ml)的作用，并且在添加药物后立即捕获图像并跟踪至16h。图12A中的筛选帧显示3h生物膜菌丝生长，其在添加药物后仍然发育不良并且不能生长成成熟生物膜(图12B)。16h后可清楚地看到凸起的、变形的、破碎的细胞/菌丝(箭头，图12B)。

结论

我们的结果表明CD101具有针对由白色假丝酵母形成的粘附期和成熟期生物膜的抗生物膜活性。

实施例10：CD101的预防性单剂量皮下施用在假丝酵母病和曲霉菌病的嗜中性粒细胞减少症小鼠模型中显示出稳健效力。

间歇性皮下(SC)施用CD101的潜力可以将CD101的效用扩展超出其他棘白菌素的效用，扩展到包括门诊环境中的抗真菌治疗和预防。假丝酵母病和曲霉菌病的嗜中性粒细胞减少症小鼠模型用于评估单个SC剂量的CD101作为抗真菌预防的体内效力。

方法

假丝酵母病模型：在第-4天(150mg/kg)和第-1天(100mg/kg)通过环磷酰胺使ICR小鼠(5只/组)具有嗜中性粒细胞减少症，然后通过IV(100μL,10⁵CFU/小鼠)用白色假丝酵母ATCC SC5314攻击(第0天)。在攻击之前，在第-5天、第-3天或第-1天给予小鼠一个SC剂量(5、10或20mg/kg)的CD101。在攻击后24小时，取出肾进行CFU计数。

曲霉菌病模型：在第-3天(6mg/小鼠)、第+1天和第+4天(2mg/小鼠)，通过环磷酰胺使ICR小鼠(6只/组)具有嗜中性粒细胞减少症。在第0天通过IV(100μL,10⁴CFU/小鼠)进行用烟曲霉ATCC的攻击。在攻击之前，在第-5天、第-3天或第-1天给予小鼠一个SC剂量(5、10或20mg/kg)的CD101。监测存活率14天。

结果

在假丝酵母病模型中(图13)，肾CFU随着CD101剂量的增加而降低，并且在较接近攻击时发生预防。在第-3天和第-1天接受10mg/kg的所有动物中观察到完全清除，并且在第-3天接受20mg/kg的除了一只以外的所有动物中观察到完全清除。在剂量为5或10mg/kg时，用CD101预防显示在第-3天和第-1天CFU显著降低。在20mg/kg的最高剂量下，无论预防性治疗日如何，CD101都降低了CFU负荷。

在曲霉菌病模型中(图14A)，在攻击后监测存活率14天。在第-5天、第-3天或第-1天的5、10和20mg/kg的皮下CD101与同溶媒相比存活率显著(>50％)增加相关。当较接近攻击时给予预防时，5mg/kg组显示存活率增加。无论预防性治疗日如何，10和20mg/kg组中的所有动物均存活。

在10-mg/kg皮下剂量后CD101在小鼠中的药代动力学曲线显示～25小时的半衰期，绝对生物利用度为～50％(图14B)。在小鼠中来自皮下10mg/kg的AUC接近人中的IV200mg剂量。通常，注意到在感染时超过MIC(0.03μg/mL)的游离药物血浆浓度与产生更大的CFU减少的更高的游离药物血浆浓度之间的相关性，如图14C对假丝酵母病模型所示。如图14C中的(1)和(2)所示的例外对应于10和20mg/kg(分别为第-3天和第-5天)并且表示明显的滞后现象，其中尽管可能由于自组织的较慢清除率所致的血浆浓度低，但仍发生有效的预防。

实施例11：CD101在大鼠模型中治疗外阴阴道假丝酵母病的效力方法和实验设计

动物品系.Wistar大鼠由Harlan Laboratories UK提供，并且不含特定病原体。大鼠在手术时重80-100g。进行了卵巢切除术。允许大鼠恢复4-7天，然后运输到要进行实验的设施。到达后，在实验开始前让大鼠适应环境至少4天。大鼠在卵巢切除术时重100-120g，在实验开始时为大约300g。

动物圈养.将大鼠圈养在灭菌的个体通风笼中，该通风笼使动物始终暴露于HEPA过滤的无菌空气中。大鼠可以自由获取食物和水(无菌)并且具有无菌的白杨碎屑垫(每3-4天更换)。另外，在感染期间，如果需要的话大鼠可以额外获得湿食物以确保它们保持完全补水。

室温为22℃+/-1℃，相对湿度为60％，最大背景噪音为56dB。将小鼠暴露于12小时光/暗循环。

预调理.雌性Wistar大鼠在研究开始前至少10天接受卵巢切除术。通过在用白色假丝酵母菌株529感染之前，用在第-7、-5、-3和-1天每隔一天皮下(SC)施用的5mg/kg 17-β-雌二醇处理，进一步预处理它们。在整个研究期间每隔一天继续雌二醇处理至感染后7天。

酵母分离株.在该慢性大鼠阴道感染模型中使用白色假丝酵母菌株529L。

感染.将酵母菌株有氧接种到含有0.05mg/mL氯霉素的Sabouraud葡萄糖琼脂培养基(SAB)上，并在30℃孵育48-72h。在感染前18-24h，用来自琼脂平板的2-3个分离的菌落接种酵母蛋白胨葡萄糖(YPD)肉汤并孵育过夜(37℃，在定轨振荡器上)。将含有白色假丝酵母菌株529L的肉汤用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤3次，然后稀释至正确的接种物用于感染。使用血球计测定细胞计数，并通过Sabouraud葡萄糖琼脂上的定量培养确认。

在吸入异氟烷麻醉下，使用约9.8x10⁵CFU/mL(9.8x10⁴CFU/大鼠)白色假丝酵母菌株529L，通过阴道内施用以0.1mL感染大鼠。

制备17-β-雌二醇、CD101和氟康唑

在20％2-羟丙基-β-环糊精(HPBCD)中的17-β-雌二醇.称取90mg17-β-雌二醇(Sigma,UK)并加入到7.2g HPBCD(Sigma,UK)中，并加入感染用水(WFI)以获得最终体积36mL的悬浮液，并立即用于以2.5mg/mL给药动物。

溶媒：WFI中的12.81mg/mL甘露醇。称取384.3mg甘露醇并加入30mL WFI。将混合物短暂涡旋直至完全溶解，并使用0.2μm过滤器过滤除菌。将其储存在2-8℃直至需要，并在使用前温热至室温。

CD101.向61.3mg CD101中加入12.26mL溶媒，并将混合物短暂涡旋直至完全溶解。对于10mg/kg剂量，其以2mL/kg直接使用，并在溶媒中1：2稀释以制备5mg/kg剂量。将它们储存在2-8℃直至需要，并在使用前温热至室温。通过SC途径以2mL/kg剂量给药动物。

氟康唑.临床口服悬浮液用于如下制备氟康唑：1)按照制造商的说明书制备口服悬浮液(10mg/mL氟康唑)；和2)将10mg/mL口服悬浮液在WFI中进一步1：5稀释，得到2mg/mL(20mg/kg)给药溶液。将其保持在室温直至需要并且对动物以10mg/mL给药体积口服给药(通过PO途径)。

治疗.CD101、氟康唑和溶媒治疗在感染后24h通过遵循表7中所示的剂量体积和频率的SC途径开始。氟康唑治疗也在感染后24h开始，但是通过PO途径以表7中所示的剂量体积和频率施用。研究设计在图15中进一步概述。

表7

终点.以适合其临床状况的频率监测大鼠。每天至少记录一次大鼠重量以确保动物保持在伦理限度内。

在该模型中，大鼠通常不会死于感染，但是未治疗的大鼠可能经历一些重量减轻、脱水和毛发直立。在该大鼠模型中，由雌二醇治疗引起的重量减轻和一般性病况减少也是典型的。通过每日阴道灌洗样品的定量培养确定白色假丝酵母的定殖。感染后9天对大鼠实施安乐死，并通过阴道组织(包括子宫角)的定量培养确定白色假丝酵母。

通过用0.1mL预热的无菌PBS冲洗大鼠阴道4次，在感染后第1(治疗前)、2、3、5、7和9天获得灌洗样品。在安乐死之后，在称重之前取出包括子宫角的阴道组织。使用珠搅拌器将组织在2mL无菌PBS中匀浆。适当稀释阴道冲洗液和组织匀浆，然后在含有0.05mg/mL氯霉素的Sabouraud葡萄糖琼脂上定量培养，并在计数前在37℃孵育最多72h。

统计分析.使用StatsDirect软件(版本2.7.8)使用非参数Kruskal-Wallis检验分析数据，如果这是统计学上显著的，则分析所有成对比较(Conover-Inman)。

结果

在该研究中，在由白色假丝酵母菌株529L引起的外阴阴道假丝酵母病的大鼠模型中研究了CD101以5和10mg/kg SC给药一次或以5mg/kg SC给药两次的体内效力。

CD101和氟康唑耐受性和临床条件.所有治疗剂量和持续时间的CD101和氟康唑均耐受良好，未观察到不良事件。用白色假丝酵母局部阴道感染和用CD101或氟康唑治疗后的动物重量示于图16A和16B。动物重量显示为每日组平均重量(图16A)和相对于感染当天(第0天，图16B)测量的重量的重量。作为该模型的典型，卵巢切除的大鼠在多个剂量的17-β-雌二醇后缓慢减轻重量。观察到的重量减轻是该模型的典型，并且似乎没有因CD101治疗而恶化。

CD101的药代动力学曲线.表征了雌性大鼠(每组三只)中CD101的药代动力学(PK)曲线。皮下(SC)施用后，到Cmax的时间(即Tmax)在剂量后8至24小时观察到，表明从施用部位缓慢吸收/分布(图17)。半衰期t1/2值与静脉内(IV)给药时观察到的那些相似，显示48小时的t1/2和97％的SC生物利用度。

效力数据.成功建立了局部白色假丝酵母菌株529L阴道感染的稳健模型。在治疗前阴道灌洗样品中，感染后第1天所有感染大鼠的几何平均负荷为约0.9x10³CFU/mL(表8和图18)。在研究期间，从仅溶媒的灌洗样品中回收的这种感染水平略微增加(约2.0Log₁₀CFU/mL)，并且在第5天至研究结束之间稳定。在研究结束时从溶媒对照大鼠取得的终末阴道、子宫和子宫角组织也获得高水平(约5.5Log₁₀CFU/g)的白色假丝酵母负荷(参见表14和图25A和25B)，如该模型典型的(由于假菌丝侵入，真菌与阴道粘膜紧密粘附)。

表8.治疗前阴道灌洗样品中感染后第1天的几何平均负荷

每日灌洗数据显示以下结果：

·治疗后第1天(感染后第2天，表9和图19)-所有剂量的CD101显示出相似的负荷降低(约1.3Log₁₀CFU/mL)。氟康唑显示略微更高的降低(约1.6Log₁₀CFU/mL)。然而，CD101和氟康唑负荷均与溶媒负荷没有统计学差异。

表9.治疗后第1天(感染后第2天)的几何平均负荷

·治疗后第2天(感染后第3天，表10和图20)-与以5mg/kg给药一次或两次的CD101相比，以10mg/kg给药一次的CD101显示出更高的负荷降低。与溶媒或氟康唑治疗的动物相比，CD101负荷数据变化更多。氟康唑显示出最大的负荷降低，11/12大鼠具有低于检测限的负荷。所有CD101和氟康唑治疗均与溶媒治疗有统计学差异。

表10.治疗后第2天(感染后第3天)的几何平均负荷

·治疗后第4天(感染后第5天，表11和图21)-以5mg/kg给药一次或两次的CD101将负荷降低至约1Log₁₀CFU/m，但这与溶媒治疗无统计学差异。以10mg/kg给药一次的CD101非常有效并且将负荷降低至约4Log₁₀CFU/mL，5/6大鼠具有低于检测限的负荷并且几乎与氟康唑相似。用氟康唑治疗一次或两次的所有大鼠都具有低于检测限的负荷。

表11.治疗后第4天(感染后第5天)的几何平均负荷

·治疗后第6天(感染后第7天，表12和图22)-以5mg/kg给药一次的CD101与感染后第5天相比显示出轻微的真菌负荷增加。以5mg/kg给药两次的CD101比感染后第5天降低了更多的负荷，但是没有统计学显著性。以10mg/kg给药的CD101与感染后第5天相似，但总体负荷降低不如第5天高。在第5天具有可检测负荷的单只大鼠具有略微增加的真菌负荷。

表12.治疗后第6天(感染后第7天)的几何平均负荷

·治疗后第8天(感染后第9天，表13和图23)-数据与治疗后第6天相似。

表13.治疗后第8天(感染后第9天)的几何平均负荷

灌洗负荷数据总结在图24A-24C中。建立了稳健的VVC模型(图24C)；溶媒治疗的大鼠在整个研究中保持高真菌负荷，在感染后第9天升至2x10⁴CFU/mL。以10mg/kg施用一次的CD101是最有效的剂量并且类似于以20mg/kg给药的氟康唑，在感染后第5天显示相当的CFU，此后负荷略微增加。该增加由单只大鼠引起，所述大鼠在第5天具有小的真菌负荷，但真菌负荷在感染后第7天和第9天增加。如所预期的，对于所有治疗，第9天组织CFU高于灌洗CFU，但总体模式类似于灌洗CFU。以10mg/kg用CD101治疗一次的除一只外的所有大鼠都具有不可检测的CFU。

终末阴道组织负荷(阴道、子宫和子宫角)显示在表14和图25A和25B中。数据与阴道灌洗液中观察到的数据一致。数据显示以5mg/kg给药一次CD101导致负荷的最小降低(约0.4Log₁₀CFU/g)，接着是以5mg/kg给药两次的CD101(约0.9Log₁₀CFU/g)，两者在统计学上均不低于溶媒治疗。用以10mg/kg给药一次的CD101治疗的5/6大鼠具有低于检测水平的负荷。单只大鼠具有低水平的负荷。用氟康唑治疗一次或两次的所有大鼠都具有低于检测限的负荷。

表14.终末阴道组织负荷(阴道、子宫和子宫角)(感染后第+9天)

总结

建立了白色假丝酵母菌株529L感染后外阴阴道假丝酵母病的局部大鼠慢性模型的稳健模型。在溶媒治疗组的灌洗样品中，感染负荷峰值达到>4Log₁₀CFU/mL。从溶媒对照大鼠取得的阴道、子宫和子宫角组织也回收了高水平的白色假丝酵母负荷。

通过SC途径施用CD101治疗显示以下灌洗液负荷：

·感染后24h施用5mg/kg的单剂量降低真菌负荷，在感染后第3天(治疗后48h)出现峰值效应，但是其没有保持到研究结束。仅在感染后第3天负荷降低相对于溶媒对照具有统计学显著性。

·给予两次5mg/kg的单剂量(一次在感染后24h，另一次在感染后48h)导致与单剂量相比优异的负荷降低，其在研究期间得以维持。但与单剂量一样，仅在感染后第3天观察到统计学显著性。

·感染后24h给予的10mg/kg(相当于人中的200mg)单剂量导致感染后3天(治疗后48h)真菌负荷显著降低，感染后第5天出现峰值效应。此后负荷似乎再次增加，但这是由于保持了负荷的单只老鼠所致，而所有其它老鼠实际负荷都低于检测水平。这些结果表明通过单次SC剂量CD101优异分布/渗透到阴道粘膜中。

通过SC途径施用CD101治疗显示以下阴道组织负荷：

·感染后24h 5mg/kg的单剂量导致负荷轻微降低。

·给予两次5mg/kg的单剂量(一次在感染后24h，另一次在感染后48h)(总共2个剂量)导致与单剂量相比更大的负荷降低。

·在感染后24h给予的10mg/kg(相当于人中的200mg)的单剂量导致负荷显著降低，其中在6只大鼠中的5只中真菌负荷清除至低于检测水平。与灌洗数据类似，单只大鼠保持了真菌负荷。这些结果表明通过单次SC剂量CD101优异分布/渗透到阴道粘膜中。

用在感染后24h给药一次或单剂量给药两次(感染后24h和48h)20mg/kg PO的氟康唑治疗的所有大鼠显示与CD101相比灌洗液的负荷降低更快。在研究结束时，在灌洗液和阴道组织中所有大鼠都将感染清除至低于检测水平。

实施例12：使用延长间隔给药设计进行的嗜中性粒细胞减少症侵袭性假丝酵母病小鼠模型中长效棘白菌素CD101的药效学

本研究包括药代动力学/药效学(PK/PD)评估CD101在播散性假丝酵母病的嗜中性粒细胞减少症小鼠模型中的效力，以帮助进一步临床开发最佳给药策略。该研究经专门设计以检查[1]鼠模型中延长间隔给药的药代动力学；[2]针对包括白色假丝酵母、光滑假丝酵母和近平滑假丝酵母的多种菌株的CD101剂量-反应关系；[3]与针对每种物种的效力相关的PK/PD靶标暴露。检查药代动力学(PK)/药效学(PD)靶标以提供框架用于进一步开发临床给药方案，优化治疗和帮助建立初步敏感性断点。

方法

抗真菌剂.根据制造商的说明书，在实验当天用0.9％NaCl、10％DMSO和1％Tween-20制备CD101剂量溶液。

菌株.十种临床假丝酵母属菌株用于体内治疗研究，包括四种白色假丝酵母、三种光滑假丝酵母和三种近平滑假丝酵母菌株(表15)。选择该组以包括对三唑和棘白菌素的敏感性的表型变异性，并基于动物模型中的相似适合度，如由对照动物在24h内的生长量所定义的。在Sabouraud的葡萄糖琼脂(SDA)平板上维持、生长和定量生物体。表15总结了研究中使用的选择菌株。

表15.研究生物体、CD101敏感性结果和对阿尼芬净的比较敏感性结果。

体外敏感性测试.根据CLSI文件M27-A3中的标准测试所有分离株。在孵育24h后视觉确定MIC作为与对照相比导致生长显著减少(≥50％)的最低药物浓度。MIC在三个独立的场合一式两份测定。结果表示为这些结果的中值。

动物.所有研究均使用6周龄ICR Swiss/CD1无特定病原体的雌性小鼠(HarlanSprague-Dawley,Indianapolis,IN)，其重23至27g。

感染模型.嗜中性粒细胞减少症鼠播散性假丝酵母病模型用于治疗研究。通过如下使小鼠具有嗜中性粒细胞减少症(多形核细胞计数<100/mm3)：在感染前4天皮下注射150mg/kg环磷酰胺(Mead Johnson Pharmaceuticals,Evansville,IN)，在感染前1天注射100mg/kg环磷酰胺，以及感染后第2天和第4天的额外环磷酰胺剂量(100mg/kg)以确保在整个168h(7d)研究期间具有嗜中性粒细胞减少症。每个治疗组和对照组包括三只小鼠。

在感染前24h将生物体在SDA平板上传代培养。通过将3至5个菌落置于5ml温热至35℃的无菌无热原0.15M NaCl中来制备接种物。将最终的接种物调节至530nm处的0.6透射率。通过SDA上的活菌计数确定的接种物的真菌计数为6.1±0.2log₁₀CFU/ml。

通过在抗真菌治疗开始前2h通过侧尾静脉注射0.1ml接种物来实现假丝酵母属菌株的播散性感染。在研究期结束时，通过CO₂窒息处死动物。无菌取出每只小鼠的肾并置于4℃的0.15M NaCl中。将肾匀浆并以1：10连续稀释，并将等分试样置于SDA上用于在35℃孵育24h后进行活真菌菌落计数。检测下限为100CFU/ml。结果表示为三只小鼠的平均CFU/肾。

药代动力学.在1、4、16和64mg/kg CD101的腹膜内(IP)剂量后进行单剂量药代动力学(PK)评估。收集每个时间点(1、3、6、12、24、48和72h)来自三只小鼠组的血浆。通过液相色谱-串联质谱法测定血浆药物浓度。在药代动力学分析中使用非房室模型。通过非线性最小二乘法计算消除半衰期。通过梯形法则计算浓度-时间曲线下面积(AUC)。鉴于线性PK结果，在PK研究中未直接测量的剂量的药代动力学暴露通过对更高和更低剂量水平的线性外推，和通过研究的剂量范围内的剂量水平的内插来估计。

CD101的治疗效力和药效学靶标测定.如上所述，用10种假丝酵母属菌株之一感染嗜中性粒细胞减少症的小鼠。选择给药方案以改变24-h AUC/MIC指数的大小并试图产生范围从无效果到最大效果的治疗效果。通过IP途径以0.2ml体积施用一次从0.25至64mg/kg变化的五个剂量水平，持续168h研究期。由于对单一分离株的增强效果，对于光滑假丝酵母5592检查了0.0156和0.0625mg/kg的额外研究。每个给药方案和对照组使用三只小鼠的组。在治疗期结束时(168h)，对小鼠实施安乐死，并如上所述立即处理它们的肾用于CFU测定。

数据分析.使用S形剂量-效应(希尔)模型来测量CD101的体内效能。效力终点包括产生24h净停滞效应(与治疗开始时相比，生物体负荷没有变化)所需的剂量水平和当达到时实现菌落计数1-log₁₀减少(相对于在治疗开始时的负荷)所需的剂量。最大响应(E_max)测量为CFU/肾的数量相对于未治疗的对照动物的数量的差异。使用以下等式计算每个菌株的与停滞和1-log₁₀终点相关的剂量：log₁₀D＝[log₁₀(E/(E_max-E))/N]+log₁₀ED₅₀，其中D是药物剂量，E是未治疗动物的对照生长，E_max是最大效应，N是剂量-反应关系的斜率，ED₅₀是达到最大效应的50％所需的剂量。然后计算每种菌株的相关AUC/MIC靶标。我们在该研究中使用PK/PD指数AUC/MIC，因为在先前使用棘白菌素的体内研究中已经显示这与治疗效力相关。使用总药物浓度和游离药物浓度进行计算。决定系数(R²)用于估计可能由于PK/PD指数的回归而导致的方差。Kruskal-Wallis单因素方差分析(ANOVA)用于确定物种之间PK/PD靶标的差异是否显著。

结果

体外敏感性研究.所选菌株的CD101的MIC显示在表15中。另外，鉴于CD101与阿尼芬净的相似性，显示了与阿尼芬净的比较MIC。值得注意的是，菌株包括具有已知抗性的菌株(光滑假丝酵母10956是继发于FKS突变FKS2_HS1_F659V的棘白菌素抗性的)或对棘白菌素的敏感性降低的菌株(光滑假丝酵母35315)。总体而言，所有菌株的CD101MIC变化32倍。

药代动力学.1、4、16和64mg/kg的腹膜内剂量后小鼠CD101血浆浓度的时间过程示于图26中。峰值(C_max)水平范围为2.6–76.7mg/L,AUC_0-∞93.2–40464mg*h/L，消除半衰期范围为28–41h。AUC_0-∞在剂量范围内是线性的(R²＝1)。蛋白质结合率为99.2％。

CD101的治疗效力和药效学靶标测定.在治疗开始时，小鼠具有4.2±0.2log₁₀CFU//肾，并且未治疗对照中的负荷增加至7.2±0.6log₁₀CFU//肾。每组生物体的体内剂量-反应曲线显示在图27A-27C中。观察到每组的剂量依赖性活性，在高剂量下对白色假丝酵母和光滑假丝酵母具有显著的效能，因为对于许多菌株观察到>2-log₁₀杀伤。对近平滑假丝酵母的效能较不明显，尽管基于剂量-反应曲线，我们推测较高剂量会实现对该物种的类似活性。治疗期间(168h)内的PK/PD参数AUC/MIC与治疗效果之间的关系如图28A-28C所示。根据希尔方程，用最佳拟合线显示游离和总药物浓度。决定系数(R²)为强的，范围为0.74-0.93。最后，图29A-29C显示的是平均24h游离药物AUC/MIC，以增强与先前的棘白菌素研究的比较，所述研究关注于24h PK/PD靶标。

实现净停滞和1-log₁₀杀伤所需的剂量(当达到终点时)如表16所示。对总实验持续时间168h(7d)显示了停滞和1-log₁₀杀伤终点的相应总和游离药物AUC/MIC值。如上所述，表中还显示了平均24h游离药物AUC/MIC靶标，以允许与该模型中的其他棘白菌素研究进行比较。除了单一菌株之外对所有菌株实现了停滞，并且针对所有白色假丝酵母和光滑假丝酵母实现了1-log₁₀杀伤，但没有对近平滑假丝酵母菌株实现1-log₁₀杀伤。每个生物体组的中值停滞游离药物AUC_0-168/MIC靶标为：白色假丝酵母20.5，光滑假丝酵母0.5和近平滑假丝酵母18.2(仅两个菌株达到终点)。中值停滞24h游离药物AUC/MIC靶标为：白色假丝酵母2.92，光滑假丝酵母0.07和近平滑假丝酵母2.61。1-log₁₀杀伤终点的PK/PD靶标为停滞靶标的2-4倍高，表明相对陡峭的暴露-反应关系。

表16.嗜中性粒细胞减少症播散性假丝酵母病模型中的停滞和1-log杀伤剂量和相关的AUC/MIC值。

*NA,未达到

讨论

在本鼠模型药效学研究中，我们旨在整合药代动力学特性和体外效能，以提供关于与针对临床相关和多样化组假丝酵母属物种的效力相关的药效学靶标的指导。实际上，CD101的药代动力学是独特的，因为小鼠的消除半衰期延长(范围29-41h)。出于比较目的，同一鼠模型中其他棘白菌素的半衰期平均为约14h。我们还证明了对假丝酵母属物种的有希望的体外效能，其类似于以前较大的监测抗微生物敏感性研究。最后，我们使用鼠播散性假丝酵母病模型证明了CD101具有良好的体内效力，与其他棘白菌素相比，对于大多数生物体具有数值较低的PK/PD靶标暴露。例如，针对白色假丝酵母的中值停滞24h游离药物AUC/MIC是2.92。这是针对该物种的卡泊芬净、米卡芬净和阿尼芬净靶标的1/10至1/5。对于光滑假丝酵母，证实了甚至更大的差异，其中CD101游离AUC/MIC靶标小于三种比较物棘白菌素的1/10。近平滑假丝酵母PK/PD靶标分析在本研究中是有限的，因为只有两个菌株可评估停滞靶标终点，但此处CD101游离AUC/MIC靶标在数值上也低于三种比较物棘白菌素。重要的是注意到，由于半衰期延长，对于嗜中性粒细胞减少症7天持续时间，小鼠受到保护免于生物体生长和疾病。总之，该研究表明，鉴于其独特的药代动力学特性和体内效力，CD101是抗真菌资源的潜在有价值的补充。

将临床前PK/PD靶标模型转换为临床医学的一个重要考虑因素是检查在人药代动力学和监测敏感性范围的背景中鉴定的靶标。CD101在人中的药代动力学研究证明的游离药物AUC_0-168对400mg剂量为30.2mg*h/L和对200mg剂量为15.4mg*h/L。在7天的时间内，这将转化为分别约4.3和2.2mg*h/L的平均24h AUC。因此，如果患者在第1天接受400mg CD101，然后在第8天接受200mg以完成两周治疗，则预期将以MIC≤1mg/对所有白色假丝酵母和近平滑假丝酵母分离株和以MIC≤16mg/L对所有光滑假丝酵母实现停滞靶标。鉴于该物种中棘白菌素抗性的增加，针对包括本研究中包括的FKS突变株的光滑假丝酵母的效能值得特别关注以进一步研究。总体而言，该数据表明人中的CD101暴露预计将对所检查物种的几乎所有野生型分离株达到或超过本研究中鉴定的停滞靶标。

总之，CD101是一种开发中的有前景的新型棘白菌素，其具有有利的药代动力学特性，允许每周一次给药策略，这将减轻患者的风险以及保护健康护理资源并可能降低支出。CD101具有可证明的体外和体内效能，其对比较物棘白菌素而言是等同的或改善的，特别是对于光滑假丝酵母。单剂量在良好建立的免疫受损的播散性假丝酵母病模型中提供7天的强效抗真菌活性。重要的是，所鉴定的PK/PD靶标表明CD101的间歇给药策略(即每周一次输注)的当前研究有可能在人中对大多数白色假丝酵母、光滑假丝酵母、近平滑假丝酵母菌株有效。该研究表明，应继续进行治疗和预防侵袭性假丝酵母病以及其他潜在的真菌感染的临床评估和开发。

实施例13：CD101在肺曲霉菌病的鼠模型中的效力

本研究评估了与米卡芬净相比，在由烟曲霉(菌株AF293)引起的肺曲霉菌病的鼠模型中通过腹膜内施用CD101的抗真菌效力。该研究的主要目的是比较治疗组之间的存活率。

方法

动物品系和圈养.这些研究中使用的小鼠由Charles River(Margate UK)提供，并且是无特定病原体的。使用的小鼠品系是ICR(也称为CD1小鼠)，其是充分表征的远交鼠品系。在我们的设施收到时小鼠(雄性)为11-15g，并允许其适应至少七天。

免疫抑制.小鼠在第-4天用150mg/kg环磷酰胺IP，并在第-1天用150mg/kg环磷酰胺IP和175mg/kg醋酸可的松SC而进行免疫抑制。为了防止由免疫抑制引起的细菌感染，给予小鼠50mg/kg/天的头孢他啶。

生物体的制备和感染.烟曲霉菌株AF293接种物由在通气组织培养瓶中在含有50μg/ml氯霉素的Sabouraud葡萄糖琼脂(SAB)(SABC)上生长的孢子培养物制备。在30℃孵育7-10天后，在含有0.05％Tween80的无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤孢子培养物。使用血球计测定孢子计数，并将孢子在PBS中稀释至～6.9x10⁶CFU/mL。通过在SABC琼脂上定量培养证实接种物浓度。在临时2.5％异氟烷诱导的麻醉下通过鼻内(IN)滴注，用0.04mL(0.02mL/鼻孔)的～6.9x10⁶CFU/mL(～2.8x10⁵cfu/小鼠)的烟曲霉菌株AF293感染嗜中性粒细胞减少症的小鼠肺。

测试物品的制备.米卡芬净以50mg小瓶(批号02323002，08/2017到期)提供，并按照制造商的说明书通过将5mL注射用盐水(SFI)直接加入小瓶中以制备10mg/mL储备溶液来制备。然后将该溶液在SFI中进一步稀释至0.2mg/mL的工作浓度。以10mL/kg IP施用化合物以达到2mg/kg剂量。将其新鲜制备一次并在剂量之间储存在4℃下。

溶媒和CD101稀释剂是SFI中的10％DMSO/1％Tween 20：将1mL Tween 20加入10mLDMSO中，轻轻混合并加入SFI至终体积100mL。将其过滤除菌并在使用前保持在室温下用于给药或配制CD101。以10mL/kg IP施用溶媒。

在10％DMSO/1％Tween 20稀释剂中以2mg/mL制备测试物品CD101储液。轻轻混合后得到澄清的非颗粒溶液。将储液保持在4℃直至需要。通过在10％DMSO/1％Tween 20稀释剂中稀释，根据需要从2mg/mL储液制备5mg/kg(0.5mg/mL)和10mg/kg(1mg/mL)的研究剂量。对于20mg/kg研究剂量，未稀释地使用2mg/mL储液。所有剂量均以10mL/kg IP施用。

治疗.对于该研究，根据表17中概述的治疗组，在感染前第五天开始治疗。在该研究中使用总共78只小鼠(每个治疗组6只小鼠)。

表17.肺曲霉菌病鼠模型治疗组

*感染后1h

一般健康监测.以适合其临床状况的频率监测小鼠。每天至少记录一次小鼠重量，以确保动物保持在伦理限度内并监测治疗效力。

终点.该研究的主要终点是在约定的伦理限度(>20％重量减轻，严重低温<34℃，无法达到食物或饮水，严重弓起背部)内存活。通过每日重量测量监测小鼠，观察频率与临床条件所需一样频繁。表现出严重临床恶化的小鼠在临床评估后使用过量的通过IP注射施用的戊巴比妥进行人道安乐死，并记录死亡时间。将动物尸体储存在-20℃以评估负荷。感染后10天，将所有存活的动物称重并在实施安乐死之前评估其临床状况。如下所述记录和分析最终存活数，并且在进一步处理之前将尸体冷冻在-20℃。

该研究的次要终点是终末肺组织负荷。在确认死亡后立即将尸体在-20℃下冷冻，然后进行组织解剖和处理。将冷冻的尸体在室温下解冻，取出肺并置于含有2mL PBS的预先称重的珠打浆管中，并进行机械破碎。将器官匀浆在PBS中进一步稀释，并在SABC上针对烟曲霉进行定量培养，并在30℃下孵育24-48小时。另外，将300μL未稀释的肺组织匀浆的等分试样储存在-80℃下用于通过qPCR进行的可能的任选负荷评估。

统计分析.使用StatsDirect软件(版本2.7.8)分析数据。使用Kaplan Meier和对数秩和Wilcoxon检验(使用Peto-Prentice加权方法)分析存活数据。

结果

本研究的目的是确定CD101在肺曲霉菌病的鼠模型中的体内效力。表17总结了本研究的设计。所有治疗均耐受良好，未观察到不良体征。

体重.用烟曲霉菌株AF293感染后的动物重量示于图30中。相对于感染前第5天(第一治疗时间)的重量显示动物重量。直至感染前第-1天，重量保持稳定。在第-1天免疫抑制后，来自所有治疗组的小鼠重量减轻。在几乎所有治疗组中感染后重量持续减轻，但自感染后3天开始在第-1天用10mg/kg的CD101和第-3天和第-1天用20mg/kg的CD101治疗的小鼠重量不持续减轻。

存活率.各种治疗的中值和平均存活期显示在表18中，所有治疗组的存活率曲线显示在图31中。对数秩和Wilcoxon检验的统计结果显示在表19中。

表18.各治疗组的平均和中值存活期

治疗	中值存活期(小时)	平均存活期(小时)
			溶媒IP第-5天	52.5	69.0
米卡芬净2mg/kg IP第0天	73.3	75.3
			米卡芬净2mg/kg IP第-1天	64.7	64.7
CD101 5mg/kg IP第0天	64.6	67.8
			CD101 5mg/kg IP第-1天	67.6	72.1
CD101 5mg/kg IP第-3天	67.7	70.0
			CD101 5mg/kg IP第-5天	65.3	65.3
CD101 10mg/kg IP第-1天	81.0	121.8
			CD101 10mg/kg IP第-3天	73.4	76.9
CD101 10mg/kg IP第-5天	65.7	67.2
			CD101 20mg/kg IP第-1天	72.3	155.6
CD101 20mg/kg IP第-3天	69.8	91.9
			CD101 20mg/kg IP第-5天	69.8	75.5

建立了烟曲霉菌株AF293的肺曲霉菌病感染的稳健存活模型。溶媒治疗的小鼠在感染后～48h开始死于感染，并且在感染后第5天全部死于感染，导致感染后69h的平均存活时间。感染后10天终止该研究，因为大多数小鼠已经死于感染。

将用CD101治疗的动物组中的存活率与在感染前或感染后同时用比较物米卡芬净治疗的组进行比较。与感染前一天用米卡芬净治疗的组相比，在感染前一天用10mg/kg和20mg/kg CD101治疗的组具有统计学上更高的存活率(表19)。

表19.不同比较的对数秩和Wilcoxon检验输出

NS-不显著

肺负荷.终末肺负荷示于表20和图43中。

表20.肺负荷

结论

在这种肺曲霉菌病模型中，小鼠形成了稳健感染，在感染后第4天～80％溶媒治疗的小鼠死于感染并且在感染后第5天100％小鼠死于感染。

10mg/kg或20mg/kg(CD101人剂量(400mg)AUC当量)的感染前一天的单剂量CD101治疗与感染前一天的比较物2mg/kg(米卡芬净人剂量(50mg)AUC当量)米卡芬净治疗相比导致在统计学上更高的存活率。

实施例14：用于预防曲霉属、假丝酵母属和肺囊虫属感染的CD101预防剂量原理。

将CD101的临床药代动力学与非临床体外敏感性和体内效力的测量值进行比较以指导用于预防真菌感染的剂量选择。

方法

通过超速离心测量CD101与小鼠和人血浆蛋白的蛋白质结合，其中游离化合物在37℃下通过使用高离心力沉降2.5小时后与蛋白质结合的化合物分离。测试血浆浓度范围为7至60μg/ml，并通过LC-MS/MS分析所得样品。

先前使用CLSI肉汤微量稀释方法(M38-A2,M27-A3；Pfaller等人2017)评估了CD101的体外活性作为SENTRY国际监测程序的一部分。CD101显示出对烟曲霉((MEC₉₀＝0.015μg/mL)和白色假丝酵母(MIC₉₀＝0.06μg/mL)临床分离株的强效活性。然后将这些敏感性数据与来自健康成人研究的CD101血浆浓度(针对血浆蛋白结合调整)进行图形比较。在肺囊虫属肺炎鼠模型中的非临床效力也被认为是评估CD101剂量用于抗真菌预防的临床研究。

结果

在蛋白质结合研究中，在测试的浓度内，在人血浆中结合的CD101的百分比范围为96.4％至98.0％，平均值为97.4％，而在小鼠血浆中结合的CD101的百分比范围为99.2％至99.3％，平均值为99.2％。

单剂量400mg后1期受试者的平均未结合CD101血浆浓度高于白色假丝酵母的MIC₉₀达7天，400mg和200mg的CD101血浆浓度高于烟曲霉的MIC₉₀达7天(图32)。尽管对于肺囊虫属物种的标准体外MIC测试是不可能的，但是CD101在人当量剂量<50mg下在小鼠中预防了肺囊虫属肺炎，其结果与护理标准(甲氧苄啶/磺胺甲噁唑)相似。从最初的剂量开始，400mgCD101的剂量似乎足以预防真菌感染。鉴于重复剂量施用时约30％至55％的累积，以及CD101对假丝酵母属物种具有杀真菌作用的事实，200mg的CD101也可有效用于真菌预防。

实施例15：CD101的体外活性和体内组织分布

CD101的体外活性是针对作为2014年和2015年JMI国际SENTRY监测程序的一部分收集的153个烟曲霉临床分离株进行评估的。通过根据CLSI肉汤微量稀释指南(M38-A2)测量最小有效浓度(MEC)值来确定敏感性。在5mg/kg IV CD101剂量后，SD大鼠(N＝3/时间直至5d)中CD101的体内组织分布。通过LC-MS/MS测量血浆/组织浓度。

CD101显示出对临床烟曲霉分离株的强效体外活性，其中MEC50、MEC90和MEC范围值分别为0.015、0.015和≤0.0078-0.03μg/mL。

在体内，CD101组织/血浆暴露比(～4)在主要器官(肝、肾、肺、脾)之间是相当的，表明有效渗透。此外，观察到更长的组织停留时间，因为与血浆(39h)相比，所研究的所有组织中CD101的t_1/2(40–77h)更长(图33)。

实施例16：嗜中性粒细胞减少症ICR小鼠的烟曲霉(ATCC 13073)播散性感染：CD101预防效力

研究目的是评估测试物品CD101在嗜中性粒细胞减少症ICR小鼠的烟曲霉(ATCC13073)播散性感染模型中作为预防剂的功效。

方法

接种物制备.烟曲霉(ATCC 13073)从96h马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)中获得，并重悬于0.1％Tween 20中。将培养物重悬于1mL冷PBS(>1.0×10⁸CFU/mL,OD620 2.3-2.8)中。然后将培养物在PBS中稀释至最终细胞密度为2.0×10⁵CFU/mL。通过在PDA平板上铺板稀释液确定实际菌落计数以确认接种浓度。实际接种计数为1.85×10⁵CFU/mL。

烟曲霉(ATCC 13073)播散性感染(IV).使用重量为22±2g的6只雌性ICR小鼠组。通过三次腹膜内(IP)注射环磷酰胺(第一次在接种前3天以6mg/小鼠，第二次和第三次在接种后第1天、然后第4天以2mg/小鼠)使动物免疫抑制。在第0天，通过用烟曲霉(ATCC 13073)1.85×10⁴CFU/小鼠静脉内(IV)注射到尾静脉对动物接种(0.1mL/小鼠)。在接种前5天、3天或1天开始皮下(SC)一次施用5、10和20mg/kg的CD101作为预防剂。此外，在感染后1小时施用3mg/kg SC的CD101和通过腹膜内(IP)注射的3mg/kg的参比两性霉素B(参见表21)。

观察死亡率14天。与溶媒对照组相比存活率增加50％或更多(≥50％)表明显著的抗感染活性。每天记录健康观察(包括体重、弓背姿势、竖毛、不动和低温)，持续14天。发现濒死的动物将在研究中用CO₂窒息进行人道处死。

表21.研究设计

结果

与溶媒组相比，在第-5天、第-3天和第-1天皮下施用5、10和20mg/kg的CD101与14天存活率的显著(≥50％)增加相关(图34-36)。在感染后1小时施用的5mg/kg SC的CD101和3mg/kg IP的两性霉素B在该研究中也与14天存活率观察的显著增加相关。

此外，通过在感染前第-5天、第-3天和第-1天皮下施用5、10和20mg/kg的CD101，改善感染症状，包括体重减轻、弓背姿势、竖毛、不动和低温。

实施例17：CD101组织和上皮衬里液浓度证实了其用于预防性治疗的用途，如在小鼠播散性和肺曲霉菌病中明显的

CD101先前已证实在曲霉菌病的小鼠抗真菌模型中的稳健效力。研究了CD101在肺上皮衬里液(ELF)中的分布，以进一步证实观察到的效力。

方法

通过IP将CD101(20mg/kg)施用至24只ICR小鼠。在剂量前、剂量后1、3、6、12、24、48和72小时，将3只小鼠/时间点麻醉/安乐死用于血液收集(血浆)和用2×0.5mL盐水冲洗进行的支气管肺泡灌洗液(BALF)收集。使用市售的基于分光光度法的测定定量针对肺上皮衬里液(ELF)计算体积的血浆/BALF标准化的尿素水平。通过LC和电喷雾电离串联质谱(LC-MS/MS)检测测量血浆/BALF样品中的CD101浓度。

播散性曲霉菌病：在第-3天(270mg/kg)、第+1天和第+4天(90mg/kg)通过环磷酰胺使ICR小鼠(6/组)具有嗜中性粒细胞减少症。在第0天用A.fumigatus ATCC 13073(104CFU/小鼠)IV感染。用CD101作为单剂量(2mg/kg IV和IP)或每日(0.5mg/kg BID)给药进行治疗(感染后2h)。监测存活率≥10天。除了CD101在第-1天、第-3天或第-5天给药外，使用相同的模型进行预防。

肺曲霉菌病：通过在第-4天的环磷酰胺(150mg/kg)和第-1天的CPM/可的松(150/175mg/kg)使ICR小鼠(10/组)具有嗜中性粒细胞减少症。在第0天鼻内感染烟曲霉AF293(10⁵CFU/小鼠)。在感染前1天作为单剂量(IP；5、10、20mg/kg)的预防CD101或泊沙康唑(PO；2和10mg/kg)。监测存活率10天。

结果

CD101ELF浓度在4小时前达到最大值，并且在24和48小时时血浆和ELF之间相当(图37)。在ELF中在72小时前浓度可能更高，这表明可能与血浆中的21小时相比ELF中32小时的更长半衰期。施用CD101后，测量的平均最大血浆浓度为30.1μg/mL，并且在剂量后1小时观察到，其是第一个收集时间点。相应的平均血浆AUC_0-72和AUC_inf分别为762和848μg·hr/mL，半衰期为21.1小时。测量的平均最大ELF浓度为15.1μg/mL，其在剂量后6小时达到。相应的平均ELF AUC_0-72和AUC_inf分别为606和802μg·hr/mL，半衰期为31.9小时。基于ELF/血浆的AUC暴露比，CD101从血浆到肺ELF的分布接近于1(0.80至0.95)。

对于播散性曲霉菌病的治疗，通过IV/IP以0.2、1或5mg/kg BID x 5d的CD101显示与溶媒相比存活率显著增加。当给予单一2mg/kg或0.2mg/kg BID x 5d剂量时，存活率是相当的。对于预防，在感染前至多5天给予单次5mg/kg剂量，根据给予的日期显示出改善的存活率。剂量≥10mg/kg显示100％存活率。

在更具挑战性的肺曲霉菌病模型中，从感染前一天给予的单个CD101剂量观察到存活率的剂量依赖性增加。小鼠中20mg/kg的人(400mg)AUC当量显示相对于对照的存活率增加。与泊沙康唑在人AUC当量剂量2mg/kg下的进一步比较(图38)表明CD101的优势，与泊沙康唑的没有存活者相比，CD101具有30％存活率。相对于对照，仅10mg/kg的泊沙康唑显示存活率的统计学显著增加。

实施例18：来自单剂量的高且持续的CD101肺上皮衬里液与血浆暴露比率：在小鼠肺曲霉菌病感染模型中与泊沙康唑和米卡芬净的比较

CD101已在曲霉菌病的小鼠模型中证明体外效能和体内效力。研究了CD101在肺ELF中的分布以进一步证实这种观察到的效力。

方法

用CD101(IP；20mg/kg)给药小鼠，然后处死用于在0-72小时之间的血浆和支气管肺泡灌洗液(BALF)收集。使用分光光度法定量针对ELF体积的血浆/BALF标准化的尿素。通过LC-MS/MS测量血浆/BALF样品中的CD101浓度。针对蛋白质结合(99.2％)校正总血浆浓度。

肺曲霉菌病：在第-4天(150mg/kg)通过环磷酰胺使ICR小鼠(10/组)具有嗜中性粒细胞减少症，并且在第-1天(150/175mg/kg)给予环磷酰胺/可的松。在第0天开始用烟曲霉AF293(10⁵CFU/小鼠)鼻内攻击并且在感染前1天开始用作为单剂量的CD101(IP；5、10、20mg/kg)或泊沙康唑(PO；2和10mg/kg)进行预防。监测存活率10天。

结果

在4h时观察到最大CD101ELF浓度，并且作为总药物浓度在剂量后24h之前在血浆和ELF之间相当。在72h，平均ELF浓度(4μg/mL)保持显著高于0.015μg/mL的烟曲霉MEC₉₀(图39)。所得ELF/血浆AUC_最后比率分别对于总药物为0.80和对于游离药物暴露为100。

从单一预防性CD101剂量观察到剂量依赖性的存活率增加。小鼠中20mg/kg的人(400mg)AUC当量显示相对于对照的存活率增加。CD101蛋白结合结果显示人相对于小鼠血浆中较高的游离部分(～3x)，表明较低的人剂量可同样具有保护作用。与小鼠中人当量剂量2mg/kg的泊沙康唑或5mg/kg的米卡芬净人当量剂量(100mg)的进一步比较表明CD101的优势，与泊沙康唑或米卡芬净的没有存活者相比，CD101具有30％的存活率。相对于对照，只有10mg/kg(人AUC的5x高)的泊沙康唑显示存活率的统计学显著增加。

实施例19：评估CD101和比较物在肺曲霉菌病的鼠模型中的效力

本研究的总体目的是在由烟曲霉菌株AF293(烟曲霉AF293)引起的肺曲霉菌病的鼠模型中评估与比较物泊沙康唑和米卡芬净相比，通过腹膜内施用的CD101的抗真菌效力。该研究的主要目的是比较治疗组之间的存活率。次要目标是比较溶媒和测试物品治疗的动物的肺负荷。

方法

动物品系和圈养.这些研究中使用的小鼠由Charles River(Margate UK)提供，并且是无特定病原体的。使用的小鼠品系是ICR(也称为CD1小鼠)，其是充分表征的远交鼠品系。在收到时雄性小鼠为11-15g，并允许其适应至少七天。

免疫抑制.小鼠在第-4天用腹膜内(IP)施用的150mg/kg环磷酰胺，并在第-1天用150mg/kg环磷酰胺IP和皮下(SC)施用的175mg/kg醋酸可的松而进行免疫抑制。为了防止由免疫抑制引起的细菌感染，每天一次给予小鼠50mg/kg的头孢他啶。

生物体的制备和感染.烟曲霉菌株AF293接种物由在通气组织培养瓶中在含有50μg/ml氯霉素的Sabouraud葡萄糖琼脂(SAB)(SABC)上生长的孢子培养物制备。在30℃孵育7-10天后，在含有0.05％Tween80的无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤孢子培养物。使用血球计测定孢子计数，并将孢子在PBS中稀释至～6.9x10⁶CFU/mL。通过在SABC琼脂上定量培养证实接种物浓度。

在临时2.5％异氟烷诱导的麻醉下通过鼻内(IN)滴注，用0.04mL(0.02mL/鼻孔)的～4.17x10⁶CFU/mL(～1.67x10⁵CFU/小鼠)的烟曲霉AF293感染嗜中性粒细胞减少症的小鼠肺。

测试物品的制备.米卡芬净(Mycamine,Astellas)以50mg小瓶(批号02323002，08/2017到期)提供，并按照制造商的说明书通过将5mL注射用盐水(SFI)直接加入小瓶中以制备10mg/mL储备溶液来制备。然后将该溶液在SFI中进一步稀释至0.5mg/mL的工作浓度。以10mL/kg IP施用化合物以达到2mg/kg剂量。将其新鲜制备一次并在4℃下储存直至需要。

泊沙康唑(Noxafil 40mg/mL口服悬浮液,Merck Sharp&Dohme Limited)以40mg/mL口服悬浮液(批号N00801，04/2019到期)提供。然后将该悬浮液在注射用水(WFI)中进一步稀释至0.2和1mg/mL的工作浓度。将悬浮液分别针对2和10mg/kg剂量以10mL/kg口服(PO)施用，新鲜制备一次并在4℃下储存直至需要。

在10％DMSO/1％Tween 20稀释剂中以6mg/mL制备测试物品CD101储液。轻轻混合后得到澄清的非颗粒溶液。通过在10％DMSO/1％Tween 20稀释剂中稀释，根据需要从6mg/mL储液制备20mg/kg(2mg/mL)的研究剂量。对于60mg/kg研究剂量，未稀释地使用6mg/mL储液。所有剂量均以10mL/kg IP施用。研究剂量保持在4℃直至需要。

治疗.对于该研究，根据表22中概述的治疗组，在感染前第1天开始治疗。在该研究中使用总共36只小鼠(6只/治疗组)。

表22.肺曲霉菌病鼠模型治疗组

终点.该研究的主要终点是在约定的伦理限度(>20％重量减轻，严重低温<34℃，无法达到食物或饮水，严重弓起背部)内存活。通过每日重量测量监测小鼠，观察频率与临床条件所需一样频繁。

表现出严重临床恶化的小鼠在临床评估后使用过量的通过IP注射施用的戊巴比妥进行人道安乐死，并记录死亡时间。在定量评估负荷前将动物尸体储存在-20℃。

感染后10天，将所有存活的动物称重并在实施安乐死之前评估其临床状况。如下所述记录和分析最终存活数，并且在进一步处理之前将尸体冷冻在-20℃。

肺负荷.该研究的次要终点是终末肺组织负荷。在确认死亡后立即将尸体在-20℃下冷冻，然后进行组织解剖和处理。将冷冻的尸体在室温下解冻，取出肺并置于含有2mLPBS的预先称重的珠打浆管中，并进行机械破碎。将器官匀浆在PBS中进一步稀释，并在SABC上针对烟曲霉进行定量培养，并在30℃下孵育24-48小时。

另外，将300μL未稀释的肺组织匀浆的等分试样储存在-80℃下用于通过qPCR进行的可能的任选负荷评估。

统计分析.使用StatsDirect软件(版本2.7.8)分析数据：

1.使用Kaplan Meier和对数秩和Wilcoxon检验(使用Peto-Prentice加权方法)分析存活数据。

2.使用非参数Kruskal-Wallis检验分析肺组织负荷数据，如果这是统计学上显著的，则分析所有成对比较(Conover-Inman)。

结果

本研究的目的是确定CD101和比较物在肺曲霉菌病的鼠模型中的体内效力。表22总结了本研究的设计。所有治疗均耐受良好，未观察到不良体征。

体重.用烟曲霉AF293感染后的动物重量示于图40中。相对于感染前第4天的重量显示动物重量。

直至感染前第-1天，动物重量保持稳定。在第-1天免疫抑制后，来自所有治疗组的小鼠重量减轻。在几乎所有治疗组中感染后重量持续减轻直至感染后第5天；此后，存活的任何小鼠重量增加。

存活率.各种治疗的中值和平均存活期显示在表23中，存活率曲线显示在图41中。对数秩和Wilcoxon检验的统计结果显示在表24中。

建立了烟曲霉AF293的肺曲霉菌病感染的稳健存活模型，其中溶媒治疗的小鼠感染后具有～77h的平均存活时间和～75h的中值存活时间(感染后范围74-80h)。感染后10天终止该研究，因为除了在10mg/kg泊沙康唑治疗组中大多数小鼠已经死于感染。

用测试物品治疗显示如下。

·在感染前1天IP给药一次的20mg/kg CD101–与溶媒治疗的小鼠相比，小鼠在感染后具有～130h的更长平均存活时间，但～75h的相似中值存活时间(范围70-240h)。然而，这并不在统计学上优于溶媒治疗的小鼠(图41，表23和24)。两只小鼠存活至研究结束。

·在感染前1天IP给药一次的60mg/kg CD101–与溶媒治疗的小鼠相比，小鼠在感染后具有更长的平均和中值存活时间(分别为～123h和～89h，范围73-240)。单只小鼠存活至研究结束。与溶媒治疗的小鼠相比，用60mg/kg CD101进行的治疗没有导致显著更好的存活率(图41，表23和24)。

·在感染前1天以5mg/kg IP给药一次的米卡芬净–与溶媒治疗小鼠相比，小鼠在感染后具有略微更长的平均和中值存活时间(分别为92h和80h，范围为71-162h)，然而，这是没有统计学显著性的(图41，表23和24)。

·在感染前1天以2mg/kg PO给药一次的泊沙康唑–小鼠在感染后具有69h的相似平均存活时间和～78h的中值存活时间(范围69-114h)。在统计学上，这在使用对数秩检验时与溶媒治疗的小鼠相似，但在使用广义Wilcoxon检验时与溶媒相比统计学上较低的存活率(图41，表23和24)。

·在感染前1天以10mg/kg PO给药一次的泊沙康唑–小鼠在感染后具有212h的长得多的平均存活时间和无法估计的中值存活期，因为5只小鼠存活到研究结束(范围69-240h)。统计学上，使用对数秩检验和广义Wilcoxon检验时，这均比溶媒治疗小鼠更好(图41，表23和24)。

表23：每个治疗组的平均和中值存活期

治疗	中值存活期(小时)	平均存活期(小时)
			溶媒IP	75.3	77.4
泊沙康唑10mg/kg PO	无法估计	211.5
			泊沙康唑2mg/kg PO	69.0	77.5
米卡芬净5mg/kg IP	80.0	92.0
			CD101 20mg/kg IP	74.7	130.4
CD101 60mg/kg IP	88.7	122.7

表24：不同比较的对数秩和Wilcoxon检验输出

比较	对数秩	Wilcoxon(Peto-Prentice)
			溶媒对比泊沙康唑10mg/kg	P＝0.0182	P＝0.0441
溶媒对比泊沙康唑2mg/kg	NS	P＝0.0391
			溶媒对比米卡芬净5mg/kg	NS	NS
溶媒对比CD101 20mg/kg	NS	NS
			溶媒对比CD101 60mg/kg	NS	NS

NS–不显著

一项着眼于免疫抑制效果的小型卫星研究(n＝6只小鼠)以一周延迟和不同批次的小鼠正在进行。研究中的两只小鼠在第-1天组合免疫抑制(环磷酰胺和醋酸可的松)后数天丧失，研究中剩余的四只小鼠存活至研究结束。两只小鼠的丧失最可能是由于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)引起的继发感染，铜绿假单胞菌的来源尚不清楚。

主要研究数据不太可能受到继发感染的影响，因为阳性对照包括泊沙康唑，与基于先前结果的预期一致显示出对抗该感染的良好效力。

肺负荷

终末肺负荷如表25和图42所示。

表25：肺负荷

结论

在这种肺曲霉菌病模型中，小鼠形成了稳健感染，溶媒治疗的小鼠在感染后第4天前死于感染。在感染前一天以20和60mg/kg施用一次的CD101导致存活期略微增加，该存活期在统计学上长于溶媒治疗。在感染前一天以5mg/kg给药一次的比较物米卡芬净未显示存活期的任何改善，所有小鼠在感染后第7天之前都死于感染。与溶媒小鼠相比，在感染前一天以2mg/kg给药一次的比较物泊沙康唑没有显示出存活期的任何改善，所有小鼠在感染后第6天之前都死于感染。将泊沙康唑的剂量增加至10mg/kg并在感染前1天给药一次导致>80％的小鼠存活至研究结束，显著长于溶媒对照治疗。

其他实施方案

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用掺入本文，其掺入程度如同每个独立的出版物或专利申请被具体和单独地指出通过引用掺入。

虽然已经结合其具体实施例描述了本发明，但是应该理解，其能够进行进一步的修改，并且本申请旨在覆盖本发明的任何变化、用途或改变，所述变化、用途或改变一般地遵循本发明的原理并包括与本发明的偏离，这些偏离落入本发明所属领域内的已知或惯常实践，并且可适用于上文阐述的必要特征，并在权利要求书的范围内遵循。

其他实施方案在权利要求内。

Claims

1.一种治疗人受试者中的病况或病症的方法，其包括向所述受试者施用单剂量的药物组合物或由向所述受试者施用单剂量的药物组合物组成，所述药物组合物包含CD101盐或其中性形式和一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中所述单剂量包括足以治疗所述病况或病症的量的CD101盐或其中性形式。

2.一种预防人受试者中的病况或病症的方法，其包括向所述受试者施用单剂量的药物组合物或由向所述受试者施用单剂量的药物组合物组成，所述药物组合物包含CD101盐或其中性形式和一种或多种药学上可接受的赋形剂，其中所述单剂量包括足以预防所述病况或病症的量的CD101盐或其中性形式。

3.权利要求1或2的方法，其中口服施用所述单剂量。

4. 权利要求3的方法，其中所述单剂量包含50 mg至1200 mg的CD101盐或其中性形式。

5.权利要求1或2的方法，其中静脉内施用所述单剂量。

6. 权利要求5的方法，其中所述单剂量包含50 mg至1200 mg的CD101盐或其中性形式。

7.权利要求1或2的方法，其中皮下施用所述单剂量。

8. 权利要求7的方法，其中所述单剂量包含50 mg至1200 mg的CD101盐或其中性形式。

9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述疾病或病况选自假丝酵母血症、侵袭性假丝酵母病、甲癣、曲霉菌病和肺囊虫属感染。

10.权利要求1-9的方法，其中所述疾病或病况是真菌感染。

11.权利要求10的方法，其中所述真菌感染是假丝酵母属感染。

12.权利要求10的方法，其中所述真菌感染是曲霉属感染。

13.权利要求10的方法，其中所述真菌感染是肺囊虫属感染。

14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述单剂量的施用基本上消除或预防真菌感染。

15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述受试者未接受任何同时的抗真菌治疗。

16.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述受试者在施用所述药物组合物后21天内未接受任何抗真菌治疗。

17.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述药物组合物由CD101盐或其中性形式和一种或多种药学上可接受的赋形剂组成。

18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述病况或病症是假丝酵母血症、口咽假丝酵母病、食管假丝酵母病、粘膜假丝酵母病、生殖器假丝酵母病、外阴阴道假丝酵母病、直肠假丝酵母病、肝假丝酵母病、肾假丝酵母病、肺假丝酵母病、脾假丝酵母病、耳霉菌病、骨髓炎、脓毒性关节炎、心血管假丝酵母病或侵袭性假丝酵母病。

19.一种预防或治疗受试者中的生物膜的方法，其包括向所述受试者施用包含CD101盐或其中性形式和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

20.权利要求19的方法，其中所述生物膜是假丝酵母属生物膜。

21.权利要求20的方法，其中所述假丝酵母属生物膜是白色假丝酵母生物膜或耳道假丝酵母生物膜。

22.权利要求19-21中任一项的方法，其中所述生物膜附着于所述受试者的粘膜。

23.一种预防导管上的生物膜生长或杀伤附着于导管的生物膜的方法，其包括将所述导管浸没在包含CD101盐或其中性形式的水溶液中，或将包含CD101盐或其中性形式的水溶液流过所述导管的内腔。

24.权利要求23的方法，其中所述生物膜是假丝酵母属生物膜。

25.权利要求24的方法，其中所述假丝酵母属生物膜是白色假丝酵母生物膜或耳道假丝酵母生物膜。