CN110267974A - 修饰的纳米孔、包含其的组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本文提供了促胰液素的修饰形式或突变形式以及包含其的组合物。特别地，促胰液素的修饰形式或突变形式允许分析物通过修饰的或突变的促胰液素纳米孔有效捕获和/或易位。还提供了使用未修饰的促胰液素或修饰的或突变形式的促胰液素的方法和组合物，例如用于表征分析物如靶多核苷酸。

Description

修饰的纳米孔、包含其的组合物及其用途

技术领域

本文提供了促胰液素的修饰形式或突变形式以及包含其的组合物。还提供了使用修饰或突变形式的促胰液素和组合物的方法，例如，用于表征靶分析物，例如靶多核苷酸。本文还提供了包含促胰液素和在促胰液素内腔中提供的酶的组合物。

背景技术

跨膜孔(例如纳米孔)已用于鉴定小分子或折叠的蛋白质并监测单分子水平的化学或酶促反应。跨过重构到人工膜中的纳米孔的DNA电泳易位对于诸如DNA测序和生物标记物识别的实际应用具有很大的前景。然而，双链或单链DNA通过具有面向带负电荷的氨基酸的内表面的纳米孔的易位是无效的。

发明内容

本公开一般涉及使用促胰液素作为纳米孔的分析物检测。本公开一般涉及修饰的纳米孔。在一些实施方案中，本公开内容提供了修饰的促胰液素纳米孔和亚基多肽、包含其的组合物或装置及其用途。在一些实施方案中，本文提供的经修饰的促胰液素纳米孔可用于分析物检测和分析，因为它们促进跨纳米孔的分析物(例如，带负电或疏水的生物聚合物，例如多核苷酸或蛋白质)的有效捕获和/或易位。因此，如本文所述的促胰液素纳米孔，例如经修饰的促胰液素纳米孔可用于表征分析物，例如靶多核苷酸或多肽，以及其他合适的应用。因此，在进一步的实施方案中，本文描述了用于表征分析物(例如，靶多核苷酸或多肽)的方法和组合物。

本公开的一个方面的特征在于修饰的促胰液素纳米孔，例如，设置在膜中。经修饰的促胰液素纳米孔包含腔表面，所述腔表面限定内腔，所述内腔在顺式开口和反式开口之间延伸穿过膜，其中所述腔表面包含一个或多个氨基酸修饰。氨基酸修饰的实例包括但不限于改变电荷的修饰(例如，带有带正电荷的氨基酸取代带负电荷的氨基酸)，改变其疏水性的氨基酸修饰(例如，疏水性氨基酸取代中性氨基酸)，改变促胰液素中开口大小(例如收缩或门)的氨基酸修饰(例如取代一个或多个比天然存在的氨基酸具有较小或较大侧基的氨基酸，或限制开口的一个或多个氨基酸的缺失)，抑制或阻止门打开的氨基酸修饰(例如用更刚性的氨基酸取代一个或多个柔性氨基酸)，及其组合。

修饰的促胰液素纳米孔的顺式打开和反式打开可以具有适合应用(例如，检测和/或分析诸如靶多核苷酸的分析物)需要的任何大小的直径。在一些实施方案中，修饰的促胰液素纳米孔的顺式开口可具有60埃至120埃的直径。在一些实施方案中，修饰的促胰液素纳米孔的反式打开可具有40埃至100埃的直径。在一些实施方案中，修饰的促胰液素纳米孔的收缩可具有约7.5埃至约25埃的直径。

任何类型的促胰液素可用于产生本文所述的经修饰的促胰液素纳米孔。例如，在一些实施方案中，促胰液素可以是II型分泌系统(例如但不限于GspD)。在一些实施方案中，促胰液素可以是III型分泌系统(例如但不限于YscC和InvG)。在一些实施方案中，促胰液素可以是IV型分泌系统(例如但不限于PilQ)。

在其中促胰液素是InvG的一些实施方案中，修饰的促胰液素纳米孔可以进一步包含亚基多肽，其具有与SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列(对应于没有N1或N0结构域的InvG的氨基酸序列)至少95％相同的氨基酸序列。在这些实施方案中，腔表面可以进一步限定腔内的收缩，该收缩在SEQ ID NO：1的氨基酸D28、E225、R226和/或E231处具有一个或多个氨基酸修饰(例如，电荷改变修饰)。这种氨基酸修饰的实例包括但不限于(i)D28N/Q/T/S/G/R/K；(ii)E225N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/R/K；(iii)R226N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/K/V；(iv)缺失E225；(v)缺失R226；和(vi)E231N/Q/T/A/S/G/P/H/R/K。在一些实施方案中，修饰的促胰液素纳米孔，腔表面可包含在氨基酸E41、Q45或E114处具有一个或多个氨基酸修饰的捕获部分，其实例包括但不限于(i)Q45R/K；(ii)E41N/Q/T/S/G/R/K；和(iii)E114N/Q/T/S/G/R/K。

修饰的促胰液素纳米孔可以是同源多聚体(例如，纳米孔内的所有亚基是相同的)或异源多聚体(例如，至少一个亚基与纳米孔内的其他亚基不同)。修饰的促胰液素纳米孔可包含任何数量的亚基多肽，其足以形成足够大的腔以允许靶分析物(例如，多核苷酸)通过。在一些实施方案中，修饰的促胰液素纳米孔可包含9-20个亚基多肽，其中至少一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或直至所有)所述亚基多肽包含一种或多种如本文所述的氨基酸修饰。

因此，本文还提供了修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽和包含编码修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽的核苷酸序列的多核苷酸。

例如，在一个方面，修饰的GspD促胰液素纳米孔包含亚基多肽，其包含具有与SEQIDNO：36所示的促胰液素结构域的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的促胰液素结构域。

来自霍乱弧菌和来自大肠杆菌ETEC的GspD的促胰液素结构域含有帽门。其他II型分泌系统促胰液素亚基多肽，包括一些GspD亚基多肽，例如大肠杆菌K12，不包含帽门。在一个方面，修饰的促胰液素纳米孔可以是不包含帽门的纳米孔。在SEQ ID NO：36中所述的促胰液素结构域包含位置56和77之间的帽门。例如，可以修饰SEQ ID NO：36中所示的促胰液素结构域以删除全部或部分帽门，例如可以删除或替代SEQ ID NO：36的D55或T56至T77的全部或部分氨基酸。或者，修饰的GspD促胰液素纳米孔可以自然地缺少帽门。SEQ IDNO：36的D55或T56至T77的氨基酸对应于SEQ ID NO：32的D371或T372至T393的氨基酸。

可以修饰GspD的中央门以用具有较小侧基的氨基酸取代氨基酸和/或用中性或带正电荷的氨基酸取代带负电荷的氨基酸。在SEQ ID NO：36中设置的促胰液素结构域包含位置144至157之间的中央门，其对应于SEQ ID NO：32的位置460和473。修饰的GspD促胰液素纳米孔的促胰液素结构域可包含具有与SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的促胰液素结构域，其中：(i)D55或T56至T77的全部或部分氨基酸缺失或被取代，K60、D64、R71和E73中的一个或多个被不带电荷的氨基酸取代和/或D55、T56、T77和K78中的一个或多个被P取代；和/或(ii)F156被较小的氨基酸取代，N151和/或N152被较小的氨基酸取代，D153被不带电荷的氨基酸取代，G137和G165各自独立地未被修饰或被A或V取代。例如，在修饰的促胰液素中，GspD纳米孔Y63至R71可以被缺失和/或被GSG或SGS取代，F156可以被A取代，D153可以被S取代，和/或N151和N152可以各自独立地被G或S取代。SEQ IDNO：36的D55、T56、K60、Y63、D64、R71、E73、T77、K78、G137、N151、N152、D153、F156和G165对应于SEQ ID NO：32所示的全长GspD氨基酸序列的D371、T372、K376、Y379、D380、R387、E389、T393、K394、G453、N467、N468、D469、F472和G481。修饰的促胰液素GspD纳米孔可以在一个方面包含亚基多肽，所述亚基多肽包含与SEQ ID NO：33、34和/或35所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。

修饰的GspD促胰液素纳米孔的促胰液素结构域可包含具有与SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的促胰液素结构域，其中：(i)D55或T56至T77的全部或部分氨基酸缺失或被取代，K60、D64、R71和E73中的一个或多个被不带电荷的氨基酸取代和/或D55、T56、T77和K78中的一个或多个被P取代；和/或(ii)F156被较小的氨基酸取代，N151和/或N152被较小的氨基酸取代，D153被不带电荷的氨基酸取代，G137和G165各自独立地未被修饰或被A或V取代。例如，在修饰的促胰液素中，GspD纳米孔Y63至R71可以被缺失和/或被GSG或SGS取代，F156可以被A取代，D153可以被S取代，和/或N151和N152可以各自独立地被G或S取代。SEQ ID NO：35的D55、T56、K60、Y63、D64、R71、E73、T77、K78、G137、N151、N152、D153、F156和G165对应于SEQ ID NO：32所示的全长GspD氨基酸序列的D371、T372、K376、Y379、D380、R387、E389、T393、K394、G453、N467、N468、D469、F472和G481。

修饰的GspD促胰液素纳米孔的促胰液素结构域可包含具有与SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的促胰液素结构域，其中：(i)D117或T118至T139的全部或部分氨基酸缺失或被取代，K122、D126、R133和E135中的一个或多个被不带电荷的氨基酸取代和/或D117、T118、T139和K140中的一个或多个被P取代；和/或(ii)F218被较小的氨基酸取代，N213和/或N214被较小的氨基酸取代，D215被不带电荷的氨基酸取代，G199和G227各自独立地未被修饰或被A或V取代。例如，在修饰的促胰液素中，GspD纳米孔Y125至R133可以被缺失和/或被GSG或SGS取代，F218可以被A取代，D215可以被S取代，和/或N213和N214可以各自独立地被G或S取代。SEQ ID NO：34的D117、T118、K122、Y125、D126、R133、E135、T139、K140、G199、N213、N214、D215、F218和G227对应于SEQ ID NO：32所示的全长GspD氨基酸序列的D371、T372、K376、Y379、D380、R387、E389、T393、K394、G453、N467、N468、D469、F472和G481。

修饰的GspD促胰液素纳米孔的促胰液素结构域可包含具有与SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的促胰液素结构域，其中：(i)D132或T133至T154的全部或部分氨基酸缺失或被取代，K137、D141、R148和E150中的一个或多个被不带电荷的氨基酸取代和/或D132、T133、T154和K155中的一个或多个被P取代；和/或(ii)F233被较小的氨基酸取代，N228和/或N229被较小的氨基酸取代，D230被不带电荷的氨基酸取代，G214和G242各自独立地未被修饰或被A或V取代。例如，在修饰的促胰液素中，GspD纳米孔Y140至R148可以被缺失和/或被GSG或SGS取代，F233可以被A取代，D230可以被S取代，和/或N228和N229可以各自独立地被G或S取代。SEQ ID NO：33的D132、T133、K137、Y140、D141、R148、E150、T154、K155、G214、N228、N229、D230、F233和G242对应于SEQ ID NO：32所示的全长GspD氨基酸序列的D371、T372、K376、Y379、D380、R387、E389、T393、K394、G453、N467、N468、D469、F472和G481。例如，在一个方面，修饰的InvG纳米孔亚基多肽包含与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列(对应于不含N1或N0结构域的InvG的氨基酸序列)，其中修饰的InvG纳米孔亚基多肽在选自SEQ ID NO：1的D28、E41、E114、Q45、E225、R226和E231的氨基酸处包含一个或多个氨基酸修饰(例如，电荷改变氨基酸修饰)。一种或多种氨基酸修饰(例如，改变电荷的氨基酸修饰)可包括以下一种或多种：(i)D28N/Q/T/S/G/R/K；(ii)E225N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/R/K；(iii)R226N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/K/V；(iv)缺失E225；(v)缺失R226；和(vi)E231N/Q/T/A/S/G/P/H/R/K。其他氨基酸修饰可包括但不限于(i)Q45R/K；(ii)E41N/Q/T/S/G/R/K；和/或(iii)E114N/Q/T/S/G/R/K。此类氨基酸修饰可以增强纳米孔对分析物(例如多核苷酸)的捕获(例如D28、E41、E114和/或Q45处的突变)和/或改善分析物(例如多核苷酸)与纳米孔的收缩的相互作用(例如E225和/或R226处的突变)。在另一方面，修饰的InvG纳米孔亚基多肽包含与SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列(对应于包括N1和N0结构域的WT InvG的氨基酸序列)，其中修饰的InvG纳米孔亚基多肽在选自SEQ ID NO：2的D199、E212、E285、Q216、E396、R397和E402的氨基酸处包含一个或多个氨基酸修饰(例如，电荷改变氨基酸修饰)。这种氨基酸修饰的非限制性实例包括：(i)D199N/Q/T/S/G/R/K；(ii)E396N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/R/K；(iii)R397N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/K/V；(iv)缺失E396；(v)缺失R397；(vi)E402N/Q/T/A/S/G/P/H/R/K。其他氨基酸修饰可包括但不限于(i)Q216R/K；(ii)E212N/Q/T/S/G/R/K；和(iii)E285N/Q/T/S/G/R/K。此类氨基酸修饰可以增强纳米孔对分析物(例如多核苷酸)的捕获(例如D199、E212、E285和/或Q216处的突变)和/或改善分析物(例如多核苷酸)与纳米孔的收缩的相互作用(例如E396和/或R397处的突变)。

另一方面的特征在于修饰的InvG纳米孔亚基多肽，其包含内肽酶切割位点。在这方面，修饰的InvG纳米孔亚基多肽包含与SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列(对应于包括N1和N0结构域的WT InvG的氨基酸序列)至少95％相同的氨基酸序列，其中内肽酶切割位点插入SEQ ID NO：2的170和171或171和172位之间。在一些实施方案中，修饰的InvG纳米孔亚基多肽可以进一步包含在选自SEQ ID NO：2的的D199、E212、E285、Q216、E396、R397和E402的氨基酸处的一个或多个氨基酸修饰(例如，电荷改变氨基酸修饰)。这种氨基酸修饰的非限制性实例包括：(i)D199N/Q/T/S/G/R/K；(ii)E396N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/R/K；(iii)R397N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/K/V；(iv)缺失E396；(v)缺失R397；(vi)E402N/Q/T/A/S/G/P/H/R/K。其他氨基酸修饰可包括但不限于(i)Q216R/K；(ii)E212N/Q/T/S/G/R/K；和(iii)E285N/Q/T/S/G/R/K。

本公开的另一方面提供了一种组合物，其包含促胰液素纳米孔和在纳米孔的内腔中提供的酶。组合物可以置于膜内。

同样在本公开的范围内的是例如用于表征靶分析物(例如靶多核苷酸)的装置。所述装置可包括容纳水溶液的腔室，所述水溶液中设置有膜，所述膜包含本文所述的促胰液素纳米孔的任何实施方案。

在一些实施方案中，该装置可进一步包含存在于水溶液中的分析物。示例性分析物包括但不限于多核苷酸、多肽和/或配体。在所述装置在水溶液中包含多核苷酸的一些实施方案中，所述装置可进一步包含多核苷酸结合蛋白，包括例如但不限于解旋酶、核酸外切酶或聚合酶，其任选地与多核苷酸结合。该多核苷酸结合蛋白可以是在膜的顺式-侧或反式-侧，例如接触(经由例如离子和/或疏水性相互作用)或共价连接到纳米孔的顺式-开口或反式-开口。

如本文所述的经修饰的促胰液素纳米孔和装置可用于各种生物传感器或分析物检测应用，但不限于多核苷酸测序和/或蛋白质检测。因此，本文还提供了使用修饰的促胰液素纳米孔和装置的方法。例如，如本文所描述的方法包括获得所述装置和添加分析物至设置在装置中的膜的顺式-侧或反式-侧的所述水溶液的实施方案。在一些实施方案中，该方法还包括通过在膜上施加电压梯度来诱导离子电流流过纳米孔。在一些实施方案中，该方法还包括在施加的电压梯度下检测通过纳米孔的离子电流，其可用于确定分析物的存在。

当该方法用于多核苷酸表征时，该方法可以进一步包括在膜的顺式-侧或反式-侧的水溶液中添加多核苷酸结合蛋白(例如解旋酶、核酸外切酶和/或聚合酶)。在一些实施方案中，多核苷酸结合蛋白可以与多核苷酸分析物结合并且任选地通过例如非共价相互作用(例如，离子和/或疏水相互作用)和/或共价连接与纳米孔的顺式开口或反式开口相互作用。

在下面的描述中阐述了本公开的一个或多个实施方案的细节。根据以下附图和若干实施方案的详细描述以及所附权利要求，本公开的其他特征或优点将显而易见。

附图说明

以下附图构成本说明书的一部分，并且将其包括在内以进一步说明本公开的某些方面，通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文给出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本公开的某些方面。

图1A显示了注射体基体和分离的促胰液素的Cry-EM结构。(左图)基体重建的中央切片视图(深灰色轮廓为a和浅灰色轮廓在较低级别以突出显示较少有序的特征)和分离的促胰液素(蓝色)。PrgH、PrgK和InvG的结构域注释覆盖在左侧，而单体结构域的结构先前在右侧解析。所述PrgH胞质域D1(绿色，左下)不存在于在本研究中使用的PrgH_130-392突变体中并且其相对于所述基体的精确位置不清楚。存在PrgH(N-末端)和PrgK(C-末端)的跨膜螺旋和PrgK N-末端脂化，但是扩散有序。(右图)InvG_172-557(蓝色)、PrgH_171-364(绿色)、PrgK_20-203(橙色)和Rosetta-建模的InvG_34-171(浅蓝色)的精制结构。包含InvG_34-557的一种单体根据结构域着色：中蓝色，N0-N1结构域；钴蓝，N3结构域；青色，外β-折叠；绿色，内β-折叠；橙色，促胰液素结构域唇缘；红色，S结构域(注意与第i+1和i+2启动子的β折叠的移位相互作用)。

图1B显示了野生型InvG_172-557促胰液素的二级结构拓扑结构。促胰液素结构域的β链被编号为1、3a/3b、8和9，其形成外β-桶；4-7，其形成内β-桶；和1、2和3a，其形成β-桶的唇缘。通过保守残基Pro371将链3分成3a和3b。在每个结构域的两端指示的数值限定基于SEQID NO：2的结构域的第一个和最后一个氨基酸位置。

图1C显示来自肠沙门氏菌(例如，基于SEQ ID NO：2)的野生型InvG促胰液素和来自SEQ ID NO：10的97-646位的霍乱弧菌的野生型GspD促胰液素的二级结构拓扑结构。该图显示了InvG纳米孔和GspD纳米孔的顺式和反式开口的不同结构域和尺寸。纳米孔的取向使得纳米孔的OM区域(如在天然状态下)如本文所述位于膜中。

图1D显示了来自霍乱弧菌(PDB：5wq8)和大肠杆菌(PDB：5wq7)的GspD的结构。每个GspD结构的一个亚基以青色着色。

图2显示了CsgG纳米孔与InvG纳米孔的比较。顶行显示CsgG和InvG纳米孔的顶视图，而底行显示CsgG和InvG纳米孔的侧视图。CsgG纳米孔具有9个单体或亚基，InvG纳米孔具有15个单体或亚基。然而，CsgG和InvG纳米孔在管腔内具有直径大致相同的收缩。

图3显示了InvG和CsgG纳米孔曲线。X轴显示InvG和CsgG纳米孔的内部孔半径分布：-60(膜侧/反式开口)和+60(顺式开口)是孔高度的任意数。0是中点。Y轴表示X轴每个位置的孔的腔的实际半径，以埃为单位。

图4显示了CsgG和InvG纳米孔的收缩的比较。顶行显示了CsgG和InvG纳米孔的侧视图。底行显示CsgG和InvG孔收缩内存在的氨基酸。虽然CsgG和InvG纳米孔的直径收缩大致相同，但CsgG纳米孔的收缩在位置51、55和56处具有3个氨基酸(基于野生型序列)并且InvG纳米孔收缩在396和397位具有两个氨基酸(基于SEQ ID NO：2)。

图5显示了多核苷酸结合蛋白(例如，DNA结合酶，例如解旋酶或聚合酶)与CsgG和InvG纳米孔的相对大小。由于InvG纳米孔的开口比CsgG纳米孔的开口宽得多，因此多核苷酸结合蛋白(例如DNA结合酶，例如解旋酶或聚合酶)可以以不同方向与InvG和CsgG纳米孔相互作用。

图6显示了与InvG纳米孔相互作用的多核苷酸结合蛋白(例如，DNA结合酶，例如解旋酶或聚合酶)的顶视图(从不同视角)。在左侧图中，内部虚线对应于图4的InvG(右侧图)中的下部虚线，外部虚线对应于图4的InvG(右侧图)中的上部虚线。

图7显示可用于形成纳米孔的InvG亚基多肽中突变的示例性组合。图中所示的氨基酸位置基于SEQ ID NO：2。

图8显示了InvG纳米孔中图7中所示突变的相对位置。虽然纳米孔不具有N0或N1结构域，但图中指示的氨基酸位置基于SEQ ID NO：2。

图9显示了GspD和InvG促胰液素纳米孔之间的结构同源性。

图10显示了来自霍乱弧菌的GspD的氨基酸序列，并突出显示了晶体结构中缺失的氨基酸序列区域，即本领域尚未确定其壳结构的区域。图中指示的氨基酸位置基于SEQ IDNO：32。

图11显示了来自霍乱弧菌的GspD的结构域结构。图中指示的氨基酸位置基于SEQID NO：32。

图12显示了来自霍乱弧菌的GspD的结构，并突出显示了N3收缩位点和帽和中央门的位置。图中指示的氨基酸位置基于SEQ ID NO：32。

图13显示了G453和G481在来自霍乱弧菌的GspD的氨基酸序列中形成的扭结。

图14显示了用作基线的GspD-Vch-(WT-del(1-239)/(265-282)-H6(C)突变体的电生理学特征。A)在500mM KCl，25mM磷酸盐缓冲液(pH7)中在-180mV下的开孔电流。B)在25mV的交替电位阶梯中，IV曲线范围为-25mV至-200mV和25mV至200mV。

图15显示了在25mV的交替电位阶梯中，-25mV至-200mV和25mV至200mV的不同GspD突变体的IV特征。A)GspD-Vch-(WT-del(1-239)/(265-282)-H6(C)。B)GspD-Vch-(WT-Del((N1-K239)/(N265-SGS-E282)/(Y379-GSG-R387))。C)GspD-Vch-(WT-F472A-Del((N1-K239)/(N265-SGS-E282)))。D)GspD-Vch-(WT-D469S-Del((N1-K239)/(N265-SGS-E282)))。E)GspD-Vch-(WT-N467G/N468S-Del((N1-K239)/(N265-SGS-E282)))。F)GspD-Vch-(WT-N467S/N468G-Del((N1-K239)/(N265-SGS-E282)))。G)GspD-Vch-(WT-N467G/N468S/D469S-Del((N1-K239)/(N265-SGS-E282)))。

图16显示通过GspD-Vch-(WT-del(1-239)/(265-282)-H6(C)突变体的DNA易位。A)在470mM KCL，25mM HEPES，11mM ATP和10mM MgCl 2，pH8.0中在-180mV下的开孔电流。B)连接到适配体的Lambda 3.6kb DNA的添加在当前迹线中显示出清晰的噪声模式。当DNA在孔内时，电流尖峰增加。C)在噪声模式的图像中放大显示开孔电流的下降，这是通过孔易位的DNA。

图17是在GspD孔内结合的单价链霉抗生物素蛋白的生物素化静态链的模型。A)孔顶部的链霉抗生物素蛋白分子。B)在收缩门上方的孔内的链霉抗生物素蛋白分子。

图18显示了GspD-Vch-(WT-N467G/N468S-Del((N1-K239)/(N265-SGS-E282)))对链霉抗生物素蛋白结合的生物素化静态链的捕获。A)静态链实验在单个GspD孔中运行1小时，从对照开孔实验开始15分钟，并在15分钟后通过芯片分别冲洗三条静态链ONLA19798、AH71和AH72。B)开孔对照迹线，电流约为250pA。C)ONLA19798的添加显示立即从开孔中捕获静态链。D)AH71的添加显示从开孔捕获静态链。E)AH72的添加也显示静态链的捕获。

序列简述

SEQ ID NO：1是来自肠沙门氏菌的截短的InvG的391个氨基酸序列(不含N0和N1结构域的全长InvG)。

SEQ ID NO：2是来自肠沙门氏菌的野生型InvG的572个氨基酸序列(包括N0和N1结构域的全长InvG)。前171个氨基酸对应于N0和N1结构域。

SEQ ID NO：3是来自肠沙门氏菌的野生型InvG的氨基酸序列，其中在N1和N2结构域(前171个氨基酸)之后的氨基酸172至178处添加了TEV切割位点(ENLYFQG)。

SEQ ID NO：4是来自大肠杆菌(菌株K12)的GspD的氨基酸序列(>sp|P45758|GSPD_ECOLI II型分泌系统蛋白质D OS＝大肠杆菌(菌株K12)GN＝gspD PE＝2SV＝2)。

SEQ ID NO：5是>tr|Q7BRZ9|Q7BRZ9_YEREN促胰液素YscC的氨基酸序列S OS＝小肠结肠炎耶尔森氏菌GN＝yscC PE＝3SV＝1。

SEQ ID NO：6是>sp|Q04641|MXID_SHIFL外膜蛋白MxiD的氨基酸序列OS＝弗氏志贺氏菌GN＝mxiD PE＝1SV＝1。

SEQ ID NO：7是>tr|A0A1C6ZHG5|A0A1C6ZHG5_PSEAI III型分泌外膜蛋白PscC的氨基酸序列OS＝铜绿假单胞菌GN＝pscC PE＝3SV＝1。

SEQ ID NO：8是>tr|B7UMB3|B7UMB3_ECO27T3SS结构蛋白EscC的氨基酸序列OS＝大肠杆菌O127：H6(菌株E2348/69/EPEC)GN＝escC PE＝1SV＝1。

SEQ ID NO：9是>sp|D0ZWR9|SPIA_SALT1III型分泌系统外膜蛋白SpiA的氨基酸序列OS＝鼠伤寒沙门氏菌(菌株14028s/SGSC 2262)GN＝spiA PE＝2SV＝1。

SEQ ID NO：10是>tr|A0A1E4UJH6|A0A1E4UJH6_VIBCL II型分泌系统蛋白质GspD的氨基酸序列OS＝霍乱弧菌GN＝BFX10_13405PE＝4SV＝1。

SEQ ID NO：11是>sp|P15644|GSPD_KLEPN II型分泌系统蛋白质D的氨基酸序列OS＝肺炎克雷伯氏菌GN＝pulD PE＝1SV＝1。

SEQ ID NO：12是>tr|X5F782|X5F782_NEIME IV型菌毛组装蛋白pilQ的氨基酸序列OS＝脑膜炎奈瑟菌GN＝pilQ PE＝3SV＝1。

SEQ ID NO：13是>WP_071651540.1EscC/YscC/HrcC家族III型分泌系统外膜环蛋白[肠沙门氏菌]的氨基酸序列-与SEQ ID NO：2具有97％的同一性。

SEQ ID NO：14是>WP_038392434.1III型分泌系统外膜孔InvG[沙门氏菌]的氨基酸序列-与SEQ ID NO：2具有94％的同一性。

SEQ ID NO：15是>WP_043640872.1III型分泌系统外膜孔InvG[溶血性杆菌]的氨基酸序列-与SEQ ID NO：2具有69％的同一性。

SEQ ID NO：16是>WP_059765897.1III型分泌系统外膜孔InvG[尤伯纳伯克氏菌(Burkholderia ubonensis)]的氨基酸序列-与SEQ ID NO：2具有67％的同一性。

SEQ ID NO：17是>WP_036979259.1III型分泌系统外膜孔InvG[普罗威登斯菌(Providencia alcalifaciens)]的氨基酸序列-与SEQ ID NO：2具有64％的同一性。

SEQ ID NO：18是>WP_051238518.1III型分泌系统外膜孔InvG[氧化亚铁色假高炳根氏菌(Pseudogulbenkiania ferrooxidans)]的氨基酸序列-与SEQ ID NO：2具有61％的同一性。

SEQ ID NO：19是>WP_070981539.1EscC/YscC/HrcC家族III型分泌系统外膜环蛋白[色杆菌(Chromobacterium vaccinii)]的氨基酸序列-与SEQ ID NO：2具有61％的同一性。

SEQ ID NO：20是>WP_052429256.1III型分泌系统外膜孔InvG[肠沙门氏菌]的氨基酸序列-与SEQ ID NO：2具有60％的同一性。

SEQ ID NO 21是>WP_021564153.1EscC/YscC/HrcC家族III型分泌系统外膜环蛋白[大肠杆菌]的氨基酸序列-与SEQ ID NO：2具有59％的同一性。

SEQ ID NO：22是>WP_024250244.1III型分泌系统外膜孔InvG[志贺氏痢疾杆菌]的氨基酸序列-与SEQ ID NO：2具有56％的同一性。

SEQ ID NO：23是>WP_000694679.1III型分泌系统外膜孔InvG[大肠杆菌]的氨基酸序列-与SEQ ID NO：2具有53％的同一性。

SEQ ID NO：24是>WP_061203566.1EscC/YscC/HrcC家族III型分泌系统外膜环蛋白[嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)]的氨基酸序列-与SEQ ID NO：2具有52％的同一性。

SEQ ID NO：25是>WP_016498773.1EscC/YscC/HrcC家族III型分泌系统外膜环蛋白[恶臭假单胞菌]的氨基酸序列-与SEQ ID NO：2具有52％的同一性。

SEQ ID NO：26是>ANI31722.1III型分泌系统外膜孔InvG[昆虫耶尔森菌(Yersinia entomophaophaga)]的氨基酸序列-与SEQ ID NO：2具有50％的同一性。

SEQ ID NO：27是>WP_053215251.1EscC/YscC/HrcC家族III型分泌系统外膜环蛋白[耶尔森氏菌(Yersinia nurmii)]的氨基酸序列-与SEQ ID NO：2具有49％的同一性。

SEQ ID NO：28是>WP_034249407.1EscC/YscC/HrcC家族III型分泌系统外膜环蛋白[飞虫杀雄菌(Arsenophonus nasoniae)]的氨基酸序列-与SEQ ID NO：2具有46％的同一性。

SEQ ID NO：29是>WP_006122201.1EscC/YscC/HrcC家族III型分泌系统外膜环蛋白[玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii)]的氨基酸序列-与SEQ ID NO：2具有42％的同一性。

SEQ ID NO：30是>KJO55878.1III型分泌系统蛋白[[肠杆菌]产气菌]的氨基酸序列-与SEQ ID NO：2具有41％同一性。

SEQ ID NO：31是霍乱弧菌的GspD的氨基酸序列，包括前导序列。

SEQ ID NO：32是霍乱弧菌的GspD的成熟氨基酸序列。

SEQ ID NO：33是霍乱弧菌的GspD的N3、促胰液素和S结构域的序列(SEQ ID NO：32的氨基酸1至239缺失)。

SEQ ID NO：34是霍乱弧菌GspD的N3、促胰液素和S结构域的序列，其中通过用氨基酸GSG取代SEQ ID NO：32的氨基酸Y379至R387来去除N3结构域中的构建体。

SEQ ID NO：35是霍乱弧菌的GspD的促胰液素和S结构域的序列。

SEQ ID NO：36是霍乱弧菌的GspD的促胰液素结构域的序列。

SEQ ID NO：37是>tr|A7ZRJ5|A7ZRJ5_ECO24一般分泌途径蛋白质D的序列OS＝大肠杆菌O139：H28(菌株E24377A/ETEC)GN＝gspD PE＝1SV＝1。

SEQ ID NO：38是>sp|P31780|GSPD_AERHY II型分泌系统蛋白D的序列OS＝嗜水气单胞菌GN＝exeD PE＝3SV＝2。

SEQ ID NO：39是>sp|P35818|GSPD_PSEAE II型分泌系统蛋白D的序列OS＝铜绿假单胞菌(菌株ATCC 15692/DSM 22644/CIP 104116/JCM 14847/LMG 12228/1C/PRS 101/PAO1)GN＝xcpQ PE＝1SV＝1。

SEQ ID NO：40是>tr|A0A181X688|A0A181X688_KLEOX一般分泌途径蛋白D的序列OS＝产酸克雷伯菌GN＝PulD PE＝3SV＝1。

具体实施方式

某些跨膜孔(例如，蛋白质纳米孔或固态纳米孔)可用作检测或表征生物聚合物的传感器。跨膜孔的结构，特别是孔的内腔，影响生物聚合物和孔之间的相互作用，因此可以从生物聚合物与孔相互作用时产生的信号中获得信息。因此，需要鉴定能够捕获和易位分析物的新的跨膜纳米孔，分析物例如带负电或疏水的生物聚合物，例如多核苷酸或蛋白质。本公开第一次提供了促胰液素纳米孔可用于实际应用，例如多核苷酸作图或测序，或蛋白质检测。

虽然跨膜孔(例如，蛋白质纳米孔或固态纳米孔)可用作检测或表征生物聚合物的传感器，但是生物聚合物(例如多核苷酸)通过某些纳米孔的易位可能是具有挑战性的，例如由于生物聚合物进入纳米孔的大的静电屏障。因此，需要设计跨膜纳米孔，其允许跨纳米孔更有效地捕获和/或易位分析物，例如，带负电或疏水的生物聚合物，例如多核苷酸或蛋白质，这可用于实际应用。例如多核苷酸作图或测序或蛋白质检测。

本公开涉及修饰的促胰液素纳米孔及其亚基多肽、包含其的组合物或装置及其用途。在一些方面，本公开内容提供了修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽(例如，用于形成修饰的促胰液素纳米孔)和包含其的纳米孔。如本文所述的促胰液素纳米孔和经修饰的促胰液素纳米孔可用于各种实际应用，例如表征分析物，例如靶多核苷酸或多肽。因此，本文描述的还是用于表征分析物(例如靶多核苷酸或多肽)的方法和组合物。

在本文所述任何方面的一些实施方案中，促胰液素纳米孔的顺式和反式开口的大小使得酶可能能够进入腔洞。酶可以固定在腔内，例如，通过结合或附着到纳米孔的腔表面或以非固定方式提供在腔洞内。因此，本公开的一个方面还涉及包含促胰液素纳米孔和在腔内提供的酶的组合物。促胰液素纳米孔可以是野生型或突变体或修饰形式，如下文更详细描述的。酶可以存在于纳米孔的顺式前庭或反式前庭中，其中顺式前庭可以定义为从顺式开口延伸到纳米孔的收缩部分的腔的部分，并且其中反式前庭可以定义为从反式开口延伸到纳米孔的收缩部分的腔的部分。此类组合物可用于检测与酶结合或以其他方式与酶相互作用的小分子。这种小分子与酶的相互作用可导致流过纳米孔的离子电流的变化，例如通过改变酶的构象。

修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽

本公开的一些方面提供了修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽。修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽是其序列与参考促胰液素氨基酸序列不同的多肽。修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽的氨基酸序列包含(i)形成顺式开口的氨基酸序列，(ii)形成内腔的氨基酸序列，和(iii)形成反式开口的氨基酸序列。形成顺式开口的氨基酸序列是当修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽与其他亚基多肽相互作用以在膜中形成纳米孔时形成纳米孔的顺式开口的一部分的氨基酸序列的一个或多个部分。形成内腔的氨基酸序列是当修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽与其他亚基多肽相互作用以在膜中形成纳米孔时形成纳米孔的腔的一部分的氨基酸序列的一个或多个部分。形成反式开口的氨基酸序列是当修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽与其他亚基多肽相互作用以在膜中形成纳米孔时形成纳米孔的反式开口的一部分的氨基酸序列的一个或多个部分。鉴定形成促胰液素纳米孔的顺式开口、内腔和反式开口的促胰液素氨基酸序列的部分的方法是本领域已知的。例如，可以通过使用VMD和NAMD从已知的促胰液素结构进行同源建模来构建纳米孔，其一部分嵌入膜中，VMD例如Humphrey等，“VMD：Visual Molecular Dynamics”J.Mol.Graphics(1996)14：33-38中所述；和NAMD例如Phillips等人，“Scalable Molecular Dynamics with NAMD”J.Comput.Chem.(2005)26:1781-1802中所述。参见例如图1D显示来自霍乱弧菌(PDB：5wq8)和大肠杆菌(PDB：5wq7)的GspD的结构；和图8显示InvG纳米孔及其不同蛋白质结构域的结构以及纳米孔的腔内的实例氨基酸修饰的相应位置。

如本文所用，术语“参考促胰液素氨基酸序列”是指促胰液素纳米孔亚基的已知氨基酸序列。各种形式的促胰液素纳米孔亚单位是本领域已知的，包括例如但不限于II型、III型或IV型分泌系统的任何促胰液素亚基。II型分泌系统的非限制性实例包括GspD、PulD和pIV。III型分泌系统的实例包括但不限于InvG、MxiD、YscC、PscC、EscC和SpiA。IV型分泌系统的非限制性实例包括PilQ。参考促胰液素氨基酸序列可以是II型、III型或IV型分泌系统成员的已知氨基酸序列或其部分。例如，参考促胰液素氨基酸序列可以是对应于野生型GspD、PulD、pIV、PilQ、InvG、MxiD、YscC、PscC、EscC、SpiA、ExeD或XcpQ的至少一部分的氨基酸序列，其中所述部分包含促胰液素结构域、S结构域、N2结构域、N3结构域和/或另一相关结构域的一个或多个。例如，在一些实施方案中，该部分可包含促胰液素结构域、S结构域和N3结构域。在一些实施方案中，该部分可包含促胰液素结构域、S结构域、N3结构域和N2结构域。在一些实施方案中，该部分可包含促胰液素结构域和S结构域。促胰液素纳米孔的不同结构域是本领域已知的。例如，图1C显示来自肠沙门氏菌的InvG和来自霍乱弧菌的GspD的不同结构域。在一些实施方案中，参考促胰液素氨基酸序列可以是对应于全长野生型GspD的氨基酸序列(例如，如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：37(均包括信号序列)或SEQ ID NO：32(无前导肽)所示)，PulD(例如，如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：40所示)，pIV、PilQ(例如，如SEQ ID NO：12所示)，InvG(例如，如SEQ ID Nos：2和13-30所示)，MxiD(例如，如SEQ ID NO：6所示)，YscC(例如，如SEQ ID NO：5所示)，PscC(例如，如SEQID NO：7所示)，EscC(例如，如SEQ ID NO：8所示)，SpiA(例如，如SEQ ID NO：9所示)，ExeD(例如，如SEQ ID NO：38所示)或XcpQ(例如，如SEQ ID NO：39所示)，如本领域已知的。在一些实施方案中，参考促胰液素氨基酸序列可以是如SEQ ID Nos.1-40所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，参考促胰液素氨基酸序列可以是野生型InvG纳米孔亚基多肽或其突变体的氨基酸序列，例如，如Worrall等"Near-Atomic-Resolution Cryo-EM analysis of theSalmonella T3S Injectisome Basal Body"Nature(2016)540:597–601所述。在一些实施方案中，参考促胰液素氨基酸序列可以是GspD纳米孔亚基多肽或其突变体的氨基酸序列，例如，如Yan等人"Structural insights into the secretin translocation channel inthe type II secretion system"Nature Structural&Molecular Biology(2017)doi:10.1038/nsmb.3350所述。本领域已知的任何天然促胰液素序列或其变体可用作参考促胰液素氨基酸序列。

在一些实施方案中，参考促胰液素氨基酸序列可以是对应于促胰液素结构域、促胰液素和S结构域或促胰液素的促胰液素、S和N3结构域的氨基酸序列，例如野生型GspD(例如，如SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：33所示)或对应于GspD的促胰液素、S和N3结构域的氨基酸序列，其中N3结构域中的限制位点被缺失或取代(例如，如SEQ ID NO：34所示)。形成孔的任何天然截短的促胰液素序列或其变体可用作参考促胰液素氨基酸序列。

因此，在一些实施方案中，修饰的促胰岛素纳米孔亚基多肽具有不同于任何天然促胰液素的氨基酸序列例如任何参考促胰液素氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：1-40中的任一个)的氨基酸序列，并包括一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多且最多40个)相对于所选择的天然促胰液素的氨基酸修饰，例如相对于任何参考促胰液素氨基酸序列(例如，相对于SEQ IDNO：1-40中的任一个)。例如，修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽可包含与天然促胰液素的氨基酸序列例如任何参考促胰液素氨基酸序列(例如，SEQ ID Nos：1-40中的任何一个)至少约40％(包括例如至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高)的同一性的氨基酸序列，或其任何结构或功能片段(例如，本文所述的促胰液素的任何片段、部分或结构域，例如，如图1A或1B所示的任何片段、部分或结构域)，并且包括至少一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多且最多40个)的相对于天然促胰液素的氨基酸修饰，例如相对于参考促胰液素(例如，相对于任何SEQ ID NO：1-40的任一个)，或其任何结构或功能片段(例如，本文所述的促胰液素的任何片段、部分或结构域，例如，如图1A或1B中所示的任何片段、部分或结构域)。例如，可以选择氨基酸修饰以促进膜整合，促进寡聚化，促进亚基合成，促进纳米孔稳定性，促进分析物捕获，促进分析物释放，促进通过纳米孔的分析物易位，改善分析物检测或信号质量，促进聚合物分析(例如多核苷酸序列)等等。在一些实施方案中，氨基酸修饰可以包含修饰以促进分析物捕获到纳米孔中、促进通过纳米孔的分析物易位和/或改善分析物检测，例如改善信号质量。此类氨基酸修饰的实例包括但不限于如本文所述的带正电荷的取代和疏水性氨基酸取代。

本领域中的标准方法可以用于确定同源性。例如，UWGCG程序包提供了BESTFIT程序，其可以用于计算同源性，例如根据其默认设置使用(Devereux等人(1984)《核酸研究(Nucleic Acids Research)》12,p387-395)。PILEUP和BLAST算法可以用于计算同源性或对序列进行排序(如识别等同残基或对应序列(通常根据其默认设置))，例如如AltschulS.F.(1993)《分子进化杂志(J Mol Evol)》36:290-300；Altschul,S.F等人(1990)《分子生物学杂志(J Mol Biol)215:403-10》中所述。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。可以通过使用成对序列比对来确定序列同一性。可以使用诸如Needleman-Wunsch算法的全局比对技术或诸如Smith-Waterman算法的局部比对方法来确定序列比对。存在各种技术来确定结构同源性，例如DALI，一种用于构建结构比对的距离矩阵比对http://ekhidna.biocenter.helsinki.fi/dali_server/start，或SSAP(顺序结构比对程序)，一种基于动态编程的结构比对方法。后者的一个例子是CATHhttp://www.cathdb.info/。

在一些实施方案中，修饰的促胰液素纳米孔可包含与对应于包含促胰液素结构域、S结构域和N3结构域的野生型InvG促胰液素的至少一部分的氨基酸序列具有至少约40％(包括例如至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高)的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，InvG促胰液素可以从任何物种获得，包括例如但不限于细菌，例如沙门氏菌、色杆菌、伯克霍尔德氏菌、普罗威登斯菌、假单胞菌属、埃希氏菌属、志贺氏菌属、嗜麦芽寡养单胞菌属、假单胞菌属、耶尔森氏菌属、Arsenophonus、Pantoea和肠杆菌。来自不同物种的全长InvG促胰液素(包括N0和N1结构域)的氨基酸序列示于SEQ ID No：2和13-32和37-40。在一个实施方案中，InvG促胰液素可以从沙门氏菌获得。例如，在一些实施方案中，修饰的促胰液素纳米孔可包含具有与对应于来自没有N1或N0结构域的沙门氏菌的野生型InvG促胰液素的如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列至少约40％(包括例如至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高)的同一性的氨基酸序列；并包括至少一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多且最多40个)相对于SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的氨基酸修饰(例如，如本文所述)。替代地，修饰的促胰液素纳米孔可包含具有与对应于野生型全长InvG促胰液素的如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列至少约40％(包括例如至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高)的同一性的氨基酸序列；并包括至少一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多且最多40个)相对于SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列的氨基酸修饰(例如，如本文所述)。不希望受理论束缚，去除InvG促胰液素的N1和N0结构域可以改善当修饰的促胰液素纳米孔用于检测或表征分析物(例如靶多核苷酸或多肽)时的信噪比。

在一些实施方案中，修饰的促胰液素纳米孔可包含与对应于包含促胰液素结构域、S结构域和N3结构域的野生型GspD促胰液素的至少一部分的氨基酸序列具有至少约40％(包括例如至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高)的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，GspD促胰液素可以从任何物种获得，包括例如但不限于细菌，例如弧菌、埃希氏菌、气单胞菌、假单胞菌和克雷伯氏菌。来自不同物种的全长GspD促胰液素(包括N0和N1结构域)的氨基酸序列示于SEQ ID No：4、10、31、32和37)。在一个实施方案中，GspD促胰液素可以从霍乱弧菌中获得。例如，修饰的促胰液素纳米孔可包含与SEQ ID NO:32、33、34、35或36中所示的氨基酸序列具有至少约40％(包括例如至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高)的同一性的氨基酸序列。修饰的促胰液素纳米孔可包含具有对应于SEQID NO:32、33、34、35或36所示的氨基酸序列的氨基酸序列；并包括至少一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多且最多40个)相对于SEQ ID NO：32、33、34、35或36中所示的氨基酸序列的氨基酸修饰(例如，如本文所述)。或者，GspD促胰液素可以从大肠杆菌获得，或者II型促胰液素可以是PulD，例如来自产酸克雷伯氏菌、XcpQ，例如来自铜绿假单胞菌或ExeD，例如来自嗜水气单胞菌。例如，在一些实施方案中，修饰的促胰液素纳米孔可包含具有与如SEQ ID NO：37、38、39或40的成熟部分所示的氨基酸序列，SEQ ID NO：37、38、39或40所示的氨基酸序列的N3、促胰液素和S结构域，SEQ ID NO：37、38、39或40中所示的氨基酸序列的促胰液素和S结构域，或SEQ ID NO：37、38、39或40中所示的氨基酸序列的促胰液素结构域至少约40％(包括例如至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高)的同一性的氨基酸序列。修饰的促胰液素纳米孔可包含具有对应于SEQ ID NO:32、33、34、35或36所示的氨基酸序列的氨基酸序列；并包括至少一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多且最多40个)相对于SEQ ID NO：37、38、39或40中所示的氨基酸序列，SEQ ID NO：37、38、39或40中所示的氨基酸序列的N3、促胰液素和S结构域，SEQ ID NO：37、38、39或40中所示的氨基酸序列的促胰液素和S结构域，或SEQID NO：37、38、39或40中所示的氨基酸序列的促胰液素结构域的氨基酸修饰(例如，如本文所述)。这些SEQ ID NO中的N3、促胰液素和S结构域的氨基酸可以通过将序列与SEQ ID NO：31比对来确定(如Yan等人"Structural insights into the secretin translocationchannel in the type II secretion system"Nature Structural&Molecular Biology(2017)doi:10.1038/nsmb.3350)的补充说明中所述)。

图1B显示了来自SEQ ID NO：2的172-557位的野生型InvG促胰液素的二级结构拓扑结构，其中编号的结构域对应于β-链和两个编号的结构域之间的区域(显示为图1B中带箭头的线)对应于环区域。仅举例来说，结构域4(氨基酸381-393)和结构域5(氨基酸400-417)对应于β链，并且结构域4和5之间的区域(氨基酸393-400)对应于环区域。

图11显示了野生型GspD促胰液素(SEQ ID NO：32)的二级结构拓扑结构，显示了β-链、α-螺旋和环区域。

图1C显示来自霍乱弧菌的野生型InvG促胰液素和野生型GspD促胰液素的二级结构拓扑结构(来自SEQ ID NO：10的97-646位，或来自SEQ ID NO：32)。在SEQ ID NO：32所示的霍乱弧菌GspD氨基酸序列中，氨基酸1至99形成N0结构域，氨基酸100至163形成N1结构域，氨基酸164至238形成N2结构域，氨基酸239至314形成N3结构域，氨基酸317至588形成促胰液素结构域，氨基酸589至650形成S结构域。

在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多且最多40个氨基酸修饰)可以针对一个或多个(例如，1、2、3或4个)形成外β-桶的促胰液素结构域(“外β-桶形成结构域”)的β-链进行，例如，如图1B所示的编号为1、3a/3b、8和9的结构域，或如图11所示的β10、β11、β14、β15、β20和β21。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多且最多40个氨基酸修饰)可以针对一个或多个(例如，1、2、3或4个)外部β-桶形成结构域之间的环区域进行，例如，如图1B或图11所示。在一些实施方案中，至少一个或多个氨基酸修饰(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多且最多40个氨基酸修饰)可以针对一个或多个(例如，1、2、3或4个)形成内β-桶的促胰液素结构域(“内β-桶形成结构域”)的β-链进行，例如，如图1B所示的编号为4、5、6和7的结构域，或如图11所示的β16、β17、β18和β19。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多且最多40个氨基酸修饰)可以针对一个或多个(例如，1、2、3或4个)内β-桶形成结构域之间的环区域进行。例如，在一些实施方案中，可以对如图1B所示的内β-桶形成结构域4和5之间的环区域进行一个或多个氨基酸修饰(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸修饰)。例如，在一些实施方案中，可以对如图11所示的形成中央门的形成内β-桶的β16和β17之间的环区域进行一个或多个氨基酸修饰(例如，1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸修饰)。

在一些实施方案中，至少一个或多个氨基酸修饰(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多且最多40个氨基酸修饰)可以针对一个或多个(例如，1、2或3个)形成β-桶的唇缘的区域(“β-桶唇缘形成区”)进行，例如，如图1B所示的编号为1、2和3a的结构域，或者图11中所示的β12、β13、α7、α8，其对应于形成本文所述的修饰的促胰液纳米孔的反式-开口部分的β链。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多且最多40个氨基酸修饰)可以针对一个或多个(例如，1、2、3或4个)β-桶唇缘形成结构域之间的环区域进行。例如，在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如，1、2、3、4或5个氨基酸修饰)可以对如图1B所示的β-桶唇缘形成结构域1和2之间的环区域(氨基酸331-335)或图11中的β12和β13之间的环(帽门)进行，其形成本文所述的修饰的促胰液素纳米孔的反式-开口的至少一部分。

在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多且最多40个氨基酸修饰)可以针对一个或多个β-链和/或N3结构域内的环区域进行，例如，如图1B或图11所限定的。例如，在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如，1、2、3、4或5个氨基酸修饰)可以对由SEQ ID NO：2的氨基酸216-268限定的环区域进行。例如，在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如，1、2、3、4或5个氨基酸修饰)可以对GspD的N3结构域中的收缩位点进行(例如SEQ ID NO：32中的氨基酸N265至E282)。

在一些实施方案中，至少一个或多个氨基酸修饰(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多且最多40个氨基酸修饰)可以针对一个或多个β-链和/或S结构域内的环区域进行，例如，如图1B或图11所限定的。

因此，在一些实施方案中，修饰的纳米孔促胰液素纳米孔可以包含亚基多肽，其具有(i)InvG或GspD促胰液素的外β-桶形成结构域和/或其间的环区；(ii)InvG或GspD促胰液素的内β-桶形成结构域和/或其间的环区；(iii)InvG或GspD促胰液素的β-桶唇缘形成结构域和/或其间的环区，(iv)InvG或GspD促胰液素的S结构域和/或其间的环区；和(v)InvG或GspD促胰液素的N3结构域和/或其间的环区，其中β-链和/或环区可具有不同数量和/或类型的氨基酸修饰，例如，取决于它们在纳米孔中的位置和/或其与分析物和/或酶的相互作用程度。例如，每个外β-桶形成结构域和/或其间的环区的氨基酸序列可各自独立地为与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4、32或37中所示的相应结构域的氨基酸序列至少约50％(包括例如至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高，包括100％)相同。每个内β-桶形成结构域和/或其间的环区的氨基酸序列可各自独立地为与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4、32或37中所示的相应结构域的氨基酸序列至少约50％(包括例如至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高，包括100％)相同。每个β-桶唇缘形成结构域和/或其间的环区的氨基酸序列可各自独立地为与SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：4、32或37中所示的相应结构域的氨基酸序列至少约50％(包括例如至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高，包括100％)相同。S结构域内的每个结构域和/或其间的环区的氨基酸序列可以与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4、32或37中所示的相应结构域的氨基酸序列至少约50％(包括例如至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高，包括100％)相同。N3结构域内的每个结构域和/或其间的环区的氨基酸序列可以与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4、32或37中所示的相应结构域的氨基酸序列至少约50％(包括例如至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高，包括100％)相同。每个结构域可具有不同的氨基酸同一性百分比，条件是所得的修饰结构域不会不利地影响分析物通过修饰的纳米孔的内腔的捕获和/或易位。例如，在一些实施方案中，外β-桶形成结构域可允许大量氨基酸突变，其导致小于80％或更低(包括例如小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％或更低)的与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4、32或37中所示的相应结构域的氨基酸序列的氨基酸同一性，而内β-桶形成结构域保持较高的氨基酸同一性，例如，内β-桶形成结构域的氨基酸序列可各自独立地为至少约80％或更高(包括至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高，包括100％)。在一些实施方案中，N3结构域的至少一个环区域(例如，由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4、32或37的氨基酸216-268定义的环区域)可允许更大数量的氨基酸突变(例如，以改善酶/纳米孔相互作用)，其导致小于80％或更低(包括例如小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％或更低)的与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4、32或37中所示的相应结构域的氨基酸序列的氨基酸同一性，而内β-桶形成结构域保持较高的氨基酸同一性，例如，内β-桶形成结构域的氨基酸序列可各自独立地为至少约80％或更高(包括至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高，包括100％)。

本领域普通技术人员将容易认识到，如本文所述的对促胰液素纳米孔的各种类型的修饰(例如但不限于对促胰液素纳米孔的不同结构域的氨基酸修饰)可以应用于与本文所述的促胰液素纳米孔具有高度结构同源性的任何其他促胰液素纳米孔。仅举例来说，SEQID Nos：4和37以及10、31和32分别涉及来自大肠杆菌和霍乱弧菌的GspD。例如，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：10之间的序列同一性是41.6％，例如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：10的促胰液素结构域之间的序列同一性是44.2％，并且相似性为62.7％，使用由EMBL-EBIhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html提供的EMBOSS针核苷酸比对算法通过成对比对计算。虽然两种结构之间的序列同一性可能低，但它们具有高结构同源性，因为它们都具有相似的结构域，包括例如促胰液素结构域、S结构域、N3结构域、N2结构域和N1结构域。

缺失N-末端结构域的截短的促胰液素亚基多肽能够形成孔。因此，在一些实施方案中，本发明的经修饰的促胰液素纳米孔是截短的促胰液素纳米孔。截短的促胰液素纳米孔通常可以包含N3结构域、促胰液素结构域和S结构域，促胰液素结构域和S结构域，或促胰液素结构域。

因此，在一些实施方案中，促胰液素纳米孔亚基多肽包含促胰岛素结构域，其包含β桶形成结构域，其包含形成内桶的子结构域和形成外桶的子结构域，每个子结构域由β-折叠组成，外桶通常包含约六个β-折叠和/或内桶通常包括约四个β-折叠。外β桶还可包括两个α-螺旋，通常在两个β-折叠之间，例如如图11所示。在促胰液素纳米孔中，外桶通常跨越膜，并且内桶通常邻接孔的内腔。内桶通常包括中央门。中央门通常是形成内桶的两个β-折叠之间的环。中央门通常延伸到孔中以缩小孔的尺寸。可以通过改变中央门环中存在的氨基酸来修饰中央门，如本文所述，以改变孔的性质。中央门可以是柔性的，例如中央门可以是能够打开的。中央门可以是刚性的以保持恒定的收缩尺寸，例如中央门环可以是闭合的或部分闭合的。促胰液素纳米孔的β桶还可包括唇缘，其中第一唇缘在膜的相对侧上从膜突出到内β桶。第二唇缘相对于第一唇缘可以位于内β桶的另一侧。β桶的第一唇缘通常由两个α-螺旋和两个β-折叠组成。β-折叠可以通过形成帽门的环区域连接，或者连接β-折叠的环可以是短的并且不形成门。帽门可以是柔性的，例如帽门可以是能够打开的。帽门可以是刚性的以保持恒定的收缩尺寸，例如帽门可以是闭合的或部分闭合的。在一些实施方案中，β桶的第一唇缘可以不包含β-折叠并且包含通过环连接的两个α-螺旋。在这些实施方案中，亚基多肽形成纳米孔，其不包含帽门。β桶的第二唇缘可包括两个α-螺旋。

在一些实施方案中，除促胰液素结构域外，促胰液素纳米孔亚基多肽还可包含S结构域。S结构域可包含两个α-螺旋。其中一个α-螺旋通常与促胰液素纳米孔的β-桶相互作用。S结构域通常位于孔的外侧(即远离孔的内腔)。

在一些实施方案中，除了促胰液素结构域和任选的S结构域之外，促胰液素纳米孔亚基多肽还可以包含N3结构域。N3结构域通常由β-桶和α-螺旋组成，例如3至6个β-桶和2至3个α-螺旋，例如3个β-桶和2个α-螺旋，如图11所示，或6个β-桶和3个α-螺旋，如图1B所示。N3结构域可在孔的内腔中形成收缩。可以修饰N3结构域，使其不会收缩所述孔。可以修饰N3结构域以增加或减小收缩的大小。

在一些实施方案中，修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽的氨基酸序列在形成腔的氨基酸序列内的位置处包含一个或多个氨基酸修饰(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多且最多40个氨基酸修饰)。选择氨基酸修饰以与参考促胰液素氨基酸序列相比提供通过纳米孔的分析物(例如多核苷酸，例如双链或单链DNA)的捕获和/或易位的改善的频率。

在一些实施方案中，氨基酸修饰可以是改变电荷的修饰。在一些实施方案中，氨基酸修饰是带正电荷的氨基酸取代。如本文所用的术语“带正电荷的氨基酸取代”是指对参考氨基酸的修饰，其增加参考氨基酸的净正电荷或降低净负电荷，例如，在pH 7.0-8.0(例如在pH 8.0)和在室温下例如在20-25℃下检测的。例如，带正电荷的氨基酸取代可包括但不限于(i)用带负电荷较少的氨基酸、中性氨基酸或带正电荷的氨基酸取代带负电荷的氨基酸，(ii)用带正电荷的氨基酸取代中性氨基酸，或(iii)用带正电荷的氨基酸取代带正电荷的氨基酸。在一些实施方案中，带正电荷的氨基酸取代可包括缺失带负电荷的氨基酸或添加带正电荷的氨基酸。在一些实施方案中，带正电荷的氨基酸取代可包括一个或多个带负电荷的氨基酸的一种或多种化学修饰，其中和了它们的负电荷。例如，一种或多种带负电荷的氨基酸可以与碳二亚胺反应。

带正电荷的氨基酸是具有高于溶液pH的等电点(pI)的氨基酸，使得溶液中的氨基酸带有净正电荷。例如，在pH 7.0-8.0(例如pH 8.0)和室温(例如20-25℃)下检测的带正电荷的氨基酸的实例包括但不限于精氨酸(R)、组氨酸(H)和赖氨酸(K)。带负电荷的氨基酸是pI低于溶液pH的氨基酸，因此溶液中的氨基酸带有净负电荷。在pH 7.0-8.0(例如，pH 8.0)和室温(例如，20-25℃)下检测的带负电荷的氨基酸的实例包括但不限于天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)、谷氨酰胺(Q)。中性氨基酸是具有与溶液的pH相同的等电点(pI)的氨基酸，使得溶液中的氨基酸不带净电荷。中性氨基酸可以是极性、非极性或疏水性氨基酸。氨基酸的pI值是本领域已知的。通过比较目标氨基酸的pI值与溶液的pH，本领域普通技术人员将容易确定溶液中存在的氨基酸是带正电荷的氨基酸、中性氨基酸还是带负电荷的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的或合成的氨基酸。

在一些实施方案中，氨基酸修饰可以是改变氨基酸疏水性的修饰。这种修饰包括对参考氨基酸的修饰，其改变其疏水性，例如在pH 7.0-8.0(例如，pH 8.0)和室温(例如，20-25℃)下检测的。例如，氨基酸修饰可以是用疏水性氨基酸取代参考氨基酸，例如用具有疏水侧链的氨基酸。疏水性氨基酸的实例包括甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、蛋氨酸(M)、酪氨酸(Y)、和色氨酸(W)。例如，氨基酸修饰可以是用疏水性氨基酸取代中性氨基酸。氨基酸的亲水指数在本领域中是已知的。疏水性标度是定义氨基酸残基的相对疏水性的值。值越正，位于蛋白质区域的氨基酸越疏水。氨基酸可以是天然存在的或合成的氨基酸。

在一些实施方案中，氨基酸修饰可以是改变氨基酸大小的修饰。这种修饰包括对参考氨基酸的修饰，其改变其大小，例如侧链的大小。例如，氨基酸修饰可以是具有大侧链的参考氨基酸被具有较小侧链的氨基酸取代。非常大的氨基酸的实例包括苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。大氨基酸的实例包括异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、赖氨酸(K)和精氨酸(R)。中等大小的氨基酸的实例包括缬氨酸(V)、组氨酸(H)、谷氨酸(E)和谷氨酰胺(Q)。小氨基酸的实例包括半胱氨酸(C)、脯氨酸(P)、苏氨酸(T)、天冬氨酸(D)和天冬酰胺(N)。非常小的氨基酸的实例包括丝氨酸(S)、甘氨酸(G)和丙氨酸(A)。例如，氨基酸修饰可以是用大、中、小或非常小的氨基酸取代非常大的氨基酸。例如，氨基酸修饰可以是用中、小或非常小的氨基酸取代大氨基酸。例如，氨基酸修饰可以是用小或非常小的氨基酸取代中等氨基酸。较小的氨基酸可以是天然存在的或合成的氨基酸。

在一些实施方案中，修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽是修饰的InvG纳米孔亚基多肽，其包含与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列(对应于不含N1或N0结构域的InvG的氨基酸序列)至少约40％(包括例如至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高)相同，其中修饰的InvG纳米孔亚基多肽在选自SEQ ID NO：1的D28、E41、E114、Q45、E225、R226和E231的氨基酸处包含一个或多个氨基酸修饰(例如，1、2、3、4、5、6或7个氨基酸修饰)。氨基酸修饰可以是带正电荷的氨基酸取代或改变参考氨基酸的疏水性的修饰。在一些实施方案中，氨基酸修饰可包含以下一种或多种(例如，1、2、3、4、5或6种):(i)D28N/Q/T/S/G/R/K；(ii)E225N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/R/K；(iii)R226N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/K/V；(iv)缺失E225；(v)缺失R226；和(vi)E231N/Q/T/A/S/G/P/H/R/K。在一些实施方案中，修饰的InvG纳米孔亚基多肽可以在选自SEQ ID NO：1的Q45、E41和E114的氨基酸处包含一个或多个氨基酸修饰。例如，修饰的InvG纳米孔亚基多肽可包含一个或多个(例如，1、2或3个)以下氨基酸修饰：(i)Q45R/K；(ii)E41N/Q/T/S/G/R/K；和(iii)SEQ ID NO：1的E114N/Q/T/S/G/R/K。氨基酸X和Y之间的“/”符号表示参考氨基酸可以被修饰为氨基酸X或氨基酸Y。应当理解，如果修饰(例如，氨基酸添加或缺失)针对SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的N-末端或内部，则因此基于SEQ ID NO：1的氨基酸位置将相应地改变。仅举例来说，SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：1的不同之处在于SEQ ID NO：2的N末端含有另外171个氨基酸，其对应于从SEQ ID NO：1的N末端缺失的InvG纳米孔的N0和N1结构域。因此，本领域普通技术人员将容易认识到，SEQ ID NO：1中的氨基酸位置D28、E41、E114、Q45、E225、R226和E231对应于SEQ ID NO：2中的氨基酸位置D199、E212、E285、Q216、E396、R397和E402。

在一些实施方案中，修饰的InvG纳米孔亚基多肽包含与SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列具有至少约40％或更高(包括例如至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高)的同一性的氨基酸序列以及如图7所示的氨基酸修饰的一种或任何组合。例如，在一些实施方案中，修饰的InvG纳米孔亚基多肽可包含氨基酸取代E225N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/R/K和SEQ ID NO：1的R226的缺失。在一些实施方案中，修饰的InvG纳米孔亚基多肽可包含E225氨基酸的缺失和氨基酸取代E231N/Q/T/A/S/G/P/H/R/K和Q45R/K。应注意，调整如图7所示的氨基酸位置(基于SEQ ID NO：2)以对应于SEQ ID NO：1中的氨基酸位置。比对两个氨基酸序列的方法是本领域已知的。因此，本领域普通技术人员可以基于SEQ ID NO：2中提供的氨基酸位置容易地鉴定SEQ ID NO：1中的相应氨基酸位置。

在一些实施方案中，修饰的InvG纳米孔亚基多肽包含与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少约40％或更高(包括例如至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高)的同一性的氨基酸序列以及如图7所示的氨基酸修饰的一种或任何组合。

另一方面，本文提供了修饰的促胰岛素纳米孔亚基多肽，其包含与促胰液素纳米孔亚基多肽的氨基酸序列至少40％或更高(包括例如至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高)的同一性的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO：2或4-30中所示的氨基酸序列(对应于包括N1和N0结构域的野生型(WT)促胰液素的氨基酸序列)，其中将内肽酶切割位点插入促胰液素纳米孔亚基多肽的N3结构域的上游。在一些实施方案中，将内肽酶切割位点插入促胰液素纳米孔亚基多肽(例如，InvG纳米孔亚基多肽)的N1结构域和N3结构域之间。在其他实施方案中，将内肽酶切割位点插入N1结构域和N2结构域(例如，GspD或PulD纳米孔亚基多肽)之间。这种修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽允许使用内肽酶去除N1和/或N0结构域，所述内肽酶在多肽表达后靶向相应的内肽酶切割位点。例如，可以通过处理用合适的内肽酶表达和纯化的全长蛋白质来切割N0和N1结构域。

如本文所用，术语“内肽酶切割位点”是指被内肽酶识别和切割的肽序列，内肽酶是破坏或切割非末端氨基酸的键(例如，在分子内)的蛋白水解酶。各种内肽酶及其相应的切割位点是本领域已知的。例如，可以在web.expasy.org/peptide_cutter/peptidecutter_enzymes.html上在线评估此类信息。内肽酶的非限制性实例包括但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶、谷氨酰内肽酶、脑啡肽酶、半胱天冬酶1-10、CNBr、肠激酶、蛋白酶K、因子Xa蛋白酶、牛α凝血酶、和烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶。在一个实施方案中，插入修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽中的内肽酶切割位点可以被TEV蛋白酶识别。TEV蛋白酶识别一般形式E-Xaa-Xaa-T-Xaa-Q-(G/S)的线性表位，其中切割发生在Q和G或Q和S之间。示例性TEV蛋白酶切割序列可以是ENLYFQG。在一个实施方案中，插入修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽中的内肽酶切割位点可以被因子Xa蛋白酶识别。因子Xa在其优选的切割位点Ile-(Glu或Asp)-Gly-Arg中的精氨酸残基后切割。它有时会切割其他碱性残基，这取决于蛋白质底物的构象。在另一个实施方案中，插入修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽中的内肽酶切割位点可以被牛α凝血酶识别。凝血酶识别共有序列Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser，切割Arg和Gly之间的肽键。

在一个方面，本文提供修饰的InvG纳米孔亚基多肽，其包含与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列(对应于包括N1和N0结构域的WT InvG的氨基酸序列)至少约40％或更高(包括例如至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高)的同一性的氨基酸序列，其中内肽酶切割位点插入SEQ ID NO：2的170和171或171和172位之间。在一个实施方案中，将内肽酶切割位点插入SEQ ID NO：2的D171和G172之间。这种修饰的InvG纳米孔亚基多肽允许使用内肽酶去除N1和N0结构域，所述内肽酶在多肽表达后靶向相应的内肽酶切割位点。可以使用任何合适的内肽酶切割位点(例如，如本文所述)。在一个实施方案中，插入修饰的InvG纳米孔亚基多肽中的内肽酶切割位点可以被TEV蛋白酶识别。示例性TEV蛋白酶切割序列可以是ENLYFQG。实施例2提供了用于表达和纯化包含TEV蛋白酶切割位点的修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽的示例性方法。

在一些实施方案中，包含内肽酶切割位点的经修饰的InvG纳米孔亚基多肽可包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6或7个)氨基酸修饰，如图7中所示。例如，在一些实施方案中，修饰的InvG纳米孔亚基多肽可包含氨基酸取代E396N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/R/K和SEQID NO：2的R397的缺失。在一些实施方案中，修饰的InvG纳米孔亚基多肽可包含E396氨基酸的缺失和氨基酸取代E402N/Q/T/A/S/G/P/H/R/K和Q216R/K。

例如，在一个方面，修饰的GspD促胰液素纳米孔包括亚基多肽，其包含具有与SEQID NO:36中所示的促胰液素结构域的氨基酸序列具有至少约40％或更高(包括例如至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高)的同一性的氨基酸序列的促胰液素结构域。

来自霍乱弧菌和来自大肠杆菌ETEC的GspD的促胰液素结构域含有帽门。其他II型分泌系统亚基多肽，包括一些GspD促胰液素亚基多肽，例如大肠杆菌K12，不包含帽门。在一个方面，修饰的GspD促胰液素纳米孔可以是不包含帽门的纳米孔。在SEQ ID NO：36中所述的促胰液素结构域包含位置56和77之间的帽门。例如，可以修饰SEQ ID NO：36中所示的促胰液素结构域以删除全部或部分帽门，例如可以删除或替代SEQ ID NO：36的D55或T56至T77的全部或部分氨基酸。或者，修饰的GspD促胰液素纳米孔可以自然地缺少帽门。

可以修饰GspD的中心门以用具有较小侧基的氨基酸取代氨基酸和/或用中性或带正电荷的氨基酸取代带负电荷的氨基酸。在SEQ ID NO：36中设置的促胰液素结构域包含位置144至157之间的中心门，其对应于SEQ ID NO：32的位置460和473。修饰的GspD促胰液素纳米孔的促胰液素结构域可包含具有与SEQ ID NO:36中所示的氨基酸序列具有至少约40％或更高(包括例如至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高)的同一性的氨基酸序列的促胰液素结构域，其中：(i)D55或T56至T77的全部或部分氨基酸缺失或被取代，K60、D64、R71和E73中的一个或多个被不带电荷的氨基酸取代和/或D55、T56、T77和K78中的一个或多个被P取代；和/或(ii)F156被较小的氨基酸取代，N151和/或N152被较小的氨基酸取代，D153被不带电荷的氨基酸取代，G137和G165各自独立地未被修饰或被A或V取代。例如，在修饰的促胰液素中，GspD纳米孔Y63至R71可以被缺失和/或被GSG或SGS取代，F156可以被A取代，D153可以被S取代，和/或N151和N152可以各自独立地被G或S取代。SEQ ID NO：36的D55、T56、K60、Y63、D64、R71、E73、T77、K78、G137、N151、N152、D153、F156和G165对应于SEQID NO：32所示的全长GspD氨基酸序列的D371、T372、K376、Y379、D380、R387、E389、T393、K394、G453、N467、N468、D469、F472和G481。

修饰的促胰液素GspD纳米孔可以包含如上文参考SEQ ID NO 36定义的修饰的促胰液素结构域、N3结构域和S结构域。修饰的促胰液素GspD纳米孔在一个方面可包括包含与SEQ ID NO:33、34和/或35中所示的氨基酸序列具有至少约40％或更高(包括例如至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高)的同一性的氨基酸序列的亚基多肽。SEQ ID NO：35包含促胰液素结构域和S结构域。SEQ ID NO：34包含促胰液素结构域、S结构域和修饰的N3结构域。SEQ ID NO：34包含促胰液素结构域、S结构域和N3结构域。参考SEQ ID NO：36提及的氨基酸修饰可以在SEQ ID NO：31至35中任一个的相应位置进行。参考SEQ ID NO：36提及的氨基酸修饰也可以在SEQ ID NO：4和37至40中任一个的相应位置进行，或截短的亚基多肽包含SEQ ID NO：4和37至40中的任一个的一部分，例如截短的亚基多肽包含SEQ ID NO：4和37至40中任一个的促胰液素结构域，促胰液素和S结构域，或促胰液素、S和N3结构域。

例如，修饰的GspD促胰液素纳米孔的促胰液素结构域可包含具有与SEQ ID NO:34中所示的氨基酸序列具有至少约40％或更高(包括例如至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高)的同一性的氨基酸序列的促胰液素结构域，其中：(i)D117或T118至T139的全部或部分氨基酸缺失或被取代，K122、D126、R133和E135中的一个或多个被不带电荷的氨基酸取代和/或D117、T118、T139和K140中的一个或多个被P取代；和/或(ii)F218被较小的氨基酸取代，N213和/或N214被较小的氨基酸取代，D215被不带电荷的氨基酸取代，G199和G227各自独立地未被修饰或被A或V取代。例如，在修饰的促胰液素中，GspD纳米孔Y125至R133可以被缺失和/或被GSG或SGS取代，F218可以被A取代，D215可以被S取代，和/或N213和N214可以各自独立地被G或S取代。SEQ ID NO：34的D117、T118、K122、Y125、D126、R133、E135、T139、K140、G199、N213、N214、D215、F218和G227对应于SEQ ID NO：32所示的全长GspD氨基酸序列的D371、T372、K376、Y379、D380、R387、E389、T393、K394、G453、N467、N468、D469、F472和G481。

例如，修饰的GspD促胰液素纳米孔的促胰液素结构域可包含具有与SEQ ID NO:35中所示的氨基酸序列具有至少约40％或更高(包括例如至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高)的同一性的氨基酸序列的促胰液素结构域，其中：(i)D55或T56至T77的全部或部分氨基酸缺失或被取代，K60、D64、R71和E73中的一个或多个被不带电荷的氨基酸取代和/或D55、T56、T77和K78中的一个或多个被P取代；和/或(ii)F156被较小的氨基酸取代，N151和/或N152被较小的氨基酸取代，D153被不带电荷的氨基酸取代，G137和G165各自独立地未被修饰或被A或V取代。例如，在修饰的促胰液素中，GspD纳米孔Y63至R71可以被缺失和/或被GSG或SGS取代，F156可以被A取代，D153可以被S取代，和/或N151和N152可以各自独立地被G或S取代。SEQ ID NO：35的D55、T56、K60、Y63、D64、R71、E73、T77、K78、G137、N151、N152、D153、F156和G165对应于SEQ ID NO：32所示的全长GspD氨基酸序列的D371、T372、K376、Y379、D380、R387、E389、T393、K394、G453、N467、N468、D469、F472和G481。

例如，修饰的GspD促胰液素纳米孔的促胰液素结构域可包含具有与SEQ ID NO:33中所示的氨基酸序列具有至少约40％或更高(包括例如至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高)的同一性的氨基酸序列的促胰液素结构域，其中：(i)D132或T133至T154的全部或部分氨基酸缺失或被取代，K137、D141、R148和E150中的一个或多个被不带电荷的氨基酸取代和/或D132、T133、T154和K155中的一个或多个被P取代；和/或(ii)F233被较小的氨基酸取代，N228和/或N229被较小的氨基酸取代，D230被不带电荷的氨基酸取代，G214和G242各自独立地未被修饰或被A或V取代。例如，在修饰的促胰液素中，GspD纳米孔Y140至R148可以被缺失和/或被GSG或SGS取代，F233可以被A取代，D230可以被S取代，和/或N228和N229可以各自独立地被G或S取代。SEQ ID NO：33的D132、T133、K137、Y140、D141、R148、E150、T154、K155、G214、N228、N229、D230、F233和G242对应于SEQ ID NO：32所示的全长GspD氨基酸序列的D371、T372、K376、Y379、D380、R387、E389、T393、K394、G453、N467、N468、D469、F472和G481。

在本文所述的修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽的任何方面中，可以对参考促胰液素氨基酸序列进行额外的氨基酸取代(除了上述氨基酸修饰之外)，例如多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或30个取代。保守取代使用具有类似化学结构、类似化学性质或类似侧链体积的其它氨基酸来代替氨基酸。所引入的氨基酸可以具有与其所代替的氨基酸类似的极性、亲水性、疏水性、碱性、酸性、电中性或电荷。替代性地，保守取代可以引入芳香族或脂肪族的另一种氨基酸代替预先存在的芳香族或脂肪族氨基酸。保守氨基酸改变在所属领域中是众所周知的，且可以根据如在下表1中限定的20种主要氨基酸的特性来进行选择。在氨基酸具有类似极性的情况下，还可以参考表2中的氨基酸侧链的亲水性尺度来确定这一点。

表1-氨基酸的化学性质

表2-亲水性尺度

参考氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基(例如，如SEQ ID Nos：1-10中所示)可以另外从上述多肽中缺失。可缺失高达1个、2个、3个、4个、5个、10个、20个或30个或更多个残基。

替代地或另外，可向上文所描述的多肽中添加一或多个氨基酸。可在参考氨基酸序列(如SEQ ID NO:1或2中所示的)或其多肽变体或片段的氨基端或羧基端处提供延长物。延长物的长度可以非常短，例如1到10个氨基酸。可替代地，延长物可以较长，例如高达50或100个氨基酸。载体蛋白可以与氨基酸序列融合，例如，修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽的氨基酸序列。下文更详细地讨论了其它融合蛋白。

修饰氨基酸的方法(例如，通过取代、添加或缺失)是本领域熟知的。例如，通过用编码修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽的多核苷酸中的相关位置处的靶氨基酸的密码子替换参考氨基酸的密码子，可以用靶氨基酸取代参考氨基酸。然后，可以如下文所讨论那样表达多核苷酸。如果氨基酸是非天然存在的氨基酸，可以通过在用于表达修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽的IVTT系统中包括合成的氨酰基-tRNA来引入。可替代地，可以通过在存在特定氨基酸的合成(即非天然存在的)类似物存在的情况下表达对于那些特定氨基酸来说是营养缺陷的大肠杆菌中表达修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽来引入它。如果修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽是使用部分肽合成来产生的，则非天然存在的氨基酸还可通过裸连接来产生。

本文所述的经修饰的促胰岛素纳米孔亚基多肽可用于形成如本文所述的同源多聚体纳米孔或异源多聚体纳米孔。因此，在一些实施方案中，修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽保留与其他亚基多肽形成纳米孔的能力。评估修饰单体形成纳米孔的能力的方法是本领域熟知的。例如，可以将修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽连同其它适当的亚基一起插入到两亲层中，并且可以确定其寡聚形成孔的能力。用于将亚基插入到膜，如两亲层中的方法在本领域中已知。例如，可以将纯化形式的亚基悬浮于含有三嵌段共聚物膜的溶液中，使得其扩散到膜并且通过结合到膜和组装成功能性状态来插入。替代性地，可以使用M.A.Holden，H.Bayley.J.Am.Chem.Soc.2005,127,6502-6503和国际申请PCT/GB2006/001057(公布为WO2006/100484)(其内容通过引用并入本文)中描述的“拾取和放置(pick and place)”方法，将亚基直接插入膜中。

修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽可以含有非特异性修饰，只要它们不干扰纳米孔形成。多种非特异性侧链修饰在本领域中是已知的并且可以对氨基酸的侧链进行所述多种非特异性侧链修饰。此类修饰包括例如，通过与醛反应，随后用NaBH₄、用甲基乙酰亚氨酸脒化或用乙酸酐酰化来对氨基酸还原烷化。

可以使用本领域已知的标准方法产生修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽。修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽可以合成制备或通过重组方法制备。在实施例1和2中提供了根据本文描述的一些实施方案的表达和纯化修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽的示例性方法。或者，可以通过体外翻译和转录(IVTT)合成修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽。用于产生孔和修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽的合适方法在国际申请第PCT/GB09/001690号(公开为WO2010/004273)、第PCT/GB09/001679号(公开为WO 2010/004265)或第PCT/GB10/000133号(公开为WO 2010/086603)中论述，其每一篇的内容通过引用并入本文。

如本文所述的修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽可以使用D-氨基酸产生。例如，如本文所述的修饰的促胰岛素纳米孔亚基多肽可包含L-氨基酸和D-氨基酸的混合物。这在用于产生这种蛋白或肽的所属领域中是常规的。

在一些实施方案中，修饰的促胰岛素纳米孔亚基多肽可以是化学修饰的。可以以任何方式和在任何位点对修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽进行化学修饰。举例来说，修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽可通过连接染料或荧光团来进行化学修饰。在一些实施方案中，可以通过将分子附接到一个或多个半胱氨酸(半胱氨酸连接)、将分子附接到一个或多个赖氨酸、将分子附接到一个或多个非天然氨基酸、表位的酶修饰或末端的修饰对修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽进行化学修饰。用于进行此类修饰的合适方法在所属领域中是众所周知的。

在一些实施方案中，修饰的促胰岛素纳米孔亚基多肽可以用分子衔接子进行化学修饰，所述分子衔接子促进包含修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽的纳米孔与靶核苷酸或靶多核苷酸序列之间的相互作用。衔接子的存在改进纳米孔和核苷酸或多核苷酸序列的宿主-客体化学，且从而改进由修饰的促胰岛素纳米孔亚基多肽形成的孔的测序能力。主客体化学的原理在所属领域中是众所周知的。衔接子对于纳米孔的物理或化学特性具有效果，其改进其与核苷酸或多核苷酸序列的相互作用。衔接子可改变孔的折叠桶或通道的电荷，或特异性地与核苷酸或多核苷酸序列相互作用或结合于所述核苷酸或多核苷酸序列，从而促进其与孔相互作用。

在一些实施方案中，分子衔接子可以是环状分子、环糊精、能够杂交的物种、DNA结合剂或嵌入剂、肽或肽类似物、合成聚合物、芳族平面分子、能够结合氢的带正电小分子或小分子。

在一些实施方案中，分子衔接子可以共价连接至修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽。可以使用所属领域中已知的任何方法将衔接子共价连接到纳米孔。通常通过化学连接附接衔接子。如果分子衔接子通过半胱氨酸键连接，则可以通过取代将一个或多个半胱氨酸引入修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽。

在其他实施方案中，修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽可以连接或偶联至酶，例如多核苷酸结合蛋白，例如解旋酶、核酸外切酶和聚合酶。在一些实施方案中，修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽可以连接或偶联至解旋酶，例如DNA解旋酶。适用于纳米孔测序的解旋酶、核酸外切酶和聚合酶的实例是本领域已知的。在一些实施方案中，修饰的促胰岛素纳米孔亚基多肽可以连接或偶联至解旋酶，例如DNA解旋酶、Hel308解旋酶(例如，如WO2013/057495中所述)、RecD解旋酶(例如，如WO2013/098562中所述)、XPD解旋酶(例如，如WO201/098561中所述)、或Dda解旋酶(例如，如WO2015/055981中所述)。这形成可以在表征靶多核苷酸的方法中使用的模块化测序系统。下文讨论了多核苷酸结合蛋白。易位速度控制可以通过多核苷酸结合蛋白的类型和/或添加到系统的燃料量(ATP)来确定。例如，双链DNA分析物的易位速率可以通过双链DNA转位酶如FtsK控制。取决于添加到系统中的燃料(ATP)，靶多核苷酸的易位速度可以在约30B/s和1000B/s或约30B/s和2000B/s之间。

在一些实施方案中，多核苷酸结合蛋白可以共价连接至修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽。可以使用本领域已知的任何方法将多核苷酸结合蛋白共价连接至修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽。修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽和多核苷酸结合蛋白可以化学融合或遗传融合。如果整个构建体由单个多核苷酸序列表达，则修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽和多核苷酸结合蛋白是遗传融合的。在国际申请号PCT/GB09/001679(公布为WO2010/004265)中讨论了修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽与多核苷酸结合蛋白的遗传融合，其内容通过引用并入本文。

可以使用分子衔接子和多核苷酸结合蛋白对修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽进行化学修饰。

可以例如通过加入组氨酸残基(his标签)、天冬氨酸残基(asp标签)、链霉亲和素标签、flag标签、SUMO标签、GST标签或MBP标签，或在多肽天然地不含信号序列的情况下通过加入这样的序列以促进其从细胞分泌，来修饰本文所述的任何蛋白质，如本文所述的修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽和纳米孔，从而帮助其鉴定或纯化。引入基因标签的替代性方案是将标签化学反应到蛋白质上的原生或经工程改造的位置上。此的实例将为将凝胶移动试剂与蛋白质外上经工程改造的半胱氨酸反应。这已被证明是一种用于分离溶血素异型低聚物的方法(《生物化学》(Chem Biol).1997年7月；4(7)：497-505)。

本文所述的任何蛋白质，例如本文所述的修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽和纳米孔，可以用可检测的标记物标记。可检测的标记可以是使蛋白质被检测到的任何合适标记。合适的标记包括但不限于荧光分子；放射性同位素，例如125I、35S；酶；抗体；抗原；多核苷酸；以及配体，如生物素。

本文所述的任何蛋白质，包括本文所述的修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽，可使用本领域已知的标准方法产生。可使用所属领域中的标准方法来推导编码蛋白质的多核苷酸序列且进行复制。可使用所属领域中的标准技术在细菌宿主细胞中表达编码蛋白质的多核苷酸序列。可通过从重组表达载体原位表达多肽来在细胞中产生蛋白质。表达载体任选地携带诱导型启动子以控制多肽的表达。这些方法描述于Sambrook,J.和Russell,D.(2001).《分子克隆：实验室手册》,第3版.纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press)中。

可在从蛋白质产生生物体通过任何蛋白质液相色谱系统纯化之后或在重组表达之后，大规模生产蛋白质。典型的蛋白质液相色谱系统包括FPLC、AKTA系统、Bio-Cad系统、Bio-Rad BioLogic系统以及Gilson HPLC系统。

编码修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽的多核苷酸

本文提供了编码如本文所述的任何一种修饰的促胰岛素纳米孔亚基多肽的多核苷酸序列。

可以使用所属领域中的标准方法来衍生或复制多核苷酸序列。可以从如伤寒沙门菌等孔产生生物体中提取对野生型促胰液素进行编码的染色体DNA。可使用涉及特异性引物的PCR来扩增编码孔亚基的基因。可接着对所扩增的序列进行定点诱变。适当的定点诱变方法在所属领域中是已知的并且包含例如组合链式反应。可以使用熟知的技术制备对修饰的促胰岛素纳米孔亚基多肽进行编码的多核苷酸，所述技术如在Sambrook,J.和Russell,D.(2001).《分子克隆：实验室手册》,第3版.纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press)中描述的。

然后可以将所得多核苷酸序列并入到如克隆载体等重组可复制载体中。可以将载体用于在相容的宿主细胞中复制多核苷酸。因此，可以通过将多核苷酸引入到可复制载体中、将所述载体引入到相容的宿主细胞中以及在引起载体复制的条件下使宿主细胞生长来制备多核苷酸序列。可以从宿主细胞中回收载体。用于克隆多核苷酸的适当宿主细胞在所属领域中是已知的。

本公开的另一方面包括产生修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽或本文描述的构建体的方法。该方法包括在合适的宿主细胞中表达编码修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽的任何实施方案的多核苷酸。多核苷酸优选地是载体的一部分，且优选地可操作地连接于启动子。

修饰的促胰液素纳米孔

本公开内容的一个方面的特征在于例如修饰的促胰液素纳米孔，其设置在膜中并且允许将分析物(例如靶多核苷酸或多肽)捕获到修饰的促胰液素纳米孔中和/或将分析物易位通过所述修饰的促胰液素纳米孔。修饰的促胰液素纳米孔，例如，如设置在膜中，包含限定腔的腔表面，所述腔表面例如通过膜在顺式开口和反式开口之间延伸，其中腔表面包含一个或多个氨基修饰。如本文所用，术语“腔表面”是指纳米孔的内表面，该表面包含多个纳米孔亚基的一组氨基酸，其限定暴露于溶液的腔。

在一些实施方案中，促胰液素纳米孔包含促胰岛素结构域，其包含β桶，其包含内桶子结构域和外桶子结构域，每个子结构域由β-折叠组成，每个亚基通常贡献约六个β-折叠和/或内桶通常包括约四个β-折叠到外筒。每个亚基可以进一步贡献两个α-螺旋(通常在两个β-折叠之间)到外β桶，例如如图11所示。外筒通常跨越膜。内桶通常邻接孔的内腔。内桶通常包括中央门。中央门通常由两个β-折叠之间的环形成，所述两个β-折叠在每个亚基中形成内桶。中央门通常延伸到孔中以缩小孔的尺寸。可以通过改变中央门环中存在的氨基酸来修饰中央门，如本文所述，以改变孔的性质。中央门可以是柔性的，例如中央门可以是能够打开的。中央门可以是刚性的以保持恒定的收缩尺寸，例如中央门环可以是闭合的或部分闭合的。促胰液素纳米孔的β桶，其中第一唇缘在膜的相对侧上从膜突出到内β桶。β桶的唇缘通常由来自每个亚基多肽的两个α-螺旋和两个β-折叠组成。每个亚基中的β-折叠可以通过环区域连接，并且环区域形成帽门。或者，连接β-折叠的环可以很短并且不形成门。帽门可以是柔性的，例如帽门可以是能够打开的。帽门可以是刚性的以保持恒定的收缩尺寸，例如帽门可以是闭合的或部分闭合的。在一些实施方案中，β桶的第一唇缘可以不包含β-折叠并且包含通过环连接的来自每个亚基的两个α-螺旋。在这些实施方案中，纳米孔不包括帽门。第二唇缘相对于第一唇缘可以位于内β桶的另一侧。β桶的第二唇缘可在每个亚基中包含两个α-螺旋。

在一些实施方案中，除促胰液素结构域外，促胰液素纳米孔还可包含S结构域。S结构域可包含两个α-螺旋。其中一个α-螺旋通常与促胰液素纳米孔的β-桶相互作用。S结构域通常位于孔的外侧(即远离孔的内腔)。

在一些实施方案中，除了促胰液素结构域和任选的S结构域之外，促胰液素纳米孔还可以包含N3结构域。N3结构域通常由β-桶和α-螺旋组成，例如3至6个β-桶和2至3个α-螺旋，例如3个β-桶和2个α-螺旋，如图11所示，或6个β-桶和3个α-螺旋，如图1B所示。N3结构域可在孔的内腔中形成收缩。可以修饰N3结构域，使其不会收缩所述孔。可以修饰N3结构域以增加或减小收缩的大小。

当用作纳米孔来检测或表征分析物时，中央门、帽门和/或N3收缩可以用作读取头，即分析物与中央门、帽门和N3收缩中的一个、两个或全部相互作用可以改变当分析物与孔相互作用时获得的信号，从而使得能够得到关于分析物的信息。因此，促胰液素纳米孔可包含一个、两个或三个读取头。

可以选择氨基酸修饰以改善分析物通过修饰的促胰液素纳米孔的转运，以改善分析物捕获到修饰的促胰液素纳米孔中，和/或改善在分析物移动通过纳米孔时检测分析物期间的信号质量。氨基酸修饰的实例在上文“修饰的促胰液素纳米孔多肽”部分中详细描述。虽然修饰的促胰液素纳米孔通常包含腔表面的一个或多个氨基酸修饰(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多且最多40个氨基酸修饰)，但应当理解，修饰的促胰液素纳米孔可以有各种不同的修饰。例如，修饰的促胰液素纳米孔可具有氨基酸修饰(腔或非腔)(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70或更多以及最多100个氨基酸修饰)，其促进膜整合、促进寡聚化、促进亚基合成、促进纳米孔稳定性、促进分析物捕获、促进分析物释放、改善分析物检测、促进聚合物分析(例如多核苷酸序列)，等等。

仅作为示例，图5显示由于InvG纳米孔的较大顺式开口，酶可以以不同方向与CsgG和InvG纳米孔相互作用。不希望受理论束缚，由于酶和纳米孔开口的大小差异(也参见图6)，酶可以楔入纳米孔中。类似于CsgG纳米孔——其中顺式开口被改造以改善其与酶的相互作用，例如多核苷酸结合问题，在一些实施方案中，本文所述的修饰的促胰液素纳米孔(例如，如本文所述的顺式开口或捕获部分)可以被改造以促进酶(例如，多核苷酸结合蛋白)的优选取向，从而降低噪音并改善信号和准确度。

在一些实施方案中，顺式开口可具有至少约30埃、至少约40埃、至少约50埃、至少约60埃、至少约70埃、至少约80埃、至少约90埃、至少约100埃或更高的直径。在一些实施方案中，顺式开口的直径可以不大于约150埃，不大于约140埃，不大于约130埃，不大于约120埃，不大于约110埃，不大于约100埃，不大于约90埃，不大于约80埃，不大于约70埃，不大于约60埃，不大于约50埃或更低。上述范围的组合也是可能的。例如，在一些实施方案中，顺式开口的直径可以为约30埃至约120埃的范围。在一些实施方案中，顺式开口的直径可以为约60埃至约120埃的范围。在一些实施方案中，顺式开口的直径可以为约60埃至约100埃的范围。在一些实施方案中，顺式开口的直径可以为约30埃至约80埃的范围。在一个实施方案中，反式开口可具有约80埃的直径。

在一些实施方案中，反式开口可具有至少约30埃、至少约40埃、至少约50埃、至少约60埃、至少约70埃、至少约80埃、至少约90埃、至少约100埃或更高的直径。在一些实施方案中，反式开口的直径可以不大于约150埃，不大于约140埃，不大于约130埃，不大于约120埃，不大于约110埃，不大于约100埃，不大于约90埃，不大于约80埃，不大于约70埃，不大于约60埃，不大于约50埃或更低。上述范围的组合也是可能的。例如，在一些实施方案中，反式开口的直径可以为约30埃至约100埃的范围。在一些实施方案中，反式开口的直径可以为约40埃至约100埃的范围。在一些实施方案中，反式开口的直径可以为约60埃至约100埃的范围。在一些实施方案中，反式开口的直径可以为约30埃至约80埃的范围。在一个实施方案中，反式开口可具有约80埃的直径。

在一些实施方案中，腔表面可进一步限定腔内的收缩。腔的直径可以沿着在纳米孔的顺式开口和反式开口之间延伸的轴线变化。仅作为说明，图3显示InvG纳米孔的内腔沿纳米孔轴线(在顺式开口和反式开口之间延伸)的半径分布，其中内腔包括收缩。如本文所用，术语“收缩”是指腔的一部分的直径小于顺式开口和反式开口的直径。例如，收缩部的直径可以是顺式开口直径和/或反式开口直径的约5％-20％(包括端值)。例如，在一些实施方案中，收缩部可具有至少约5埃、至少约6埃、至少约7埃、至少约8埃、至少约9埃、至少约10埃、至少约15埃、至少约20埃、至少约25埃、或更高的直径。在一些实施方案中，收缩部的直径可以不大于约30埃、不大于约25埃、不大于约20埃、不大于约15埃、不大于约10埃或更低。上述范围的组合也是可能的。例如，在一些实施方案中，收缩部的直径可以在约5埃至约25埃的范围内。在一些实施方案中，收缩部的直径可以在约7埃至约25埃的范围内。在一些实施方案中，收缩部的直径可以在约10埃至约25埃的范围内。在一个实施例中，收缩部可具有约15埃的直径。

收缩部可位于顺式开口和反式开口之间的中间位置。在一些实施方案中，收缩部可位于距顺式开口约30埃至约60埃的距离处。在一些实施方案中，收缩部可位于距反式开口约30埃至约60埃的距离处。

在一些实施方案中，本文所述的经修饰的促胰液素纳米孔可包含限定腔的腔表面，所述腔表现出天然促胰液素纳米孔的半径分布，例如，如图3所示。

在微生物(例如细菌)中发现的任何形式的促胰液素可用于产生本文所述的修饰的促胰液素纳米孔。在一些实施方案中，促胰液素可以是II型、III型或IV型分泌系统的任何成员。II型分泌系统的非限制性实例包括GspD、PulD和pIV。III型分泌系统的实例包括但不限于InvG、MxiD、YscC、PscC、EscC和SpiA。示例性的IV型分泌系统包括但不限于PilQ。因此，在一些实施方案中，修饰的促胰液素纳米孔可包含本文所述的经修饰的促胰液素亚基多肽的任何实施方案，例如，在上文的“修饰的促胰液素纳米孔多肽”部分中描述的。

在一些实施方案中，本文描述的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种)氨基酸修饰(例如但不限于带正电荷的氨基酸取代和/或疏水性氨基酸取代)可以存在于限定收缩的腔表面的一部分中。例如，本文所述的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种)氨基酸修饰(例如但不限于带正电的氨基酸取代和/或疏水氨基酸取代)可以存在于腔表面的限定修饰的促胰液素纳米孔(例如，修饰的InvG纳米孔)的收缩部的部分中。仅作为示例，图1A显示野生型InvG纳米孔的收缩部(在图中标记为“周质门”)的位置。在一些实施方案中，修饰的InvG促胰液素纳米孔的收缩可具有一个或多个氨基酸修饰，用于改善分析物通过纳米孔的易位和/或在分析物移动通过纳米孔时改善检测信号质量。例如，修饰的InvG促胰液素纳米孔的收缩部可包括SEQ ID NO：1的氨基酸D28、E225、R226和/或E231处的氨基酸修饰。在一些实施方案中，修饰的InvG促胰液素纳米孔的收缩可包含一个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)以下氨基酸修饰：(i)D28N/Q/T/S/G/R/K；(ii)E225N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/R/K；(iii)R226N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/K/V；(iv)缺失E225；(v)缺失R226；和(vi)E231N/Q/T/A/S/G/P/H/R/K。

在一些实施方案中，腔表面可进一步包含捕获部分(例如，分析物捕获部分(例如，多核苷酸捕获部分))。如本文所用，术语“捕获部分”是指纳米孔的腔表面的一部分，其有利地通过一个或多个孔亚基的一个或多个氨基酸与靶分析物相互作用以允许或促进分析物与纳米孔结合和/或分析物易位通过纳米孔。捕获部分可以位于修饰的促胰液素纳米孔的顺式开口和收缩部之间。在一些实施方案中，捕获部分可以对应于促胰液素纳米孔的N3结构域(例如，II型、III型或IV型分泌系统)。例如，捕获部分可以对应于InvG纳米孔的N3结构域，例如，如图1A所示，或这种结构域的一部分。图1B显示包含InvG纳米孔的N3结构域的肽结构域(具有SEQ ID NO：2中的相应氨基酸位置)。在一些实施方案中，腔表面的捕获部分在收缩的顺式开口侧上包含一个或多个孔亚基的一个或多个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或更多个氨基酸)。

在一些实施方案中，捕获部分可以对应于InvG纳米孔的N3结构域，例如，如图1A所示，或者这种结构域的一部分，并且包括“周质收缩”，如图1A所示，其可以充当例如第二收缩。因此，在一些实施方案中，修饰的促胰液素纳米孔(例如，修饰的InvG纳米孔)可以包含两个收缩部-一个位于如上所述的顺式开口和反式开口之间的中间，另一个位于靠近纳米孔的顺式开口。这种修饰的促胰液素纳米孔可以像两个读取器纳米孔一样起作用，其中分析物(例如，多核苷酸)在彼此远离的两个收缩部位处与孔腔相互作用。

在一些实施方案中，腔表面的捕获部分可包含一个或多个氨基酸修饰(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或更多且最多25个氨基酸修饰)，用于改善靶分析物(例如靶多核苷酸)的捕获。仅举例来说，修饰的InvG促胰液素纳米孔的捕获部分可包含SEQ ID NO：1的氨基酸E41、Q45和/或E114处的氨基酸修饰。在一些实施方案中，修饰的InvG促胰液素纳米孔的捕获部分可包含一个或多个(例如，1、2或3个)以下氨基酸修饰：(i)Q45R/K；(ii)E41N/Q/T/S/G/R/K；(iii)E114N/Q/T/S/G/R/K。

本文所述的修饰的促胰液素纳米孔的任一种可以是同源多聚体(例如，纳米孔内的所有亚基是相同的)或异源多聚体(例如，至少一个亚基与纳米孔内的其他亚基不同)。修饰的促胰液素纳米孔可包含任何数量的亚基多肽，其足以形成足够大的腔以允许靶聚合物(例如，多核苷酸)通过。在一些实施方案中，修饰的促胰液素纳米孔可包含约9至约20个亚基多肽(例如，9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个亚基多肽)，其中至少一个或多个亚基多肽包含如本文所述的一个或多个氨基酸取代(例如，带正电荷的氨基酸取代和/或疏水氨基酸修饰)。

可以分离、基本上分离、纯化或基本纯化修饰的促胰液素纳米孔。如果它完全不含任何其它组分，如脂质或其它孔，则所述修饰的促胰液素纳米孔是分离的或纯化的。如果孔与将不干扰其既定用途的载体或稀释剂混合，则其是基本上分离的。举例来说，如果孔是以包含小于10％、小于5％、小于2％或小于1％的其它组分(如三嵌段共聚物、脂质或其它孔)的形式存在，那么其大体上是经分离或大体上经纯化的。或者，一种或多种修饰的促胰液素纳米孔可以存在于膜中。下文论述合适膜。

修饰的促胰液素纳米孔可以作为单独孔或单个孔存在。替代地，修饰的促胰液素纳米孔可以同源孔群体或两种或更多种孔的异源群体存在。在一些实施方案中，修饰的促胰液素纳米孔可以排列成阵列，例如，每个纳米孔设置在微孔中存在的膜中。在一些实施方案中，阵列可包含修饰的促胰液素纳米孔和本领域已知的至少一种或多种非促胰液素纳米孔，例如但不限于CsgG纳米孔(例如，如WO 2016/034591中所述)；α-溶血素纳米孔(例如，如WO2010/004273中所述)；lysenin纳米孔(例如，如WO2013/153359中所述)；Msp纳米孔(例如，如WO2012/107778；WO2015/166275；和WO2016/055778中所述)。

本文描述的修饰的促胰液素纳米孔可以提供改进的分析物检测和/或分析。仅用于说明，图4显示，虽然CsgG和InvG纳米孔的直径都具有大致相同的收缩，但CsgG纳米孔的收缩分别在位置51、55和56处(基于野生型序列)具有3个氨基酸，并且InvG纳米孔收缩分别在396和397位(基于SEQ ID NO：2)具有两个氨基酸。此外，CsgG纳米孔收缩处的氨基酸51也稍远离氨基酸55。相反，InvG纳米孔收缩处的氨基酸396和397彼此相邻，从而提供更清晰的读取头。因此，在一些实施方案中，修饰的促胰液素纳米孔可以提供更清晰的读数头用于分析物检测和/或分析。

同源多聚促胰液素纳米孔

本文还提供了包含相同的修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽的同源多聚体纳米孔。同源多聚体纳米孔可包含本文所述的经修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽的任何实施方案。同多聚体纳米孔可用于表征分析物，例如靶多核苷酸和/或靶多肽。本文描述的同源多聚体纳米孔可具有上文讨论的任何优点。

同源多聚体孔可含有任何数量的经修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽。所述孔通常包含至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少19、至少20个相同的修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽，例如9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个相同的修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽。

异源多聚体促胰液素纳米孔

本文还提供了包含至少一种修饰的促胰岛素纳米孔亚基多肽的异源多聚体纳米孔。异源多聚体纳米孔可用于表征靶分析物，例如靶多核苷酸和/或靶多肽。可以使用本领域中已知的方法(例如Protein Sci.2002Jul；11(7):1813-24)制备异源多聚体纳米孔。

异源多聚体孔含有足够的亚基多肽以形成孔。亚基多肽可以是任何类型。所述孔通常包含至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少19、至少20个亚基多肽，例如9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个亚基多肽。

在一些实施方案中，所有亚基多肽(例如9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个亚基多肽)是修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽和它们彼此不同的至少一种。

在一些实施方案中，至少一个亚基多肽不是如本文所述的经修饰的促胰岛素纳米孔亚基多肽。在该实施方案中，剩余的单体可以是本文所述的修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽中的任何一种。因此，孔可包含19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽。形成纳米孔的修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽可以相同或不同。

本文描述的促胰液素纳米孔的示例性用途

修饰的促胰液素纳米孔可用于表征或检测分析物，例如靶多核苷酸(例如，双链多核苷酸和/或单链多核苷酸)和/或靶多肽。因此，本文还提供了用于检测和/或表征样品中的分析物的方法。该方法包括：提供包含本文所述的修饰的促胰液素纳米孔的任何实施方案的水溶液，以及膜，其中将修饰的促胰液素纳米孔置于膜中；并将分析物添加到膜的顺式侧或反式侧的水溶液中。在一些实施方案中，还可以将酶例如多核苷酸结合蛋白，例如解旋酶、核酸外切酶和/或聚合酶，添加到膜的顺式侧或反式侧的水溶液中。诸如多核苷酸结合蛋白的酶可以进入内腔或者与修饰的促胰液素纳米孔的顺式开口或反式开口接触(通过例如但不限于离子和/或疏水相互作用)或与之共价连接。在一些实施方案中，分析物可以与酶结合，例如多核苷酸结合蛋白。分析物可以是靶多核苷酸、多肽、配体或疏水分子。

在一些实施方案中，促胰液素纳米孔可用于检测与顺式或反式前庭内提供的酶结合或以其他方式相互作用的分子，所述结合引起酶构象的变化。构象的变化可以引起通过纳米孔的离子电流的变化。此类分子的实例是药物、抗体、肽、多核苷酸等。与诸如药物的小分子相互作用的酶的实例包括但不限于细胞色素p450酶。

在一些实施方案中，该方法可以进一步包括在膜上施加电势。外加电位可以是电压电位。或者，外加电位可以是化学势。化学势的实例是跨膜，如跨两亲层使用盐梯度。Holden等人J Am Chem Soc.2007Jul 11；129(27):8650-5中公开了盐梯度。所述方法通常在跨膜和孔施加电压的情况下进行。所使用的电压可以从+5V到-5V变化，如+4V到-4V、+3V到-3V或+2V到-2V。在一些实施方案中，所使用的电压可以是-600mV到+600mV或-400mV到+400mV。在一些实施方案中，所使用的电压可以处于具有下限和上限的范围内，所述下限选自-400mV、-300mV、-200mV、-150mV、-100mV、-50mV、-20mV和0mV，并且所述上限独立地选自+10mV、+20mV、+50mV、+100mV、+150mV、+200mV、+300mV和+400mV。在一些实施方案中，所使用的电压可以在100mV至240mV的范围内或在120mV至220mV的范围内。通过使用增加的施加电位，可以通过孔增加不同核苷酸之间的区分。

在一些实施方案中，该方法可以进一步包括，在跨膜施加电势时，响应于穿过纳米孔的分析物检测信号。信号可以是电测量和/或光学测量。可能的电测量包括：电流测量、阻抗测量、隧穿测量(Ivanov AP等人(Ivanov AP et al.,Nano Lett.2011Jan 12；11(1):279-85)以及FET测量(International Application WO 2005/124888)。光学测量可以与电测量相结合(Soni GV等人,Rev Sci Instrum.2010Jan；81(1):014301)。测量可以是跨膜电流测量，例如对流过孔的离子电流的测量。替代性地，测量可以是指示通过通道的离子流的荧光测量，如通过Heron等人，《美国化学协会期刊(J.Am.Chem.Soc.)》2009,131(5),1652-1653所公开的或使用FET测量跨膜的电压。在一些实施方案中，所述方法还可包括，当施加跨膜电位时，在分析物(例如但不限于靶多核苷酸)相互作用和/或移动通过纳米孔时检测流过纳米孔的离子电流。在一些实施方案中，可以使用膜片钳或电压钳来进行所述方法。在一些实施方案中，可以使用电压钳来进行所述方法。电测量可以使用标准信号通道记录设备来进行，如Stoddart D等人,《美国国家科学院院刊》(Proc Natl Acad Sci),12；106(19):7702-7；Lieberman KR等人,《美国化学会志》(J Am Chem Soc.)2010；132(50):17961-72；以及国际申请WO 2000/28312中所述。可替代地，可以使用多通道系统进行电测量，例如如国际申请WO 2009/077734和国际申请WO 2011/067559中所述。

在替代实施方案中，该方法可以进一步包括，在跨膜施加电势时，通过在结合分析物时测量酶(例如，多核苷酸结合蛋白或配体结合蛋白)的运动或构象变化来检测分析物。在一些实施方案中，当分析物与酶结合时，至少一部分酶可以存在于修饰的促胰液素纳米孔的内腔中。在这些实施方案中，与没有结合分析物的酶相比，通过纳米孔的离子电流可随着与分析物结合的酶的运动或构象变化而变化。因此，可以通过测量在纳米孔上产生的离子电流和/或电流特征的水平的变化来检测分析物的存在和/或类型。

在本文所述的任何方法中，其中设置修饰的促胰液素纳米孔和膜的水溶液可包含任何电荷载流子，例如金属盐，例如碱金属盐、卤化物盐，例如氯化物盐，例如碱金属氯化物盐。电荷载流子可以包括离子液体或有机盐，例如四甲基氯化铵、三甲基苯基氯化铵、苯基三甲基氯化铵或1-乙基-3-甲基氯化咪唑鎓。在于此讨论的示例性装置中，盐存在于室中的水溶液中。通常使用氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)、氯化铯(CsCl)，或亚铁氰化钾和铁氰化钾的混合物。可以使用KCl、NaCl以及亚铁氰化钾和铁氰化钾的混合物。电荷载流子可以是跨膜不对称的。例如，电荷载流子的类型和/或浓度可以在膜的各侧上不同。

在本文所述的任何方法中，其中布置有经修饰的促胰液素纳米孔和膜的水溶液可包含盐。盐浓度可以是饱和的。盐浓度可以是3M或更低，并且通常是0.1至2.5M、0.3至1.9M、0.5至1.8M、0.7至1.7M、0.9至1.6M或1M至1.4M。盐浓度优选是150mM至1M。所述方法优选使用至少0.3M的盐浓度进行，例如至少0.4M、至少0.5M、至少0.6M、至少0.8M、至少1.0M、至少1.5M、至少2.0M、至少2.5M或至少3.0M。高盐浓度提供高信噪比并允许相对于正常电流波动的背景鉴定指示核苷酸的存在的电流。

在一些实施方案中，水溶液可以是低离子强度溶液。如本文所用，术语“低离子强度溶液”是指离子强度小于2M的溶液，包括例如小于1M，小于900mM，小于800mM，小于700mM，小于600mM，小于500mM，小于400mM，小于300mM，小于200mM，小于150mM或更低。在一些实施方案中，较低离子强度溶液具有至少约50mM，至少约100mM，至少约150mM，至少约200mM，至少约300mM，至少约400mM，至少约500mM，至少约600mM，至少约700mM，至少约800mM，至少约900mM，至少约1M或更高的离子强度。还包括上述参考范围的组合。例如，低离子强度溶液可具有约100mM至约600mM，或约150mM至约300mM的离子强度。可以使用任何盐来产生具有适当离子强度的溶液。在一些实施方案中，碱性盐(例如但不限于氯化钾或氯化钠)可用于低离子强度溶液中。

通常在存在缓冲液的情况下进行本文所述的方法。在于此讨论的示例性装置中，缓冲液存在于室中的水溶液中。在本文所述的方法中可以使用任何缓冲液。通常，缓冲液是磷酸盐缓冲液。其它合适的缓冲液是HEPES和Tris-HCl缓冲液。通常在以下pH下进行所述方法：4.0至12.0、4.5至10.0、5.0至9.0、5.5至8.8、6.0至8.7或7.0至8.8或7.5至8.5。所用pH优选是约7.5或8.0。

可以在以下温度下进行本文所述方法：0℃至100℃、15℃至95℃、16℃至90℃、17℃至85℃、18℃至80℃、19℃至70℃或20℃至60℃。通常在室温下进行所述方法。任选地在支持酶功能的温度下进行所述方法，如在约37℃下进行。

在一些实施方案中，本文所述的方法可用于在一系列条件下区分不同的核苷酸，这将在下面的“多核苷酸表征”部分中进一步详细描述。例如，本文描述的方法可用于在有利于核酸表征(例如测序)的条件下区分核苷酸。本方法中使用的修饰的促胰液素纳米孔可以区分不同核苷酸的程度可以通过改变所施加的电势、盐浓度、缓冲液、温度和如脲、甜菜碱和DTT等添加剂的存在进行控制。这允许对孔的功能进行微调，尤其在测序时。在下文中更详细地论述这一点。修饰的促胰液素纳米孔还可以用于根据与一个或多个单体的相互作用而不是在逐核苷酸的基础上识别多核苷酸聚合物。在一些实施方案中，修饰的促胰液素纳米孔还可用于区分修饰的碱基，例如，甲基化和未甲基化的核苷酸之间。

图2显示，虽然CsgG纳米孔具有9个单体或亚基，并且InvG纳米孔具有15个单体或亚基，但两个纳米孔的直径都具有大致相同的收缩。与CsgG纳米孔(例如，如WO 2016/034591中所述)不同，在一些实施方案中，修饰的促胰液素纳米孔(例如但不限于InvG纳米孔)可用于测序DNA和/或RNA。

在一些实施方案中，本文描述的方法可用于表征和/或检测或表征分子或配体。例如，本文所述方法中使用的修饰的促胰液素纳米孔可用于表征配体-酶相互作用(例如，核酸-蛋白质相互作用或蛋白质-蛋白质相互作用)。在一些实施方案中，纳米孔可以使用不同的感测模式来询问配体-酶相互作用(例如，蛋白质-核酸相互作用或蛋白质-蛋白质相互作用)，例如通过沿着配体(例如，核酸或多肽)扫描和绘制结合位点的位置和/或通过探测配体和酶之间(例如，在蛋白质和核酸之间或在蛋白质和蛋白质之间)的相互作用的强度。在一些实施方案中，可利用核酸或蛋白质的天然电荷将电泳力施加至核酸-蛋白质复合物或蛋白质-蛋白质复合物。例如，在一些实施方案中，可以使用单个DNA分子通过蛋白质纳米孔的电压驱动穿线来评估DNA-蛋白质相互作用。在这样的实施方案中，施加到单个DNA蛋白复合物(例如，DNA-外切核酸酶I复合物、DNA-解旋酶复合物、DNA-钳复合物)的电力可以将两个分子拉开，同时离子电流改变可用于评估复合物的解离速率。在一些实施方案中，本文提供的经修饰的促胰液素纳米孔可用于检测和表征涉及核酸和其他核酸结合蛋白(例如转录因子、酶、DNA包装蛋白等)的核酸-蛋白质相互作用。在一些实施方案中，本文提供的经修饰的促胰液素纳米孔可用于检测和表征涉及配体和其他配体结合蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用。

在一些实施方案中，酶的至少一部分(例如但不限于多核苷酸结合蛋白)可以进入修饰的促胰液素纳米孔的内腔，例如，如图6所示。酶在纳米孔内的定位可以限制酶的不期望的运动，从而导致改善的信号。例如，如ClyA纳米孔所示(例如，如国际专利申请公开WO2014/153625和WO2016/166232中所述)，在一些实施方案中，如本文所述的经修饰的促胰液素纳米孔可用于通过测量其与酶结合的运动来检测分析物，所述酶的至少一部分存在于纳米孔内。由于诸如InvG纳米孔的促胰液素纳米孔的收缩比ClyA纳米孔的收缩小得多，因此使用诸如InvG纳米孔的促胰液素纳米孔，从这样的事件产生的信号可能更明显。因此，在一些实施方案中，修饰的促胰液素纳米孔和本文描述的方法可提供分子测试的新领域。

多核苷酸表征

本公开的另一方面提供了表征靶多核苷酸的方法。该方法包括：(a)在水溶液中提供根据本文所述的任何实施方案的修饰的促胰液素纳米孔，和膜，其中所述修饰的促胰液素纳米孔存在于所述膜中；(b)在步骤(a)的水溶液中加入靶多核苷酸；(c)在施加穿过纳米孔的电势期间测量通过修饰的促胰液素纳米孔的离子流，其中离子流测量指示靶多核苷酸的一种或多种特征。在一些实施方案中，将靶多核苷酸添加至水溶液的顺式侧。在一些实施方案中，将靶多核苷酸添加至水溶液的反式侧。在一些实施方案中，水溶液存在于本文描述的装置的实施方案中。

靶多核苷酸还可被称为模板多核苷酸或所关注的多核苷酸。

多核苷酸

多核苷酸(如核酸)是包含两个或更多个核苷酸的大分子。多核苷酸或核酸可以包括任何核苷酸的任何组合。核苷酸可以是天然存在的或人工的。多核苷酸中的一或多个核苷酸可以是氧化或甲基化的。多核苷酸中的一或多个核苷酸可以是受损的。例如，多核苷酸可以包括嘧啶二聚体。此类二聚体通常与紫外线损伤有关并且是皮肤黑色素瘤的主要病因。多核苷酸中的一或多个核苷酸可以例如用标记或标签修饰。合适的标记在下文描述。多核苷酸可包含一或多个间隔子。

核苷酸通常含有核碱基、糖和至少一个磷酸基。核碱基和糖形成核苷。

核碱基通常是杂环的。核碱基包括(但不限于)嘌呤和嘧啶，且更详细地说腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)和胞嘧啶(C)。

糖通常是戊糖。核苷酸糖包括(但不限于)核糖和脱氧核糖。糖优选地是脱氧核糖。

多核苷酸优选地包含以下核苷：脱氧腺苷(dA)、脱氧尿苷(dU)和/或胸苷(dT)、脱氧鸟苷(dG)和脱氧胞苷(dC)。

核苷酸通常是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。核苷酸通常含有单磷酸、二磷酸或三磷酸。核苷酸可包含超过三个磷酸，如4或5个磷酸。磷酸可连接在核苷酸的5'或3'侧上。核苷酸包括(但不限于)：单磷酸腺苷(AMP)、单磷酸鸟苷(GMP)、单磷酸胸苷(TMP)、单磷酸尿苷(UMP)、单磷酸5-甲基胞啶、单磷酸5-羟基甲基胞苷、单磷酸胞嘧啶核苷(CMP)、环单磷酸腺苷(cAMP)、环单磷酸鸟苷(cGMP)、单磷酸脱氧腺苷(dAMP)、单磷酸脱氧鸟苷(dGMP)、单磷酸脱氧胸苷(dTMP)、单磷酸脱氧尿苷(dUMP)、单磷酸脱氧胞苷(dCMP)和单磷酸脱氧甲基胞苷。核苷酸优选地是选自AMP、TMP、GMP、CMP、UMP、dAMP、dTMP、dGMP、dCMP和dUMP。

核苷酸可以无碱基的(即缺乏核碱基)。核苷酸还可缺乏核碱基和糖。

多核苷酸中的核苷酸可以任何方式彼此连接。核苷酸通常通过其糖和磷酸基附接，如在核酸中那样。核苷酸可以通过其核碱基连接，如在嘧啶二聚体中那样。

多核苷酸可以是单链的或双链的。多核苷酸的至少一部分优选地是双链的。

多核苷酸可以是核酸，如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。多核苷酸可包含与一个DNA链杂交的一个RNA链。多核苷酸可以是本领域中已知的任何合成核酸，如肽核酸(PNA)、甘油核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、锁核酸(LNA)或具有核苷酸侧链的其它合成聚合物。PNA主链由通过肽键连接的重复N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元构成。GNA主链由通过磷酸二酯键连接的重复二醇单元构成。TNA主链由通过磷酸二酯键连接在一起的重复苏糖构成。LNA是由如上文所论述的具有将核糖部分中的2'氧和4'碳连接的额外桥的核糖核苷酸形成。

多核苷酸最优选地是核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。

多核苷酸可以是任何长度的。举例来说，多核苷酸的长度可以是至少10、至少50、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少400或至少500个核苷酸或核苷酸对。多核苷酸的长度可以是1000个或更多个核苷酸或核苷酸对、5000个或更多个核苷酸或核苷酸对、或100000个或更多个核苷酸或核苷酸对。

可以研究任何数量的多核苷酸。举例来说，本文所述的方法可涉及表征2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、50、100或更多个多核苷酸。如果表征两个或更多个多核苷酸，那么其可以是不同的多核苷酸或两个相同多核苷酸的例子。

多核苷酸可以是天然存在的或人工的。举例来说，方法可用于验证所制造寡核苷酸的序列。通常在活体外进行所述方法。

多核苷酸可包含附着的物种，例如蛋白质或分析物。多核苷酸可包含杂交的探针。

表征

表征多核苷酸的方法可涉及测量多核苷酸的两个、三个、四个或五个或更多个特征。一个或多个特征优选选自：(i)多核苷酸的长度，(ii)多核苷酸的同一性，(iii)多核苷酸的序列，(iv)多核苷酸的二级结构，以及(v)多核苷酸是否被修饰。可以根据本文所述的方法来测量(i)到(v)的任何组合，如：{i}、{ii}、{iii}、{iv}、{v}、{i,ii}、{i,iii}、{i,iv}、{i,v}、{ii,iii}、{ii,iv}、{ii,v}、{iii,iv}、{iii,v}、{iv,v}、{i,ii,iii}、{i,ii,iv}、{i,ii,v}、{i,iii,iv}、{i,iii,v}、{i,iv,v}、{ii,iii,iv}、{ii,iii,v}、{ii,iv,v}、{iii,iv,v}、{i,ii,iii,iv}、{i,ii,iii,v}、{i,ii,iv,v}、{i,iii,iv,v}、{ii,iii,iv,v}或{i,ii,iii,iv,v}。可对于与第二多核苷酸进行比较的第一多核苷酸，测量(i)到(v)的不同组合，包括上文所列的那些组合中的任一个。

对于(i)，可例如通过测定多核苷酸与孔之间的相互作用的数量或多核苷酸与孔之间的相互作用的持续时间，来测量多核苷酸的长度。

对于(ii)，可以用多种方式来测量多核苷酸的同一性。可以结合测量多核苷酸的序列或不测量多核苷酸的序列来测量多核苷酸的同一性。前者是很简单的；对多核苷酸进行测序并由此鉴定所述多核苷酸。后者可以按若干方式进行。举例来说，可以测量多核苷酸中的特定基序的存在情况(不测量多核苷酸的其余序列)。或者，所述方法中的特定电信号和/或光学信号的测量可以将多核苷酸鉴定为来自于特定来源。

对于(iii)，可以如先前所描述般测定多核苷酸的序列。在Stoddart D等人,《美国国家科学院院刊》,12；106(19):7702-7；Lieberman KR等人,《美国化学会志》2010；132(50):17961-72；以及国际申请WO 2000/28312中描述了合适的测序方法，特别是使用电气测量的那些。

对于(iv)，可以用多种方式测量二级结构。例如，如果所述方法涉及电气测量，那么可以使用停留时间的变化或流过孔的电流的变化来测量二级结构。这允许区分单链多核苷酸和双链多核苷酸的区域。

对于(v)，可以测量任何修饰的存在或不存在。所述方法优选包含：用一个或多个蛋白质或用一个或多个标记、标签或间隔区确定多核苷酸是否通过甲基化、通过氧化、通过损坏来修饰。特定的修饰将引起与孔的特定的相互作用，这可以使用下文所描述的方法测量。例如，可以在孔与每个核苷酸相互作用期间流过孔的电流的基础上区别甲基胞嘧啶和胞嘧啶。

使靶多核苷酸与本文所述的任何一种修饰的促胰液素纳米孔接触。孔通常存在于膜中。下文论述合适膜。可使用适合于研究膜/孔系统的任何设备来进行方法，其中孔存在于膜中。可使用适合于跨膜孔感测的任何设备来进行方法。例如，设备包含腔室，所述腔室包含水溶液和将腔室分成两个部分的屏障。屏障通常具有孔口，在其中形成含有孔的膜。或者，屏障形成其中存在孔的膜。

该方法可以使用国际申请PCT/GB08/000562(公开为WO 2008/102120)中描述的装置进行，其内容通过引用并入本文。

可以进行各种不同类型的测量。这包括但不限于：电气测量和光学测量。可能的电气测量包括：电流测量、阻抗测量、隧穿测量(Ivanov AP等人，Nano Lett.2011Jan 12；11(1):279-85)以及FET测量(International Application WO 2005/124888)。光学测量可以与电测量相结合(Soni GV等人,Rev Sci Instrum.2010Jan；81(1):014301)。测量可以是跨膜电流测量，例如对流过孔的离子电流的测量。替代性地，测量可以是指示通过通道的离子流的荧光测量，如通过Heron等人，《美国化学协会期刊(J.Am.Chem.Soc.)》2009,131(5),1652-1653所公开的或使用FET测量跨膜的电压。

可以使用标准单通道记录设备来进行电气测量，如以下文献中所述：

Stoddart D等人,《美国国家科学院院刊》,12；106(19):7702-7；Lieberman KR等人,《美国化学会志》2010；132(50):17961-72；以及国际申请WO 2000/28312。可替代地，可以使用多通道系统进行电测量，例如如国际申请WO 2009/077734和国际申请WO 2011/067559中所述。

所述方法可以在跨膜施加电位的情况下进行。外加电位可以是电压电位。或者，外加电位可以是化学势。化学势的实例是跨膜，如跨两亲层使用盐梯度。Holden等人J AmChem Soc.2007Jul 11；129(27):8650-5中公开了盐梯度。在一些情况下，使用在多核苷酸相对于孔移动时通过孔的电流来评估或确定多核苷酸的序列。这可以描述为链测序。

方法可涉及在多核苷酸相对于孔移动时测量穿过孔的电流。因此，在方法中使用的设备还可包含能够施加电势和测量膜和孔两端的电信号的电路。可使用贴片钳或电压钳来进行方法。所述方法优选涉及使用电压钳。

所述方法可以涉及测量在多核苷酸相对于孔移动时通过孔的电流。用于测量通过跨膜蛋白孔的离子电流的适当条件在本领域中是已知的并且也在此提供。

酶，如多核苷酸结合蛋白

在一些实施方案中，用于表征分析物(例如，靶多核苷酸或多肽)的方法可以包括在包含分析物的水溶液中添加酶，例如多核苷酸结合蛋白，使得酶结合分析物(例如，靶多核苷酸或多肽)。在一些实施方案中，分析物(例如，靶多核苷酸)与酶(例如多核苷酸结合蛋白)的结合控制分析物(例如，靶多核苷酸)通过修饰的促胰液素纳米孔的运动，从而表征分析物(例如，靶多核苷酸)。在一些实施方案中，可以测量分析物(例如，靶多肽或配体)与酶(例如配体结合蛋白)结合的运动以检测分析物和/或表征分析物与酶的相互作用。

多核苷酸结合蛋白：多核苷酸结合蛋白可以是能够与多核苷酸结合并且控制其通过孔的移动的任何蛋白质。多核苷酸结合蛋白的实例包括但不限于解旋酶、聚合酶、核酸外切酶、DNA钳等。多核苷酸可以以任何顺序与多核苷酸结合蛋白和孔接触。优选的是，当使多核苷酸与如解旋酶的多核苷酸结合蛋白和孔接触时，多核苷酸首先与蛋白质形成复合物。当跨孔施加电压时，多核苷酸/蛋白质复合物就会与孔形成复合物并且控制多核苷酸通过孔的移动。

使用多核苷酸结合蛋白的方法中的任何步骤通常在游离核苷酸或游离核苷酸类似物和促进多核苷酸结合蛋白的作用的酶辅因子存在下进行。

解螺旋酶和分子制动器

在一个实施方案中，该方法包括：

(a)提供多核苷酸与一或多个解螺旋酶以及连接于多核苷酸的一或多个分子制动器；

(b)在低离子强度溶液中添加多核苷酸，所述低离子强度溶液包含存在于膜中的修饰的促胰液素纳米孔，并且在孔上施加电势，使得一个或多个解旋酶和一个或多个分子制动器在一起并且均控制多核苷酸通过孔的运动；

(c)在跨纳米孔施加电势期间测量通过修饰的促胰液素纳米孔的离子流，因为多核苷酸相对于孔移动，其中离子流测量指示多核苷酸的一个或多个特征，从而表征多核苷酸。在国际申请PCT/GB2014/052737(公布为WO 2015/110777)中详细讨论了这种类型的方法，其内容通过引用并入本文。

膜

本文所述的修饰的促胰液素纳米孔可以存在于膜中。在表征分析物(例如，靶多核苷酸、多肽或配体)的方法中，分析物(例如，靶多核苷酸、多肽或配体)通常与膜中的修饰的促胰液素纳米孔接触。可以使用任何膜。合适的膜在本领域中是众所周知的。膜优选地是两亲层。两亲层是由两亲分子形成的层，所述两亲分子如磷脂，其具有亲水性和亲脂性特性两种。两亲分子可以是合成的或天然存在的。非天然存在的两亲物和形成单层的两亲物在所属领域中是已知的，且包括例如嵌段共聚物(Gonzalez-Perez等人,《朗缪尔(Langmuir)》,2009,25,10447-10450)。嵌段共聚物是聚合在一起的两个或更多个单体亚基产生单一聚合物链的聚合材料。嵌段共聚物通常具有通过每个单体亚基贡献的性质。然而，嵌段共聚物可以具有由单独的亚单元形成的聚合物所不具备的独特性质。嵌段共聚物可以被工程化，使得其中一个单体亚单元在水性介质中是疏水性的或亲脂性的，而其它亚单元是亲水性的。在这种情况下，嵌段共聚物可以具备两亲性质，并且可以形成模拟生物膜的结构。嵌段共聚物可以是二嵌段(由两个单体亚单元组成)，但也可以由多于两个单体亚单元构建以形成表现为两亲物的更复杂布置。共聚物可以是三嵌段、四嵌段或五嵌段共聚物。膜优选是三嵌段共聚物膜。

古细菌双极性四醚脂质是天然存在的脂质，其被构建成使得脂质形成单层膜。这些脂质一般发现于在苛刻生物环境中存活的嗜极生物、嗜热生物、嗜盐生物和嗜酸生物中。认为其稳定性是源于最终双层的融合性质。直接了当的做法是，通过产生具有一般基序亲水性-疏水性-亲水性的三嵌段聚合物来构建模拟这些生物实体的嵌段共聚物材料。这种材料可形成表现类似于脂质双层并且涵盖从囊泡到层状膜的一系列阶段表现的单体膜。由这些三嵌段共聚物形成的膜相对于生物脂质膜保持若干优势。因为三嵌段共聚物是合成的，所以可小心地控制准确的构建，以提供形成膜并与孔和其它蛋白质相互作用的正确链长度和特性。

还可以由不被归类为脂质亚材料的亚单元来构建嵌段共聚物，例如可由硅氧烷或其它非基于烃的单体来制成疏水性聚合物。嵌段共聚物的亲水性亚区段还可以具备低蛋白质结合特性，这允许产生当暴露于原始生物样品时具有高度抗性的膜。这种头基单元还可来源于非经典的脂质头基。

与生物脂质膜进行比较，三嵌段共聚物膜还具有增加的机械和环境稳定性，例如高许多的操作温度或pH范围。嵌段共聚物的合成性质提供定制用于广泛范围应用的基于聚合物的膜的平台。

该膜最优选是国际申请号PCT/GB2013/052766(公布为WO2014/064443)或PCT/GB2013/052767(公布为WO2014/064444)中公开的膜之一，其中每一种的内容均为通过引用并入本文。

可以对两亲分子进行化学修饰或官能化以促进分析物(例如，靶多核苷酸、多肽或配体)的偶联。

两亲性层可以是单层或双层。两亲层通常是平面的。两亲层可以是弯曲的。两亲层可以是支撑式的。

两亲膜通常天然地是可移动的，基本上以大致10^-8cm s^-1的脂质扩散速率充当二维液体。这意味着孔和偶联的分析物(例如，靶多核苷酸、多肽或配体)通常可以在两亲膜内移动。

膜可以是脂质双层。脂质双层是细胞膜的模型，并且用作一系列实验研究的极佳平台。例如，脂质双层可以用于通过单通道记录对膜蛋白进行体外研究。或者，脂质双层可以用作检测一系列物质的存在的生物传感器。脂质双层可以是任何脂质双层。适当的脂质双层包括但不限于平面脂质双层、支撑双层或脂质体。脂质双层优选是平面脂质双层。合适的脂质双分子层在国际申请号PCT/GB08/000563(公开号WO 2008/102121)、国际申请号PCT/GB08/004127(公布号WO2009/077734)和国际申请号PCT/GB2006/001057(公布为WO2006/100484)中公开，其各自的内容通过引用并入本文。

在一些实施方案中，分析物(例如，靶多核苷酸、多肽或配体)可以与包含本文所述的任何一种修饰的促胰液素纳米孔的膜偶联。该方法可以包括将分析物(例如，靶多核苷酸、多肽或配体)偶联至包含本文所述的任何一种修饰的促胰液素纳米孔的膜。分析物(例如，靶多核苷酸、多肽或配体)优选使用一个或多个锚与膜偶联。可以使用任何已知方法将分析物(例如，靶多核苷酸、多肽或配体)偶联至膜。

双链多核苷酸测序

在一些实施方式中，多核苷酸可以是双链。如果多核苷酸是双链，那么在接触步骤之前，方法优选地进一步包含使发夹衔接子与多核苷酸的一端接合的步骤。然后可以在多核苷酸与如本文所述的修饰的促胰液素纳米孔接触或相互作用之时或之前分离多核苷酸的两条链。在多核苷酸通过孔移动受多核苷酸结合蛋白(如解螺旋酶或分子制动器)控制时，可将两条链分开。这在国际申请号PCT/GB2012/051786(公布为WO2013/014451)中描述，其内容通过引用并入本文。以此方式连接和询问双链构建体上的两条链提高了表征的效率和准确度。

进行转角测序

在一优选实施方案中，靶双链多核苷酸在一端具备发夹环衔接子，且方法包含使多核苷酸与本文描述的任一种修饰的促胰液素纳米孔接触，使得多核苷酸的两条链移动通过孔，且在多核苷酸的两条链相对于孔移动时进行一或多个测量，其中测量指示多核苷酸的链的一或多个特征，且从而表征靶双链多核苷酸。上文所论述的任一个实施方案同样应用于这个实施方案。

前导序列

在接触步骤之前，方法优选地包含将多核苷酸连接于优选地螺旋到孔中的前导序列。前导序列促进本文描述的任何方法。设计前导序列以优先穿入本文所述的任何一种修饰的促胰液素纳米孔中，从而促进多核苷酸通过纳米孔的移动。前导序列还可以用于将多核苷酸连接到如上文所论述的一个或多个锚。

修饰的多核苷酸

在表征之前，可通过在使用靶多核苷酸作为模板，聚合酶形成经修饰多核苷酸的条件下，使多核苷酸与聚合酶和游离核苷酸群体接触，来对靶多核苷酸进行修饰，其中当形成经修饰多核苷酸时，聚合酶用不同核苷酸物种置换靶多核苷酸中的一或多个核苷酸物种。接着，经修饰的多核苷酸可具备连接于多核苷酸的一或多个解螺旋酶和连接于多核苷酸的一或多个分子制动器。在国际申请PCT/GB2015/050483中描述了这种类型的修饰，其内容通过引用结合在此。可以使用上文论述的任何聚合酶。

在使用模板多核苷酸作为模板，聚合酶形成经修饰多核苷酸的条件下，使模板多核苷酸与聚合酶接触。此类条件是本领域中已知的。举例来说，通常使多核苷酸与含聚合酶的可商购的聚合酶缓冲液接触，所述缓冲液如来自New England的缓冲液。引物或3'发夹通常用作聚合酶延伸的成核点。

使用跨膜孔表征(如测序)多核苷酸通常涉及分析由k个核苷酸构成的聚合物单元，其中k是正整数(即"k聚体(k-mers)")。这在国际申请号PCT/GB2012/052343(公布为WO2013/041878)中讨论，其内容通过引用并入本文。尽管期望在不同聚体的电流测量之间具有清楚的分隔，但这些测量中的一些重叠是常见的。尤其在k聚体中用高数量的聚合物单元，即高的k值，可能变得难以解析由不同k聚体产生的测量，损害关于多核苷酸的推导信息，例如多核苷酸的潜在序列的评估。可以采用各种算法来表征序列，例如使用隐马尔可夫模型或递归神经网络。可使用如国际专利申请号PCT/GB2015/050776(公布为WO 2015/140535)和PCT/GB2015/053083(公布为WO 2016/059427)中公开的方法将序列与参考序列比对，其中每一篇的内容都通过引用并入本文。

通过用经修饰多核苷酸中的不同核苷酸物种来置换靶多核苷酸中的一或多个核苷酸物种，经修饰多核苷酸含有不同于靶多核苷酸中的那些k聚体的k聚体。经修饰多核苷酸中的不同k聚体能够从靶多核苷酸中的k聚体产生不同的电流测量，且因此经修饰多核苷酸提供来自靶多核苷酸的不同信息。来自经修饰多核苷酸的额外信息可使得其更容易表征靶多核苷酸。在一些例子中，经修饰多核苷酸自身可以更容易进行表征。举例来说，经修饰多核苷酸可以设计成包括在其电流测量之间具有增加的分隔或清楚的分隔的k聚体，或具有噪声减少的k聚体。

当形成经修饰多核苷酸时，聚合酶优选地用不同核苷酸物种置换靶多核苷酸中的两个或更多个核苷酸物种。聚合酶可用独特的核苷酸物种置换靶多核苷酸中的两个或更多个核苷酸物种中的每一个。聚合酶可用相同的核苷酸物种置换靶多核苷酸中的两个或更多个核苷酸物种中的每一个。

如果靶多核苷酸是DNA，那么经修饰多核苷酸中的不同核苷酸物种通常包含不同于腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或甲基胞嘧啶的核碱基，和/或包含不同于脱氧腺苷、脱氧鸟苷、胸苷、脱氧胞苷或脱氧甲基胞苷的核苷。如果靶多核苷酸是RNA，那么经修饰多核苷酸中的不同核苷酸物种通常包含不同于腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶或甲基胞嘧啶的核碱基，和/或包含不同于腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷或甲基胞苷的核苷。不同核苷酸物种可以是上文所论述的任一个通用核苷酸。

聚合酶可用不同核苷酸物种来置换一或多个核苷酸物种，所述不同核苷酸物种包含一或多个核苷酸物种缺乏的化学基团或原子。化学基团可以是丙炔基、硫基、氧代基、甲基、羟甲基、甲酰基、羧基、羰基、苯甲基、炔丙基或炔丙胺基。

聚合酶可用不同核苷酸物种来置换一或多个核苷酸物种，所述不同核苷酸物种缺乏一或多个核苷酸物种中存在的化学基团或原子。聚合酶可用具有电负性改变的不同核苷酸物种来置换核苷酸物种中的一或多个。具有电负性改变的不同核苷酸物种优选地包含卤素原子。

方法优选地进一步包含从经修饰多核苷酸中的一或多个不同核苷酸物种选择性地移除核碱基。

其它表征方法

在另一个实施方案中，多核苷酸的特征在于检测作为聚合酶释放的标记物质将核苷酸掺入多核苷酸中。聚合酶使用多核苷酸作为模板。各标记的物种对各核苷酸具有特异性。使多核苷酸与本文所述的修饰的促胰液素纳米孔、聚合酶和标记核苷酸接触，使得磷酸标记的物种在将核苷酸通过聚合酶添加到多核苷酸中时依序释放，其中磷酸物种含有对各核苷酸具有特异性的标记。聚合酶可以是上文所论述的那些聚合酶中的任一个。使用所述孔检测磷酸标记物种，且从而表征多核苷酸。这种方法类型公开于欧洲申请第13187149.3(公开为EP2682460)号中。上文所讨论的实施方案中的任一个同样适用于这种方法。

样品

包含待检测或表征的分析物的任何合适的样品可以进行本文所述的任何方法。本文描述的方法可以在已知含有或怀疑含有分析物的两个或更多个样品上进行。或者，该方法可以在两个或更多个样品上进行，以确认其中样品中存在的已知或预期的两种或更多种分析物的特性。在一些实施方案中，可以对样品进行该方法以区分双链多核苷酸与单链多核苷酸。

第一样品和/或第二样品可以是生物样品。可使用从任何生物体或微生物获得或提取的样品在活体外进行本文所述的方法。第一样品和/或第二样品可以是非生物样品。非生物样品可以是流体样品。非生物样品的实例包括手术液；水，如饮用水、海水或河水；以及实验室测试用试剂。

通常在于本文所述方法中使用之前处理第一样品和/或第二样品，例如通过离心或通过穿过滤出不需要的分子或细胞(如红细胞)的膜。第一样品和/或第二样品可以在获取之后立即测量。通常还可以在分析之前，优选在低于-70C下储存第一样品和/或第二样品。

试剂盒

本公开的另一方面还提供了试剂盒，例如，用于表征靶分析物，例如靶多核苷酸、多肽或配体。该试剂盒包含本文所述的任何一种修饰的促胰液素纳米孔和膜的组分。膜优选地由组分形成。修饰的促胰液素纳米孔优选存在于膜中。试剂盒可以包含上文所公开的任何膜的组分，所述膜例如两亲层或三嵌段共聚物膜。

试剂盒可以进一步包含酶，例如多核苷酸结合蛋白或配体结合蛋白。

试剂盒可进一步包含用于使分析物(例如多核苷酸、多肽或配体)与膜偶联的一或多个锚。

试剂盒可以另外包含一种或多种能够实施上述任何实施例的其它试剂或仪器。此类试剂或仪器可包括以下中的一或多个：合适缓冲液(水性溶液)、例如从受试者获得样本的装置(如包含针的容器或仪器)、用于扩增多核苷酸和/或表达蛋白质或多核苷酸的装置，或电压或贴片钳设备。试剂可以以干态存在于试剂盒中，使得流体样品使试剂再悬浮。试剂盒还可以任选地包含使所述试剂盒能够用于本文所述的方法的说明书或关于所述方法可以用于何种生物体的详情。

装置

本文描述的另一方面还提供了一种装置，例如，用于表征目标分析物，例如多核苷酸、多肽或配体。该装置包括多个如本文所述的经修饰的促胰液素纳米孔和多个膜。在一些实施方案中，多个修饰的促胰液素纳米孔存在于多个膜中。在一些实施方案中，修饰的促胰液素纳米孔和膜的数量相等。在一个实施方案中，每个膜中存在单个修饰的促胰液素纳米孔。

在一些实施方案中，装置包括含有水溶液的腔室(例如，微孔)，所述水溶液中设置有膜，所述膜包含如本文所述的经修饰的促胰液素纳米孔。在一些实施方案中，装置可包括腔室阵列(例如，微孔阵列)，每个腔室包含水溶液，其中设置有包含如本文所述的经修饰的促胰液素纳米孔的膜。在一些实施方案中，装置可包括室阵列(例如，微孔阵列)，每个室包含水溶液，其中设置有包含纳米孔的膜。在这些实施方案中，至少一个纳米孔是如本文所述的经修饰的促胰液素纳米孔，并且剩余的纳米孔可以是本领域已知的非促胰液素纳米孔，例如但不限于CsgG纳米孔(例如，如WO 2016/034591中所述)；α-溶血素纳米孔(例如，如WO2010/004273中所述)；lysenin纳米孔(例如，如WO2013/153359中所述)；Msp纳米孔(例如，如WO2012/107778；WO2015/166275；和WO2016/055778中所述)。因此，在这种阵列中可以存在多于一种类型的纳米孔。

在一些实施方案中，该装置可进一步包含水溶液中的分析物。在分析物是多核苷酸的一些实施方案中，该装置可以进一步包含多核苷酸结合蛋白，例如解旋酶、外切核酸酶或聚合酶。多核苷酸结合蛋白可以与多核苷酸结合。在一些实施方案中，多核苷酸结合蛋白可以位于膜的顺式侧，并且多核苷酸结合蛋白可以与纳米孔的顺式开口接触(通过例如离子和/或疏水相互作用)或共价连接。在一些实施方案中，多核苷酸结合蛋白可以位于膜的反式侧，并且多核苷酸结合蛋白可以与纳米孔的反式开口接触(通过例如离子和/或疏水相互作用)或共价连接。

该装置还可以包括用于执行本文所述的任何方法的指令。设备可以是用于多核苷酸分析的任何常规设备，如阵列或芯片。以上参考所述方法讨论的任何实施方案，例如，用于表征靶多核苷酸的，同样适用于本文所述的装置。所述装置可以进一步包括本文的试剂盒中存在的特征中的任一个。

在一些实施方案中，装置被设置为实施本文所述的任何方法，例如，用于表征靶分析物，例如靶多核苷酸。

在一个实施方案中，所述装置包括：(a)传感器装置，其能够支持多个经修饰的促胰液素纳米孔和膜，并且可操作以使用纳米孔和膜进行多核苷酸表征；及(b)至少一个端口，用于递送进行表征的材料。

或者，该装置可包括：(a)传感器装置，其能够支持多个经修饰的促胰液素纳米孔和膜，并且可操作以使用纳米孔和膜进行多核苷酸表征；和(b)至少一个储存器，用于容纳用于进行表征的材料。

在另一个实施方案中，所述装置可包括：(a)传感器装置，其能够支撑所述膜和多个经修饰的促胰液素纳米孔和膜，并且可操作以使用所述孔和膜进行多核苷酸表征；(b)至少一个储存器，用于容纳进行表征的材料；(c)流体系统，其配置成可控制地将来自至少一个储存器的材料供应到传感器装置；和(d)一个或多个用于接收相应样品的容器，该流体系统被配置成选择性地将样品从一个或多个容器供应到传感器装置。

该装置可以是国际申请PCT/GB08/004127(公布为WO2009/077734)、PCT/GB10/000789(公布为WO 2010/122293)、国际申请PCT/GB10/002206(公布为WO2011/067559)或国际申请PCT/US99/25679(公布为WO 00/28312)中描述的任一种，其各自的内容通过引用并入本文。

无需进一步详细说明，相信本领域技术人员基于以上描述可以最充分地利用本公开。因此，以下具体实施方案应被解释为仅是说明性的，并且不以任何方式限制本公开的其余部分。出于本文引用的目的或主题，本文引用的所有出版物均通过引用并入。

实施例1：用于表达和纯化修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽例如修饰的InvG纳米 孔亚基多肽的示例性方法

将含有编码修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽(例如，如SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列，其具有一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30或更多和最多50个本文所述的氨基酸修饰))的基因的具有C末端六组氨酸(His)标签的氨苄青霉素抗性pT7载体和含有编码InvH蛋白(将增强InvG表达的20Kd蛋白)的基因的卡那霉素抗性pRham载体共转化到C43DE3pLysS细胞中，并在含有氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(30μg/ml)的琼脂平板上铺板，并在37℃生长过夜。使用单个菌落接种含有氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(30μg/ml)的TB培养基的100ml起子培养物。将培养物在250rpm下于37℃下搅拌18小时。15ml起子培养物用于接种含有氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(30μg/ml)的500mlTB培养基中，并将培养物在37℃以250rpm生长，直到OD在600nm处达到0.6。将温度降低至18℃和将培养物平衡至降低的温度1小时。加入IPTG至终浓度为0.5mM，加入鼠李糖至0.2％以诱导蛋白质产生。将培养物在18℃以250rpm孵育18个小时。通过在6000g离心20分钟收获培养物。通过重悬于7.5ml每1g沉淀的25mM HEPES、500mM NaCl、15mM咪唑、蛋白酶抑制剂、25单位/ml Benzonase核酸酶、0.01％DDM pH7.5中并将其混合均匀来裂解细胞沉淀。然后通过超声处理裂解重悬的沉淀(15个循环的20秒开/20秒关，15个循环)。通过以50,000g离心1小时分离裂解物。将上清液通过0.22μm过滤器过滤，并施加到1mL His阱粗柱上。按照制造商的说明，用AKTA系统纯化蛋白质，使用25mM HEPES、500mM NaCl、15mM咪唑、0.01％DDMpH7.5作为上样缓冲液；25mM HEPES、500mM NaCl、75mM咪唑、0.01％DDMpH7.5作为洗涤缓冲液；和25mM HEPES、500mM NaCl、500mM咪唑、0.01％DDM pH7.5作为洗脱缓冲液。

进行SDS Page以确定存在正确的蛋白质。然后合并洗脱的级分并浓缩，例如，通过30kD MWCO Amicon离心柱。根据制造商的说明，使用25mM HEPES，500mM NaCl，0.001％DDMpH7.5作为缓冲液A，将蛋白质用于S200增量柱的SEC层析。目标蛋白质以适当分子量分数的单峰洗脱。例如，修饰的InvG纳米孔亚基多肽可具有约40kDa至约70kDa的分子量(其可根据SEC层析的洗脱条件而变化)。合并洗脱级分并在热振荡器中与卵磷脂脂质体在37℃下温育3小时，伴随温和的混合。然后将样品在20,000G下旋转20分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于25mM HEPES、500mM NaCl、0.1％SDS pH7.5中。再悬浮之后，将样品在60°下加热15分钟，并于20,000g离心10分钟。根据制造商的说明，将上清液在SW TOSOH G4000柱上进行SEC以选择低聚物。

实施例2用于表达和纯化包含内肽酶切割位点的修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽 的示例性方法

将具有C末端六组氨酸标签的含有编码修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽的基因的氨苄青霉素抗性pT7载体——其包含内肽酶切割位点，例如烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶切割位点(例如，SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，其具有一个或更多(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30或更多和最多50个本文所述的氨基酸修饰))——转化到C43DE3pLysS细胞中，并在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的琼脂平板上铺板。使用单个菌落接种含有氨苄青霉素(100μg/ml)的TB培养基的100ml起子培养物。将培养物在250rpm下于37℃下搅拌18小时。15ml起子培养物用于接种含有氨苄青霉素(100μg/ml)的500ml TB培养基中，并将培养物在37℃以250rpm生长，直到OD在600nm处达到0.6。将温度降低至18℃和将培养物平衡至降低的温度1小时。加入IPTG至终浓度为0.5mM以诱导蛋白质产生。将培养物在18℃以250rpm孵育18小时，并在6000克通过离心收获20分钟。通过重悬于7.5ml每1g沉淀的25mMHEPES、500mM NaCl、15mM咪唑、蛋白酶抑制剂、25单位/ml Benzonase核酸酶、和0.01％DDMpH7.5中并将其混合均匀来裂解细胞沉淀。然后通过超声处理裂解重悬的沉淀(15个循环的20秒开/20秒关，15个循环)。通过以50,000g离心1小时分离裂解物。将上清液通过0.22μm过滤器过滤，并施加到1mL His阱粗柱上。按照制造商的说明，用AKTA系统纯化蛋白质，使用25mM HEPES、500mM NaCl、15mM咪唑和0.01％DDM pH7.5作为上样缓冲液；25mM HEPES、500mMNaCl、75mM咪唑和0.01％DDM pH7.5作为洗涤缓冲液；和25mM HEPES、500mM NaCl、500mM咪唑和0.01％DDM pH7.5作为洗脱缓冲液。

进行SDS Page以确定存在正确的蛋白质。然后通过30kD MWCO Amicon离心柱合并洗脱的级分并浓缩。根据制造商的说明，使用25mM HEPES、500mM NaCl和0.001％DDM pH7.5作为缓冲液A，将蛋白质用于S200增量柱的SEC层析。目标蛋白质以适当分子量分数的单峰洗脱。例如，修饰的InvG纳米孔亚基多肽可具有约40kDa至约70kDa的分子量(其可根据SEC层析的洗脱条件而变化)。合并洗脱级分。将His标记的TEV蛋白酶加入到0.2mg/ml的最终浓度，使样品在4℃下孵育18小时，以从修饰的促胰液素纳米孔亚基的其余部分除去位于载体序列内的内肽酶切割位点的上游的肽结构域(例如，InvG蛋白的N0和N1结构域)。将样品重新施加到捕集柱上并收集流出物。将流出级分在热振荡器中与卵磷脂脂质体在37℃下温育3小时，伴随温和的混合。然后将样品在20,000G下旋转20分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于25mM HEPES、500mM NaCl和0.1％SDS pH7.5中。再悬浮之后，将样品在60°下加热15分钟，并于20,000g离心10分钟。根据制造商的说明，在SW TOSOH G4000柱上将上清液用于SEC，以选择低聚物。

实施例3 GspD突变体的设计、表达和纯化

使用SEQ ID NO：32中所示的霍乱弧菌GspD序列作为起始序列，如下表所示设计GspD突变体。

表1：DNA捕获突变体

表2：增加中央门的收缩尺寸

*被选为进一步突变设计的背景

表3：稳定中央门

表4：稳定帽门：去除电荷

表5：稳定帽门

表6：收缩和帽极端突变体

使用NEB纯表达试剂盒体外表达和纯化GspD突变体。设定反应如下所示。

表7：反应混合物

组分	体积(μL)
		溶液A	10
溶液B	7.5
		35S蛋氨酸	1
利福平	0.8
		水	4
卵磷脂囊泡	20μl(作为沉淀旋转)
		DNA	1.5

初始反应混合物的体积为25μL。将反应混合物在37℃下在热混合器中温育3小时。温育后，将管在22000g离心10分钟，弃去上清液。将沉淀中存在的蛋白质重新悬浮在1xlaemmli缓冲液中，并在55V下在5％Tris-HCl凝胶中过夜。然后将凝胶干燥并暴露于MR膜过夜。然后处理膜并观察凝胶中的蛋白质。从凝胶上切下蛋白质的寡聚条带，并重悬于100mM Tris、50mM NaCl、0.1％两性洗涤液pH8中。

实施例4电生理学装置

设置实验涉及两个单独的步骤，i)制备含有多个本体共聚物膜的孔的芯片以插入单个GspD突变体纳米孔并准备用于测序，和ii)DNA样品制备，将其加入芯片用于测序。以下解释用于这两个步骤的材料和方法。

在体外表达并纯化GspD突变体，并储存在含有100mM Tris、50mM NaCl、0.1％两性洗涤剂pH8的缓冲液中。使用25mM磷酸钾、150mM亚铁氰化钾(II)、150mM铁氰化钾(III)，pH8.0缓冲液将这些突变孔稀释至1：1000，并加入到芯片中以在每个孔中获得单个孔。孔插入后，用1mL的25mM磷酸钾缓冲液、150mM亚铁氰化钾(II)、150mM铁氰化钾(III)的pH8.0缓冲液洗涤芯片以除去过量的GspD孔。当需要时，使用记录了在25mV交替电位步骤中在-25mV至-200mV和25mV至200mV范围内的不同电位的电流的脚本进行IV曲线测量。用500mL的测序混合液冲洗芯片两次，所述测序混合液含有470mM KCl、25mM HEPES、11mM ATP和10mMMgCl2，pH8.0。该芯片现已准备好进行测序。

同时，对于3.6kb实验，准备DNA样品用于测序。将1μg DNA分析物与40nM的衔接子混合物(含有预结合至衔接子的E8解旋酶)和平头TA接合酶一起培育10分钟。接着，使用Spri纯化，纯化接合反应混合物，以移除未接合的游离衔接子。将最终连接的混合物在含有40mM CAPS pH10,40mM KCl，400nM胆固醇系链的25μL洗脱缓冲液中洗脱。对于各芯片，将6μl DNA-衔接子接合的混合物与测序混合液(最终体积，75μL)混合，且添加到芯片，以用于测序。接着，在180mV下进行实验6小时。

对于静态链实验，将生物素化的静态链与1：1比例的单价链霉抗生物素蛋白一起温育10分钟。将静态链在470mM KCL，25mM HEPES，pH8中制成1mM终浓度。然后将150μl链加入芯片中用于静态链实验。用于静态链实验的孔是GspD-Vch-(WT-N467G/N468S-Del((N1-K239)/(N265-SGS-E282)))。

结果显示在下表和图14至19中。基线孔是GspD-Vch-(WT-del(N1-K239)/(N265-SGS-E282)))。选择该孔作为基线。该孔在IVTT中表达甚至在两个结构域(1-238)以及收缩位点265-282从N3结构域缺失之后。它是在C13缓冲区中在200pA附近的-180mV的开孔，尽管开孔电流的增加经常出现尖峰。它具有不对称的IV曲线不对称，使得孔在负电位中保持开放并且在正电位中闭合。它具有非线性IV曲线，开孔电流随电位增加而增加。

表8：突变GspD孔的特征

*被选为进一步突变设计的背景

表9：突变GspD孔的特征

*被选为进一步突变设计的背景

其他实施方案

本说明书中公开的所有特征可以任意组合。本说明书中公开的每个特征可以用用于相同、等效或类似目的替代特征代替。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是一系列等效或类似特征的实例。

从以上描述中，本领域技术人员可以容易地确定本公开的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以对本公开进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此，其他实施方案也在权利要求内。

等效方案

尽管本文已经描述和说明了本发明的若干个实施方案，但本领域普通技术人员将容易想到用于执行本文描述的功能和/或获得这些结果和/或这些优点中的一个或多个优点的各种其它装置和/或结构，并且此类变型和/或修改中的每一个被认为是在本文所述的发明实施方案的范围内。更一般来讲，本领域的技术人员将容易认识到，本文中描述的所有参数、尺寸、材料以及构造意味着是示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或构造将取决于发明传授内容所用于的一种或多种具体应用。本领域的技术人员仅仅使用常规实验将认识到或能够确认本文中描述的本发明的具体实施例的许多等效物。因此，应理解，前述实施例是仅通过实例方式来介绍的，并且在所附权利要求和其等效物的范围内，发明实施方案可以按与具体描述和要求不同的方式来实践。本公开的发明实施方案涉及本文中描述的每个单独的特征、系统、物品、材料和/或方法。此外，两个或更多个这样的特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合，如果这样的特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法并不相互矛盾，被包含在本公开的发明范围内。

如本文定义和使用的所有定义应理解为先于字典定义，通过引用并入的文献中的定义，和/或所定义的术语的普通含义。

本文公开的所有参考文献、专利和专利申请均通过引用关于各自所引用的主题而并入本文，在某些情况下可涵盖整个文件。

除非明确相反指出，否则本说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一”和“一个”应理解为表示“至少一个”。

如本文在说明书中使用的，短语“和/或”应当理解为是指这样联合的要素中的“任一个或两个”，即，要素在一些情况下共同存在而在其它情况下分开存在。用“和/或”列出的多个要素应以相同的方式解释，即“一个或多个”如此结合的要素。除了用“和/或”短语具体标识的要素，其它要素可以任选地存在，无论是与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，当连同开放式语言，如“包含”使用时，提到“A和/或B”，在一个实施方案中，可以指仅有A(任选地包括除了B之外的要素)；在另一个实施方案中，指仅有B(任选地包括除了A之外的要素)；在又另一个实施方案中，指A和B两者(任选地包括其他要素)；等等。

如本文中在本说明书和权利要求中所使用的，“或”应被理解为具有与如上所定义的“和/或”相同的含义。例如，当将列表中的项目分开时，“或”或“和/或”应被解释为包容性的，即包括多个要素或要素清单中的至少一个要素、而且还包括多于一个要素，以及可选地其它未列出的项。仅仅清楚地指示相反的用语，如“……中的仅一个”或“……中的确切一个”或者在权利要求中使用时“由……组成”将指包括多个要素或要素清单中的恰好一个要素。一般而言，当之前有排他性术语、比如“任一个”、“……之一”、“……中的仅一个”、或“……中的确切一个”时，本文中使用的用语“或”应当仅被解释为指示排他性替代品(即，“一个或另一个、而不是两个”)。当在权利要求中使用时，“基本上由……组成”应当具有如在专利法领域中所使用的普通含义。

如在本说明书和权利要求中所使用的，关于一个或多个要素的清单的短语“至少一个”应被理解为是指选自要素清单中的任一个或多个要素的至少一个要素、但不一定包括要素清单内具体列出的每一个要素的至少一个、并且不排除要素清单中要素的任何组合。这个定义还允许可以可选地存在除了在短语“至少一个”所指的要素清单内具体标识的要素之外的要素，而无论是否与具体标识的那些元素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等效地，“A或B中的至少一个”，或等效地“A和/或B中的至少一个”)在一个实施例中可以是指至少一个、任选地包括多于一个A，而不存在B(并且任选地包括除了B的元件)；在另一个实施例中，可以是指至少一个、任选地包括多于一个B，而不存在A(并且任选地包括除了A的元件)；在又另一个实施例中，可以是指至少一个、任选地包括多于一个A，以及至少一个、任选地包括多于一个B(并且任选地包括其它元件)；等。

还应该理解，除非明确指出相反，否则在本文要求保护的包括一个以上步骤或操作的任何方法中，该方法的步骤或操作的顺序不一定限于叙述的该方法的步骤或步骤的顺序。

序列表

<110> 牛津纳米孔技术公司

<120> 修饰的纳米孔、包含其的组合物及其用途

<130> N412869WO

<150> US62/457,483

<151> 2017-02-10

<160> 40

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 391

<212> PRT

<213> 肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)

<400> 1

Gly Ile Glu Leu Gly Arg Gln Lys Ile Gly Val Met Arg Leu Asn Asn

1 5 10 15

Thr Phe Val Gly Asp Arg Thr Tyr Asn Leu Arg Asp Gln Lys Met Val

20 25 30

Ile Pro Gly Ile Ala Thr Ala Ile Glu Arg Leu Leu Gln Gly Glu Glu

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Phe Ser Ala Asn Gly Glu Lys Gly Lys Ala Ala Asn Tyr Ala Gly Gly

65 70 75 80

Met Ser Leu Gln Glu Ala Leu Lys Gln Asn Ala Ala Ala Gly Asn Ile

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Lys Ile Val Ala Tyr Pro Asp Thr Asn Ser Leu Leu Val Lys Gly Thr

100 105 110

Ala Glu Gln Val His Phe Ile Glu Met Leu Val Lys Ala Leu Asp Val

115 120 125

Ala Lys Arg His Val Glu Leu Ser Leu Trp Ile Val Asp Leu Asn Lys

130 135 140

Ser Asp Leu Glu Arg Leu Gly Thr Ser Trp Ser Gly Ser Ile Thr Ile

145 150 155 160

Gly Asp Lys Leu Gly Val Ser Leu Asn Gln Ser Ser Ile Ser Thr Leu

165 170 175

Asp Gly Ser Arg Phe Ile Ala Ala Val Asn Ala Leu Glu Glu Lys Lys

180 185 190

Gln Ala Thr Val Val Ser Arg Pro Val Leu Leu Thr Gln Glu Asn Val

195 200 205

Pro Ala Ile Phe Asp Asn Asn Arg Thr Phe Tyr Thr Lys Leu Ile Gly

210 215 220

Glu Arg Asn Val Ala Leu Glu His Val Thr Tyr Gly Thr Met Ile Arg

225 230 235 240

Val Leu Pro Arg Phe Ser Ala Asp Gly Gln Ile Glu Met Ser Leu Asp

245 250 255

Ile Glu Asp Gly Asn Asp Lys Thr Pro Gln Ser Asp Thr Thr Thr Ser

260 265 270

Val Asp Ala Leu Pro Glu Val Gly Arg Thr Leu Ile Ser Thr Ile Ala

275 280 285

Arg Val Pro His Gly Lys Ser Leu Leu Val Gly Gly Tyr Thr Arg Asp

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Ala Asn Thr Asp Thr Val Gln Ser Ile Pro Phe Leu Gly Lys Leu Pro

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Leu Ile Gly Ser Leu Phe Arg Tyr Ser Ser Lys Asn Lys Ser Asn Val

325 330 335

Val Arg Val Phe Met Ile Glu Pro Lys Glu Ile Val Asp Pro Leu Thr

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Pro Asp Ala Ser Glu Ser Val Asn Asn Ile Leu Lys Gln Ser Gly Ala

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Trp Ser Gly Asp Asp Lys Leu Gln Lys Trp Val Arg Val Tyr Leu Asp

370 375 380

Arg Gly Gln Glu Ala Ile Lys

385 390

<210> 2

<211> 562

<212> PRT

<213> 肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)

<400> 2

Met Lys Thr His Ile Leu Leu Ala Arg Val Leu Ala Cys Ala Ala Leu

1 5 10 15

Val Leu Val Thr Pro Gly Tyr Ser Ser Glu Lys Ile Pro Val Thr Gly

20 25 30

Ser Gly Phe Val Ala Lys Asp Asp Ser Leu Arg Thr Phe Phe Asp Ala

35 40 45

Met Ala Leu Gln Leu Lys Glu Pro Val Ile Val Ser Lys Met Ala Ala

50 55 60

Arg Lys Lys Ile Thr Gly Asn Phe Glu Phe His Asp Pro Asn Ala Leu

65 70 75 80

Leu Glu Lys Leu Ser Leu Gln Leu Gly Leu Ile Trp Tyr Phe Asp Gly

85 90 95

Gln Ala Ile Tyr Ile Tyr Asp Ala Ser Glu Met Arg Asn Ala Val Val

100 105 110

Ser Leu Arg Asn Val Ser Leu Asn Glu Phe Asn Asn Phe Leu Lys Arg

115 120 125

Ser Gly Leu Tyr Asn Lys Asn Tyr Pro Leu Arg Gly Asp Asn Arg Lys

130 135 140

Gly Thr Phe Tyr Val Ser Gly Pro Pro Val Tyr Val Asp Met Val Val

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Asn Ala Ala Thr Met Met Asp Lys Gln Asn Asp Gly Ile Glu Leu Gly

165 170 175

Arg Gln Lys Ile Gly Val Met Arg Leu Asn Asn Thr Phe Val Gly Asp

180 185 190

Arg Thr Tyr Asn Leu Arg Asp Gln Lys Met Val Ile Pro Gly Ile Ala

195 200 205

Thr Ala Ile Glu Arg Leu Leu Gln Gly Glu Glu Gln Pro Leu Gly Asn

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225 230 235 240

Glu Lys Gly Lys Ala Ala Asn Tyr Ala Gly Gly Met Ser Leu Gln Glu

245 250 255

Ala Leu Lys Gln Asn Ala Ala Ala Gly Asn Ile Lys Ile Val Ala Tyr

260 265 270

Pro Asp Thr Asn Ser Leu Leu Val Lys Gly Thr Ala Glu Gln Val His

275 280 285

Phe Ile Glu Met Leu Val Lys Ala Leu Asp Val Ala Lys Arg His Val

290 295 300

Glu Leu Ser Leu Trp Ile Val Asp Leu Asn Lys Ser Asp Leu Glu Arg

305 310 315 320

Leu Gly Thr Ser Trp Ser Gly Ser Ile Thr Ile Gly Asp Lys Leu Gly

325 330 335

Val Ser Leu Asn Gln Ser Ser Ile Ser Thr Leu Asp Gly Ser Arg Phe

340 345 350

Ile Ala Ala Val Asn Ala Leu Glu Glu Lys Lys Gln Ala Thr Val Val

355 360 365

Ser Arg Pro Val Leu Leu Thr Gln Glu Asn Val Pro Ala Ile Phe Asp

370 375 380

Asn Asn Arg Thr Phe Tyr Thr Lys Leu Ile Gly Glu Arg Asn Val Ala

385 390 395 400

Leu Glu His Val Thr Tyr Gly Thr Met Ile Arg Val Leu Pro Arg Phe

405 410 415

Ser Ala Asp Gly Gln Ile Glu Met Ser Leu Asp Ile Glu Asp Gly Asn

420 425 430

Asp Lys Thr Pro Gln Ser Asp Thr Thr Thr Ser Val Asp Ala Leu Pro

435 440 445

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Lys Ser Leu Leu Val Gly Gly Tyr Thr Arg Asp Ala Asn Thr Asp Thr

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Val Gln Ser Ile Pro Phe Leu Gly Lys Leu Pro Leu Ile Gly Ser Leu

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515 520 525

Ser Val Asn Asn Ile Leu Lys Gln Ser Gly Ala Trp Ser Gly Asp Asp

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Lys Leu Gln Lys Trp Val Arg Val Tyr Leu Asp Arg Gly Gln Glu Ala

545 550 555 560

Ile Lys

<210> 3

<211> 569

<212> PRT

<213> 肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)

<400> 3

Met Lys Thr His Ile Leu Leu Ala Arg Val Leu Ala Cys Ala Ala Leu

1 5 10 15

Val Leu Val Thr Pro Gly Tyr Ser Ser Glu Lys Ile Pro Val Thr Gly

20 25 30

Ser Gly Phe Val Ala Lys Asp Asp Ser Leu Arg Thr Phe Phe Asp Ala

35 40 45

Met Ala Leu Gln Leu Lys Glu Pro Val Ile Val Ser Lys Met Ala Ala

50 55 60

Arg Lys Lys Ile Thr Gly Asn Phe Glu Phe His Asp Pro Asn Ala Leu

65 70 75 80

Leu Glu Lys Leu Ser Leu Gln Leu Gly Leu Ile Trp Tyr Phe Asp Gly

85 90 95

Gln Ala Ile Tyr Ile Tyr Asp Ala Ser Glu Met Arg Asn Ala Val Val

100 105 110

Ser Leu Arg Asn Val Ser Leu Asn Glu Phe Asn Asn Phe Leu Lys Arg

115 120 125

Ser Gly Leu Tyr Asn Lys Asn Tyr Pro Leu Arg Gly Asp Asn Arg Lys

130 135 140

Gly Thr Phe Tyr Val Ser Gly Pro Pro Val Tyr Val Asp Met Val Val

145 150 155 160

Asn Ala Ala Thr Met Met Asp Lys Gln Asn Asp Glu Asn Leu Tyr Phe

165 170 175

Gln Gly Gly Ile Glu Leu Gly Arg Gln Lys Ile Gly Val Met Arg Leu

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Asn Asn Thr Phe Val Gly Asp Arg Thr Tyr Asn Leu Arg Asp Gln Lys

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Met Val Ile Pro Gly Ile Ala Thr Ala Ile Glu Arg Leu Leu Gln Gly

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Pro Ala Phe Ser Ala Asn Gly Glu Lys Gly Lys Ala Ala Asn Tyr Ala

245 250 255

Gly Gly Met Ser Leu Gln Glu Ala Leu Lys Gln Asn Ala Ala Ala Gly

260 265 270

Asn Ile Lys Ile Val Ala Tyr Pro Asp Thr Asn Ser Leu Leu Val Lys

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Gly Thr Ala Glu Gln Val His Phe Ile Glu Met Leu Val Lys Ala Leu

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Asn Lys Ser Asp Leu Glu Arg Leu Gly Thr Ser Trp Ser Gly Ser Ile

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Thr Ile Gly Asp Lys Leu Gly Val Ser Leu Asn Gln Ser Ser Ile Ser

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Ile Ala Arg Val Pro His Gly Lys Ser Leu Leu Val Gly Gly Tyr Thr

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485 490 495

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Asn Val Val Arg Val Phe Met Ile Glu Pro Lys Glu Ile Val Asp Pro

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Leu Thr Pro Asp Ala Ser Glu Ser Val Asn Asn Ile Leu Lys Gln Ser

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Gly Ala Trp Ser Gly Asp Asp Lys Leu Gln Lys Trp Val Arg Val Tyr

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Leu Asp Arg Gly Gln Glu Ala Ile Lys

565

<210> 4

<211> 650

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 4

Met Lys Gly Leu Asn Lys Ile Thr Cys Cys Leu Leu Ala Ala Leu Leu

1 5 10 15

Met Pro Cys Ala Gly His Ala Glu Asn Glu Gln Tyr Gly Ala Asn Phe

20 25 30

Asn Asn Ala Asp Ile Arg Gln Phe Val Glu Ile Val Gly Gln His Leu

35 40 45

Gly Lys Thr Ile Leu Ile Asp Pro Ser Val Gln Gly Thr Ile Ser Val

50 55 60

Arg Ser Asn Asp Thr Phe Ser Gln Gln Glu Tyr Tyr Gln Phe Phe Leu

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Ser Ile Leu Asp Leu Tyr Gly Tyr Ser Val Ile Thr Leu Asp Asn Gly

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Phe Leu Lys Val Val Arg Ser Ala Asn Val Lys Thr Ser Pro Gly Met

100 105 110

Ile Ala Asp Ser Ser Arg Pro Gly Val Gly Asp Glu Leu Val Thr Arg

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Ile Val Pro Leu Glu Asn Val Pro Ala Arg Asp Leu Ala Pro Leu Leu

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Arg Gln Met Met Asp Ala Gly Ser Val Gly Asn Val Val His Tyr Glu

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Pro Ser Asn Val Leu Ile Leu Thr Gly Arg Ala Ser Thr Ile Asn Lys

165 170 175

Leu Ile Glu Val Ile Lys Arg Val Asp Val Ile Gly Thr Glu Lys Gln

180 185 190

Gln Ile Ile His Leu Glu Tyr Ala Ser Ala Glu Asp Leu Ala Glu Ile

195 200 205

Leu Asn Gln Leu Ile Ser Glu Ser His Gly Lys Ser Gln Met Pro Ala

210 215 220

Leu Leu Ser Ala Lys Ile Val Ala Asp Lys Arg Thr Asn Ser Leu Ile

225 230 235 240

Ile Ser Gly Pro Glu Lys Ala Arg Gln Arg Ile Thr Ser Leu Leu Lys

245 250 255

Ser Leu Asp Val Glu Glu Ser Glu Glu Gly Asn Thr Arg Val Tyr Tyr

260 265 270

Leu Lys Tyr Ala Lys Ala Thr Asn Leu Val Glu Val Leu Thr Gly Val

275 280 285

Ser Glu Lys Leu Lys Asp Glu Lys Gly Asn Ala Arg Lys Pro Ser Ser

290 295 300

Ser Gly Ala Met Asp Asn Val Ala Ile Thr Ala Asp Glu Gln Thr Asn

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Ser Leu Val Ile Thr Ala Asp Gln Ser Val Gln Glu Lys Leu Ala Thr

325 330 335

Val Ile Ala Arg Leu Asp Ile Arg Arg Ala Gln Val Leu Val Glu Ala

340 345 350

Ile Ile Val Glu Val Gln Asp Gly Asn Gly Leu Asn Leu Gly Val Gln

355 360 365

Trp Ala Asn Lys Asn Val Gly Ala Gln Gln Phe Thr Asn Thr Gly Leu

370 375 380

Pro Ile Phe Asn Ala Ala Gln Gly Val Ala Asp Tyr Lys Lys Asn Gly

385 390 395 400

Gly Ile Thr Ser Ala Asn Pro Ala Trp Asp Met Phe Ser Ala Tyr Asn

405 410 415

Gly Met Ala Ala Gly Phe Phe Asn Gly Asp Trp Gly Val Leu Leu Thr

420 425 430

Ala Leu Ala Ser Asn Asn Lys Asn Asp Ile Leu Ala Thr Pro Ser Ile

435 440 445

Val Thr Leu Asp Asn Lys Leu Ala Ser Phe Asn Val Gly Gln Asp Val

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Pro Val Leu Ser Gly Ser Gln Thr Thr Ser Gly Asp Asn Val Phe Asn

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Thr Val Glu Arg Lys Thr Val Gly Thr Lys Leu Lys Val Thr Pro Gln

485 490 495

Val Asn Glu Gly Asp Ala Val Leu Leu Glu Ile Glu Gln Glu Val Ser

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Ser Val Asp Ser Ser Ser Asn Ser Thr Leu Gly Pro Thr Phe Asn Thr

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Arg Thr Ile Gln Asn Ala Val Leu Val Lys Thr Gly Glu Thr Val Val

530 535 540

Leu Gly Gly Leu Leu Asp Asp Phe Ser Lys Glu Gln Val Ser Lys Val

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<210> 5

<211> 607

<212> PRT

<213> 小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)

<400> 5

Met Ala Phe Pro Leu His Ser Phe Phe Lys Arg Val Leu Thr Gly Thr

1 5 10 15

Leu Leu Leu Leu Ser Ser Tyr Ser Trp Ala Gln Glu Leu Asp Trp Leu

20 25 30

Pro Ile Pro Tyr Val Tyr Val Ala Lys Gly Glu Ser Leu Arg Asp Leu

35 40 45

Leu Thr Asp Phe Gly Ala Asn Tyr Asp Ala Thr Val Val Val Ser Asp

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Lys Ile Asn Asp Lys Val Ser Gly Gln Phe Glu His Asp Asn Pro Gln

65 70 75 80

Asp Phe Leu Gln His Ile Ala Ser Leu Tyr Asn Leu Val Trp Tyr Tyr

85 90 95

Asp Gly Asn Val Leu Tyr Ile Phe Lys Asn Ser Glu Val Ala Ser Arg

100 105 110

Leu Ile Arg Leu Gln Glu Ser Glu Ala Ala Glu Leu Lys Gln Ala Leu

115 120 125

Gln Arg Ser Gly Ile Trp Glu Pro Arg Phe Gly Trp Arg Pro Asp Ala

130 135 140

Ser Asn Arg Leu Val Tyr Val Ser Gly Pro Pro Arg Tyr Leu Glu Leu

145 150 155 160

Val Glu Gln Thr Ala Ala Ala Leu Glu Gln Gln Thr Gln Ile Arg Ser

165 170 175

Glu Lys Thr Gly Ala Leu Ala Ile Glu Ile Phe Pro Leu Lys Tyr Ala

180 185 190

Ser Ala Ser Asp Arg Thr Ile His Tyr Arg Asp Asp Glu Val Ala Ala

195 200 205

Pro Gly Val Ala Thr Ile Leu Gln Arg Val Leu Ser Asp Ala Thr Ile

210 215 220

Gln Gln Val Thr Val Asp Asn Gln Arg Ile Pro Gln Ala Ala Thr Arg

225 230 235 240

Ala Ser Ala Gln Ala Arg Val Glu Ala Asp Pro Ser Leu Asn Ala Ile

245 250 255

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260 265 270

His Ala Leu Asp Lys Pro Ser Ala Arg Ile Glu Val Ala Leu Ser Ile

275 280 285

Val Asp Ile Asn Ala Asp Gln Leu Thr Glu Leu Gly Val Asp Trp Arg

290 295 300

Val Gly Ile Arg Thr Gly Asn Asn His Gln Val Val Ile Lys Thr Thr

305 310 315 320

Gly Asp Gln Ser Asn Ile Ala Ser Asn Gly Ala Leu Gly Ser Leu Val

325 330 335

Asp Ala Arg Gly Leu Asp Tyr Leu Leu Ala Arg Val Asn Leu Leu Glu

340 345 350

Asn Glu Gly Ser Ala Gln Val Val Ser Arg Pro Thr Leu Leu Thr Gln

355 360 365

Glu Asn Ala Gln Ala Val Ile Asp His Ser Glu Thr Tyr Tyr Val Lys

370 375 380

Val Thr Gly Lys Glu Val Ala Glu Leu Lys Gly Ile Thr Tyr Gly Thr

385 390 395 400

Met Leu Arg Met Thr Pro Arg Val Leu Thr Gln Gly Asp Lys Ser Glu

405 410 415

Ile Ser Leu Asn Leu His Ile Glu Asp Gly Asn Gln Lys Pro Asn Ser

420 425 430

Ser Gly Ile Glu Gly Ile Pro Thr Ile Ser Arg Thr Val Val Asp Thr

435 440 445

Val Ala Arg Val Gly His Gly Gln Ser Leu Ile Ile Gly Gly Ile Tyr

450 455 460

Arg Asp Glu Leu Ser Val Ala Leu Ser Lys Val Pro Leu Leu Gly Asp

465 470 475 480

Ile Pro Tyr Ile Gly Ala Leu Phe Arg Arg Lys Ser Glu Leu Thr Arg

485 490 495

Arg Thr Val Arg Leu Phe Ile Ile Glu Pro Arg Ile Ile Asp Glu Gly

500 505 510

Ile Ala His His Leu Ala Leu Gly Asn Gly Gln Asp Leu Arg Thr Gly

515 520 525

Ile Leu Thr Val Asp Glu Ile Ser Asn Gln Ser Thr Thr Leu Asn Lys

530 535 540

Leu Leu Gly Gly Ser Gln Cys Gln Pro Leu Asn Lys Ala Gln Glu Val

545 550 555 560

Gln Lys Trp Leu Ser Gln Asn Asn Lys Ser Ser Tyr Leu Thr Gln Cys

565 570 575

Lys Met Asp Lys Ser Leu Gly Trp Arg Val Val Glu Gly Ala Cys Thr

580 585 590

Pro Ala Gln Ser Trp Cys Val Ser Ala Pro Lys Arg Gly Val Leu

595 600 605

<210> 6

<211> 566

<212> PRT

<213> 福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)

<400> 6

Met Lys Lys Phe Asn Ile Lys Ser Leu Thr Leu Leu Ile Val Leu Leu

1 5 10 15

Pro Leu Ile Val Asn Ala Asn Asn Ile Asp Ser His Leu Leu Glu Gln

20 25 30

Asn Asp Ile Ala Lys Tyr Val Ala Gln Ser Asp Thr Val Gly Ser Phe

35 40 45

Phe Glu Arg Phe Ser Ala Leu Leu Asn Tyr Pro Ile Val Val Ser Lys

50 55 60

Gln Ala Ala Lys Lys Arg Ile Ser Gly Glu Phe Asp Leu Ser Asn Pro

65 70 75 80

Glu Glu Met Leu Glu Lys Leu Thr Leu Leu Val Gly Leu Ile Trp Tyr

85 90 95

Lys Asp Gly Asn Ala Leu Tyr Ile Tyr Asp Ser Gly Glu Leu Ile Ser

100 105 110

Lys Val Ile Leu Leu Glu Asn Ile Ser Leu Asn Tyr Leu Ile Gln Tyr

115 120 125

Leu Lys Asp Ala Asn Leu Tyr Asp His Arg Tyr Pro Ile Arg Gly Asn

130 135 140

Ile Ser Asp Lys Thr Phe Tyr Ile Ser Gly Pro Pro Ala Leu Val Glu

145 150 155 160

Leu Val Ala Asn Thr Ala Thr Leu Leu Asp Lys Gln Val Ser Ser Ile

165 170 175

Gly Thr Asp Lys Val Asn Phe Gly Val Ile Lys Leu Lys Asn Thr Phe

180 185 190

Val Ser Asp Arg Thr Tyr Asn Met Arg Gly Glu Asp Ile Val Ile Pro

195 200 205

Gly Val Ala Thr Val Val Glu Arg Leu Leu Asn Asn Gly Lys Ala Leu

210 215 220

Ser Asn Arg Gln Ala Gln Asn Asp Pro Met Pro Pro Phe Asn Ile Thr

225 230 235 240

Gln Lys Val Ser Glu Asp Ser Asn Asp Phe Ser Phe Ser Ser Val Thr

245 250 255

Asn Ser Ser Ile Leu Glu Asp Val Ser Leu Ile Ala Tyr Pro Glu Thr

260 265 270

Asn Ser Ile Leu Val Lys Gly Asn Asp Gln Gln Ile Gln Ile Ile Arg

275 280 285

Asp Ile Ile Thr Gln Leu Asp Val Ala Lys Arg His Ile Glu Leu Ser

290 295 300

Leu Trp Ile Ile Asp Ile Asp Lys Ser Glu Leu Asn Asn Leu Gly Val

305 310 315 320

Asn Trp Gln Gly Thr Ala Ser Phe Gly Asp Ser Phe Gly Ala Ser Phe

325 330 335

Asn Met Ser Ser Ser Ala Ser Ile Ser Thr Leu Asp Gly Asn Lys Phe

340 345 350

Ile Ala Ser Val Met Ala Leu Asn Gln Lys Lys Lys Ala Asn Val Val

355 360 365

Ser Arg Pro Val Ile Leu Thr Gln Glu Asn Ile Pro Ala Ile Phe Asp

370 375 380

Asn Asn Arg Thr Phe Tyr Val Ser Leu Val Gly Glu Arg Asn Ser Ser

385 390 395 400

Leu Glu His Val Thr Tyr Gly Thr Leu Ile Asn Val Ile Pro Arg Phe

405 410 415

Ser Ser Arg Gly Gln Ile Glu Met Ser Leu Thr Ile Glu Asp Gly Thr

420 425 430

Gly Asn Ser Gln Ser Asn Tyr Asn Tyr Asn Asn Glu Asn Thr Ser Val

435 440 445

Leu Pro Glu Val Gly Arg Thr Lys Ile Ser Thr Ile Ala Arg Val Pro

450 455 460

Gln Gly Lys Ser Leu Leu Ile Gly Gly Tyr Thr His Glu Thr Asn Ser

465 470 475 480

Asn Glu Ile Ile Ser Ile Pro Phe Leu Ser Ser Ile Pro Val Ile Gly

485 490 495

Asn Val Phe Lys Tyr Lys Thr Ser Asn Ile Ser Asn Ile Val Arg Val

500 505 510

Phe Leu Ile Gln Pro Arg Glu Ile Lys Glu Ser Ser Tyr Tyr Asn Thr

515 520 525

Ala Glu Tyr Lys Ser Leu Ile Ser Glu Arg Glu Ile Gln Lys Thr Thr

530 535 540

Gln Ile Ile Pro Ser Glu Thr Thr Leu Leu Glu Asp Glu Lys Ser Leu

545 550 555 560

Val Ser Tyr Leu Asn Tyr

565

<210> 7

<211> 600

<212> PRT

<213> 铜绿色假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)

<400> 7

Met Arg Arg Leu Leu Ile Gly Gly Leu Leu Ala Leu Leu Pro Gly Ala

1 5 10 15

Val Leu Arg Ala Gln Pro Leu Asp Trp Pro Ser Leu Pro Tyr Asp Tyr

20 25 30

Val Ala Gln Gly Glu Ser Leu Arg Asp Val Leu Ala Asn Phe Gly Ala

35 40 45

Asn Tyr Asp Ala Ser Val Ile Val Ser Asp Lys Val Asn Asp Gln Val

50 55 60

Ser Gly Arg Phe Asp Leu Glu Ser Pro Gln Ala Phe Leu Gln Leu Met

65 70 75 80

Ala Ser Leu Tyr Asn Leu Gly Trp Tyr Tyr Asp Gly Thr Val Leu Tyr

85 90 95

Val Phe Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Arg Leu Val Arg Leu Glu Gln

100 105 110

Val Gly Glu Ala Glu Leu Lys Arg Ala Leu Thr Ala Ala Gly Ile Trp

115 120 125

Glu Pro Arg Phe Gly Trp Arg Ala Asp Pro Ser Gly Arg Leu Val His

130 135 140

Val Ser Gly Pro Gly Arg Tyr Leu Glu Leu Val Glu Gln Thr Ala Gln

145 150 155 160

Val Leu Glu Gln Gln Tyr Thr Leu Arg Ser Glu Lys Thr Gly Asp Leu

165 170 175

Ser Val Glu Ile Phe Pro Leu Arg Tyr Ala Val Ala Glu Asp Arg Lys

180 185 190

Ile Glu Tyr Arg Asp Asp Glu Ile Glu Ala Pro Gly Ile Ala Ser Ile

195 200 205

Leu Ser Arg Val Leu Ser Asp Ala Asn Val Val Ala Val Gly Asp Glu

210 215 220

Pro Gly Lys Leu Arg Pro Gly Pro Gln Ser Ser His Ala Val Val Gln

225 230 235 240

Ala Glu Pro Ser Leu Asn Ala Val Val Val Arg Asp His Lys Asp Arg

245 250 255

Leu Pro Met Tyr Arg Arg Leu Ile Glu Ala Leu Asp Arg Pro Ser Ala

260 265 270

Arg Ile Glu Val Gly Leu Ser Ile Ile Asp Ile Asn Ala Glu Asn Leu

275 280 285

Ala Gln Leu Gly Val Asp Trp Ser Ala Gly Ile Arg Leu Gly Asn Asn

290 295 300

Lys Ser Ile Gln Ile Arg Thr Thr Gly Gln Asp Ser Glu Glu Gly Gly

305 310 315 320

Gly Ala Gly Asn Gly Ala Val Gly Ser Leu Val Asp Ser Arg Gly Leu

325 330 335

Asp Phe Leu Leu Ala Lys Val Thr Leu Leu Gln Ser Gln Gly Gln Ala

340 345 350

Gln Ile Gly Ser Arg Pro Thr Leu Leu Thr Gln Glu Asn Thr Gln Ala

355 360 365

Val Leu Asp Gln Ser Glu Thr Tyr Tyr Val Arg Val Thr Gly Glu Arg

370 375 380

Val Ala Glu Leu Lys Ala Ile Thr Tyr Gly Thr Met Leu Lys Met Thr

385 390 395 400

Pro Arg Val Val Thr Leu Gly Asp Thr Pro Glu Ile Ser Leu Ser Leu

405 410 415

His Ile Glu Asp Gly Ser Gln Lys Pro Asn Ser Ala Gly Leu Asp Lys

420 425 430

Ile Pro Thr Ile Asn Arg Thr Val Ile Asp Thr Ile Ala Arg Val Gly

435 440 445

His Gly Gln Ser Leu Leu Ile Gly Gly Ile Tyr Arg Asp Glu Leu Ser

450 455 460

Gln Ser Gln Arg Lys Val Pro Trp Leu Gly Asp Ile Pro Tyr Leu Gly

465 470 475 480

Ala Leu Phe Arg Thr Thr Ala Asp Thr Val Arg Arg Ser Val Arg Leu

485 490 495

Phe Leu Ile Glu Pro Arg Leu Ile Asp Asp Gly Val Gly His Tyr Leu

500 505 510

Ala Leu Asn Asn Arg Arg Asp Leu Arg Gly Gly Leu Leu Glu Val Asp

515 520 525

Glu Leu Ser Asn Gln Ser Leu Ser Leu Arg Lys Leu Leu Gly Ser Ala

530 535 540

Arg Cys Gln Ala Leu Ala Pro Ala Arg Ala Glu Gln Glu Arg Leu Arg

545 550 555 560

Gln Ala Gly Gln Gly Ser Phe Leu Thr Pro Cys Arg Met Gly Ala Gln

565 570 575

Glu Gly Trp Arg Val Thr Asp Ser Ala Cys Pro Lys Asp Gly Ala Trp

580 585 590

Cys Val Gly Ala Glu Arg Gly Asn

595 600

<210> 8

<211> 512

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 8

Met Lys Lys Ile Ser Phe Phe Ile Phe Thr Ala Leu Phe Cys Cys Ser

1 5 10 15

Ala Gln Ala Ala Pro Ser Ser Leu Glu Lys Arg Leu Gly Lys Asn Glu

20 25 30

Tyr Phe Ile Ile Thr Lys Ser Ser Pro Val Arg Ala Ile Leu Asn Asp

35 40 45

Phe Ala Ala Asn Tyr Ser Ile Pro Val Phe Ile Ser Ser Ser Val Asn

50 55 60

Asp Asp Phe Ser Gly Glu Ile Lys Asn Glu Lys Pro Val Lys Val Leu

65 70 75 80

Glu Lys Leu Ser Lys Leu Tyr His Leu Thr Trp Tyr Tyr Asp Glu Asn

85 90 95

Ile Leu Tyr Ile Tyr Lys Thr Asn Glu Ile Ser Arg Ser Ile Ile Thr

100 105 110

Pro Thr Tyr Leu Asp Ile Asp Ser Leu Leu Lys Tyr Leu Ser Asp Thr

115 120 125

Ile Ser Val Asn Lys Asn Ser Cys Asn Val Arg Lys Ile Thr Thr Phe

130 135 140

Asn Ser Ile Glu Val Arg Gly Val Pro Glu Cys Ile Lys Tyr Ile Thr

145 150 155 160

Ser Leu Ser Glu Ser Leu Asp Lys Glu Ala Gln Ser Lys Ala Lys Asn

165 170 175

Lys Asp Val Val Lys Val Phe Lys Leu Asn Tyr Ala Ser Ala Thr Asp

180 185 190

Ile Thr Tyr Lys Tyr Arg Asp Gln Asn Val Val Val Pro Gly Val Val

195 200 205

Ser Ile Leu Lys Thr Met Ala Ser Asn Gly Ser Leu Pro Ser Thr Gly

210 215 220

Lys Gly Ala Val Glu Arg Ser Gly Asn Leu Phe Asp Asn Ser Val Thr

225 230 235 240

Ile Ser Ala Asp Pro Arg Leu Asn Ala Val Val Val Lys Asp Arg Glu

245 250 255

Ile Thr Met Asp Ile Tyr Gln Gln Leu Ile Ser Glu Leu Asp Ile Glu

260 265 270

Gln Arg Gln Ile Glu Ile Ser Val Ser Ile Ile Asp Val Asp Ala Asn

275 280 285

Asp Leu Gln Gln Leu Gly Val Asn Trp Ser Gly Thr Leu Asn Ala Gly

290 295 300

Gln Gly Thr Ile Ala Phe Asn Ser Ser Thr Ala Gln Ala Asn Ile Ser

305 310 315 320

Ser Ser Val Ile Ser Asn Ala Ser Asn Phe Met Ile Arg Val Asn Ala

325 330 335

Leu Gln Gln Asn Ser Lys Ala Lys Ile Leu Ser Gln Pro Ser Ile Ile

340 345 350

Thr Leu Asn Asn Met Gln Ala Ile Leu Asp Lys Asn Val Thr Phe Tyr

355 360 365

Thr Lys Val Ser Gly Glu Lys Val Ala Ser Leu Glu Ser Ile Thr Ser

370 375 380

Gly Thr Leu Leu Arg Val Thr Pro Arg Ile Leu Asp Asp Ser Ser Asn

385 390 395 400

Ser Leu Thr Gly Lys Arg Arg Glu Arg Val Arg Leu Leu Leu Asp Ile

405 410 415

Gln Asp Gly Asn Gln Ser Thr Asn Gln Ser Asn Ala Gln Asp Ala Ser

420 425 430

Ser Thr Leu Pro Glu Val Gln Asn Ser Glu Met Thr Thr Glu Ala Thr

435 440 445

Leu Ser Ala Gly Glu Ser Leu Leu Leu Gly Gly Phe Ile Gln Asp Lys

450 455 460

Glu Ser Ser Ser Lys Asp Gly Ile Pro Leu Leu Ser Asp Ile Pro Val

465 470 475 480

Ile Gly Ser Leu Phe Ser Ser Thr Val Lys Gln Lys His Ser Val Val

485 490 495

Arg Leu Phe Leu Ile Lys Ala Thr Pro Ile Lys Ser Ala Ser Ser Glu

500 505 510

<210> 9

<211> 497

<212> PRT

<213> 鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)

<400> 9

Met Val Val Asn Lys Arg Leu Ile Leu Ile Leu Leu Phe Ile Leu Asn

1 5 10 15

Thr Ala Lys Ser Asp Glu Leu Ser Trp Lys Gly Asn Asp Phe Thr Leu

20 25 30

Tyr Ala Arg Gln Met Pro Leu Ala Glu Val Leu His Leu Leu Ser Glu

35 40 45

Asn Tyr Asp Thr Ala Ile Thr Ile Ser Pro Leu Ile Thr Ala Thr Phe

50 55 60

Ser Gly Lys Ile Pro Pro Gly Pro Pro Val Asp Ile Leu Asn Asn Leu

65 70 75 80

Ala Ala Gln Tyr Asp Leu Leu Thr Trp Phe Asp Gly Ser Met Leu Tyr

85 90 95

Val Tyr Pro Ala Ser Leu Leu Lys His Gln Val Ile Thr Phe Asn Ile

100 105 110

Leu Ser Thr Gly Arg Phe Ile His Tyr Leu Arg Ser Gln Asn Ile Leu

115 120 125

Ser Ser Pro Gly Cys Glu Val Lys Glu Ile Thr Gly Thr Lys Ala Val

130 135 140

Glu Val Ser Gly Val Pro Ser Cys Leu Thr Arg Ile Ser Gln Leu Ala

145 150 155 160

Ser Val Leu Asp Asn Ala Leu Ile Lys Arg Lys Asp Ser Ala Val Ser

165 170 175

Val Ser Ile Tyr Thr Leu Lys Tyr Ala Thr Ala Met Asp Thr Gln Tyr

180 185 190

Gln Tyr Arg Asp Gln Ser Val Val Val Pro Gly Val Val Ser Val Leu

195 200 205

Arg Glu Met Ser Lys Thr Ser Val Pro Thr Ser Ser Thr Asn Asn Gly

210 215 220

Ser Pro Ala Thr Gln Ala Leu Pro Met Phe Ala Ala Asp Pro Arg Gln

225 230 235 240

Asn Ala Val Ile Val Arg Asp Tyr Ala Ala Asn Met Ala Gly Tyr Arg

245 250 255

Lys Leu Ile Thr Glu Leu Asp Gln Arg Gln Gln Met Ile Glu Ile Ser

260 265 270

Val Lys Ile Ile Asp Val Asn Ala Gly Asp Ile Asn Gln Leu Gly Ile

275 280 285

Asp Trp Gly Thr Ala Val Ser Leu Gly Gly Lys Lys Ile Ala Phe Asn

290 295 300

Thr Gly Leu Asn Asp Gly Gly Ala Ser Gly Phe Ser Thr Val Ile Ser

305 310 315 320

Asp Thr Ser Asn Phe Met Val Arg Leu Asn Ala Leu Glu Lys Ser Ser

325 330 335

Gln Ala Tyr Val Leu Ser Gln Pro Ser Val Val Thr Leu Asn Asn Ile

340 345 350

Gln Ala Val Leu Asp Lys Asn Ile Thr Phe Tyr Thr Lys Leu Gln Gly

355 360 365

Glu Lys Val Ala Lys Leu Glu Ser Ile Thr Thr Gly Ser Leu Leu Arg

370 375 380

Val Thr Pro Arg Leu Leu Asn Asp Asn Gly Thr Gln Lys Ile Met Leu

385 390 395 400

Asn Leu Asn Ile Gln Asp Gly Gln Gln Ser Asp Thr Gln Ser Glu Thr

405 410 415

Asp Pro Leu Pro Glu Val Gln Asn Ser Glu Ile Ala Ser Gln Ala Thr

420 425 430

Leu Leu Ala Gly Gln Ser Leu Leu Leu Gly Gly Phe Lys Gln Gly Lys

435 440 445

Gln Ile His Ser Gln Asn Lys Ile Pro Leu Leu Gly Asp Ile Pro Val

450 455 460

Val Gly His Leu Phe Arg Asn Asp Thr Thr Gln Val His Ser Val Ile

465 470 475 480

Arg Leu Phe Leu Ile Lys Ala Ser Val Val Asn Asn Gly Ile Ser His

485 490 495

Gly

<210> 10

<211> 675

<212> PRT

<213> 霍乱弧菌(Vibrio cholerae)

<400> 10

Met Lys Tyr Trp Leu Lys Lys Ser Ser Trp Leu Leu Ala Gly Ser Leu

1 5 10 15

Leu Ser Thr Pro Leu Ala Met Ala Asn Glu Phe Ser Ala Ser Phe Lys

20 25 30

Gly Thr Asp Ile Gln Glu Phe Ile Asn Ile Val Gly Arg Asn Leu Glu

35 40 45

Lys Thr Ile Ile Val Asp Pro Ser Val Arg Gly Lys Val Asp Val Arg

50 55 60

Ser Phe Asp Thr Leu Asn Glu Glu Gln Tyr Tyr Ser Phe Phe Leu Ser

65 70 75 80

Val Leu Glu Val Tyr Gly Phe Ala Val Val Glu Met Asp Asn Gly Val

85 90 95

Leu Lys Val Ile Lys Ser Lys Asp Ala Lys Thr Ser Ala Ile Pro Val

100 105 110

Leu Ser Gly Glu Glu Arg Ala Asn Gly Asp Glu Val Ile Thr Gln Val

115 120 125

Val Ala Val Lys Asn Val Ser Val Arg Glu Leu Ser Pro Leu Leu Arg

130 135 140

Gln Leu Ile Asp Asn Ala Gly Ala Gly Asn Val Val His Tyr Asp Pro

145 150 155 160

Ala Asn Ile Ile Leu Ile Thr Gly Arg Ala Ala Val Val Asn Arg Leu

165 170 175

Ala Glu Ile Ile Arg Arg Val Asp Gln Ala Gly Asp Lys Glu Ile Glu

180 185 190

Val Val Glu Leu Asn Asn Ala Ser Ala Ala Glu Met Val Arg Ile Val

195 200 205

Glu Ala Leu Asn Lys Thr Thr Asp Ala Gln Asn Thr Pro Glu Phe Leu

210 215 220

Lys Pro Lys Phe Val Ala Asp Glu Arg Thr Asn Ser Ile Leu Ile Ser

225 230 235 240

Gly Asp Pro Lys Val Arg Glu Arg Leu Lys Arg Leu Ile Lys Gln Leu

245 250 255

Asp Val Glu Met Ala Ala Lys Gly Asn Asn Arg Val Val Tyr Leu Lys

260 265 270

Tyr Ala Lys Ala Glu Asp Leu Val Glu Val Leu Lys Gly Val Ser Glu

275 280 285

Asn Leu Gln Ala Glu Lys Gly Thr Gly Gln Pro Thr Thr Ser Lys Arg

290 295 300

Asn Glu Val Met Ile Ala Ala His Ala Asp Thr Asn Ser Leu Val Leu

305 310 315 320

Thr Ala Pro Gln Asp Ile Met Asn Ala Met Leu Glu Val Ile Gly Gln

325 330 335

Leu Asp Ile Arg Arg Ala Gln Val Leu Ile Glu Ala Leu Ile Val Glu

340 345 350

Met Ala Glu Gly Asp Gly Ile Asn Leu Gly Val Gln Trp Gly Ser Leu

355 360 365

Glu Ser Gly Ser Val Ile Gln Tyr Gly Asn Thr Gly Ala Ser Ile Gly

370 375 380

Asn Val Met Ile Gly Leu Glu Glu Ala Lys Asp Thr Thr Glu Lys Lys

385 390 395 400

Pro Ile Arg Asn Ser Glu Thr Gly Glu Ile Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr

405 410 415

Thr Thr Lys Gly Asp Tyr Ser Lys Leu Ala Ser Ala Leu Ser Gly Leu

420 425 430

Gln Gly Ala Ala Val Ser Ile Ala Met Gly Asp Trp Thr Ala Leu Ile

435 440 445

Asn Ala Val Ser Asn Asp Ser Ser Ser Asn Ile Leu Ser Ser Pro Ser

450 455 460

Ile Thr Val Met Asp Asn Gly Glu Ala Ser Phe Ile Val Gly Glu Glu

465 470 475 480

Val Pro Val Ile Thr Gly Ser Thr Ala Gly Ser Asn Asn Asp Asn Pro

485 490 495

Phe Gln Thr Val Asp Arg Lys Glu Val Gly Ile Lys Leu Lys Val Val

500 505 510

Pro Gln Ile Asn Glu Gly Asn Ser Val Gln Leu Asn Ile Glu Gln Glu

515 520 525

Val Ser Asn Val Leu Gly Ala Asn Gly Ala Val Asp Val Arg Phe Ala

530 535 540

Lys Arg Gln Leu Asn Thr Ser Val Met Val Gln Asp Gly Gln Met Leu

545 550 555 560

Val Leu Gly Gly Leu Ile Asp Glu Arg Ala Leu Glu Ser Glu Ser Lys

565 570 575

Val Pro Leu Leu Gly Asp Ile Pro Leu Leu Gly Gln Leu Phe Arg Ser

580 585 590

Thr Ser Ser Gln Val Glu Lys Lys Asn Leu Met Val Phe Ile Lys Pro

595 600 605

Thr Ile Ile Arg Asp Gly Val Thr Ala Asp Gly Ile Thr Gln Arg Lys

610 615 620

Tyr Asn Tyr Ile Arg Ala Glu Gln Leu Phe Arg Ala Glu Lys Gly Leu

625 630 635 640

Arg Leu Leu Asp Asp Ala Ser Val Pro Val Leu Pro Lys Phe Gly Asp

645 650 655

Asp Arg Arg His Ser Pro Glu Ile Gln Ala Phe Ile Glu Gln Met Glu

660 665 670

Ala Lys Gln

675

<210> 11

<211> 660

<212> PRT

<213> 肺炎克雷白杆菌(Klebsiella pneumoniae)

<400> 11

Met Ile Ile Ala Asn Val Ile Arg Ser Phe Ser Leu Thr Leu Leu Ile

1 5 10 15

Phe Ala Ala Leu Leu Phe Arg Pro Ala Ala Ala Glu Glu Phe Ser Ala

20 25 30

Ser Phe Lys Gly Thr Asp Ile Gln Glu Phe Ile Asn Thr Val Ser Lys

35 40 45

Asn Leu Asn Lys Thr Val Ile Ile Asp Pro Ser Val Arg Gly Thr Ile

50 55 60

Thr Val Arg Ser Tyr Asp Met Leu Asn Glu Glu Gln Tyr Tyr Gln Phe

65 70 75 80

Phe Leu Ser Val Leu Asp Val Tyr Gly Phe Ala Val Ile Asn Met Asn

85 90 95

Asn Gly Val Leu Lys Val Val Arg Ser Lys Asp Ala Lys Thr Ala Ala

100 105 110

Val Pro Val Ala Ser Asp Ala Ala Pro Gly Ile Gly Asp Glu Val Val

115 120 125

Thr Arg Val Val Pro Leu Thr Asn Val Ala Ala Arg Asp Leu Ala Pro

130 135 140

Leu Leu Arg Gln Leu Asn Asp Asn Ala Gly Val Gly Ser Val Val His

145 150 155 160

Tyr Glu Pro Ser Asn Val Leu Leu Met Thr Gly Arg Ala Ala Val Ile

165 170 175

Lys Arg Leu Leu Thr Ile Val Glu Arg Val Asp Asn Ala Gly Asp Arg

180 185 190

Ser Val Val Thr Val Pro Leu Ser Trp Ala Ser Ala Ala Asp Val Val

195 200 205

Lys Leu Val Thr Glu Leu Asn Lys Asp Thr Ser Lys Ser Ala Leu Pro

210 215 220

Gly Ser Met Val Ala Asn Val Val Ala Asp Glu Arg Thr Asn Ala Val

225 230 235 240

Leu Val Ser Gly Glu Pro Asn Ser Arg Gln Arg Ile Ile Ala Met Ile

245 250 255

Lys Gln Leu Asp Arg Gln Gln Ala Thr Gln Gly Asn Thr Lys Val Ile

260 265 270

Tyr Leu Lys Tyr Ala Lys Ala Ser Asp Leu Val Glu Val Leu Thr Gly

275 280 285

Ile Ser Ser Thr Met Gln Ser Glu Lys Gln Ala Ala Lys Pro Val Ala

290 295 300

Ala Leu Asp Lys Asn Ile Ile Ile Lys Ala His Gly Gln Thr Asn Ala

305 310 315 320

Leu Ile Val Thr Ala Ala Pro Asp Val Met Asn Asp Leu Glu Arg Val

325 330 335

Ile Ala Gln Leu Asp Ile Arg Arg Pro Gln Val Leu Val Glu Ala Ile

340 345 350

Ile Ala Glu Val Gln Asp Ala Asp Gly Leu Asn Leu Gly Ile Gln Trp

355 360 365

Ala Asn Lys Asn Ala Gly Met Thr Gln Phe Thr Asn Ser Gly Leu Pro

370 375 380

Ile Ser Thr Ala Ile Ala Gly Ala Asn Gln Tyr Asn Lys Asp Gly Thr

385 390 395 400

Val Ser Ser Ser Leu Ala Ser Ala Leu Ser Ser Phe Asn Gly Ile Ala

405 410 415

Ala Gly Phe Tyr Gln Gly Asn Trp Ala Met Leu Leu Thr Ala Leu Ser

420 425 430

Ser Ser Thr Lys Asn Asp Ile Leu Ala Thr Pro Ser Ile Val Thr Leu

435 440 445

Asp Asn Met Glu Ala Thr Phe Asn Val Gly Gln Glu Val Pro Val Leu

450 455 460

Thr Gly Ser Gln Thr Thr Ser Gly Asp Asn Ile Phe Asn Thr Val Glu

465 470 475 480

Arg Lys Thr Val Gly Ile Lys Leu Lys Val Lys Pro Gln Ile Asn Glu

485 490 495

Gly Asp Ser Val Leu Leu Glu Ile Glu Gln Glu Val Ser Ser Val Ala

500 505 510

Asp Ala Ala Ser Ser Thr Ser Ser Asp Leu Gly Ala Thr Phe Asn Thr

515 520 525

Arg Thr Val Asn Asn Ala Val Leu Val Gly Ser Gly Glu Thr Val Val

530 535 540

Val Gly Gly Leu Leu Asp Lys Ser Val Ser Asp Thr Ala Asp Lys Val

545 550 555 560

Pro Leu Leu Gly Asp Ile Pro Val Ile Gly Ala Leu Phe Arg Ser Thr

565 570 575

Ser Lys Lys Val Ser Lys Arg Asn Leu Met Leu Phe Ile Arg Pro Thr

580 585 590

Val Ile Arg Asp Arg Asp Glu Tyr Arg Gln Ala Ser Ser Gly Gln Tyr

595 600 605

Thr Ala Phe Asn Asp Ala Gln Ser Lys Gln Arg Gly Lys Glu Asn Asn

610 615 620

Asp Ala Met Leu Asn Gln Asp Leu Leu Glu Ile Tyr Pro Arg Gln Asp

625 630 635 640

Thr Ala Ala Phe Arg Gln Val Ser Ala Ala Ile Asp Ala Phe Asn Leu

645 650 655

Gly Gly Asn Leu

660

<210> 12

<211> 745

<212> PRT

<213> 脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)

<400> 12

Met Asn Thr Lys Leu Thr Lys Ile Ile Ser Gly Leu Phe Val Ala Thr

1 5 10 15

Ala Ala Phe Gln Thr Ala Ser Ala Gly Asn Ile Thr Asp Ile Lys Val

20 25 30

Ser Ser Leu Pro Asn Lys Gln Lys Ile Val Lys Val Ser Phe Asp Lys

35 40 45

Glu Ile Val Asn Pro Thr Gly Phe Val Thr Ser Ser Pro Ala Arg Ile

50 55 60

Ala Leu Asp Phe Glu Gln Thr Gly Ile Ser Met Asp Gln Gln Val Leu

65 70 75 80

Glu Tyr Ala Asp Pro Leu Leu Ser Lys Ile Ser Ala Ala Gln Asn Ser

85 90 95

Ser Arg Ala Arg Leu Val Leu Asn Leu Asn Lys Pro Gly Gln Tyr Asn

100 105 110

Thr Glu Val Arg Gly Asn Lys Val Trp Ile Phe Ile Asn Glu Ser Asp

115 120 125

Asp Thr Val Ser Ala Pro Ala Arg Pro Ala Val Lys Ala Ala Pro Ala

130 135 140

Ala Pro Ala Lys Gln Gln Ala Ala Ala Pro Ser Thr Lys Ser Ala Val

145 150 155 160

Ser Val Ser Glu Pro Phe Thr Pro Ala Lys Gln Gln Ala Ala Ala Pro

165 170 175

Phe Thr Glu Ser Val Val Ser Val Ser Ala Pro Phe Ser Pro Ala Lys

180 185 190

Gln Gln Ala Ala Ala Pro Ala Lys Gln Thr Asn Ile Asp Phe Arg Lys

195 200 205

Asp Gly Lys Asn Ala Gly Ile Ile Glu Leu Ala Ala Leu Gly Phe Ala

210 215 220

Gly Gln Pro Asp Ile Ser Gln Gln His Asp His Ile Ile Val Thr Leu

225 230 235 240

Lys Asn His Thr Leu Pro Thr Thr Leu Gln Arg Ser Leu Asp Val Ala

245 250 255

Asp Phe Lys Thr Pro Val Gln Lys Val Thr Leu Lys Arg Leu Asn Asn

260 265 270

Asp Thr Gln Leu Ile Ile Thr Thr Ala Gly Asn Trp Glu Leu Val Asn

275 280 285

Lys Ser Ala Ala Pro Gly Tyr Phe Thr Phe Gln Val Leu Pro Lys Lys

290 295 300

Gln Asn Leu Glu Ser Gly Gly Val Asn Asn Ala Pro Lys Thr Phe Thr

305 310 315 320

Gly Arg Lys Ile Ser Leu Asp Phe Gln Asp Val Glu Ile Arg Thr Ile

325 330 335

Leu Gln Ile Leu Ala Lys Glu Ser Gly Met Asn Ile Val Ala Ser Asp

340 345 350

Ser Val Asn Gly Lys Met Thr Leu Ser Leu Lys Asp Val Pro Trp Asp

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Gln Gly Asn Ile Val Asn Ile Ala Pro Arg Asp Glu Leu Leu Ala Lys

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Asp Lys Ala Phe Leu Gln Ala Glu Lys Asp Ile Ala Asp Leu Gly Ala

405 410 415

Leu Tyr Ser Gln Asn Phe Gln Leu Lys Tyr Lys Asn Val Glu Glu Phe

420 425 430

Arg Ser Ile Leu Arg Leu Asp Asn Ala Asp Thr Thr Gly Asn Arg Asn

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Thr Leu Val Ser Gly Arg Gly Ser Val Leu Ile Asp Pro Ala Thr Asn

450 455 460

Thr Leu Ile Val Thr Asp Thr Arg Ser Val Ile Glu Lys Phe Arg Lys

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Leu Ile Asp Glu Leu Asp Val Pro Ala Gln Gln Val Met Ile Glu Ala

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Arg Ile Val Glu Ala Ala Asp Gly Phe Ser Arg Asp Leu Gly Val Lys

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515 520 525

Gly Trp Gly Val Asn Ser Gly Phe Gly Gly Asp Asp Lys Trp Gly Ala

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Glu Thr Lys Ile Asn Leu Pro Ile Thr Ala Ala Ala Asn Ser Ile Ser

545 550 555 560

Leu Val Arg Ala Ile Ser Ser Gly Ala Leu Asn Leu Glu Leu Ser Ala

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Lys Thr Asp Arg Arg Glu Leu Leu Ile Phe Ile Thr Pro Arg Ile Met

725 730 735

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<210> 13

<211> 563

<212> PRT

<213> 肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)

<400> 13

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1 5 10 15

Val Leu Val Ala Pro Gly Tyr Ser Ser Glu Lys Ile Pro Val Thr Glu

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Ser Gly Phe Val Ala Lys Asp Asp Ser Leu Arg Thr Phe Phe Asp Ala

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65 70 75 80

Leu Glu Lys Leu Ser Leu Gln Leu Gly Leu Ile Trp Tyr Phe Asp Gly

85 90 95

Gln Ala Ile Tyr Ile Tyr Asp Ala Ser Glu Met Arg Asn Ala Val Val

100 105 110

Ser Leu Arg Asn Val Ser Leu Asn Glu Phe Asn Asn Phe Leu Lys Arg

115 120 125

Ser Gly Leu Tyr Asn Lys Asn Tyr Pro Leu Arg Gly Asp Asn Arg Lys

130 135 140

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260 265 270

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275 280 285

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Val Glu Leu Ser Leu Trp Ile Val Asp Leu Asn Lys Ser Asp Leu Glu

305 310 315 320

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325 330 335

Gly Val Ser Leu Asn Gln Ser Ser Ile Ser Thr Leu Asp Gly Ser Arg

340 345 350

Phe Ile Ala Ala Val Asn Ala Leu Glu Glu Lys Lys Gln Ala Thr Val

355 360 365

Val Ser Arg Pro Val Leu Leu Thr Gln Glu Asn Val Pro Ala Ile Phe

370 375 380

Asp Asn Asn Arg Thr Phe Tyr Thr Lys Leu Ile Gly Glu Arg Asn Val

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465 470 475 480

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Leu Phe Arg Tyr Ser Ser Lys Asn Lys Ser Asn Val Val Arg Val Phe

500 505 510

Met Ile Glu Pro Lys Glu Ile Val Asp Pro Leu Met Pro Asp Ala Ser

515 520 525

Glu Ser Val Asn Asn Ile Leu Lys Gln Ser Gly Ala Trp Ser Gly Asp

530 535 540

Asp Lys Leu Gln Lys Trp Val Arg Val Tyr Leu Asp Arg Gly Leu Glu

545 550 555 560

Ala Thr Lys

<210> 14

<211> 563

<212> PRT

<213> 邦戈尔沙门氏菌(Salmonella bongori)

<400> 14

Met Lys Thr His Ile Leu Leu Ala Arg Val Leu Ala Cys Ala Ala Leu

1 5 10 15

Ile Leu Ala Ala Pro Gly Tyr Ser Ser Glu Lys Ile Pro Val Thr Gly

20 25 30

Ser Gly Phe Val Ala Lys Asp Asp Ser Leu Arg Thr Phe Phe Asp Ala

35 40 45

Met Ala Leu Gln Leu Lys Glu Pro Val Ile Val Ser Lys Met Ala Ala

50 55 60

Arg Lys Lys Ile Thr Gly Asn Phe Glu Phe Asn Asp Pro Asn Ala Leu

65 70 75 80

Leu Glu Lys Leu Ser Leu Gln Leu Gly Leu Ile Trp Tyr Phe Asp Gly

85 90 95

Gln Ala Ile Tyr Ile Tyr Asp Ala Ser Glu Met Arg Asn Ala Val Val

100 105 110

Ser Leu Arg Asn Val Ser Leu Asn Glu Phe Asn Asn Phe Leu Lys Arg

115 120 125

Ser Gly Leu Tyr Asn Lys Asn Tyr Pro Leu Arg Gly Asp Asn Arg Lys

130 135 140

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145 150 155 160

Asn Ala Ala Thr Met Met Asp Lys Gln Asn Asp Gly Ile Glu Leu Gly

165 170 175

Arg Gln Lys Ile Gly Val Met Arg Leu Asn Asn Thr Phe Val Gly Asp

180 185 190

Arg Thr Tyr Asn Leu Arg Asp Gln Lys Ile Val Ile Pro Gly Ile Ala

195 200 205

Thr Ala Ile Glu Arg Leu Leu Gln Gly Glu Glu Lys Pro Leu Gly Asn

210 215 220

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225 230 235 240

Gly Asp Lys Gly Lys Pro Ala Asn Tyr Ala Gly Gly Met Ser Leu Gln

245 250 255

Glu Ala Leu Lys Gln Asn Ala Ala Ala Gly Asp Ile Lys Ile Val Ala

260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

Val Glu Leu Ser Leu Trp Ile Val Asp Leu Asn Lys Ser Asp Leu Glu

305 310 315 320

Arg Leu Gly Ala Ser Trp Ser Gly Ser Ile Thr Ile Gly Asp Lys Leu

325 330 335

Gly Val Ser Leu Asn Gln Ser Ser Ile Ser Thr Leu Asp Gly Ser Arg

340 345 350

Phe Ile Ala Ala Val Asn Ala Leu Glu Glu Lys Lys Gln Ala Thr Val

355 360 365

Val Ser Arg Pro Val Leu Leu Thr Gln Glu Asn Val Pro Ala Ile Phe

370 375 380

Asp Asn Asn Arg Thr Phe Tyr Thr Lys Leu Ile Gly Glu Arg Asn Val

385 390 395 400

Ala Leu Glu His Val Thr Tyr Gly Thr Met Val Arg Val Leu Pro Arg

405 410 415

Phe Ser Ala Asp Gly Gln Ile Glu Met Ser Leu Asp Ile Glu Asp Gly

420 425 430

Asn Glu Thr Ile Pro Lys Thr Asp Ile Thr Ala Ser Val Asp Ala Leu

435 440 445

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450 455 460

Gly Lys Ser Leu Leu Val Gly Gly Tyr Thr Arg Asp Ala Asn Thr Asp

465 470 475 480

Thr Val Gln Ser Val Pro Phe Leu Gly Lys Ile Pro Phe Ile Gly Gly

485 490 495

Leu Phe Arg Tyr Ser Ser Lys Asn Lys Ser Asn Val Val Arg Val Phe

500 505 510

Leu Ile Glu Pro Lys Glu Ile Val Asp Pro Leu Thr Pro Asp Ala Ser

515 520 525

Glu Ser Val Asn Asn Ile Leu Lys Gln Ser Gly Thr Trp Ser Gly Asp

530 535 540

Asp Lys Leu Gln Lys Trp Val Arg Val Tyr Leu Asp Arg Asn Gln Glu

545 550 555 560

Thr Ile Lys

<210> 15

<211> 579

<212> PRT

<213> 溶血性铬杆菌(Chromobacterium haemolyticum)

<400> 15

Met Asn Arg Ser Phe Leu Ser Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ala Leu Leu

1 5 10 15

Ala Ser Val Pro Ala Ala Ala Ala Pro Glu Pro Ala Arg Ala Ala Asp

20 25 30

Ser Ala Gly Tyr Val Ala Lys Lys Glu Gly Leu Arg Ser Phe Phe Asp

35 40 45

Ala Ile Ser Ser Arg Leu Lys Lys Pro Val Ile Val Ser Lys Gln Ala

50 55 60

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115 120 125

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145 150 155 160

Val Asn Ala Ala Gly Phe Met Asp Lys Gln Ser Asp Gly Ile Glu Leu

165 170 175

Gly Arg Gln Lys Ile Gly Val Val Arg Leu Asn Asn Thr Phe Val Ser

180 185 190

Asp Arg Ser Tyr Glu Leu Arg Asp Gln Lys Ile Val Ile Pro Gly Met

195 200 205

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290 295 300

Ala Leu Asp Val Ala Lys Arg His Val Glu Leu Ser Leu Trp Ile Ile

305 310 315 320

Asp Leu Asp Lys Gly Asp Leu Asp Gln Leu Gly Val Asn Trp Ser Gly

325 330 335

Ser Val Thr Val Gly Asn Lys Leu Gly Val Ala Leu Asn Pro Ser Ser

340 345 350

Ser Ile Ser Thr Leu Asp Gly Thr Arg Phe Ile Ala Ser Val Met Ala

355 360 365

Leu Ser Gln Lys Asn Lys Ala Asn Val Val Ser Arg Pro Val Val Leu

370 375 380

Thr Gln Glu Asn Val Pro Ala Ile Phe Asp Asn Asn Arg Thr Phe Tyr

385 390 395 400

Ala Lys Leu Val Gly Glu Arg Asn Ala Ser Leu Gln His Val Thr Tyr

405 410 415

Gly Thr Leu Val Ser Val Leu Pro Arg Phe Ser Ala Asp Gly Gln Ile

420 425 430

Glu Met Ser Leu Asn Ile Glu Asp Gly Arg Glu Ala Lys Thr Pro Asp

435 440 445

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450 455 460

Ile Ser Thr Val Ala Arg Val Pro Gln Gly Lys Ser Leu Leu Ile Gly

465 470 475 480

Gly Tyr Thr Arg Asp Ala Asn Ile Glu Gln Asn Asn Lys Val Pro Phe

485 490 495

Leu Gly Ser Leu Pro Leu Val Gly Gly Leu Phe Arg Tyr Arg Ser Gln

500 505 510

Asn Gln Ser Asn Thr Val Arg Val Phe Leu Ile Gln Pro Arg Glu Ile

515 520 525

Asp Asp Pro Leu Thr Pro Asp Ala Ser Asp Leu Ser Ala Ala Val Ala

530 535 540

Lys Glu Gly Gly Ile Ala Ser Asp Pro Leu Gln Gln Trp Val Arg Asp

545 550 555 560

Tyr Leu Asp Arg Glu Gln Arg Ala Glu Gly Ala Ala Lys Gly Ala Thr

565 570 575

Arg Gly His

<210> 16

<211> 570

<212> PRT

<213> 尤伯纳伯克氏菌(Burkholderia ubonensis)

<400> 16

Met Lys Ile His His Leu Arg Ala Trp Phe Leu Val Cys Ala Val Leu

1 5 10 15

Leu Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ala Val Gly Pro Met Ala Ser Ala Gly

20 25 30

Ser Gly Tyr Val Ala Lys Asn Glu Ser Leu Arg Ser Phe Phe Asp Ala

35 40 45

Leu Ala Ala Gln Leu Glu Lys Pro Val Ile Val Ser Lys Leu Ala Ala

50 55 60

Arg Lys Gln Ile Ser Gly Glu Phe Asp Leu Asn Gly Ser Gln Ala Leu

65 70 75 80

Leu Asp Lys Leu Ser Gln Gln Leu Gly Leu Ile Trp Tyr His Asp Gly

85 90 95

Gln Ala Ile Tyr Ile Tyr Asp Ala Ser Glu Ile Arg Asn Ala Val Val

100 105 110

Ser Leu Arg Asn Val Ser Leu Gly Ala Phe Asn Asp Phe Leu Arg Arg

115 120 125

Ser Gly Leu Tyr Asp Arg Arg Tyr Pro Leu Arg Gly Asp Ala Arg Ser

130 135 140

Gly Thr Phe Tyr Val Ser Gly Pro Ala Val Phe Val Asp Leu Val Val

145 150 155 160

Asn Ala Ala Thr Phe Met Asp Lys Gln Ser Thr Gly Val Glu Leu Gly

165 170 175

Arg Gln Lys Ile Gly Val Val Arg Leu Asn Asn Thr Phe Val Ser Asp

180 185 190

Arg Thr Tyr Glu Leu Arg Asp Gln Lys Ile Val Ile Pro Gly Met Ala

195 200 205

Thr Val Val Glu Lys Leu Leu Leu Gly Glu Gly Lys Pro Leu Gln Ser

210 215 220

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225 230 235 240

Pro Ala Met Pro Asp Phe Pro Ser Gly Gly Glu Ser Lys Ala Pro Ala

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

Val Lys Gly Thr Thr Glu Gln Val Arg Phe Ile Glu Lys Leu Ala Ala

290 295 300

Ala Leu Asp Val Pro Lys Arg His Val Glu Leu Ser Leu Trp Ile Ile

305 310 315 320

Asp Leu Asp Lys Gly Asp Leu Asp Gln Leu Gly Val Lys Trp Ser Gly

325 330 335

Ser Ala Thr Ile Gly Asp Lys Leu Gly Val Thr Leu Asn Gln Ala Gly

340 345 350

Ser Val Ser Thr Leu Asp Gly Ser Arg Phe Ile Ala Tyr Val Met Ala

355 360 365

Leu Glu Gln Lys Asp Lys Ala Gln Val Val Ser Arg Pro Val Val Leu

370 375 380

Thr Gln Glu Asn Val Pro Ala Leu Phe Asp Asn Asn Arg Thr Phe Tyr

385 390 395 400

Ala Lys Leu Val Gly Glu Arg Thr Ala Ser Leu Gln Ser Val Thr Tyr

405 410 415

Gly Thr Leu Ile Ser Val Leu Pro Arg Phe Ser Ala Asp Gly Gln Ile

420 425 430

Glu Met Ser Leu Asn Ile Glu Asp Gly Arg Glu Ala Asn Ala Pro Asp

435 440 445

Asp Glu Asn Ser Ser Phe Asp Ala Leu Pro Glu Val Gly Arg Thr His

450 455 460

Ile Ser Thr Val Ala Arg Val Pro Gln Gly Lys Ser Leu Leu Ile Gly

465 470 475 480

Gly Tyr Thr Arg Asp Ser Ser Val Glu Arg Thr Ala Arg Ile Pro Gly

485 490 495

Leu Arg Lys Leu Pro Leu Ile Gly Gly Leu Phe Arg Tyr Arg Ser Gln

500 505 510

Asn Gln Ser Asn Thr Val Arg Val Phe Leu Ile Gln Pro Arg Glu Ile

515 520 525

Ile Asp Pro Leu Thr Pro Asp Ala Ser Asp Leu Val Gly Glu Val Ala

530 535 540

Lys Gln Ala Gly Ile Gly Asn Asp Pro Leu Gln Gln Trp Val Arg Asp

545 550 555 560

Tyr Leu Tyr His Gly Gly Arg Arg Gly Asp

565 570

<210> 17

<211> 575

<212> PRT

<213> 普罗威登斯菌（Providencia alcalifaciens）

<400> 17

Met Lys Thr Lys Val Ile Phe Ser Ala Leu Phe Leu Cys Leu Val Ser

1 5 10 15

Tyr Gly Ile Thr Ala Pro Gln Ala Ala Glu Leu Ser Val Glu Leu Asn

20 25 30

Ala Lys Gly Asp His Gly Tyr Val Ala Lys Asp Asp Ser Leu Arg Ser

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Phe Phe Glu Ala Met Ala Ala Lys Leu Asn Glu Pro Val Ile Val Ser

50 55 60

Lys Leu Ala Ala Arg Lys Lys Ile Thr Gly Thr Phe Asp Phe Ser Arg

65 70 75 80

Pro Lys Glu Leu Leu Asp Lys Leu Ser Phe Gln Leu Gly Leu Leu Trp

85 90 95

Tyr Phe Asp Gly Gln Ala Ile Tyr Ile Tyr Asp Ala Ser Glu Ile Arg

100 105 110

Asn Ala Val Ile Ser Leu Gln Asn Ile Ser Leu Thr Ser Phe Asn Asp

115 120 125

Phe Leu Arg Lys Ser Gly Leu Tyr Asp Gln Arg Tyr Pro Leu Arg Gly

130 135 140

Asp Asn Asn Ser Asn Thr Phe Tyr Val Ser Gly Pro Pro Val Phe Val

145 150 155 160

Glu Leu Ile Val Asn Thr Ala Thr Leu Ile Asp Lys Lys Asp Glu Gly

165 170 175

Ile Gln Leu Gly Lys Gln Lys Ile Gly Val Ile Arg Leu Asn Asn Thr

180 185 190

Phe Val Asn Asp Arg Val Tyr Lys Leu Arg Gly Gln Glu Ile Val Ile

195 200 205

Pro Gly Met Ala Thr Val Ile Glu Asn Leu Leu Glu Gly Glu Lys Gln

210 215 220

Pro Leu Ala Asn Ser Ile Leu Asn Lys Gln Ile Thr Glu Met Pro Asp

225 230 235 240

Phe Val Ser Glu Met Asn Gly Met Ser Ser Val Pro Leu Asn Tyr Ser

245 250 255

Ser Asn Val Ser Leu Pro Glu Ala Leu Lys Gln Thr Ala Ala Ala Gly

260 265 270

Asp Ile Lys Val Ile Ala Tyr Pro Gly Thr Asn Ser Leu Leu Val Lys

275 280 285

Gly Thr Ala Glu Gln Val Asp Phe Ile Glu Leu Leu Val Arg Thr Leu

290 295 300

Asp Ile Thr Lys Arg His Val Glu Leu Ser Leu Trp Ile Ile Asp Leu

305 310 315 320

Asn Lys Ser Asp Leu Asp Gln Leu Gly Val Glu Trp Ser Gly Gly Ile

325 330 335

Asn Leu Gly Asp Lys Leu Ser Met Ser Phe Asn Gln Ser Thr Pro Ile

340 345 350

Ser Thr Leu Asp Gly Gly Lys Phe Ile Ala Ser Val Tyr Ala Leu Glu

355 360 365

Gln Lys Lys Gln Ala Thr Val Val Ser Arg Pro Val Ile Met Thr Gln

370 375 380

Glu Asn Ile Pro Ala Ile Phe Asp Asn Asn Arg Thr Phe Tyr Thr Lys

385 390 395 400

Leu Ile Gly Glu Arg Thr Ser Ser Leu Ala Asp Val Thr Tyr Gly Thr

405 410 415

Leu Ile Ser Val Leu Pro Arg Phe Ser Ala Asp Gly Gln Ile Glu Met

420 425 430

Leu Leu Asp Ile Glu Asp Gly Asn Glu Ala Arg Ser Val Asp Tyr Asn

435 440 445

Asn Glu Glu Asn Val Asp Val Leu Pro Glu Val Gly Arg Thr His Ile

450 455 460

Ser Thr Ile Ala Arg Val Pro Gln Gly Lys Ser Leu Leu Ile Gly Gly

465 470 475 480

Tyr Thr Arg Asp Ala Asn Ser Gln Asp Leu Gln Lys Val Pro Phe Leu

485 490 495

Gly Asp Leu Pro Phe Val Gly Gly Leu Phe Arg Tyr Asn Asn Gln Asn

500 505 510

Lys Ser Asn Thr Val Arg Val Phe Leu Ile Gln Pro Lys Glu Ile Val

515 520 525

Glu Pro Leu Met Phe Asp Ala Asn Asp Val Ala Leu Lys Val Thr Lys

530 535 540

Glu Gly Gly Ala Asp Ile Thr Asp Asp Pro Leu His Lys Trp Val Ile

545 550 555 560

Ser Phe Leu Asn Arg Asp Thr Gly Leu Lys Leu Asn Asn Gly Asn

565 570 575

<210> 18

<211> 576

<212> PRT

<213> 氧化亚铁色假高炳根氏菌(Pseudogulbenkiania ferrooxidans)

<400> 18

Met Ser Lys Cys Leu Ser Tyr Ala Leu Trp Leu Gly Cys Ala Leu Cys

1 5 10 15

Leu Ala Ala Gly Ala Leu Ala Ala Pro Glu Pro Gly Glu Ala Ala Asp

20 25 30

Gly Ala Gly Tyr Val Ala Arg Lys Asp Ser Leu Arg Ser Phe Phe Asp

35 40 45

Ala Ile Ser Ser Lys Leu Lys Lys Pro Val Ile Leu Ser Lys Gln Ala

50 55 60

Ala Arg Lys Gln Val Ser Gly Glu Phe Asp Leu Ser Asn Pro Gln Ala

65 70 75 80

Leu Leu Glu Arg Met Thr Gln Gln Leu Gly Leu Val Trp Tyr His Asp

85 90 95

Gly Gln Ser Ile Tyr Val Tyr Asp Ala Ser Glu Thr Arg Asn Ala Val

100 105 110

Val Ala Leu Arg Asn Val Ser Leu Ser Ala Phe Asn Gly Phe Leu Arg

115 120 125

Lys Ser Gly Leu Tyr Asp Lys Arg Tyr Pro Leu Arg Gly Asp Ser Arg

130 135 140

Ser Gly Ala Phe Tyr Val Ser Gly Pro Pro Met Tyr Val Asp Leu Val

145 150 155 160

Ile Asn Ala Ala Gly Phe Met Asp Lys Gln Ser Glu Gly Met Asp Leu

165 170 175

Gly Arg Leu Lys Ile Gly Val Ile Lys Leu Asn Asn Thr Phe Val Gly

180 185 190

Asp Arg Ser Tyr Glu Leu Arg Asp Gln Lys Leu Val Ile Pro Gly Met

195 200 205

Ala Thr Val Ile Glu Lys Leu Leu Thr Gly Glu Gly Lys Ser Val Arg

210 215 220

Met Leu Pro Pro Pro Ala Pro Ser Gln Pro Pro Ser Pro Gly Leu Pro

225 230 235 240

Ala Arg Ala Glu Asp Ala Ala Ser Gln Val Gly Leu Pro Pro Leu Pro

245 250 255

Gly Leu Pro Leu Pro Ser Lys Ala Ala Leu Pro Glu Pro Pro Pro Gln

260 265 270

Asp Gly Pro Ala Gly Asp Ile Arg Val Ile Ala Tyr Pro Asp Thr Asn

275 280 285

Ser Leu Leu Val Lys Gly Ser Ala Glu Gln Val Arg Phe Ile Glu Asn

290 295 300

Leu Val Ser Ala Leu Asp Val Ala Lys Arg His Val Glu Leu Ser Leu

305 310 315 320

Trp Ile Ile Asp Leu Gln Lys Glu Asp Leu Asn Arg Leu Gly Val Glu

325 330 335

Trp Ser Gly Gln Leu Ala Val Gly Gly Gly Leu Gly Val Ser Phe Asn

340 345 350

Gly Ser Gly Ser Leu Ser Thr Leu Asp Gly Ser Arg Phe Ile Ala Ser

355 360 365

Val Met Ala Leu Ser Gln Gln Asn Lys Ala Asn Val Val Ser Arg Pro

370 375 380

Val Leu Leu Thr Gln Glu Asn Val Pro Ala Val Phe Asp Asn Asn Arg

385 390 395 400

Thr Phe Tyr Thr Lys Leu Glu Gly Glu Arg Ser Val Asp Leu Gln His

405 410 415

Val Thr Tyr Gly Thr Leu Val Ser Val Leu Pro Arg Phe Ser Ala Asp

420 425 430

Gly Gln Ile Glu Met Ser Leu Asn Ile Glu Asp Gly Ser Glu Ala Arg

435 440 445

Ala Pro Asp Tyr Ser Lys Asp Asn Lys Asp Ala Ala Thr Pro Glu Val

450 455 460

Gly Arg Thr Arg Ile Ser Thr Val Ala Arg Val Pro Gln Gly Lys Ser

465 470 475 480

Leu Leu Ile Gly Gly Phe Thr Arg Asp Ala Ser Ser Asp Asn Arg Ala

485 490 495

Ala Val Pro Gly Leu Gly Gln Leu Pro Leu Val Gly Ser Leu Phe Arg

500 505 510

Tyr Gln Arg Lys Asp Leu Ser Asn Ser Val Arg Val Phe Leu Ile Gln

515 520 525

Pro Arg Glu Ile Asp Ser Pro Leu Thr Pro Asp Ala Ser Asp Leu Ala

530 535 540

Gly Gly Leu Ser Arg Gln Gly Gly Met Asp Met Asp Pro Leu Gln Gln

545 550 555 560

Lys Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Arg Arg Glu Gly Ala Gly His Gly Asp

565 570 575

<210> 19

<211> 576

<212> PRT

<213> 色杆菌(Chromobacterium vaccinii)

<400> 19

Met Asn Lys Cys Leu Ser Tyr Ala Leu Trp Leu Gly Cys Ala Leu Cys

1 5 10 15

Leu Ala Ala Gly Ala Leu Ala Ala Pro Glu Pro Gly Glu Ala Ala Asp

20 25 30

Gly Ala Gly Tyr Val Ala Arg Lys Asp Ser Leu Arg Ser Phe Phe Asp

35 40 45

Ala Ile Ser Ser Lys Leu Lys Lys Pro Val Ile Leu Ser Lys Gln Ala

50 55 60

Ala Arg Lys Gln Val Ser Gly Glu Phe Asp Leu Ser Asn Pro Gln Ala

65 70 75 80

Leu Leu Glu Arg Met Thr Gln Gln Leu Gly Leu Val Trp Tyr His Asp

85 90 95

Gly Gln Ser Ile Tyr Val Tyr Asp Ala Ser Glu Thr Arg Asn Ala Val

100 105 110

Val Ala Leu Arg Asn Val Ser Leu Ser Ala Phe Asn Gly Phe Leu Arg

115 120 125

Lys Ser Gly Leu Tyr Asp Lys Arg Tyr Pro Leu Arg Gly Asp Ser Arg

130 135 140

Ser Gly Ala Phe Tyr Val Ser Gly Pro Pro Met Tyr Val Asp Leu Val

145 150 155 160

Ile Asn Ala Ala Gly Phe Met Asp Lys Gln Ser Glu Gly Met Asp Leu

165 170 175

Gly Arg Leu Lys Ile Gly Val Ile Lys Leu Asn Asn Thr Phe Val Gly

180 185 190

Asp Arg Ser Tyr Glu Leu Arg Asp Gln Lys Leu Val Ile Pro Gly Met

195 200 205

Ala Thr Val Ile Glu Lys Leu Leu Thr Gly Glu Gly Lys Ser Val Arg

210 215 220

Met Leu Pro Pro Pro Ala Pro Ser Leu Pro Pro Ser Ser Ala Leu Pro

225 230 235 240

Ala Arg Ala Glu Asp Ala Ala Ser Gln Val Gly Leu Pro Pro Leu Pro

245 250 255

Gly Leu Pro Leu Pro Ser Arg Thr Ala Leu Pro Glu Pro Pro Pro Gln

260 265 270

Asp Gly Pro Ala Gly Asp Ile Arg Val Ile Ala Tyr Pro Asp Thr Asn

275 280 285

Ser Leu Leu Val Lys Gly Ser Ala Glu Gln Val Arg Phe Ile Glu Asn

290 295 300

Leu Val Thr Ala Leu Asp Val Ala Lys Arg His Val Glu Leu Ser Leu

305 310 315 320

Trp Ile Ile Asp Leu Gln Lys Glu Asp Leu Asn Arg Leu Gly Val Glu

325 330 335

Trp Ser Gly Gln Leu Val Val Gly Gly Gly Leu Gly Val Ser Phe Asn

340 345 350

Gly Ser Gly Ser Leu Ser Thr Leu Asp Gly Ser Arg Phe Ile Ala Ser

355 360 365

Val Met Ala Leu Ser Gln Gln Asn Lys Ala Asn Val Val Ser Arg Pro

370 375 380

Val Leu Leu Thr Gln Glu Asn Val Pro Ala Val Phe Asp Asn Asn Arg

385 390 395 400

Thr Phe Tyr Thr Lys Leu Glu Gly Glu Arg Ser Val Asp Leu Gln His

405 410 415

Val Thr Tyr Gly Thr Leu Val Ser Val Leu Pro Arg Phe Ser Ala Asp

420 425 430

Gly Gln Ile Glu Met Ser Leu Asn Ile Glu Asp Gly Ser Glu Ala Arg

435 440 445

Ala Pro Asp Tyr Ser Lys Asp Asn Lys Asp Ala Ala Thr Pro Glu Val

450 455 460

Gly Arg Thr Arg Ile Ser Thr Val Ala Arg Val Pro Gln Gly Lys Ser

465 470 475 480

Leu Leu Ile Gly Gly Phe Thr Arg Asp Ala Ser Ser Asp Asn Arg Ala

485 490 495

Ala Val Pro Gly Leu Gly Gln Leu Pro Leu Val Gly Ser Leu Phe Arg

500 505 510

Tyr Gln Arg Lys Asp Leu Ser Asn Ser Val Arg Val Phe Leu Ile Gln

515 520 525

Pro Arg Glu Ile Asp Ser Pro Leu Thr Pro Asp Ala Ser Asp Leu Ala

530 535 540

Gly Gly Leu Ser Arg Gln Gly Gly Leu Asp Met Asp Pro Leu Gln Gln

545 550 555 560

Lys Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Arg Arg Glu Gly Ala Gly His Gly Asp

565 570 575

<210> 20

<211> 569

<212> PRT

<213> 肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)

<400> 20

Met Asn Ile Ser Asn Val Cys Ala Lys Val Phe Ile Ile Phe Ser Ala

1 5 10 15

Val Met Cys Pro Tyr Ser Leu Ala Thr Gly Thr Glu Thr Val Ala Asp

20 25 30

Ser Gly Tyr Val Ala Arg Asn Asp Ser Leu Gly Ser Phe Phe Glu Ala

35 40 45

Met Ser Ala Arg Leu Asn Lys Ala Val Val Val Ser Lys Met Ala Ala

50 55 60

Arg Lys Lys Ile Asn Gly Asp Phe Asn Phe Arg Asp Pro Glu Ala Leu

65 70 75 80

Leu Asn Arg Leu Ala Leu Gln Leu Gly Leu Ile Trp Tyr Ser Asp Gly

85 90 95

Arg Thr Val Tyr Ile Tyr Asp Ala Ser Glu Ile Arg Asn Ala Val Val

100 105 110

Ser Leu Gln Asn Thr Ser Leu Ser Ala Phe Asn Ala Phe Leu Lys Arg

115 120 125

Ser Gly Leu Tyr Asp Ser Arg Tyr Pro Leu Arg Gly Asp Glu Gln Gly

130 135 140

Gly Val Phe Tyr Val Ser Gly Pro Pro Val Phe Val Ser Leu Val Thr

145 150 155 160

Arg Ala Ala Ala Leu Met Asp Lys Gln Asp Asn Asp Ile Arg Met Gly

165 170 175

Arg Leu Lys Ile Gly Val Phe Arg Leu Asn Asn Thr Phe Val Asn Asp

180 185 190

Arg Thr Tyr Gln Leu Arg Asp Gln Asn Ile Val Ile Pro Gly Ile Ser

195 200 205

Thr Val Ile Asp Lys Leu Leu Ala Gly Glu Pro Gln Thr Leu Thr Gly

210 215 220

Ile Pro Gly Arg Leu Leu Leu Pro Pro Gly Val Asp Pro Val Pro Gly

225 230 235 240

Val Ala Pro Glu Asp Gly Ile Ala Asp Ser Asp Met Ser Val Asp Arg

245 250 255

Ala Gly Glu Ala Ser Ala Ala Pro Ala Gly Val Pro Ala Gly Asp Ile

260 265 270

Arg Val Ile Ser Tyr Pro Asp Thr Asn Ser Leu Leu Val Lys Gly Thr

275 280 285

Ala Glu Gln Val Asp Phe Ile Gly Ser Leu Ile Arg Val Leu Asp Val

290 295 300

Ala Lys Arg His Val Glu Leu Ser Leu Trp Ile Ile Asp Leu Asn Lys

305 310 315 320

Asn Asp Leu Glu Gln Leu Gly Ala Ser Trp Gly Gly Ala Ala Gly Val

325 330 335

Gly Asn Arg Leu Asp Val Thr Leu Asn Gln Thr Leu Val Ser Thr Leu

340 345 350

Asp Gly Val His Phe Leu Ala Ser Val Tyr Ala Leu Glu Lys Lys Asn

355 360 365

Gln Ala Arg Ile Val Ser Lys Pro Val Leu Met Thr Gln Glu Asn Val

370 375 380

Pro Ala Ile Phe Asp Asn Asn Arg Thr Phe Tyr Thr Lys Leu Ile Gly

385 390 395 400

Glu Arg Asn Ser Ser Leu Ala His Val Thr Tyr Gly Thr Met Ile Ser

405 410 415

Val Leu Pro Arg Phe Ser Glu Asp Gly Glu Ile Glu Met Ser Leu Asp

420 425 430

Ile Glu Asp Gly Asn Glu Glu Lys Gln Ser Val Thr Gly Asn Glu Glu

435 440 445

Glu Thr Val Leu Pro Glu Val Gly Arg Thr His Ile Ser Thr Val Ala

450 455 460

Arg Val Pro Gln Gly Lys Ser Leu Leu Ile Gly Gly Tyr Thr Arg Asp

465 470 475 480

Thr Arg Thr Glu Asp Val Gln Lys Ile Pro Leu Leu Gly Asp Ile Pro

485 490 495

Leu Ile Gly Gly Leu Phe Arg Tyr Glu Asn Gln Asn Gln Ser Asn Val

500 505 510

Val Arg Val Phe Leu Ile Gln Pro Lys Glu Ile Ser Asp Pro Leu Thr

515 520 525

Pro Asp Ala Asp Val Phe Ala Ala Glu Leu Met Gln Asn Ser Gly Ile

530 535 540

Glu Ser Asn Arg Asp Pro Leu Asp Lys Trp Val Leu Ser Tyr Leu Asn

545 550 555 560

Arg Gly Gln Ala Leu Asn His Gly Lys

565

<210> 21

<211> 566

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 21

Met Lys Leu Ser Asn Ile Ile Val Ile Phe Ile Ile Leu Leu Phe Gly

1 5 10 15

Ile Ser Pro Phe Ser Ile Ala Thr Gly Ser Glu Thr Leu Phe Asp Asn

20 25 30

Gly Tyr Val Ala Arg Asn Asp Ser Leu Asn Ser Phe Phe Glu Ala Met

35 40 45

Ser Thr Lys Leu Asn Lys Thr Val Val Val Ser Lys Ser Ala Ser Arg

50 55 60

Lys Lys Ile Asn Gly Asn Phe Asn Phe Arg Glu Pro Glu Ala Leu Leu

65 70 75 80

Asp Arg Leu Ala Ser Gln Leu Gly Val Ile Trp Tyr Ser Asp Gly Gln

85 90 95

Thr Ile Tyr Ile Tyr Asp Ala Glu Glu Ile Arg Asn Ser Val Ile Ser

100 105 110

Leu Gln Asn Val Ser Leu Ser Ala Phe Lys Ser Phe Leu Lys Glu Ala

115 120 125

Gly Leu Tyr Asp Ser Arg Tyr Pro Leu Lys Gly Asp Glu Gln Asn Gly

130 135 140

Ile Val Tyr Ile Ser Gly Pro Pro Ile Phe Val Ser Ile Val Thr Lys

145 150 155 160

Thr Ala Ala Leu Ile Asp Lys Gln Asn Asn Asp Ile Glu Met Gly Arg

165 170 175

Leu Lys Ile Gly Val Phe Arg Leu His Asn Thr Phe Val Asn Asp Arg

180 185 190

Thr Tyr Gln Leu Arg Asp Gln Asn Ile Val Ile Pro Gly Ile Ala Thr

195 200 205

Val Ile Glu Lys Leu Leu Ala Gly Glu Gln Gln Asn Leu Thr Glu Val

210 215 220

Gln Gly Arg Met Phe Arg Ala Ser Gly Ser Asn Ile Ala Ser Glu Thr

225 230 235 240

Leu Ser Gly Asn Ser Ser Thr Asp Asn Glu Met Tyr Ile Asp Glu Thr

245 250 255

Arg Asp Ser Thr Thr Ser Ser Ser Thr Pro Ile Ser Asp Ile Lys Val

260 265 270

Ile Ser Tyr Pro Asp Thr Asn Ser Leu Leu Val Lys Gly Thr Ala Glu

275 280 285

Gln Val Asp Phe Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu Leu Asp Val Ala Lys

290 295 300

Arg His Val Glu Leu Ser Leu Trp Ile Ile Asp Leu Asn Lys Asn Asp

305 310 315 320

Leu Glu Gln Leu Gly Val Ala Trp Gly Gly Ser Ala Ser Phe Ser Asn

325 330 335

Lys Leu Asp Ile Ala Leu Asn Gln Thr Leu Val Ser Thr Leu Asp Gly

340 345 350

Val His Phe Leu Ala Ser Val Tyr Ala Leu Glu Lys Lys Asn Gln Ala

355 360 365

Arg Ile Val Ser Lys Pro Val Leu Met Thr Gln Glu Asn Val Pro Ala

370 375 380

Ile Phe Asp Asn Asn Arg Thr Phe Tyr Thr Lys Leu Ile Gly Glu Arg

385 390 395 400

Asn Ser Ser Leu Ala His Val Thr Tyr Gly Thr Met Ile Ser Val Leu

405 410 415

Pro Arg Phe Ser Ala Asp Gly Glu Ile Glu Met Ser Leu Asn Ile Glu

420 425 430

Asp Gly Asn Glu Glu Lys Gln Ser Val Ser Gly Asn Glu Asp Ser Val

435 440 445

Leu Pro Glu Val Gly Arg Thr His Ile Ser Thr Val Ala Arg Val Pro

450 455 460

Gln Gly Lys Ser Leu Leu Ile Gly Gly Tyr Thr Arg Asp Ser Arg Thr

465 470 475 480

Lys Asp Val Gln Lys Ile Pro Leu Leu Gly Asp Ile Pro Leu Ile Gly

485 490 495

Gly Leu Phe Arg Tyr Glu Asn Gln Asn Gln Asn Asn Val Val Arg Val

500 505 510

Phe Leu Ile Gln Pro Lys Glu Ile Leu Asp Pro Leu Met Pro Asp Ala

515 520 525

Asp Val Phe Ala Ala Glu Leu Met Gln Asp Ser Gly Ile Glu Asn Asn

530 535 540

Arg Asp Pro Leu Asp Lys Trp Val Leu Ser Tyr Leu Asn Arg Gly Gln

545 550 555 560

Ala Leu Asn His Gly Lys

565

<210> 22

<211> 567

<212> PRT

<213> 痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae）

<400> 22

Met Lys Ile Lys Leu Arg Ile Thr Ile Ile Leu Ile Ser Val Leu Cys

1 5 10 15

Ile Phe Asn Gly Leu Leu Thr Pro Gly Ala Tyr Ala Ala Ala Ala Asn

20 25 30

Gly Tyr Val Ala Asn Lys Asp Asn Leu Arg Ser Phe Phe Glu Thr Val

35 40 45

Ser Ser Tyr Ala Gly Lys Pro Thr Ile Val Ser Lys Leu Ala Met Lys

50 55 60

Lys Gln Ile Ser Gly Asn Phe Asp Leu Thr Glu Pro Tyr Ala Leu Ile

65 70 75 80

Glu Arg Leu Ser Ala Gln Met Gly Leu Ile Trp Tyr Asp Asp Gly Lys

85 90 95

Ala Ile Tyr Ile Tyr Asp Ser Ser Glu Met Arg Asn Ala Leu Ile Asn

100 105 110

Leu Arg Lys Val Ser Thr Asn Glu Phe Asn Asn Phe Leu Lys Lys Ser

115 120 125

Gly Leu Tyr Asn Ser Arg Tyr Glu Ile Lys Gly Gly Gly Asn Gly Thr

130 135 140

Phe Tyr Val Ser Gly Pro Pro Val Tyr Val Asp Leu Val Val Asn Ala

145 150 155 160

Ala Lys Leu Met Glu Gln Asn Ser Asp Gly Ile Glu Ile Gly Arg Asn

165 170 175

Lys Val Gly Ile Ile His Leu Val Asn Thr Phe Val Asn Asp Arg Thr

180 185 190

Tyr Glu Leu Arg Gly Glu Lys Ile Val Ile Pro Gly Met Ala Lys Ile

195 200 205

Leu Ser Thr Leu Leu Asn Asn Asn Ile Lys Gln Ser Thr Gly Val Asn

210 215 220

Val Leu Ser Glu Ile Ser Ser Arg Gln Gln Leu Lys Asn Val Ser Arg

225 230 235 240

Met Pro Pro Phe Pro Gly Ala Glu Glu Asp Asp Asp Leu Gln Val Glu

245 250 255

Lys Ile Ile Ser Thr Ala Gly Ala Pro Glu Thr Asp Asp Ile Gln Ile

260 265 270

Ile Ala Tyr Pro Asp Thr Asn Ser Leu Leu Val Lys Gly Thr Val Ser

275 280 285

Gln Val Asp Phe Ile Glu Lys Leu Val Ala Thr Leu Asp Ile Pro Lys

290 295 300

Arg His Ile Glu Leu Ser Leu Trp Ile Ile Asp Ile Asp Lys Thr Asp

305 310 315 320

Leu Glu Gln Leu Gly Ala Asp Trp Ser Gly Thr Ile Lys Ile Gly Ser

325 330 335

Ser Leu Ser Ala Ser Phe Asn Asn Ser Gly Ser Ile Ser Thr Leu Asp

340 345 350

Gly Thr Gln Phe Ile Ala Thr Ile Gln Ala Leu Ala Gln Lys Arg Arg

355 360 365

Ala Ala Val Val Ala Arg Pro Val Val Leu Thr Gln Glu Asn Ile Pro

370 375 380

Ala Ile Phe Asp Asn Asn Arg Thr Phe Tyr Thr Lys Leu Val Gly Glu

385 390 395 400

Arg Thr Ala Glu Leu Asp Glu Val Thr Tyr Gly Thr Met Ile Ser Val

405 410 415

Leu Pro Arg Phe Ala Ala Arg Asn Gln Ile Glu Leu Leu Leu Asn Ile

420 425 430

Glu Asp Gly Asn Glu Ile Asn Ser Asp Lys Thr Asn Val Asp Asp Leu

435 440 445

Pro Gln Val Gly Arg Thr Leu Ile Ser Thr Ile Ala Arg Val Pro Gln

450 455 460

Gly Lys Ser Leu Leu Ile Gly Gly Tyr Thr Arg Asp Thr Asn Thr Tyr

465 470 475 480

Glu Ser Arg Lys Ile Pro Ile Leu Gly Ser Ile Pro Phe Ile Gly Lys

485 490 495

Leu Phe Gly Tyr Glu Gly Thr Asn Ala Asn Asn Ile Val Arg Val Phe

500 505 510

Leu Ile Glu Pro Arg Glu Ile Asp Glu Arg Met Met Asn Asn Ala Asn

515 520 525

Glu Ala Ala Val Asp Ala Arg Ala Ile Thr Gln Gln Met Ala Lys Asn

530 535 540

Lys Glu Ile Asn Asp Glu Leu Leu Gln Lys Trp Ile Lys Thr Tyr Leu

545 550 555 560

Asn Arg Glu Val Val Gly Gly

565

<210> 23

<211> 567

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 23

Met Lys Ile Lys Leu Arg Ile Thr Ile Ile Leu Ile Ser Ala Leu Cys

1 5 10 15

Ile Phe Asn Gly Leu Leu Thr Pro Gly Ala Tyr Ala Ala Thr Ala Asn

20 25 30

Gly Tyr Val Ala Asn Lys Glu Asn Leu Arg Ser Phe Phe Glu Thr Val

35 40 45

Ser Ser Tyr Ala Gly Lys Pro Thr Ile Val Ser Lys Leu Ala Met Lys

50 55 60

Lys Gln Ile Ser Gly Asn Phe Asp Leu Thr Glu Pro Tyr Ala Leu Ile

65 70 75 80

Glu Arg Leu Ser Ala Gln Met Gly Leu Ile Trp Tyr Asp Asp Gly Lys

85 90 95

Ala Ile Tyr Ile Tyr Asp Ser Ser Glu Met Arg Asn Ala Leu Ile Asn

100 105 110

Leu Arg Lys Val Ser Thr Asn Glu Phe Asn Asn Phe Leu Lys Lys Ser

115 120 125

Gly Leu Tyr Asn Ser Arg Tyr Glu Ile Lys Gly Gly Gly Asn Gly Thr

130 135 140

Phe Tyr Val Ser Gly Pro Pro Val Tyr Val Asp Leu Val Val Asn Ala

145 150 155 160

Ala Lys Leu Met Glu Gln Asn Ser Asp Gly Ile Glu Ile Gly Arg Asn

165 170 175

Lys Val Gly Ile Ile His Leu Val Asn Thr Phe Val Asn Asp Arg Thr

180 185 190

Tyr Glu Leu Arg Gly Glu Lys Ile Val Ile Pro Gly Met Ala Lys Val

195 200 205

Leu Ser Thr Leu Leu Asn Asn Asn Ile Lys Gln Ser Thr Gly Val Asn

210 215 220

Val Leu Ser Glu Ile Ser Ser Arg Gln Gln Leu Lys Asn Val Ser Arg

225 230 235 240

Met Pro Pro Phe Pro Gly Ala Glu Glu Asp Asp Asp Leu Gln Val Glu

245 250 255

Lys Ile Ile Ser Thr Ala Gly Ala Pro Glu Thr Asp Asp Ile Gln Ile

260 265 270

Ile Ala Tyr Pro Asp Thr Asn Ser Leu Leu Val Lys Gly Thr Val Ser

275 280 285

Gln Val Asp Phe Ile Glu Lys Leu Val Ala Thr Leu Asp Ile Pro Lys

290 295 300

Arg His Ile Glu Leu Ser Leu Trp Ile Ile Asp Ile Asp Lys Thr Asp

305 310 315 320

Leu Glu Gln Leu Gly Ala Asp Trp Ser Gly Thr Ile Lys Ile Gly Ser

325 330 335

Ser Leu Ser Ala Ser Phe Asn Asn Ser Gly Ser Ile Ser Thr Leu Asp

340 345 350

Gly Thr Gln Phe Ile Ala Thr Ile Gln Ala Leu Ala Gln Lys Arg Arg

355 360 365

Ala Ala Val Val Ala Arg Pro Val Val Leu Thr Gln Glu Asn Ile Pro

370 375 380

Ala Ile Phe Asp Asn Asn Arg Thr Phe Tyr Thr Lys Leu Val Gly Glu

385 390 395 400

Arg Thr Ala Glu Leu Asp Glu Val Thr Tyr Gly Thr Met Ile Ser Val

405 410 415

Leu Pro Arg Phe Ala Ala Arg Asn Gln Ile Glu Leu Leu Leu Asn Ile

420 425 430

Glu Asp Gly Asn Glu Ile Asn Ser Asp Lys Thr Asn Val Asp Asp Leu

435 440 445

Pro Gln Val Gly Arg Thr Leu Ile Ser Thr Ile Ala Arg Val Pro Gln

450 455 460

Gly Lys Ser Leu Leu Ile Gly Gly Tyr Thr Arg Asp Thr Asn Thr Tyr

465 470 475 480

Glu Ser Arg Lys Ile Pro Ile Leu Gly Ser Ile Pro Phe Ile Gly Lys

485 490 495

Leu Phe Gly Tyr Glu Gly Thr Asn Ala Asn Asn Ile Val Arg Val Phe

500 505 510

Leu Ile Glu Pro Arg Glu Ile Asp Glu Arg Met Met Asn Asn Ala Asn

515 520 525

Glu Ala Ala Val Asp Ala Arg Ala Ile Thr Gln Gln Met Ala Lys Asn

530 535 540

Lys Glu Ile Asn Asp Glu Leu Leu Gln Lys Trp Ile Lys Thr Tyr Leu

545 550 555 560

Asn Arg Glu Val Val Gly Gly

565

<210> 24

<211> 519

<212> PRT

<213> 嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)

<400> 24

Met Ala Arg Gln Glu Gly Leu Arg Thr Phe Phe Asp Ala Leu Ser Ala

1 5 10 15

Ser Leu Asp Lys Pro Val Ile Leu Ser Lys Ala Ala Ala Arg Arg Thr

20 25 30

Ile Ser Gly Asp Phe Ser Met Val Ala Pro Gln Gln Thr Leu Glu Arg

35 40 45

Val Val Arg Gln Met Gly Leu Val Trp Tyr Ser Asp Gly Gln Thr Leu

50 55 60

Tyr Ile Tyr Glu Ala Ala Glu Val Lys Ser Ala Val Ile Ser Leu Asn

65 70 75 80

Thr Ile Thr Val His Lys Leu Asp Ala Phe Leu Arg Ser Ser Gly Leu

85 90 95

Arg Asp Thr Arg Tyr Pro Leu Arg His Asp Gly Leu Arg Thr Phe Tyr

100 105 110

Ile Ser Gly Pro Pro Ile Tyr Val Asp Leu Val Ala Gln Ala Ala Gln

115 120 125

Phe Met Asp Asn Gln Ser Ala Ser Leu Gln Leu Gly Gln Gln Arg Ile

130 135 140

Gly Val Ile Asn Leu Arg Asn Thr Phe Val Ala Asp Arg Thr Tyr Glu

145 150 155 160

Leu Arg Glu Gln Ser Ile Thr Val Pro Gly Ile Ala Thr Ala Ile Glu

165 170 175

Thr Leu Leu Lys Gly Glu Gly Arg Gly Ala Asp Ala Val Ile His Lys

180 185 190

Asp Ala Glu Gly His Pro Gly Gly Met Pro Ser Phe Pro Leu Glu Glu

195 200 205

Leu Gly Ala His Glu Ala Ala Ser Gly Asp Asn Thr Ser Arg Gln Ile

210 215 220

Ile Ala Arg Asp Leu Ala Ala Gly Asn Ile Arg Val Val Ala Tyr Pro

225 230 235 240

Asp Thr Asn Ser Leu Leu Val Lys Gly Leu Pro Glu Gln Val Gln Phe

245 250 255

Ile Glu Asn Leu Val Ala Ala Leu Asp Glu Pro Lys Arg His Val Glu

260 265 270

Leu Ser Leu Trp Ile Ile Asp Leu His Lys Asp Asp Leu Asn Glu Leu

275 280 285

Gly Val Asp Trp Arg Gly Ser Phe Lys Val Gly Ser Lys Val Ala Ala

290 295 300

Ser Leu Asn Gly Gly Ser Leu Ser Thr Leu Asp Ser Ala Ser Phe Met

305 310 315 320

Ala Ala Ile Ser Ala Leu Glu Thr Asp Asn Arg Ala Arg Val Val Ser

325 330 335

Arg Pro Val Val Leu Thr Gln Glu Asn Val Pro Ala Ile Phe Asp Asn

340 345 350

Asn Arg Thr Phe Tyr Ala Arg Leu Ile Gly Glu Arg Ser Val Gln Leu

355 360 365

Glu His Val Thr Tyr Gly Thr Leu Val Ser Val Leu Pro Arg Leu Ser

370 375 380

Pro Ser Gly Glu Val Glu Met Ala Leu Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val

385 390 395 400

Val Glu Ser Ala Arg Glu Gln Ser Ser Gly Ala Asp Thr Leu Pro Thr

405 410 415

Val Gly Arg Thr Arg Ile Ser Thr Val Ala Arg Val Pro Gln Gly Lys

420 425 430

Ser Leu Leu Val Gly Gly Phe Thr Arg Asp Glu Arg Ala Glu Val Ile

435 440 445

Lys Arg Ile Pro Leu Leu Gly His Ile Pro Tyr Leu Gly Arg Val Phe

450 455 460

Ser Tyr Arg Gln Thr Arg Gln Ala Asn Thr Val Arg Val Phe Leu Ile

465 470 475 480

Gln Pro Arg Glu Leu Asp Ser Pro Leu Glu Pro Gly Ala Met Gln Thr

485 490 495

Gly Ser Gln Val Ile Gly Asn Val Val Arg Asp Pro Ala Glu Arg Ala

500 505 510

Val Leu Arg Val Leu Glu Arg

515

<210> 25

<211> 519

<212> PRT

<213> 恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）

<400> 25

Met Ala Arg Gln Glu Gly Leu Arg Thr Phe Phe Asp Ala Leu Ser Ala

1 5 10 15

Ser Leu Asp Lys Pro Val Ile Leu Ser Lys Ala Ala Ala Arg Arg Thr

20 25 30

Ile Ser Gly Asp Phe Ser Met Val Ala Pro Gln Gln Thr Leu Glu Arg

35 40 45

Val Val Arg Gln Met Gly Leu Val Trp Tyr Ser Asp Gly Gln Thr Leu

50 55 60

Tyr Ile Tyr Glu Ala Ala Glu Ala Lys Ser Ala Val Ile Ser Leu Asn

65 70 75 80

Thr Ile Thr Val His Lys Leu Asp Ala Phe Leu Arg Ser Ser Gly Leu

85 90 95

Arg Asp Thr Arg Tyr Pro Leu Arg His Asp Gly Leu Arg Thr Phe Tyr

100 105 110

Ile Ser Gly Pro Pro Ile Tyr Val Asp Leu Val Ala Gln Ala Ala Gln

115 120 125

Phe Met Asp Asn Gln Ser Ala Ser Leu Gln Leu Gly Gln Gln Arg Ile

130 135 140

Gly Val Ile Asn Leu Arg Asn Thr Phe Val Ala Asp Arg Thr Tyr Glu

145 150 155 160

Leu Arg Glu Gln Ser Ile Thr Val Pro Gly Ile Ala Thr Ala Ile Glu

165 170 175

Thr Leu Leu Lys Gly Glu Gly Arg Gly Ala Asp Ala Val Ile His Lys

180 185 190

Asp Ala Glu Gly His Pro Gly Gly Met Pro Ser Phe Pro Leu Glu Glu

195 200 205

Leu Gly Ala His Glu Ala Ala Ser Gly Asp Asn Thr Ser Arg Gln Ile

210 215 220

Ile Ala Arg Asp Leu Ala Ala Gly Asn Ile Arg Val Val Ala Tyr Pro

225 230 235 240

Asp Thr Asn Ser Leu Leu Val Lys Gly Leu Pro Glu Gln Val Gln Phe

245 250 255

Ile Glu Asn Leu Val Ala Ala Leu Asp Glu Pro Lys Arg His Val Glu

260 265 270

Leu Ser Leu Trp Ile Ile Asp Leu His Lys Asp Asp Leu Asn Glu Leu

275 280 285

Gly Val Asp Trp Arg Gly Ser Phe Lys Val Gly Ser Lys Val Ala Ala

290 295 300

Ser Leu Asn Gly Gly Ser Leu Ser Thr Leu Asp Ser Ala Ser Phe Met

305 310 315 320

Ala Ala Ile Ser Ala Leu Glu Thr Asp Asn Arg Ala Arg Val Val Ser

325 330 335

Arg Pro Val Val Leu Thr Gln Glu Asn Val Pro Ala Ile Phe Asp Asn

340 345 350

Asn Arg Thr Phe Tyr Ala Arg Leu Ile Gly Glu Arg Ser Val Gln Leu

355 360 365

Glu His Val Thr Tyr Gly Thr Leu Val Ser Val Leu Pro Arg Leu Ser

370 375 380

Pro Ser Gly Glu Val Glu Met Ala Leu Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val

385 390 395 400

Val Glu Ser Ala Arg Glu Gln Ser Ser Gly Ala Asp Thr Leu Pro Thr

405 410 415

Val Gly Arg Thr Arg Ile Ser Thr Val Ala Arg Val Pro Gln Gly Lys

420 425 430

Ser Leu Leu Val Gly Gly Phe Thr Arg Asp Glu Arg Ala Glu Val Ile

435 440 445

Lys Arg Ile Pro Leu Leu Gly His Ile Pro Tyr Leu Gly Arg Val Phe

450 455 460

Ser Tyr Arg Gln Thr Arg Gln Ala Asn Thr Val Arg Val Phe Leu Ile

465 470 475 480

Gln Pro Arg Glu Leu Asp Ser Pro Leu Glu Pro Gly Ala Met Gln Ile

485 490 495

Gly Ser Gln Val Ile Gly Asn Val Ala Arg Asp Pro Ala Glu Arg Ala

500 505 510

Val Leu Arg Val Leu Glu Arg

515

<210> 26

<211> 549

<212> PRT

<213> 昆虫耶尔森菌(Yersinia entomophaga)

<400> 26

Met Leu Gly Val Val Val Leu Ala Gly Met Pro Glu Lys Ala Phe Ser

1 5 10 15

Glu Glu Asn Ser Ser Ser Leu Ser Gly Tyr Val Ala Arg Gln Asn Asp

20 25 30

Ile Lys Gly Leu Ile Asp Ala Leu Ser Ser Arg Met Asn Lys Pro Ile

35 40 45

Ile Ile Ser Lys Ala Val Ala Arg Lys Lys Ile Ser Gly Glu Phe Asp

50 55 60

Leu Asn Asn Pro Gln Arg Leu Ile Asp Asn Ile Ser Ala Gln Leu Gly

65 70 75 80

Leu Ile Trp Tyr His Asp Gly Gln Ala Ile Tyr Ile Tyr Asp Ala Ser

85 90 95

Glu Met Arg Asn Ala Val Val Val Leu Arg Asn Thr Ser Phe Ser Ala

100 105 110

Val Ser Asn Phe Leu Arg Lys Ser Gly Leu Tyr Asp Gln Arg Tyr Pro

115 120 125

Leu Arg Ser Asp Ser Val Ser Ser Thr Phe Tyr Val Ser Gly Pro Pro

130 135 140

Ile Tyr Val Glu Leu Val Thr Asn Thr Ala Lys Phe Leu Asp Glu Lys

145 150 155 160

Asn Asn Asp Leu Asp Gly Arg Ser Lys Val Ala Ser Ile Pro Leu Phe

165 170 175

Asn Thr Phe Val Gln Asp Arg Asp Phe Lys Tyr Arg Asp Asp Arg Ile

180 185 190

Ile Ile Pro Gly Ala Ala Ser Ile Val Gln Gln Leu Leu Asn Gly Asn

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

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Ser Leu Leu Val Lys Gly Ser Ala Glu Gln Val Ser Tyr Val Gln Asn

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Ile Val Ser Val Leu Asp Leu Pro Lys Arg His Ile Glu Leu Ser Val

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Trp Asn Gly Gly Val Asn Val Gly Gly Lys Leu Gly Ile Ser Phe Asn

325 330 335

Gly Gly Ala Ser Ser Thr Val Asp Gly Ala Thr Phe Met Ala Ser Val

340 345 350

Leu Ala Leu Ser Gln Lys Asn Gln Ala Asn Ile Val Ser Arg Pro Met

355 360 365

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Ser Ser Asp Thr Pro Asn Gly Leu Pro Glu Val Gly Arg Thr Asn Ile

435 440 445

Ser Thr Ile Ala Arg Val Pro Arg Gly Lys Ser Leu Leu Ile Gly Gly

450 455 460

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465 470 475 480

Gly Asp Ile Pro Leu Ile Gly Gly Leu Phe Arg Tyr Lys Lys Ser Arg

485 490 495

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500 505 510

Ser Pro Leu Gln Pro Asp Ala Ser Asn Leu Ile Ala Asp Met Gln Lys

515 520 525

Asn Leu Ala Asn Pro Ala Leu Gln Asp Trp Met Arg Asn Tyr Val Asp

530 535 540

Ser Gln Lys Trp Leu

545

<210> 27

<211> 562

<212> PRT

<213> 耶尔森氏菌(Yersinia nurmii)

<400> 27

Met Asn Tyr Val Ile Gly Phe Lys Arg Thr Cys Val Cys Ile Leu Gly

1 5 10 15

Val Val Val Leu Ala Gly Met Pro Glu Lys Ala Phe Ser Glu Glu Asp

20 25 30

Ser Ser Ser Ile Ser Gly Tyr Ile Ala Arg Gln Asn Asp Ile Lys Gly

35 40 45

Leu Ile Asp Ala Leu Ser Ser Arg Met Asn Lys Pro Ile Ile Ile Ser

50 55 60

Lys Ala Ala Ala Arg Lys Lys Ile Ser Gly Glu Phe Asp Leu Asn Asn

65 70 75 80

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85 90 95

Tyr His Asp Gly Gln Ala Ile Tyr Ile Tyr Asp Ala Ser Glu Met Arg

100 105 110

Asn Ala Val Val Val Leu Arg Asn Thr Ser Phe Ser Ala Val Ser Asn

115 120 125

Phe Leu Arg Lys Ser Gly Leu Tyr Asp Gln Arg Tyr Pro Leu Arg Ser

130 135 140

Asp Ser Val Ser Ser Thr Phe Tyr Val Ser Gly Pro Pro Ile Tyr Val

145 150 155 160

Glu Leu Val Thr Asn Thr Ala Lys Phe Leu Asp Glu Lys Asn Asn Asp

165 170 175

Leu Asp Gly Arg Ser Lys Val Ala Ser Ile Pro Leu Phe Asn Thr Phe

180 185 190

Val Gln Asp Arg Asp Phe Lys Tyr Arg Asp Asp Arg Ile Ile Ile Pro

195 200 205

Gly Ala Ala Ser Ile Val Gln Gln Leu Leu Asn Gly Asn Glu Ser Gly

210 215 220

Gly Asp Val Met Val Pro Ala Pro Val Thr Asp Ala Ile Ala Thr Asp

225 230 235 240

Leu Pro Pro Arg Leu Asp Glu Phe Pro Gly Val Ser Gln Ala Lys Pro

245 250 255

Lys Leu Pro Phe Ala Asp Leu Thr Thr Ala Ile Arg Ser Arg Pro Ser

260 265 270

Ala Ser Gly Phe Gln Ile Val Ala Asn Pro Gly Thr Asn Ser Leu Leu

275 280 285

Val Lys Gly Ser Ala Glu Gln Val Ser Tyr Val Gln Asn Ile Val Ser

290 295 300

Val Leu Asp Leu Pro Lys Arg His Ile Glu Leu Ser Val Trp Ile Val

305 310 315 320

Asp Leu Gln Lys Asp Ala Leu Glu Gln Met Gly Val Glu Trp Asn Gly

325 330 335

Gly Val Asn Val Gly Gly Lys Leu Gly Ile Ser Phe Asn Gly Gly Ala

340 345 350

Ser Ser Thr Val Asp Gly Ala Thr Phe Met Ala Ser Val Leu Ala Leu

355 360 365

Ser Gln Lys Asn Gln Ala Asn Ile Val Ser Arg Pro Met Val Leu Thr

370 375 380

Gln Glu Asn Ile Pro Ala Ile Phe Asp Asn Ser Arg Thr Phe Tyr Thr

385 390 395 400

Gln Leu Ile Gly Glu Arg Ser Val Glu Leu Gln His Ile Thr Tyr Gly

405 410 415

Thr Ser Val Asn Val Leu Pro Arg Phe Thr Asp Gly Asn Glu Ile Glu

420 425 430

Met Met Leu Asn Val Glu Asp Gly Ser Gln Val Pro Val Ser Ser Asp

435 440 445

Thr Pro Asn Gly Leu Pro Glu Val Gly Arg Thr Asn Ile Ser Thr Ile

450 455 460

Ala Arg Val Pro Arg Gly Lys Ser Leu Leu Ile Gly Gly Tyr Thr Arg

465 470 475 480

Asp Glu Ser Thr Asp Gly Glu Ala Lys Val Pro Leu Leu Gly Asp Ile

485 490 495

Pro Leu Ile Gly Gly Leu Phe Arg Tyr Lys Lys Ser Arg Asn Ser Asn

500 505 510

Thr Val Arg Val Phe Leu Ile Gln Pro Arg Glu Ile Glu Ser Pro Leu

515 520 525

Gln Pro Asp Ala Ser Asn Leu Ile Ala Asp Met Gln Lys Asn Leu Ala

530 535 540

Asn Pro Ala Leu Gln Asp Trp Met Arg Asn Tyr Val Asp Ser Gln Lys

545 550 555 560

Trp Leu

<210> 28

<211> 539

<212> PRT

<213> 飞虫杀雄菌(Arsenophonus nasoniae)

<400> 28

Met Lys Arg Leu Gln Ile Arg Lys Asp Ser Ser Ile Leu Ile Phe Phe

1 5 10 15

Met Phe Leu Asn Phe Ile Leu Leu Ser Ser Ser Lys Ala Val Ser Glu

20 25 30

Gln Thr Ile Glu Ser Gly Tyr Ile Ala Lys Asn Glu Thr Ile Arg Gly

35 40 45

Val Phe Asp Ala Leu Ser Ser Val Ile Asn Lys Pro Ile Ile Val Ser

50 55 60

Gln Leu Ala Ile Lys Lys Lys Ile Thr Gly Asp Phe Asp Leu Lys Tyr

65 70 75 80

Pro Leu Asp Thr Leu Arg Asp Ile Thr Gln Gln Leu Asn Leu Met Trp

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Tyr Asp Asn Gly Gln Val Ile Tyr Ile Cys Asp Ala Ile Glu Met Arg

100 105 110

Asn Thr Val Ile Thr Leu Asn Asn Thr Thr Ile Gln Glu Ile Lys Asn

115 120 125

Phe Leu Lys Asp Ser Gly Leu Tyr Asp Glu Arg Tyr Pro Leu Arg Ser

130 135 140

Gly Ser Asn Asn Arg Leu Phe Tyr Ile Ser Gly Pro Pro Val Tyr Ile

145 150 155 160

Glu Thr Ile Ile Asn Thr Thr Gln Phe Leu Asp Glu Thr Thr Thr Glu

165 170 175

Phe Asp Gly Arg Glu Lys Ile Ala Ile Val Pro Leu Tyr Asn Thr Phe

180 185 190

Val Glu Asp Arg His Tyr Gln Tyr Arg Phe Asn Asp Ile Ile Ile Pro

195 200 205

Gly Met Ala Ser Ile Ile Asn Lys Leu Met Asp Ala Ser Ser Asn Asn

210 215 220

Ile Ser Lys Leu Lys Asn His Ile Gln Lys Lys Asn Gln Asp Glu Leu

225 230 235 240

Val Asn Gln Ser Asn Asn Ser Ser Leu Ile Glu Asn Ser Pro Leu Asn

245 250 255

Lys Gly Leu Val Ser Ile Ile Ser Asn Pro Gly Asn Asn Ser Leu Leu

260 265 270

Ile Lys Gly Asn Lys Glu Gln Val Asn Tyr Leu Arg Lys Ile Val Glu

275 280 285

Gln Leu Asp Ile Thr Lys Arg His Ile Glu Leu Ser Val Trp Ile Ile

290 295 300

Asp Ile Glu Lys Lys Ala Leu Asp Gln Leu Gly Ile Lys Trp Ser Gly

305 310 315 320

Gly Ala Lys Ile Gly Gln Lys Leu Gly Val Ser Leu Asn Ala Gly Thr

325 330 335

Ser Thr Ile Asp Gly Ala Ser Phe Met Thr Ala Ile Phe Ala Leu Thr

340 345 350

Arg Asn Asp Lys Ala Asn Ile Val Ser Arg Pro Met Val Leu Thr Gln

355 360 365

Glu Asn Ile Pro Ala Ile Phe Asp Asn Asn Arg Thr Phe Tyr Thr Lys

370 375 380

Leu Ile Gly Glu Arg Ala Thr Asp Leu Lys Asn Val Thr Tyr Gly Thr

385 390 395 400

Ala Ile Ser Val Leu Pro Arg Phe Thr Ile Asn Asn Gln Ile Glu Met

405 410 415

Met Ile Thr Val Glu Asp Gly Ser Arg Ala Gly Gln Ile Thr Asp His

420 425 430

Leu Pro Glu Ile Gly Arg Thr Asn Ile Ser Thr Ile Ala Arg Val Pro

435 440 445

Gln Asn Lys Ser Leu Leu Ile Gly Gly Tyr Thr Arg Asp Glu His Arg

450 455 460

Asn Ile Glu Glu Lys Ile Pro Leu Leu Gly Asp Ile Pro Tyr Leu Gly

465 470 475 480

Ser Leu Phe Arg Tyr Asn Ile Glu Lys Lys Asp Ser Leu Val Arg Val

485 490 495

Phe Leu Ile Gln Pro Arg Glu Ile Ile Asn Pro Leu Ser Thr Ser Ala

500 505 510

Glu Asn Ile Ala Lys Lys Val Lys Glu Asp Lys Phe Asp Asn Lys Leu

515 520 525

Glu Asp Trp Met Ser Asn Phe Leu Ser Asn His

530 535

<210> 29

<211> 587

<212> PRT

<213> 玉米细菌性枯萎病菌（Pantoea stewartii）

<400> 29

Met Asn Glu Phe Val Arg Lys Thr Leu Lys Ser Arg Val Pro Cys Phe

1 5 10 15

Leu Leu Thr Val Leu Ser Cys Ala Pro Ala Gly Ala Asn Met Leu Asn

20 25 30

Thr Ser Ser Ala Pro Ala Arg Ser Met Gln Ser Thr Val Glu Asn Thr

35 40 45

Tyr Val Ala Ser Asn Asn Ser Val Gln Gln Leu Phe Phe Val Val Gly

50 55 60

Gly Ala Leu His Lys Pro Phe Ile Val Ser Val Glu Ala Ala Lys Lys

65 70 75 80

Arg Val Ser Gly Asn Phe Asp Leu Asn Asp Pro Lys Ser Val Leu Asp

85 90 95

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100 105 110

Val Tyr Ile Tyr Asp Thr Ser Glu Ile Gln Ser Ser Val Val Arg Leu

115 120 125

Ala Phe Ala Pro Tyr Asp Arg Leu Val Ala Tyr Leu Gln Ser Ser Gly

130 135 140

Leu Tyr Asp Pro Arg Phe Pro Leu Arg Ser Asp Gly Arg Ser Gly Ser

145 150 155 160

Phe Tyr Val Ser Gly Pro Pro Val Tyr Val Glu Leu Val Ser Ala Ala

165 170 175

Ala Lys Tyr Ile Asp Ala Thr Tyr Ala Lys Pro Gly Thr Gly Glu Thr

180 185 190

Thr Ile Arg Val Ile Lys Leu Lys Asn Thr Phe Val Asn Asp Arg Asn

195 200 205

Tyr Thr Gln Arg Asp Val Pro Ile Ser Val Pro Gly Val Ala Thr Val

210 215 220

Leu Asn Gln Leu Leu Asn Asn Thr Ser Cys Arg Glu Gly Gly Arg Ser

225 230 235 240

Ala Pro Ala Gly Ala Ile Ile Thr Val Asp Asn Asp Thr Arg Ser Ala

245 250 255

Leu Glu Ala Ala Ser Ala Thr Gln Lys Gly Asn Phe Pro Pro Leu Pro

260 265 270

Ser Phe Asn Ala Ala Pro Ala Ala Arg Gly Arg Ala Val Asp Arg Asp

275 280 285

Ile Pro Ser Gln Gln Thr Ile Asn Ile Val Gly Tyr Ser Asp Thr Asn

290 295 300

Ser Leu Leu Ile Gln Gly Ser Glu Arg Gln Val Ser Phe Val Glu Asp

305 310 315 320

Leu Val Asn Ala Ile Asp Ile Pro Lys Gln Gln Ile Gln Leu Ser Leu

325 330 335

Trp Ile Ile Asp Ile Ser Lys Asp Asp Ile Asn Glu Leu Gly Ile Arg

340 345 350

Trp Gln Gly Ala Ala Lys Met Gly Asn Thr Gly Val Thr Phe Asn Thr

355 360 365

Ser Ser Leu Thr Pro Glu Ser Ser Leu His Phe Leu Ala Asp Val Ser

370 375 380

Ala Leu Ala Lys Lys Gly Ser Ala Gln Val Val Ser Arg Pro Glu Ile

385 390 395 400

Leu Thr Gln Glu Asn Val Pro Ala Leu Phe Asp Asn Asn Ser Ser Phe

405 410 415

Tyr Ala Lys Leu Ile Gly Glu Arg Thr Ser Ser Leu Glu Lys Ile Thr

420 425 430

Tyr Gly Thr Met Ile Ser Val Leu Pro Arg Leu Ala Gln Arg Gln Gln

435 440 445

Glu Ile Glu Met Ile Leu Asn Ile Gln Asp Gly Gly Leu Leu Leu Asn

450 455 460

Ala Asp Gly Ser Thr Glu Asn Ile Asp Ser Leu Pro Met Val Asn Asn

465 470 475 480

Thr Gln Ile Ser Thr Glu Ala Arg Val Pro Val Gly Tyr Ser Leu Leu

485 490 495

Val Gly Gly Tyr Ser Arg Asp Gln Asp Glu His His Arg Leu Gly Ile

500 505 510

Pro Leu Leu Arg Asp Ile Pro Phe Val Gly Lys Leu Phe Asp Tyr Ser

515 520 525

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580 585

<210> 30

<211> 586

<212> PRT

<213> 产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)

<400> 30

Met Asn Leu Arg Asn Cys Pro Leu Cys Cys Leu Leu Leu Gly Ala Leu

1 5 10 15

Thr Cys Met Pro Ala Lys Ala Ala Leu Leu Asp Lys Gln Asp Met Arg

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130 135 140

Leu Tyr Asp Ser Arg Phe Pro Leu Arg Ser Asp Gly His Ser Gly Ser

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Phe Tyr Val Ser Gly Pro Pro Val Tyr Val Glu Leu Val Ala Ser Ala

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Thr Ile Arg Val Ile Lys Leu Lys Asn Thr Phe Val Asn Asp Arg Ile

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210 215 220

Leu Asn Gln Leu Leu Asn Asp Gly Ser Asn Lys Ser Gly Gly Arg Ser

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Thr Pro Ser Gly Ala Thr Ile Ser Ile Asp Asn Asp Thr Arg Gly Ala

245 250 255

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260 265 270

Ala Phe Asn Val Arg Ser Thr Ala Glu His Pro Ser Phe His Asp Asp

275 280 285

Pro Gly Gln Gln Gly Ile Asn Ile Val Gly Tyr Ser Asp Thr Asn Ser

290 295 300

Leu Leu Ile Gln Gly Ala Glu Arg Gln Val Ser Phe Val Glu Asp Leu

305 310 315 320

Val Ser Ala Ile Asp Ile Pro Lys His Gln Ile Gln Leu Ser Leu Trp

325 330 335

Ile Ile Asp Ile Ser Lys Asp Asp Ile Asn Glu Leu Gly Ile Arg Trp

340 345 350

Gln Gly Ala Gly Lys Phe Gly Asn Thr Gly Val Thr Phe Asn Thr Ser

355 360 365

Ser Leu Thr Pro Glu Asn Ser Leu His Phe Leu Ala Asp Val Ser Ala

370 375 380

Leu Ala Lys Arg Gly Asn Ala Gln Val Val Ser Arg Pro Glu Ile Leu

385 390 395 400

Thr Gln Glu Asn Val Pro Ala Leu Phe Asp Asn Asn Ser Ser Phe Tyr

405 410 415

Ala Lys Leu Val Gly Glu Arg Thr Ser Ser Leu Glu Lys Ile Thr Tyr

420 425 430

Gly Thr Met Ile Ser Val Leu Pro Arg Leu Ala Gln Arg His Gln Glu

435 440 445

Ile Glu Met Ile Leu Asn Ile Gln Asp Gly Gly Leu Pro Leu Asn Ala

450 455 460

Ser Gly Glu Val Glu Asn Val Asp Ser Leu Pro Met Val Asn Asn Thr

465 470 475 480

Gln Ile Ser Thr Glu Ala Arg Val Pro Val Gly Tyr Ser Leu Leu Val

485 490 495

Gly Gly Tyr Ser Arg Asp Gln Asp Glu His His Ser Ile Gly Ile Pro

500 505 510

Leu Leu Arg Asp Ile Pro Phe Leu Gly Lys Leu Phe Asp Tyr Ser Tyr

515 520 525

Thr Asn His Lys Lys Met Val Arg Met Phe Leu Ile Gln Pro Arg Leu

530 535 540

Leu Asn Ser Gly Glu Thr Trp Gln Gly Arg Asp Glu Arg Asn Pro Val

545 550 555 560

Leu Gly Arg Thr Leu Ser Gly Asp Asn Val Thr Leu Lys Ser Thr Val

565 570 575

Ser Met Leu Arg Asp Thr Met Lys Arg His

580 585

<210> 31

<211> 674

<212> PRT

<213> 霍乱弧菌(Vibrio cholerae)

<400> 31

Met Lys Tyr Trp Leu Lys Lys Ser Ser Trp Leu Leu Ala Gly Ser Leu

1 5 10 15

Leu Ser Thr Pro Leu Ala Met Ala Asn Glu Phe Ser Ala Ser Phe Lys

20 25 30

Gly Thr Asp Ile Gln Glu Phe Ile Asn Ile Val Gly Arg Asn Leu Glu

35 40 45

Lys Thr Ile Ile Val Asp Pro Ser Val Arg Gly Lys Val Asp Val Arg

50 55 60

Ser Phe Asp Thr Leu Asn Glu Glu Gln Tyr Tyr Ser Phe Phe Leu Ser

65 70 75 80

Val Leu Glu Val Tyr Gly Phe Ala Val Val Glu Met Asp Asn Gly Val

85 90 95

Leu Lys Val Ile Lys Ser Lys Asp Ala Lys Thr Ser Ala Ile Pro Val

100 105 110

Leu Ser Gly Glu Glu Arg Ala Asn Gly Asp Glu Val Ile Thr Gln Val

115 120 125

Val Ala Val Lys Asn Val Ser Val Arg Glu Leu Ser Pro Leu Leu Arg

130 135 140

Gln Leu Ile Asp Asn Ala Gly Ala Gly Asn Val Val His Tyr Asp Pro

145 150 155 160

Ala Asn Ile Ile Leu Ile Thr Gly Arg Ala Ala Val Val Asn Arg Leu

165 170 175

Ala Glu Ile Ile Arg Arg Val Asp Gln Ala Gly Asp Lys Glu Ile Glu

180 185 190

Val Val Glu Leu Asn Asn Ala Ser Ala Ala Glu Met Val Arg Ile Val

195 200 205

Glu Ala Leu Asn Lys Thr Thr Asp Ala Gln Asn Thr Pro Glu Phe Leu

210 215 220

Lys Pro Lys Phe Val Ala Asp Glu Arg Thr Asn Ser Ile Leu Ile Ser

225 230 235 240

Gly Asp Pro Lys Val Arg Glu Arg Leu Lys Arg Leu Ile Lys Gln Leu

245 250 255

Asp Val Glu Met Ala Ala Lys Gly Asn Asn Arg Val Val Tyr Leu Lys

260 265 270

Tyr Ala Lys Ala Glu Asp Leu Val Glu Val Leu Lys Gly Val Ser Glu

275 280 285

Asn Leu Gln Ala Glu Lys Gly Thr Gly Gln Pro Thr Thr Ser Lys Arg

290 295 300

Asn Glu Val Met Ile Ala Ala His Ala Asp Thr Asn Ser Leu Val Leu

305 310 315 320

Thr Ala Pro Gln Asp Ile Met Asn Ala Met Leu Glu Val Ile Gly Gln

325 330 335

Leu Asp Ile Arg Arg Ala Gln Val Leu Ile Glu Ala Leu Ile Val Glu

340 345 350

Met Ala Glu Gly Asp Gly Ile Asn Leu Gly Val Gln Trp Gly Ser Leu

355 360 365

Glu Ser Gly Ser Val Ile Gln Tyr Gly Asn Thr Gly Ala Ser Ile Gly

370 375 380

Asn Val Met Ile Gly Leu Glu Glu Ala Lys Asp Thr Thr Gln Thr Lys

385 390 395 400

Ala Val Tyr Asp Thr Asn Asn Asn Phe Leu Arg Asn Glu Thr Thr Thr

405 410 415

Thr Lys Gly Asp Tyr Thr Lys Leu Ala Ser Ala Leu Ser Ser Ile Gln

420 425 430

Gly Ala Ala Val Ser Ile Ala Met Gly Asp Trp Thr Ala Leu Ile Asn

435 440 445

Ala Val Ser Asn Asp Ser Ser Ser Asn Ile Leu Ser Ser Pro Ser Ile

450 455 460

Thr Val Met Asp Asn Gly Glu Ala Ser Phe Ile Val Gly Glu Glu Val

465 470 475 480

Pro Val Ile Thr Gly Ser Thr Ala Gly Ser Asn Asn Asp Asn Pro Phe

485 490 495

Gln Thr Val Asp Arg Lys Glu Val Gly Ile Lys Leu Lys Val Val Pro

500 505 510

Gln Ile Asn Glu Gly Asn Ser Val Gln Leu Asn Ile Glu Gln Glu Val

515 520 525

Ser Asn Val Leu Gly Ala Asn Gly Ala Val Asp Val Arg Phe Ala Lys

530 535 540

Arg Gln Leu Asn Thr Ser Val Met Val Gln Asp Gly Gln Met Leu Val

545 550 555 560

Leu Gly Gly Leu Ile Asp Glu Arg Ala Leu Glu Ser Glu Ser Lys Val

565 570 575

Pro Leu Leu Gly Asp Ile Pro Leu Leu Gly Gln Leu Phe Arg Ser Thr

580 585 590

Ser Ser Gln Val Glu Lys Lys Asn Leu Met Val Phe Ile Lys Pro Thr

595 600 605

Ile Ile Arg Asp Gly Val Thr Ala Asp Gly Ile Thr Gln Arg Lys Tyr

610 615 620

Asn Tyr Ile Arg Ala Glu Gln Leu Phe Arg Ala Glu Lys Gly Leu Arg

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Leu Leu Asp Asp Ala Ser Val Pro Val Leu Pro Lys Phe Gly Asp Asp

645 650 655

Arg Arg His Ser Pro Glu Ile Gln Ala Phe Ile Glu Gln Met Glu Ala

660 665 670

Lys Gln

<210> 32

<211> 650

<212> PRT

<213> 霍乱弧菌(Vibrio cholerae)

<400> 32

Asn Glu Phe Ser Ala Ser Phe Lys Gly Thr Asp Ile Gln Glu Phe Ile

1 5 10 15

Asn Ile Val Gly Arg Asn Leu Glu Lys Thr Ile Ile Val Asp Pro Ser

20 25 30

Val Arg Gly Lys Val Asp Val Arg Ser Phe Asp Thr Leu Asn Glu Glu

35 40 45

Gln Tyr Tyr Ser Phe Phe Leu Ser Val Leu Glu Val Tyr Gly Phe Ala

50 55 60

Val Val Glu Met Asp Asn Gly Val Leu Lys Val Ile Lys Ser Lys Asp

65 70 75 80

Ala Lys Thr Ser Ala Ile Pro Val Leu Ser Gly Glu Glu Arg Ala Asn

85 90 95

Gly Asp Glu Val Ile Thr Gln Val Val Ala Val Lys Asn Val Ser Val

100 105 110

Arg Glu Leu Ser Pro Leu Leu Arg Gln Leu Ile Asp Asn Ala Gly Ala

115 120 125

Gly Asn Val Val His Tyr Asp Pro Ala Asn Ile Ile Leu Ile Thr Gly

130 135 140

Arg Ala Ala Val Val Asn Arg Leu Ala Glu Ile Ile Arg Arg Val Asp

145 150 155 160

Gln Ala Gly Asp Lys Glu Ile Glu Val Val Glu Leu Asn Asn Ala Ser

165 170 175

Ala Ala Glu Met Val Arg Ile Val Glu Ala Leu Asn Lys Thr Thr Asp

180 185 190

Ala Gln Asn Thr Pro Glu Phe Leu Lys Pro Lys Phe Val Ala Asp Glu

195 200 205

Arg Thr Asn Ser Ile Leu Ile Ser Gly Asp Pro Lys Val Arg Glu Arg

210 215 220

Leu Lys Arg Leu Ile Lys Gln Leu Asp Val Glu Met Ala Ala Lys Gly

225 230 235 240

Asn Asn Arg Val Val Tyr Leu Lys Tyr Ala Lys Ala Glu Asp Leu Val

245 250 255

Glu Val Leu Lys Gly Val Ser Glu Asn Leu Gln Ala Glu Lys Gly Thr

260 265 270

Gly Gln Pro Thr Thr Ser Lys Arg Asn Glu Val Met Ile Ala Ala His

275 280 285

Ala Asp Thr Asn Ser Leu Val Leu Thr Ala Pro Gln Asp Ile Met Asn

290 295 300

Ala Met Leu Glu Val Ile Gly Gln Leu Asp Ile Arg Arg Ala Gln Val

305 310 315 320

Leu Ile Glu Ala Leu Ile Val Glu Met Ala Glu Gly Asp Gly Ile Asn

325 330 335

Leu Gly Val Gln Trp Gly Ser Leu Glu Ser Gly Ser Val Ile Gln Tyr

340 345 350

Gly Asn Thr Gly Ala Ser Ile Gly Asn Val Met Ile Gly Leu Glu Glu

355 360 365

Ala Lys Asp Thr Thr Gln Thr Lys Ala Val Tyr Asp Thr Asn Asn Asn

370 375 380

Phe Leu Arg Asn Glu Thr Thr Thr Thr Lys Gly Asp Tyr Thr Lys Leu

385 390 395 400

Ala Ser Ala Leu Ser Ser Ile Gln Gly Ala Ala Val Ser Ile Ala Met

405 410 415

Gly Asp Trp Thr Ala Leu Ile Asn Ala Val Ser Asn Asp Ser Ser Ser

420 425 430

Asn Ile Leu Ser Ser Pro Ser Ile Thr Val Met Asp Asn Gly Glu Ala

435 440 445

Ser Phe Ile Val Gly Glu Glu Val Pro Val Ile Thr Gly Ser Thr Ala

450 455 460

Gly Ser Asn Asn Asp Asn Pro Phe Gln Thr Val Asp Arg Lys Glu Val

465 470 475 480

Gly Ile Lys Leu Lys Val Val Pro Gln Ile Asn Glu Gly Asn Ser Val

485 490 495

Gln Leu Asn Ile Glu Gln Glu Val Ser Asn Val Leu Gly Ala Asn Gly

500 505 510

Ala Val Asp Val Arg Phe Ala Lys Arg Gln Leu Asn Thr Ser Val Met

515 520 525

Val Gln Asp Gly Gln Met Leu Val Leu Gly Gly Leu Ile Asp Glu Arg

530 535 540

Ala Leu Glu Ser Glu Ser Lys Val Pro Leu Leu Gly Asp Ile Pro Leu

545 550 555 560

Leu Gly Gln Leu Phe Arg Ser Thr Ser Ser Gln Val Glu Lys Lys Asn

565 570 575

Leu Met Val Phe Ile Lys Pro Thr Ile Ile Arg Asp Gly Val Thr Ala

580 585 590

Asp Gly Ile Thr Gln Arg Lys Tyr Asn Tyr Ile Arg Ala Glu Gln Leu

595 600 605

Phe Arg Ala Glu Lys Gly Leu Arg Leu Leu Asp Asp Ala Ser Val Pro

610 615 620

Val Leu Pro Lys Phe Gly Asp Asp Arg Arg His Ser Pro Glu Ile Gln

625 630 635 640

Ala Phe Ile Glu Gln Met Glu Ala Lys Gln

645 650

<210> 33

<211> 411

<212> PRT

<213> 霍乱弧菌(Vibrio cholerae)

<400> 33

Gly Asn Asn Arg Val Val Tyr Leu Lys Tyr Ala Lys Ala Glu Asp Leu

1 5 10 15

Val Glu Val Leu Lys Gly Val Ser Glu Asn Leu Gln Ala Glu Lys Gly

20 25 30

Thr Gly Gln Pro Thr Thr Ser Lys Arg Asn Glu Val Met Ile Ala Ala

35 40 45

His Ala Asp Thr Asn Ser Leu Val Leu Thr Ala Pro Gln Asp Ile Met

50 55 60

Asn Ala Met Leu Glu Val Ile Gly Gln Leu Asp Ile Arg Arg Ala Gln

65 70 75 80

Val Leu Ile Glu Ala Leu Ile Val Glu Met Ala Glu Gly Asp Gly Ile

85 90 95

Asn Leu Gly Val Gln Trp Gly Ser Leu Glu Ser Gly Ser Val Ile Gln

100 105 110

Tyr Gly Asn Thr Gly Ala Ser Ile Gly Asn Val Met Ile Gly Leu Glu

115 120 125

Glu Ala Lys Asp Thr Thr Gln Thr Lys Ala Val Tyr Asp Thr Asn Asn

130 135 140

Asn Phe Leu Arg Asn Glu Thr Thr Thr Thr Lys Gly Asp Tyr Thr Lys

145 150 155 160

Leu Ala Ser Ala Leu Ser Ser Ile Gln Gly Ala Ala Val Ser Ile Ala

165 170 175

Met Gly Asp Trp Thr Ala Leu Ile Asn Ala Val Ser Asn Asp Ser Ser

180 185 190

Ser Asn Ile Leu Ser Ser Pro Ser Ile Thr Val Met Asp Asn Gly Glu

195 200 205

Ala Ser Phe Ile Val Gly Glu Glu Val Pro Val Ile Thr Gly Ser Thr

210 215 220

Ala Gly Ser Asn Asn Asp Asn Pro Phe Gln Thr Val Asp Arg Lys Glu

225 230 235 240

Val Gly Ile Lys Leu Lys Val Val Pro Gln Ile Asn Glu Gly Asn Ser

245 250 255

Val Gln Leu Asn Ile Glu Gln Glu Val Ser Asn Val Leu Gly Ala Asn

260 265 270

Gly Ala Val Asp Val Arg Phe Ala Lys Arg Gln Leu Asn Thr Ser Val

275 280 285

Met Val Gln Asp Gly Gln Met Leu Val Leu Gly Gly Leu Ile Asp Glu

290 295 300

Arg Ala Leu Glu Ser Glu Ser Lys Val Pro Leu Leu Gly Asp Ile Pro

305 310 315 320

Leu Leu Gly Gln Leu Phe Arg Ser Thr Ser Ser Gln Val Glu Lys Lys

325 330 335

Asn Leu Met Val Phe Ile Lys Pro Thr Ile Ile Arg Asp Gly Val Thr

340 345 350

Ala Asp Gly Ile Thr Gln Arg Lys Tyr Asn Tyr Ile Arg Ala Glu Gln

355 360 365

Leu Phe Arg Ala Glu Lys Gly Leu Arg Leu Leu Asp Asp Ala Ser Val

370 375 380

Pro Val Leu Pro Lys Phe Gly Asp Asp Arg Arg His Ser Pro Glu Ile

385 390 395 400

Gln Ala Phe Ile Glu Gln Met Glu Ala Lys Gln

405 410

<210> 34

<211> 396

<212> PRT

<213> 霍乱弧菌(Vibrio cholerae)

<400> 34

Gly Asn Asn Arg Val Val Tyr Leu Lys Tyr Ala Lys Ala Glu Asp Leu

1 5 10 15

Val Glu Val Leu Lys Gly Val Ser Glu Ser Gly Ser Val Met Ile Ala

20 25 30

Ala His Ala Asp Thr Asn Ser Leu Val Leu Thr Ala Pro Gln Asp Ile

35 40 45

Met Asn Ala Met Leu Glu Val Ile Gly Gln Leu Asp Ile Arg Arg Ala

50 55 60

Gln Val Leu Ile Glu Ala Leu Ile Val Glu Met Ala Glu Gly Asp Gly

65 70 75 80

Ile Asn Leu Gly Val Gln Trp Gly Ser Leu Glu Ser Gly Ser Val Ile

85 90 95

Gln Tyr Gly Asn Thr Gly Ala Ser Ile Gly Asn Val Met Ile Gly Leu

100 105 110

Glu Glu Ala Lys Asp Thr Thr Gln Thr Lys Ala Val Tyr Asp Thr Asn

115 120 125

Asn Asn Phe Leu Arg Asn Glu Thr Thr Thr Thr Lys Gly Asp Tyr Thr

130 135 140

Lys Leu Ala Ser Ala Leu Ser Ser Ile Gln Gly Ala Ala Val Ser Ile

145 150 155 160

Ala Met Gly Asp Trp Thr Ala Leu Ile Asn Ala Val Ser Asn Asp Ser

165 170 175

Ser Ser Asn Ile Leu Ser Ser Pro Ser Ile Thr Val Met Asp Asn Gly

180 185 190

Glu Ala Ser Phe Ile Val Gly Glu Glu Val Pro Val Ile Thr Gly Ser

195 200 205

Thr Ala Gly Ser Asn Asn Asp Asn Pro Phe Gln Thr Val Asp Arg Lys

210 215 220

Glu Val Gly Ile Lys Leu Lys Val Val Pro Gln Ile Asn Glu Gly Asn

225 230 235 240

Ser Val Gln Leu Asn Ile Glu Gln Glu Val Ser Asn Val Leu Gly Ala

245 250 255

Asn Gly Ala Val Asp Val Arg Phe Ala Lys Arg Gln Leu Asn Thr Ser

260 265 270

Val Met Val Gln Asp Gly Gln Met Leu Val Leu Gly Gly Leu Ile Asp

275 280 285

Glu Arg Ala Leu Glu Ser Glu Ser Lys Val Pro Leu Leu Gly Asp Ile

290 295 300

Pro Leu Leu Gly Gln Leu Phe Arg Ser Thr Ser Ser Gln Val Glu Lys

305 310 315 320

Lys Asn Leu Met Val Phe Ile Lys Pro Thr Ile Ile Arg Asp Gly Val

325 330 335

Thr Ala Asp Gly Ile Thr Gln Arg Lys Tyr Asn Tyr Ile Arg Ala Glu

340 345 350

Gln Leu Phe Arg Ala Glu Lys Gly Leu Arg Leu Leu Asp Asp Ala Ser

355 360 365

Val Pro Val Leu Pro Lys Phe Gly Asp Asp Arg Arg His Ser Pro Glu

370 375 380

Ile Gln Ala Phe Ile Glu Gln Met Glu Ala Lys Gln

385 390 395

<210> 35

<211> 334

<212> PRT

<213> 霍乱弧菌(Vibrio cholerae)

<400> 35

Arg Ala Gln Val Leu Ile Glu Ala Leu Ile Val Glu Met Ala Glu Gly

1 5 10 15

Asp Gly Ile Asn Leu Gly Val Gln Trp Gly Ser Leu Glu Ser Gly Ser

20 25 30

Val Ile Gln Tyr Gly Asn Thr Gly Ala Ser Ile Gly Asn Val Met Ile

35 40 45

Gly Leu Glu Glu Ala Lys Asp Thr Thr Gln Thr Lys Ala Val Tyr Asp

50 55 60

Thr Asn Asn Asn Phe Leu Arg Asn Glu Thr Thr Thr Thr Lys Gly Asp

65 70 75 80

Tyr Thr Lys Leu Ala Ser Ala Leu Ser Ser Ile Gln Gly Ala Ala Val

85 90 95

Ser Ile Ala Met Gly Asp Trp Thr Ala Leu Ile Asn Ala Val Ser Asn

100 105 110

Asp Ser Ser Ser Asn Ile Leu Ser Ser Pro Ser Ile Thr Val Met Asp

115 120 125

Asn Gly Glu Ala Ser Phe Ile Val Gly Glu Glu Val Pro Val Ile Thr

130 135 140

Gly Ser Thr Ala Gly Ser Asn Asn Asp Asn Pro Phe Gln Thr Val Asp

145 150 155 160

Arg Lys Glu Val Gly Ile Lys Leu Lys Val Val Pro Gln Ile Asn Glu

165 170 175

Gly Asn Ser Val Gln Leu Asn Ile Glu Gln Glu Val Ser Asn Val Leu

180 185 190

Gly Ala Asn Gly Ala Val Asp Val Arg Phe Ala Lys Arg Gln Leu Asn

195 200 205

Thr Ser Val Met Val Gln Asp Gly Gln Met Leu Val Leu Gly Gly Leu

210 215 220

Ile Asp Glu Arg Ala Leu Glu Ser Glu Ser Lys Val Pro Leu Leu Gly

225 230 235 240

Asp Ile Pro Leu Leu Gly Gln Leu Phe Arg Ser Thr Ser Ser Gln Val

245 250 255

Glu Lys Lys Asn Leu Met Val Phe Ile Lys Pro Thr Ile Ile Arg Asp

260 265 270

Gly Val Thr Ala Asp Gly Ile Thr Gln Arg Lys Tyr Asn Tyr Ile Arg

275 280 285

Ala Glu Gln Leu Phe Arg Ala Glu Lys Gly Leu Arg Leu Leu Asp Asp

290 295 300

Ala Ser Val Pro Val Leu Pro Lys Phe Gly Asp Asp Arg Arg His Ser

305 310 315 320

Pro Glu Ile Gln Ala Phe Ile Glu Gln Met Glu Ala Lys Gln

325 330

<210> 36

<211> 272

<212> PRT

<213> 霍乱弧菌(Vibrio cholerae)

<400> 36

Arg Ala Gln Val Leu Ile Glu Ala Leu Ile Val Glu Met Ala Glu Gly

1 5 10 15

Asp Gly Ile Asn Leu Gly Val Gln Trp Gly Ser Leu Glu Ser Gly Ser

20 25 30

Val Ile Gln Tyr Gly Asn Thr Gly Ala Ser Ile Gly Asn Val Met Ile

35 40 45

Gly Leu Glu Glu Ala Lys Asp Thr Thr Gln Thr Lys Ala Val Tyr Asp

50 55 60

Thr Asn Asn Asn Phe Leu Arg Asn Glu Thr Thr Thr Thr Lys Gly Asp

65 70 75 80

Tyr Thr Lys Leu Ala Ser Ala Leu Ser Ser Ile Gln Gly Ala Ala Val

85 90 95

Ser Ile Ala Met Gly Asp Trp Thr Ala Leu Ile Asn Ala Val Ser Asn

100 105 110

Asp Ser Ser Ser Asn Ile Leu Ser Ser Pro Ser Ile Thr Val Met Asp

115 120 125

Asn Gly Glu Ala Ser Phe Ile Val Gly Glu Glu Val Pro Val Ile Thr

130 135 140

Gly Ser Thr Ala Gly Ser Asn Asn Asp Asn Pro Phe Gln Thr Val Asp

145 150 155 160

Arg Lys Glu Val Gly Ile Lys Leu Lys Val Val Pro Gln Ile Asn Glu

165 170 175

Gly Asn Ser Val Gln Leu Asn Ile Glu Gln Glu Val Ser Asn Val Leu

180 185 190

Gly Ala Asn Gly Ala Val Asp Val Arg Phe Ala Lys Arg Gln Leu Asn

195 200 205

Thr Ser Val Met Val Gln Asp Gly Gln Met Leu Val Leu Gly Gly Leu

210 215 220

Ile Asp Glu Arg Ala Leu Glu Ser Glu Ser Lys Val Pro Leu Leu Gly

225 230 235 240

Asp Ile Pro Leu Leu Gly Gln Leu Phe Arg Ser Thr Ser Ser Gln Val

245 250 255

Glu Lys Lys Asn Leu Met Val Phe Ile Lys Pro Thr Ile Ile Arg Asp

260 265 270

<210> 37

<211> 686

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 37

Met Phe Trp Arg Asp Ile Thr Leu Ser Val Trp Arg Lys Lys Thr Thr

1 5 10 15

Gly Leu Lys Thr Lys Lys Arg Leu Leu Pro Leu Val Leu Ala Ala Ala

20 25 30

Leu Cys Ser Ser Pro Val Trp Ala Glu Glu Ala Thr Phe Thr Ala Asn

35 40 45

Phe Lys Asp Thr Asp Leu Lys Ser Phe Ile Glu Thr Val Gly Ala Asn

50 55 60

Leu Asn Lys Thr Ile Ile Met Gly Pro Gly Val Gln Gly Lys Val Ser

65 70 75 80

Ile Arg Thr Met Thr Pro Leu Asn Glu Arg Gln Tyr Tyr Gln Leu Phe

85 90 95

Leu Asn Leu Leu Glu Ala Gln Gly Tyr Ala Val Val Pro Met Glu Asn

100 105 110

Asp Val Leu Lys Val Val Lys Ser Ser Ala Ala Lys Val Glu Pro Leu

115 120 125

Pro Leu Val Gly Glu Gly Ser Asp Asn Tyr Ala Gly Asp Glu Met Val

130 135 140

Thr Lys Val Val Pro Val Arg Asn Val Ser Val Arg Glu Leu Ala Pro

145 150 155 160

Ile Leu Arg Gln Met Ile Asp Ser Ala Gly Ser Gly Asn Val Val Asn

165 170 175

Tyr Asp Pro Ser Asn Val Ile Met Leu Thr Gly Arg Ala Ser Val Val

180 185 190

Glu Arg Leu Thr Glu Val Ile Gln Arg Val Asp His Ala Gly Asn Arg

195 200 205

Thr Glu Glu Val Ile Pro Leu Asp Asn Ala Ser Ala Ser Glu Ile Ala

210 215 220

Arg Val Leu Glu Ser Leu Thr Lys Asn Ser Gly Glu Asn Gln Pro Ala

225 230 235 240

Thr Leu Lys Ser Gln Ile Val Ala Asp Glu Arg Thr Asn Ser Val Ile

245 250 255

Val Ser Gly Asp Pro Ala Thr Arg Asp Lys Met Arg Arg Leu Ile Arg

260 265 270

Arg Leu Asp Ser Glu Met Glu Arg Ser Gly Asn Ser Gln Val Phe Tyr

275 280 285

Leu Lys Tyr Ser Lys Ala Glu Asp Leu Val Asp Val Leu Lys Gln Val

290 295 300

Ser Gly Thr Leu Thr Ala Ala Lys Glu Glu Ala Glu Gly Thr Val Gly

305 310 315 320

Ser Gly Arg Glu Ile Val Ser Ile Ala Ala Ser Lys His Ser Asn Ala

325 330 335

Leu Ile Val Thr Ala Pro Gln Asp Ile Met Gln Ser Leu Gln Ser Val

340 345 350

Ile Glu Gln Leu Asp Ile Arg Arg Ala Gln Val His Val Glu Ala Leu

355 360 365

Ile Val Glu Val Ala Glu Gly Ser Asn Ile Asn Phe Gly Val Gln Trp

370 375 380

Ala Ser Lys Asp Ala Gly Leu Met Gln Phe Ala Asn Gly Thr Gln Ile

385 390 395 400

Pro Ile Gly Thr Leu Gly Ala Ala Ile Ser Gln Ala Lys Pro Gln Lys

405 410 415

Gly Ser Thr Val Ile Ser Glu Asn Gly Ala Thr Thr Ile Asn Pro Asp

420 425 430

Thr Asn Gly Asp Leu Ser Thr Leu Ala Gln Leu Leu Ser Gly Phe Ser

435 440 445

Gly Thr Ala Val Gly Val Val Lys Gly Asp Trp Met Ala Leu Val Gln

450 455 460

Ala Val Lys Asn Asp Ser Ser Ser Asn Val Leu Ser Thr Pro Ser Ile

465 470 475 480

Thr Thr Leu Asp Asn Gln Glu Ala Phe Phe Met Val Gly Gln Asp Val

485 490 495

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500 505 510

Asn Thr Val Glu Arg Lys Lys Val Gly Ile Met Leu Lys Val Thr Pro

515 520 525

Gln Ile Asn Glu Gly Asn Ala Val Gln Met Val Ile Glu Gln Glu Val

530 535 540

Ser Lys Val Glu Gly Gln Thr Ser Leu Asp Val Val Phe Gly Glu Arg

545 550 555 560

Lys Leu Lys Thr Thr Val Leu Ala Asn Asp Gly Glu Leu Ile Val Leu

565 570 575

Gly Gly Leu Met Asp Asp Gln Ala Gly Glu Ser Val Ala Lys Val Pro

580 585 590

Leu Leu Gly Asp Ile Pro Leu Ile Gly Asn Leu Phe Lys Ser Thr Ala

595 600 605

Asp Lys Lys Glu Lys Arg Asn Leu Met Val Phe Ile Arg Pro Thr Ile

610 615 620

Leu Arg Asp Gly Met Ala Ala Asp Gly Val Ser Gln Arg Lys Tyr Asn

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Tyr Met Arg Ala Glu Gln Ile Tyr Arg Asp Glu Gln Gly Leu Ser Leu

645 650 655

Met Pro His Thr Ala Gln Pro Val Leu Pro Ala Gln Asn Gln Ala Leu

660 665 670

Pro Pro Glu Val Arg Ala Phe Leu Asn Ala Gly Arg Thr Arg

675 680 685

<210> 38

<211> 678

<212> PRT

<213> 嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）

<400> 38

Met Ile Asn Lys Gly Lys Gly Trp Arg Leu Ala Thr Val Ala Ala Ala

1 5 10 15

Leu Met Met Ala Gly Ser Ala Trp Ala Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Phe

20 25 30

Lys Asn Ala Asp Ile Glu Glu Phe Ile Asn Thr Val Gly Lys Asn Leu

35 40 45

Ser Lys Thr Ile Ile Ile Glu Pro Ser Val Arg Gly Lys Ile Asn Val

50 55 60

Arg Ser Tyr Asp Leu Leu Asn Glu Glu Gln Tyr Tyr Gln Phe Phe Leu

65 70 75 80

Ser Val Leu Asp Val Tyr Gly Phe Ala Val Val Pro Met Asp Asn Gly

85 90 95

Val Leu Lys Val Val Arg Ser Lys Asp Ala Lys Thr Ser Ala Ile Pro

100 105 110

Val Val Asp Glu Thr Asn Pro Gly Ile Gly Asp Glu Met Val Thr Arg

115 120 125

Val Val Pro Val Arg Asn Val Ser Val Arg Glu Leu Ala Pro Leu Leu

130 135 140

Arg Gln Leu Asn Asp Asn Ala Gly Gly Gly Asn Val Val His Tyr Asp

145 150 155 160

Pro Ser Asn Val Leu Leu Ile Thr Gly Arg Ala Ala Val Val Asn Arg

165 170 175

Leu Val Glu Val Val Arg Arg Val Asp Lys Ala Gly Asp Gln Glu Val

180 185 190

Asp Ile Ile Lys Leu Lys Tyr Ala Ser Ala Gly Glu Met Val Arg Leu

195 200 205

Val Thr Asn Leu Asn Lys Asp Gly Asn Ser Gln Gly Gly Asn Thr Ser

210 215 220

Leu Leu Leu Ala Pro Lys Val Val Ala Asp Glu Arg Thr Asn Ser Val

225 230 235 240

Val Val Ser Gly Glu Pro Lys Ala Arg Ala Arg Ile Ile Gln Met Val

245 250 255

Arg Gln Leu Asp Arg Asp Leu Gln Ser Gln Gly Asn Thr Arg Val Phe

260 265 270

Tyr Leu Lys Tyr Gly Lys Ala Lys Asp Met Val Glu Val Leu Lys Gly

275 280 285

Val Ser Ser Ser Ile Glu Ala Asp Lys Lys Gly Gly Gly Thr Ala Thr

290 295 300

Thr Ala Gly Gly Gly Ala Ser Ile Gly Gly Gly Lys Leu Ala Ile Ser

305 310 315 320

Ala Asp Glu Thr Thr Asn Ala Leu Val Ile Thr Ala Gln Pro Asp Val

325 330 335

Met Ala Glu Leu Glu Gln Val Val Ala Lys Leu Asp Ile Arg Arg Ala

340 345 350

Gln Val Leu Val Glu Ala Ile Ile Val Glu Ile Ala Asp Gly Asp Gly

355 360 365

Leu Asn Leu Gly Val Gln Trp Ala Asn Thr Asn Gly Gly Gly Thr Gln

370 375 380

Phe Thr Asn Ala Gly Pro Gly Ile Gly Ser Val Ala Ile Ala Ala Lys

385 390 395 400

Asp Tyr Lys Asp Asn Gly Thr Thr Thr Gly Leu Ala Lys Leu Ala Glu

405 410 415

Asn Phe Asn Gly Met Ala Ala Gly Phe Tyr Gln Gly Asn Trp Ala Met

420 425 430

Leu Val Thr Ala Leu Ser Thr Asn Thr Lys Ser Asp Ile Leu Ser Thr

435 440 445

Pro Ser Ile Val Thr Met Asp Asn Lys Glu Ala Ser Phe Asn Val Gly

450 455 460

Gln Glu Val Pro Val Gln Thr Gly Thr Gln Asn Ser Thr Ser Gly Asp

465 470 475 480

Thr Thr Phe Ser Thr Ile Glu Arg Lys Thr Val Gly Thr Lys Leu Val

485 490 495

Val Thr Pro Gln Ile Asn Glu Gly Asp Ser Val Leu Leu Thr Ile Glu

500 505 510

Gln Glu Val Ser Ser Val Gly Lys Gln Ala Thr Gly Thr Asp Gly Leu

515 520 525

Gly Pro Thr Phe Asp Thr Arg Thr Val Lys Asn Ala Val Leu Val Lys

530 535 540

Ser Gly Glu Thr Val Val Leu Gly Gly Leu Met Asp Glu Gln Thr Lys

545 550 555 560

Glu Glu Val Ser Lys Val Pro Leu Leu Gly Asp Ile Pro Val Leu Gly

565 570 575

Tyr Leu Phe Arg Ser Thr Ser Asn Asn Thr Ser Lys Arg Asn Leu Met

580 585 590

Val Phe Ile Arg Pro Thr Ile Leu Arg Asp Ala Asn Val Tyr Ser Gly

595 600 605

Ile Ser Ser Asn Lys Tyr Thr Leu Phe Arg Ala Gln Gln Leu Asp Ala

610 615 620

Val Ala Gln Glu Gly Tyr Ala Thr Ser Pro Asp Arg Gln Val Leu Pro

625 630 635 640

Glu Tyr Gly Gln Asp Val Thr Met Ser Pro Glu Ala Gln Lys Gln Ile

645 650 655

Glu Leu Met Lys Thr His Gln Gln Ala Thr Ala Asp Gly Val Gln Pro

660 665 670

Phe Val Gln Gly Asn Lys

675

<210> 39

<211> 658

<212> PRT

<213> 铜绿色假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)

<400> 39

Met Ser Gln Pro Leu Leu Arg Ala Leu Phe Ala Pro Ser Ser Arg Ser

1 5 10 15

Tyr Val Pro Ala Val Leu Leu Ser Leu Ala Leu Gly Ile Gln Ala Ala

20 25 30

His Ala Glu Asn Ser Gly Gly Asn Ala Phe Val Pro Ala Gly Asn Gln

35 40 45

Gln Glu Ala His Trp Thr Ile Asn Leu Lys Asp Ala Asp Ile Arg Glu

50 55 60

Phe Ile Asp Gln Ile Ser Glu Ile Thr Gly Glu Thr Phe Val Val Asp

65 70 75 80

Pro Arg Val Lys Gly Gln Val Ser Val Val Ser Lys Ala Gln Leu Ser

85 90 95

Leu Ser Glu Val Tyr Gln Leu Phe Leu Ser Val Met Ser Thr His Gly

100 105 110

Phe Thr Val Val Ala Gln Gly Asp Gln Ala Arg Ile Val Pro Asn Ala

115 120 125

Glu Ala Lys Thr Glu Ala Gly Gly Gly Gln Ser Ala Pro Asp Arg Leu

130 135 140

Glu Thr Arg Val Ile Gln Val Gln Gln Ser Pro Val Ser Glu Leu Ile

145 150 155 160

Pro Leu Ile Arg Pro Leu Val Pro Gln Tyr Gly His Leu Ala Ala Val

165 170 175

Pro Ser Ala Asn Ala Leu Ile Ile Ser Asp Arg Ser Ala Asn Ile Ala

180 185 190

Arg Ile Glu Asp Val Ile Arg Gln Leu Asp Gln Lys Gly Ser His Asp

195 200 205

Tyr Ser Val Ile Asn Leu Arg Tyr Gly Trp Val Met Asp Ala Ala Glu

210 215 220

Val Leu Asn Asn Ala Met Ser Arg Gly Gln Ala Lys Gly Ala Ala Gly

225 230 235 240

Ala Gln Val Ile Ala Asp Ala Arg Thr Asn Arg Leu Ile Ile Leu Gly

245 250 255

Pro Pro Gln Ala Arg Ala Lys Leu Val Gln Leu Ala Gln Ser Leu Asp

260 265 270

Thr Pro Thr Ala Arg Ser Ala Asn Thr Arg Val Ile Arg Leu Arg His

275 280 285

Asn Asp Ala Lys Thr Leu Ala Glu Thr Leu Gly Gln Ile Ser Glu Gly

290 295 300

Met Lys Asn Asn Gly Gly Gln Gly Gly Glu Gln Thr Gly Gly Gly Arg

305 310 315 320

Pro Ser Asn Ile Leu Ile Arg Ala Asp Glu Ser Thr Asn Ala Leu Val

325 330 335

Leu Leu Ala Asp Pro Asp Thr Val Asn Ala Leu Glu Asp Ile Val Arg

340 345 350

Gln Leu Asp Val Pro Arg Ala Gln Val Leu Val Glu Ala Ala Ile Val

355 360 365

Glu Ile Ser Gly Asp Ile Gln Asp Ala Val Gly Val Gln Trp Ala Ile

370 375 380

Asn Lys Gly Gly Met Gly Gly Thr Lys Thr Asn Phe Ala Asn Thr Gly

385 390 395 400

Leu Ser Ile Gly Thr Leu Leu Gln Ser Leu Glu Ser Asn Lys Ala Pro

405 410 415

Glu Ser Ile Pro Asp Gly Ala Ile Val Gly Ile Gly Ser Ser Ser Phe

420 425 430

Gly Ala Leu Val Thr Ala Leu Ser Ala Asn Thr Lys Ser Asn Leu Leu

435 440 445

Ser Thr Pro Ser Leu Leu Thr Leu Asp Asn Gln Lys Ala Glu Ile Leu

450 455 460

Val Gly Gln Asn Val Pro Phe Gln Thr Gly Ser Tyr Thr Thr Asn Ser

465 470 475 480

Glu Gly Ser Ser Asn Pro Phe Thr Thr Val Glu Arg Lys Asp Ile Gly

485 490 495

Val Ser Leu Lys Val Thr Pro His Ile Asn Asp Gly Ala Ala Leu Arg

500 505 510

Leu Glu Ile Glu Gln Glu Ile Ser Ala Leu Leu Pro Asn Ala Gln Gln

515 520 525

Arg Asn Asn Thr Asp Leu Ile Thr Ser Lys Arg Ser Ile Lys Ser Thr

530 535 540

Ile Leu Ala Glu Asn Gly Gln Val Ile Val Ile Gly Gly Leu Ile Gln

545 550 555 560

Asp Asp Val Ser Gln Ala Glu Ser Lys Val Pro Leu Leu Gly Asp Ile

565 570 575

Pro Leu Leu Gly Arg Leu Phe Arg Ser Thr Lys Asp Thr His Thr Lys

580 585 590

Arg Asn Leu Met Val Phe Leu Arg Pro Thr Val Val Arg Asp Ser Ala

595 600 605

Gly Leu Ala Ala Leu Ser Gly Lys Lys Tyr Ser Asp Ile Arg Val Ile

610 615 620

Asp Gly Thr Arg Gly Pro Glu Gly Arg Pro Ser Ile Leu Pro Thr Asn

625 630 635 640

Ala Asn Gln Leu Phe Asp Gly Gln Ala Val Asp Leu Arg Glu Leu Met

645 650 655

Thr Glu

<210> 40

<211> 638

<212> PRT

<213> 产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)

<400> 40

Met Lys Lys Phe Pro Trp Ala Cys Val Ala Leu Thr Ala Leu Ser Leu

1 5 10 15

Tyr Ala Ser Ser Leu Leu Ala Ala Asn Phe Ser Ala Ser Phe Lys Asn

20 25 30

Thr Asp Ile Arg Glu Phe Ile Asp Thr Val Gly Arg Asn Leu Asn Lys

35 40 45

Thr Ile Leu Val Asp Pro Ser Val Gln Gly Thr Val Ser Val Arg Thr

50 55 60

Tyr Asn Val Leu Thr Glu Asp Glu Tyr Tyr Gln Phe Phe Leu Ser Val

65 70 75 80

Leu Asp Leu Tyr Gly Leu Ser Val Ile Pro Met Asp Asn Gly Met Val

85 90 95

Lys Val Val Arg Ser Ser Val Ala Arg Thr Ala Gly Ala Pro Leu Ala

100 105 110

Asp Ser Lys Asn Pro Gly Lys Gly Asp Glu Ile Ile Thr Arg Val Val

115 120 125

Arg Met Glu Asn Val Pro Val Arg Glu Leu Ala Pro Leu Leu Arg Gln

130 135 140

Leu Asn Asp Ala Thr Gly Ile Gly Asn Val Val His Phe Glu Pro Ser

145 150 155 160

Asn Val Leu Leu Leu Thr Gly Lys Ala Ser Val Val Asn Arg Leu Val

165 170 175

Asp Leu Val Gln Arg Val Asp Lys Asp Gly Ile Gln Arg Arg Glu Ile

180 185 190

Ile Pro Leu Arg Phe Ala Ser Ala Lys Glu Leu Ser Asp Met Leu Asn

195 200 205

Asn Leu Asn Asn Glu Glu Gln Lys Gly Gln Asn Ala Pro Gln Leu Ala

210 215 220

Thr Lys Val Val Ala Asp Asp Glu Thr Asn Ser Leu Val Ile Ser Gly

225 230 235 240

Ser Glu Asp Ala Arg Ala Arg Thr Arg Ser Leu Ile His Gln Leu Asp

245 250 255

Arg Glu Gln Asn Asn Glu Gly Asn Thr Arg Val Phe Tyr Leu Lys Tyr

260 265 270

Ala Ser Ala Thr Lys Val Val Pro Val Leu Thr Gly Ile Gly Glu Gln

275 280 285

Leu Lys Asp Lys Pro Gly Ala Ala Lys Ala Lys Thr Ala Ser Ala Ser

290 295 300

Thr Asp Leu Asn Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Ser Leu Val Ile

305 310 315 320

Thr Ala Gln Pro Asn Val Met Asn Ser Leu Glu Lys Val Ile Asp Lys

325 330 335

Leu Asp Ile Arg Arg Pro Gln Val Leu Val Glu Ala Ile Ile Ala Glu

340 345 350

Val Gln Asp Gly Asn Gly Leu Asp Leu Gly Val Gln Trp Thr Ser Lys

355 360 365

His Gly Gly Val Gln Phe Gly Ala Thr Gly Leu Pro Ile Ser Gln Ile

370 375 380

Lys Asn Gly Thr Met Lys Gly Ala Ser Phe Thr Gly Leu Ala Thr Gly

385 390 395 400

Phe Phe Asn Gly Asp Phe Gly Ala Leu Val Thr Ala Leu Ser Thr Asp

405 410 415

Gly Lys Asn Asp Ile Leu Ser Thr Pro Ser Val Val Thr Leu Asp Asn

420 425 430

Lys Glu Ala Ser Phe Asn Val Gly Gln Asp Val Pro Val Leu Ser Gly

435 440 445

Ser Gln Thr Thr Ser Gly Asp Asn Val Phe Asn Ser Val Glu Arg Lys

450 455 460

Thr Val Gly Thr Lys Leu Lys Ile Val Pro Gln Ile Asn Asp Gly Asp

465 470 475 480

Met Ile His Leu Lys Ile Glu Gln Glu Val Ser Ser Val Asp Asn Ser

485 490 495

Ala Thr Glu Asp Ser Ser Leu Gly Pro Thr Phe Asn Thr Arg Thr Ile

500 505 510

Asn Asn Glu Val Met Val His Ser Gly Gln Thr Val Val Leu Gly Gly

515 520 525

Leu Met Glu Asn Val Thr Lys Gln Ser Val Ser Lys Val Pro Leu Leu

530 535 540

Gly Asp Ile Pro Leu Val Gly Gln Leu Phe Arg Tyr Thr Ser Gln Asp

545 550 555 560

Thr Ser Lys Arg Asn Leu Met Val Phe Ile His Thr Thr Val Leu Arg

565 570 575

Asp Asp Asp Asn Tyr Ser Ala Ala Ser Lys Glu Lys Tyr Asp Gln Ile

580 585 590

Arg Val Arg Gln Met Gln Arg Val Glu Glu Lys Lys Leu Gly Ile Val

595 600 605

Glu Pro Ser Asp Asn Ala Val Leu Pro Ala Phe Pro Ala Ala Ser Thr

610 615 620

Ala Pro Val Lys Thr His Ala Ala Arg Asn Pro Phe Lys Glu

625 630 635

Claims (74)

1.一种置于膜中的修饰的促胰液素纳米孔，所述修饰的促胰液素纳米孔包含腔表面，所述腔表面限定内腔，所述内腔在顺式开口和反式开口之间延伸穿过所述膜，其中所述腔表面包含一种或多种氨基酸修饰。

2.根据权利要求1所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述一种或多种氨基酸修饰包含改变电荷的修饰。

3.根据权利要求2所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述电荷改变的修饰是用带正电荷的氨基酸取代带负电荷的氨基酸。

4.根据权利要求1或2所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述一个或多个氨基酸修饰包括用疏水氨基酸取代中性氨基酸。

5.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述顺式开口的直径范围为60埃至120埃。

6.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述反式开口的直径范围为40埃到100埃。

7.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述促胰液素纳米孔包含直径为约7.5埃至约25埃的收缩部分。

8.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述促胰液素是II型分泌系统。

9.根据权利要求8所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述促胰液素是GspD。

10.根据权利要求9所述的修饰的促胰液素纳米孔，其包含亚基多肽，所述亚基多肽包含具有与SEQ ID NO：36所示氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的促胰液素结构域。

11.根据权利要求9或10所述的修饰的促胰液素纳米孔，其包含亚基多肽，所述亚基多肽具有与SEQ ID NO：34或35所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述GspD不包括帽门。

13.根据权利要求9至12中任一项所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中修饰GspD的中央门以用具有较小侧基的氨基酸取代氨基酸和/或用带中性或带正电荷的氨基酸取代带负电荷的氨基酸。

14.根据权利要求13所述的修饰的促胰液素纳米孔，其包含亚基多肽，所述亚基多肽包含具有与SEQ ID NO：36所示氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的促胰液素结构域，其中：(i)D55或T56至T77的全部或部分氨基酸缺失或被取代，K60、D64、R71和E73中的一个或多个被不带电荷的氨基酸取代和/或D55、T56、T77和K78中的一个或多个被P取代；和/或(ii)F156被较小的氨基酸取代，N151和/或N152被较小的氨基酸取代，D153被不带电荷的氨基酸取代，G137和G165各自独立地未被修饰或被A或V取代。

15.根据权利要求14所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中Y63至R71缺失和/或被GSG或SGS取代，F156被A取代，D153被S取代，和/或N151和N152各自独立地被G或S取代。

16.根据权利要求1至7中任一项所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述促胰液素是IV型分泌系统。

17.根据权利要求16所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述促胰液素是PilQ。

18.根据权利要求1至7中任一项所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述促胰液素是III型分泌系统。

19.根据权利要求18所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述促胰液素是YscC。

20.根据权利要求18所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述促胰液素是InvG。

21.根据权利要求20所述的修饰的促胰液素纳米孔，其包含亚基多肽，所述亚基多肽具有与SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列(对应于没有N1或N0结构域的InvG的氨基酸序列)至少95％相同的氨基酸序列。

22.根据权利要求20或21所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述腔表面进一步限定所述腔内的收缩部，所述收缩部在SEQ ID NO：1的氨基酸D28、E225、R226和/或E231处具有一个或多个氨基酸修饰(例如，电荷改变修饰)。

23.根据权利要求22所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述收缩部的一个或多个氨基酸修饰(例如，电荷改变修饰)包括以下一个或多个：

i.D28N/Q/T/S/G/R/K；

ii.E225N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/R/K；

iii.R226N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/K/V；

iv.缺失E225；

v.缺失R226；和

vi.E231N/Q/T/A/S/G/P/H/R/K。

24.根据权利要求20至22中任一项所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述腔表面包含在氨基酸E41、Q45或E114处具有一个或多个氨基酸修饰的捕获部分。

25.根据权利要求24所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中所述捕获部分包含一个或多个下列氨基酸修饰：

i.Q45R/K；

ii.E41N/Q/T/S/G/R/K；和

iii.E114N/Q/T/S/G/R/K。

26.一种修饰的InvG纳米孔亚基多肽，其包含与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列(对应于没有N1或N0结构域的InvG的氨基酸序列)至少95％相同的氨基酸序列，其中所述修饰的InvG纳米孔亚基多肽在选自SEQ ID NO：1的D28、E41、E114、Q45、E225、R226和E231的氨基酸处包含一个或多个氨基酸修饰(例如，电荷改变氨基酸修饰)。

27.根据权利要求26所述的修饰的InvG纳米孔亚基多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰(例如，电荷改变氨基酸修饰)包括以下一种或多种：

i.D28N/Q/T/S/G/R/K；

ii.E225N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/R/K；

iii.R226N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/K/V；

iv.缺失E225；

v.缺失R226；和

vi.E231N/Q/T/A/S/G/P/H/R/K。

28.根据权利要求26或27所述的修饰的InvG纳米孔亚基多肽，其包含一个或多个以下氨基酸修饰：

i.Q45R/K；

ii.E41N/Q/T/S/G/R/K；和

iii.E114N/Q/T/S/G/R/K。

29.一种修饰的InvG纳米孔亚基多肽，其包含与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列(对应于包括N1和N0结构域的WT InvG的氨基酸序列)至少95％相同的氨基酸序列，其中所述修饰的InvG纳米孔亚基多肽在选自SEQ ID NO：2的D199、E212、E285、Q216、E396、R397和E402的氨基酸处包含一个或多个氨基酸修饰(例如，电荷改变氨基酸修饰)和/或在SEQ ID NO：2的位置170和171或171和172之间插入内肽酶切割位点。

30.根据权利要求29所述的修饰的InvG纳米孔亚基多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰(例如，电荷改变氨基酸修饰)包括以下一种或多种：

i.D199N/Q/T/S/G/R/K；

ii.E396N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/R/K；

iii.R397N/Q/T/A/S/G/P/H/F/Y/K/V；

iv.缺失E396；

v.缺失R397；和

vi.E402N/Q/T/A/S/G/P/H/R/K。

31.根据权利要求29或30所述的修饰的InvG纳米孔亚基多肽，其包含一个或多个以下氨基酸修饰：

i.Q216R/K；

ii.E212N/Q/T/S/G/R/K；和

iii.E285N/Q/T/S/G/R/K。

32.一种修饰的GspD纳米孔亚基多肽，其包含促胰液素结构域，所述促胰液素结构域具有与SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。

33.根据权利要求32所述的修饰的GspD纳米孔亚基多肽，其包含亚基多肽，所述亚基多肽具有与SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。

34.根据权利要求32或33所述的修饰的GspD纳米孔亚基多肽，其中所述GspD不包括帽门。

35.根据权利要求32-34中任一项所述的修饰的GspD纳米孔亚基多肽，其中修饰GspD的中央门以用具有较小侧基的氨基酸取代氨基酸和/或用带中性或带正电荷的氨基酸取代带负电荷的氨基酸。

36.根据权利要求32至35中任一项所述的经修饰的GspD纳米孔亚基多肽，其包含具有与SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的促胰液素结构域，其中：(i)D55或T56至T77的全部或一些氨基酸缺失或被取代，K59、K60、R63、Q66、Q69、K71、Q74和Q75中的一个或多个被不带电荷的氨基酸取代和/或D55、T56、T57和K394中的一个或多个被P取代；和/或(ii)F157被较小的氨基酸取代，N152和/或N153被较小的氨基酸取代，D154被不带电荷的氨基酸取代，G453和G481各自独立地未被修饰或被A或V取代。

37.根据权利要求14所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中Y379-GSG-R387或Y379-SGS-R387，F472A，D469S，N467G/N468S，N467S468G，N467G/N468S/D469S。

38.一种多核苷酸，其包含编码权利要求26-31中任一项所述的修饰的InvG纳米孔亚基多肽或权利要求32-37中任一项所述的修饰的GspD纳米孔亚基多肽的核苷酸序列。

39.一种修饰的促胰液素纳米孔，其包含多个根据权利要求26-31中任一项所述的修饰的促胰岛素纳米孔亚基多肽或多个根据权利要求32-37中任一项所述的修饰的GspD纳米孔亚基多肽。

40.根据权利要求39所述的修饰的促胰液素纳米孔，其包含9至20个修饰的促胰岛素纳米孔亚基多肽。

41.根据权利要求40所述的修饰的促胰液素纳米孔，其中每个单体是根据权利要求26-31或32-37中任一项所述的修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽。

42.根据权利要求40所述的修饰的促胰液素纳米孔，其包含不同的单体，其中至少一个单体是根据权利要求26-31或32-37中任一项所述的修饰的促胰液素纳米孔亚基多肽。

43.一种装置，包括容纳水溶液的腔室，所述腔室中设置有包含促胰液素纳米孔的膜，所述促胰液素纳米孔包含腔表面，所述腔表面限定在顺式开口和反式开口之间延伸穿过所述膜的腔。

44.根据权利要求43所述的装置，其中所述促胰液素纳米孔是修饰的促胰液素纳米孔，并且腔表面包含一个或多个氨基酸修饰。

45.根据权利要求44所述的装置，其中所述修饰的促胰液素纳米孔是权利要求1至25和39至42中任一项所述的修饰的促胰液素纳米孔。

46.根据权利要求43-45中任一项所述的装置，还包括存在于水溶液中的分析物。

47.根据权利要求46所述的装置，其中所述分析物是多核苷酸。

48.根据权利要求47所述的装置，还包含与所述多核苷酸结合的多核苷酸结合蛋白。

49.根据权利要求48所述的装置，其中所述多核苷酸结合蛋白是解旋酶、外切核酸酶或聚合酶。

50.根据权利要求48或49所述的装置，其中所述多核苷酸结合蛋白位于所述膜的顺式侧。

51.根据权利要求50所述的装置，其中所述多核苷酸结合蛋白与所述纳米孔的顺式开口接触或共价连接。

52.根据权利要求48或49所述的装置，其中所述多核苷酸结合蛋白位于所述膜的反式侧。

53.根据权利要求52所述的装置，其中所述多核苷酸结合蛋白与所述纳米孔的反式开口接触或共价连接。

54.一种方法，包括获得权利要求43-45中任一项所述的装置，和将分析物添加到所述膜的顺式侧或反式侧的水溶液中。

55.根据权利要求54所述的方法，其中所述分析物是多核苷酸。

56.根据权利要求55所述的方法，还包括将多核苷酸结合蛋白添加到所述膜的顺式侧的水溶液中，其中所述多核苷酸结合蛋白结合所述多核苷酸。

57.根据权利要求56所述的方法，其中所述多核苷酸结合蛋白与所述纳米孔的顺式开口接触或共价连接，或者在所述纳米孔的顺式前庭内。

58.根据权利要求55所述的方法，还包括将多核苷酸结合蛋白添加到所述膜的反式侧的水溶液中，其中所述多核苷酸结合蛋白结合所述多核苷酸。

59.根据权利要求58所述的方法，其中所述多核苷酸结合蛋白与所述纳米孔的反式开口接触或共价连接，或者在所述纳米孔的反式前庭内。

60.根据权利要求54至59中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸结合蛋白是解旋酶、外切核酸酶或聚合酶。

61.根据权利要求54-60中任一项所述的方法，还包括通过在所述膜上施加电压梯度来诱导离子电流流过所述纳米孔。

62.根据权利要求61所述的方法，还包括在所施加的电压梯度下检测流过所述纳米孔的离子电流。

63.根据权利要求62所述的方法，还包括基于检测到的离子电流确定所述分析物的存在。

64.一种组合物，其包含促胰液素纳米孔和在促胰液素纳米孔的顺式或反式前庭内提供的酶。

65.根据权利要求64所述的组合物，其中所述促胰液素纳米孔是野生型促胰液素纳米孔。

66.根据权利要求64所述的组合物，其中所述促胰液素纳米孔是修饰的促胰液素纳米孔。

67.根据权利要求66所述的组合物，其中所述修饰的促胰液素纳米孔是权利要求1至25和39至42中任一项所述的修饰的促胰液素纳米孔。

68.根据权利要求64-67中任一项所述的组合物，其中所述纳米孔提供在所述膜内并在顺式开口和反式开口之间延伸穿过所述膜。

69.促胰液素纳米孔用于分析物检测和/或表征的用途。

70.根据权利要求69所述的用途，其中所述促胰液素纳米孔是修饰的促胰液素纳米孔。

71.根据权利要求70所述的用途，其中所述修饰的促胰液素纳米孔是权利要求1至25和39至42中任一项所述的修饰的促胰液素纳米孔。

72.一种检测样品中分析物的存在或不存在和/或表征样品中的分析物的方法，所述方法包括使设置在膜中的促胰液素纳米孔与所述样品接触、在所述膜上施加电压梯度和检测流过所述纳米孔的离子电流。

73.根据权利要求72所述的方法，其中所述促胰液素纳米孔是修饰的促胰液素纳米孔。

74.根据权利要求73所述的用途，其中所述修饰的促胰液素纳米孔是权利要求1至25和39至42中任一项所述的修饰的促胰液素纳米孔。