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CN110243804B - 一种新型拉曼探针及其制备方法 - Google Patents

一种新型拉曼探针及其制备方法 Download PDF

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CN110243804B CN201910640946.7A CN201910640946A CN110243804B CN 110243804 B CN110243804 B CN 110243804B CN 201910640946 A CN201910640946 A CN 201910640946A CN 110243804 B CN110243804 B CN 110243804B
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Qingdao University of Science and Technology
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Abstract

本发明属于拉曼探针制备及应用技术领域，公开了一种新型拉曼探针及其制备方法，合成DNA三棱锥后利用静电作用与季铵盐修饰的纳米金结合；带有巯基的拉曼探针5,5'‑二硫代双与其中的纳米金结合后，得到了一种新型拉曼探针；利用该探针结合EpCAM适体链可以实现对循环肿瘤细胞CTCs的检测。本发明实现了在大量阴性细胞背景下对人乳腺癌细胞MCF‑7细胞的检测以及在人外周血环境中MCF‑7细胞的检测；解决了现有技术的探针对循环肿瘤细胞CTCs的检测准确率低、探针实用性差；检测目标物的灵敏度不高；无法避免交叉杂交，重复性弱；检测时多需要酶催化进行信号放大，检测时间长且价格昂贵的问题。

Description

一种新型拉曼探针及其制备方法
技术领域
本发明属于拉曼探针制备及应用技术领域，尤其涉及一种新型拉曼探针及其制备方法。
背景技术
目前，最接近的现有技术：
(1)现有技术一(Song,J.；Park,S.；Kim,S.；Im,K.；Park,N.ElectrostaticInteraction Driven Gold Nanoparticle Assembly on Three-dimensional TriangularPyramid DNA Nanostructures.New J.Chem.2017,41,9590-9593.)中提出：通过杂交和酶联结合成了一种三维DNA结构，静电作用使得金纳米粒子与DNA三棱锥结构成功组装。该方法通过简单地控制金纳米粒子和DNA的混合比例，允许组装的纳米复合材料的等离子体吸收峰从可见光调谐到近红外，并且在近红外区展现出强烈的表面等离子共振效应。然而，该协议并未将这种结构应用到表面增强拉曼领域，也未对其性能进行研究。
(2)现有技术二(Wu,X.X.；Luo,L.Q.；Yang,S.；Ma,X.H.；Li,Y.L.；Dong,C.；Tian,Y.C.；Zhang,L.；Shen,Z.Y.；Wu,A.G.；Improved SERS Nanoparticles for DirectDetection of Circulating Tumor Cells in the Blood.ACSAppl.Mater.Interfaces.2015,7,9965-9971.)中提出：检测癌症患者血液中的循环肿瘤细胞(CTC)对于早期癌症诊断，癌症预后，化疗药物治疗效果的评估以及癌症治疗选择的选择至关重要。该协议提出了一种新的表面增强拉曼散射(SERS)纳米粒子，结合拉曼分子和叶酸受体，用于直接检测血液中的CTCs。然而，该协议所设计的拉曼探针没有结合EpCAM适体链，且纳米粒子的位置不可控,检测目标物的灵敏度不高。
综上所述，现有技术存在的问题是：
(1)现有技术的探针没有结合EpCAM适体链，对循环肿瘤细胞CTCs的检测准确率低。而且现有技术的探针实用性差。
(2)现有技术没有应用到表面增强拉曼上面，只是对所需的DNA三棱锥、带正电荷的季铵盐进行了简单合成及近红外光作用下表面等离子性能的研究。
(3)现有技术的探针由于等离子效应不足，产生的拉曼信号较弱，检测目标物的灵敏度不高。现有技术的探针无法避免交叉杂交，重复性较弱。
(4)现有技术的探针在检测时多需要酶催化进行信号放大，检测时间长且价格昂贵。
解决上述技术问题的难度：
为将探针应用于表面增强拉曼检测方面，需要找到一种具有强等离子效应，不需要进行酶催化信号放大，且能够避免交叉杂交的探针。
解决上述技术问题的意义：
由于现有技术的探针对循环肿瘤细胞CTCs的检测准确率低、探针实用性差；产生的拉曼信号较弱，检测目标物的灵敏度不高；无法避免交叉杂交，重复性较弱；在检测时多需要酶催化进行信号放大，检测时间长且价格昂贵。因此需要制备一种新型探针来解决上述技术问题，本发明提高了对循环肿瘤细胞CTCs靶向检测的准确性和灵敏度，能够达到早期诊断治疗的目的；检测过程中无需酶催化放大，缩短检测时间，节省检测成本。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种新型拉曼探针及其制备方法。
本发明是这样实现的，一种新型拉曼探针的制备方法，包括：
合成DNA三棱锥后(参照文献(J.Song,S.Park,S.Kim,K.Im,and N.Park,NewJ.Chem.,2017,41,9590-9593.))利用静电作用与季铵盐修饰的纳米金结合，得到组装后纳米金。
带有巯基的拉曼探针5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)与组装后纳米金结合，得到新型拉曼探针。
进一步，所述新型拉曼探针的制备方法具体包括：
室温下通过混合带正电荷的金纳米颗粒与带负电DNA三棱锥两种溶液，实现DNA与金纳米颗粒的组装。
拉曼分子选用5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，取DTNB于DMSO溶液中，配置成10mM的储备液，储存在-20℃下。
将5μL DNA三棱锥,25μL DTNB,75μL金胶和20μL TE缓冲溶液混合，室温过夜孵育，离心洗涤以去除未结合的反应物。
本发明的另一目的在于提供一种所述的新型拉曼探针的制备方法制备的新型拉曼探针。
本发明的另一目的在于提供一种在阴性细胞HEK-293T中检测MCF-7细胞中的应用方法包括：
实验所用的MCF-7细胞与HEK-293T细胞，全部用含10％FBS的RPMI 1640培养基培养；将整瓶生长到80％的MCF-7或HEK-293T细胞用胰蛋白酶消化后，用1mL的培养液吹打使细胞悬浮并采用血细胞计数板进行细胞计数；将所得的细胞悬浮液于3000rpm下离心5min，PBS(细胞专用的，不含钙镁离子)洗涤三次后稀释到所需浓度。
分别向10μL 1.0×106cells/mL HEK-293T细胞悬浮液中加入10μL不同细胞浓度的MCF-7细胞悬浮液，然后加入10μL 1.0×10-6M EpCAM适体链，10μL已经制备好的拉曼探针共同孵育1h；离心洗涤后分散于10μL PBS中，移取其中1μL滴加于活化好的金片上检测拉曼信号。
本发明的另一目的在于提供一种在人外周血中检测MCF-7细胞中的应用方法，包括：
将500μL含有不同MCF-7细胞数量的PBS缓冲溶液与500μL新鲜的全血混合。
轻轻滴加于人外周血分离培养基上，注意要使分离界限清晰，于400g下离心25min后，此时出现分层情况：从上到下共分为四层，第一层呈现淡黄色液体，为血浆层；第二层为白膜层，为所需分离提取的淋巴细胞及MCF-7细胞层；第三层为透明液体，为分离介质；第四层为红细胞层。
用移液枪小心移取第二层细胞，加于新的洁净的离心管中，用PBS离心洗涤两次，然后将细胞重新分散于50μL PBS中；使用人外周血分离培养基分离提取所需淋巴细胞及MCF-7细胞层；用PBS离心洗涤两次，然后将细胞重新分散于50μL PBS中。
将10μL 10-6M EpCAM适体链，10μL拉曼探针添加到细胞悬浮液中，孵育1h；样品在3000rpm下离心5min，PBS洗涤三次，重新分散在10μL PBS中。取1μL滴在金片上，进行拉曼信号的检测。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明合成DNA三棱锥后利用静电作用与季铵盐修饰的纳米金结合。带有巯基的拉曼探针5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)与其中的纳米金结合后，得到了一种新型拉曼探针。利用该探针结合EpCAM适体链可以实现对循环肿瘤细胞CTCs的检测。实验中，本发明利用该探针实现了在大量阴性细胞背景下对人乳腺癌细胞MCF-7细胞的检测以及在人外周血环境中MCF-7细胞的检测。
本发明提高了对循环肿瘤细胞CTCs靶向检测的准确性和灵敏度，能够达到早期诊断治疗的目的；检测过程中无需酶催化放大，缩短检测时间，节省检测成本。
附图说明
图1是本发明实施例提供的拉曼探针的结构示意图。
图2是本发明实施例提供的拉曼探针与传统拉曼探针的信号对比图。
图3是FDTD模拟的本发明实施例提供的拉曼探针的热点效应图。
图4是本发明实施例提供的探针在HEK-293T细胞中检测不同浓度的MCF-7细胞图。
图5是本发明实施例提供的探针在人外周血中检测不同浓度的MCF-7细胞图。
图6是相对应的本发明实施例提供的探针在人外周血中检测MCF-7细胞线性图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
现有技术的探针没有结合EpCAM适体链，对循环肿瘤细胞CTCs的检测准确率低。而且现有技术的探针实用性差。
为解决对上述问题，下面结合具体方案对本发明作详细描述。
本发明实施例提供的新型拉曼探针的制备方法包括：
室温下通过混合带正电荷的金纳米颗粒与带负电DNA三棱锥两种溶液，来实现DNA与金纳米颗粒的组装。拉曼分子选用5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，取适量DTNB于DMSO溶液中，配置成10mM的储备液，储存在-20℃下。将5μL DNA三棱锥,25μL DTNB,75μL金胶和20μL TE缓冲溶液混合，室温过夜孵育，离心洗涤以去除未结合的反应物。其结构如图1(a)、图1(b)所示。
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
将有无DNA三棱锥结构的拉曼探针进行信号对比，图2中曲线a为没有DNA三棱锥结构下的拉曼信号，曲线b为在有DNA三棱锥结构存在下的拉曼信号。
实施例2
如图3所示，时域有限差分法(FDTD,Finite-Difference Time-Domain)模拟，说明本发明所制备的拉曼探针比单个金纳米粒子的热点效应更明显，表面增强拉曼效果更好。
实施例3
本发明实施例提供的阴性细胞HEK-293T中检测MCF-7细胞的方法包括：
分别向10μL 1.0×106cells/mL HEK-293T细胞悬浮液中加入10μL不同细胞浓度的MCF-7细胞悬浮液，然后加入10μL 1.0×10-6M EpCAM适体链，10μL已经制备好的拉曼探针共同孵育1h。离心洗涤后分散于10μL PBS中，移取其中1μL滴加于活化好的金片上来检测拉曼信号(激光器的波长选择633nm)。图4为在1.0×106cells/mL HEK-293T中检测不同浓度的MCF-7细胞的拉曼图，从a到g分别代表为0，5，10，1000，10000，100000cells/mL的MCF-7细胞。
实施例4
本发明实施例提供的人外周血中检测MCF-7细胞的方法包括：
将500μL含有不同MCF-7细胞数量的PBS缓冲溶液与500μL新鲜的全血混合，使用人外周血分离培养基分离提取所需淋巴细胞及MCF-7细胞层。用PBS离心洗涤两次，然后将细胞重新分散于50μL PBS中。将10μL 10-6M EpCAM适体链，10μL拉曼探针添加到细胞悬浮液中，孵育1h。样品在3000rpm下离心5min，PBS洗涤三次，重新分散在10μL PBS中。取1μL滴在金片上，进行拉曼信号的检测。图5为在外周血中检测不同浓度的MCF-7细胞，从a到h分别代表为3,5,10,25,50,100,250,500cells/mL的MCF-7细胞。
实施例5
图6为相对应的拉曼信号随MCF-7细胞数量变化的线性图。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种非治疗和/或诊断目的的拉曼探针在阴性细胞HEK-293T中检测MCF-7细胞中的应用，其特征在于，所述拉曼探针的制备方法包括：合成的DNA三棱锥利用静电作用与季铵盐修饰的纳米金结合，得到组装后的DNA三棱锥纳米金结构；带有巯基的拉曼探针5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)与组装后的DNA三棱锥纳米金结构结合，得到拉曼探针；具体为：室温下通过混合带正电荷的金纳米颗粒与带负电的合成的DNA三棱锥两种溶液，进行合成的三棱锥DNA与金纳米颗粒的组装；选用5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)拉曼分子，取5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)于DMSO溶液中，配置成10mM的储备液，储存在-20℃下；将5μL合成的DNA三棱锥，25μL 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，75μL金胶和20μL TE缓冲溶液混合，室温过夜孵育，离心洗涤以去除未结合的反应物，得到拉曼探针；其中，一个组装后的DNA三棱锥纳米金结构只在DNA三棱锥的一个顶点预留了一段DNA，这样一个组装后的DNA三棱锥纳米金结构只结合一条EpCAM适体链，避免交叉结合，提高检测的灵敏度；
所述在阴性细胞HEK-293T中检测MCF-7细胞中的应用的方法包括：
MCF-7细胞与HEK-293T细胞全部用含10％FBS的RPMI 1640培养基分别培养；
将整瓶生长到80％的MCF-7或HEK-293T细胞用胰蛋白酶消化后，用1mL的培养液吹打使细胞悬浮并采用血细胞计数板进行细胞计数；将所得的细胞悬浮液于3000rpm下离心5min，PBS洗涤三次后稀释到所需浓度；
分别向10μL 1.0×106cells/mL HEK-293T细胞悬浮液中加入10μL不同细胞浓度的MCF-7细胞悬浮液，然后加入10μL 1.0×10-6M EpCAM适体链，10μL上述已经制备好的拉曼探针共同孵育1h；离心洗涤后分散于10μL PBS中，移取1μL滴加于活化好的金片上检测拉曼信号。
2.一种非治疗和/或诊断目的的拉曼探针在人外周血中检测MCF-7细胞中的应用，其特征在于，所述拉曼探针的制备方法包括：合成的DNA三棱锥利用静电作用与季铵盐修饰的纳米金结合，得到组装后的DNA三棱锥纳米金结构；带有巯基的拉曼探针5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)与组装后的DNA三棱锥纳米金结构结合，得到拉曼探针；具体为：室温下通过混合带正电荷的金纳米颗粒与带负电的合成的DNA三棱锥两种溶液，进行合成的三棱锥DNA与金纳米颗粒的组装；选用5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)拉曼分子，取5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)于DMSO溶液中，配置成10mM的储备液，储存在-20℃下；将5μL合成的DNA三棱锥，25μL 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，75μL金胶和20μL TE缓冲溶液混合，室温过夜孵育，离心洗涤以去除未结合的反应物，得到拉曼探针；其中，一个组装后的DNA三棱锥纳米金结构只在DNA三棱锥的一个顶点预留了一段DNA，这样一个组装后的DNA三棱锥纳米金结构只结合一条EpCAM适体链，避免交叉结合，提高检测的灵敏度；
所述在人外周血中检测MCF-7细胞中的应用的方法包括：
将500μL含有不同MCF-7细胞数量的PBS缓冲溶液与500μL新鲜的全血混合；滴加于人外周血分离培养基上，400g下离心25min后，从上到下共分为四层，第一层淡黄色液体为血浆层；第二层白膜层为所需分离提取的淋巴细胞及MCF-7细胞层；第三层透明液体为分离介质；第四层为红细胞层；
用移液枪移取第二层细胞，加于新的洁净的离心管中，用PBS缓冲溶液离心洗涤两次，然后将细胞重新分散于50μL PBS缓冲溶液中；使用人外周血分离培养基分离提取所需淋巴细胞及MCF-7细胞层；用PBS缓冲溶液离心洗涤两次，再将细胞重新分散于50μLPBS缓冲溶液中；
将10μL 10-6M EpCAM适体链，10μL上述已经制备好的拉曼探针添加到细胞悬浮液中，孵育1h；样品在3000rpm下离心5min，PBS缓冲溶液洗涤三次，重新分散在10μL PBS缓冲溶液中；取1μL滴在金片上，进行拉曼信号的检测。
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