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CN110234341A - 利用糖苷内切酶突变体重塑糖蛋白及其使用方法 - Google Patents

利用糖苷内切酶突变体重塑糖蛋白及其使用方法 Download PDF

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CN110234341A
CN110234341A CN201780051835.1A CN201780051835A CN110234341A CN 110234341 A CN110234341 A CN 110234341A CN 201780051835 A CN201780051835 A CN 201780051835A CN 110234341 A CN110234341 A CN 110234341A
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CN201780051835.1A
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林南宏
黄琳雅
施沙晋
陈立慈
翁启惠
吴宗益
郑婷
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Original Assignee
Cho Pharma Inc
Academia Sinica
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Abstract

糖苷内切酶S2(endoglycosidase,EndoS2)突变体包含：野生型糖苷内切酶S2序列(SEQ ID NO：1)内的一或多个突变点，其中该一或多个突变点是位于残基133‑143、残基177‑182、残基184‑189、残基221‑231、及/或残基227‑237内的肽区域内。其中，相较于野生型糖苷内切酶S2，该糖苷内切酶S2突变体具有较低的水解活性以及较高的转糖苷化活性。一种使用糖苷内切酶S2突变体来制备一经糖工程改造的糖蛋白的方法，其包含将一活化寡糖耦合至一糖蛋白受体上。活化的寡糖为聚糖恶唑啉。

Description

利用糖苷内切酶突变体重塑糖蛋白及其使用方法
相关申请案的交互参照
本申请主张美国专利申请案于2016年8月24日申请的第62/378,806号的优先权，该申请案的完整内容纳入为本揭示内容的一部分以供参照。
技术领域
本发明是关于一种从酿脓链球菌(Streptococcus Pyogenes)挑选的糖苷内切酶S2(endoglycosidase S2,EndoS2)突变体，其于合成具有各种明确定义的N-聚糖(高甘露糖型(high mannose type)、混合型(hybrid type)以及复合型(complex type))的糖蛋白或糖肽时，具有改善的转糖苷化(tranglycosylation)－活性及降低的水解活性。特别是，本发明的一或多个实施方式亦提供EndoS2突变体于有效重塑治疗性抗体的聚糖的用途，借此在Fc区域形成同质的聚糖组合物以增进其效用功能(effector function)。
背景技术
自从1986年批准第一个治疗单克隆抗体以来，这一类生物制药产品的商业管道逐渐蓬勃发展(1)。到了2015年，总共有47株单克隆抗体产品在美国或欧洲被批准用以治疗多种疾病，包括癌症、自体免疫疾病以及传染性疾病。若持续以目前的速度批准，预计在2020年将会有70株单克隆抗体产品打入市场，且全球销售量将达到1250亿美元(2)。对于单克隆抗体疗法来说，由于其临床活性取决于Fc所介导的效用功能，在Fc区域上N-聚糖的组成对药物安全性及效率至关重要。多样的糖苷化状态也会影响对药效学及药物动力学，而其他Fc聚糖结构单元则可能涉及到不良免疫反应。然而，对Fc(区域)糖苷化的控制仍是一大挑战。
典型的IgG由两个抗原结合片段(Fabs)构成，并且透过弹性区域与稳定区域(Fc)链接。Fab区域负责抗原辨识，而Fc区域Asn297位置的N-聚糖则与效用细胞上个别Fcγ受器(例如FcγRIIIa及FcγRIIb)以及补体C1q组分进行反应，借以活化诸如抗体依赖型细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cellular cytotoxicity,ADCC)及补体依赖细胞毒性作用(complement-dependent cytotoxicity,CDC)等效用功效(5-7)。几乎所有治疗性抗体的位于各同型二聚体Fc的保留性天冬酰胺酸残基(N297)皆经N-糖苷化修饰。这些以N-连接的聚糖可产生超过30种不同的糖型，且有着相当程度结构异质性的典型双分枝复合体形式，其中该核心七糖可以由核心海藻糖(fucose,Fuc)、等分N-乙酰葡萄糖胺(bisectingN-acetyl glucosamine,GlcNAc)、末端半乳糖(galactose,Gal)以及末端唾液酸(sialicacid,Sia)来进行各种修饰(8-9)。N-聚糖的组合物会影响Fc区域构型，进而调控抗体稳定性、药物动力学特征、免疫原性、效用功能、抗体介导发炎反应以及补体活性(10)。举例来说，缺乏核心海藻糖，甚或缺乏等分GlcNAc基位，都会剧烈地增强抗体对效用细胞的FcγIIIa受器(FcγRIIIa)的亲和力，导致对目标更好的消除效果(10-11)。此外，末端2,6-唾液酸化聚糖(抗体及静脉内免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin,IVIG)的次要成分)是可增进抗发炎反应特质的优化结构(12-13)。
N-糖苷化是最复杂的后转译修饰之一，重组表现系统的不同会产生包含高甘露糖型、混合型及复合型等具显著异质性的聚糖结构(14-15)。市售的治疗性抗体通常是以糖型混合物的形式存在，而该存在形式不利于各别的治疗活性。近来，为了增进效率，糖工程学已经聚集了极大的关注以控制Fc区域的糖苷化。其中一个最普遍的方法是对表现宿主的合成路径进行活体内糖工程修饰。然而，透过此方法产生的糖型有限，且无法达成完全控制所需的糖型的目标。另一个产生糖苷化异质性的替代方法是透过海藻糖酶或不透过海藻糖酶介导，利用糖苷内切酶[内-N-乙酰胺基葡萄糖苷酶(endo-N-acetyl glucosaminidase，ENGase)]将所有异质性的N-聚糖修剪掉，仅在IgGs的糖苷化位置保留第一个GlcNAc或Fuc-GlcNAc，且接着可将明确定义的恶唑啉(oxazoline)形式的活化聚糖转移回到GlcNAc受体上以形成天然的β-1,4键合(16)。
糖苷内切酶(EndoS及EndoS2)是来自人类病原酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的第18家族糖苷水解酶(glycoside hydrolase,GH)，且近年来逐渐成为治疗性抗体糖工程学的关注重点(17-18)。尽管EndoS及EndoS2彼此只有37％的序列相似度，两者均可催化人类IgG的N-键合聚糖核心内部两个N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamines，GlcNAcs)之间的β-1,4键合的水解作用。此外，两种酶均可移除在Fc区域上的复合型糖苷。然而，与EndoS相比，EndoS2对于混合型及寡甘露糖结构具有更大的水解能力(19)。更甚者，在糖-恶唑啉作为受体的情况下，部分的GH18及GH85的糖苷内切酶会转变成糖苷合成酶以催化谷质双糖键合。然而，这些糖苷合成酶酶原有的水解活性会降低整体产率。
为了进一步提升酶活性，进而发展了糖苷内切酶突变体，其包含EndoS突变体D233Q及D233A(16)。这揭示了在ENGase活性位点上的重要基位(motif)：GH18的D-X-E。此基位可辅助与参与的邻近基团进行双置换反应的ENGase催化机制。在本机制中，GlcNAc的2-乙酰胺基团作为亲核剂以取代在异构体中心的脱离基团，同时天冬酰胺(Asp)的羧酸盐促进恶唑啉离子中间物的形成。催化残基(谷氨酸盐)可当作一般酸/碱(general acid/base)，作用为质子化该聚糖脱离基团并将水(H2O)去质子化使具亲核性，借此导致恶唑啉离子中间物的水解。也有报导指出天门冬胺酸盐的羧酸盐(也就是E的N-端的第二个残基)可促进恶唑啉离子中间物的稳定成形。EndoS的D233Q突变则被指出可增进转糖苷化活性并减少水解活性。
前述的EndoS D233Q突变体是目前为止已知的最佳糖苷合成酶。他们具有合成同构型抗体的强大潜力。然而，起始材料完全转换成产物须非常大量的酶，生产大规模酶类及反应之后为了移除残余酶类的纯化步骤非常繁琐且耗费人力，如此会对整体糖工程制备方法产生较大的成本。此外，EndoS突变体的转糖苷化活性受限于特定对称的双分枝复合型糖型，但不限于广泛的高甘露糖型、混合型及三分枝与四分枝复合型糖型(这些类型具有额外的原生修饰体，例如GlcNAc的α-1,3-海藻糖、Gal的α-1,2-海藻糖、延伸的聚乙酰基乳糖胺基位、以及在末端(termini)的不对称唾液酸化分枝(antennae))使运用受限。
因为EndoS2具有可水解各种IgG聚糖的潜能，IgG糖工程学领域对其产生了极大的兴趣。根据EndoS及EndoS2的序列比对结果，推测EndoS2的D184位点与EndoS的D233位点相同。因此，可预期Endo S2的D184位点的突变形式可能可增进EndoS2的转糖苷化活性以及消弱水解活性的能力。鉴于上述现有技术，若可在野生型EndoS2的活性位置附近进行定点诱变，则应有利于改善EndoS2的糖苷合成酶活性。本揭示内容提供具有优异糖苷合成酶活性及已降低的水解活性的EndoS2突变体。更重要的是，本发明的新颖EndoS2突变体提供广泛的受体范围，并且能够将高甘露糖型、混合型及双分枝及三分枝复合型的N-聚糖转化成具有活性的聚糖恶唑啉(glycan oxazoline)。本发明的EndoS2突变体有利于制备多样的糖苷化同质抗体，特别是那些预期应获得抗发炎活性的全唾液酸化多分枝糖型的抗体，借以进行生物物理及结构的研究。
发明内容
本揭示内容的实施方式是关于选定的EndoS2突变体，该突变体对广泛范围的高甘露糖型、混合型以及复合型N-聚糖具有较少的水解活性及优异的转糖苷化活性。这些EndoS2突变体可用于制备同构型糖苷化糖肽、糖蛋白以及治疗性抗体或其Fc片段。本发明的实施方式可有效重塑这些于抗体Fc区域具有高甘露糖型、混合型以及复合型等糖型的治疗性抗体或是其Fc片段。经糖工程改造的抗体可增进其效用功能(诸如FcγIIIA结合及抗体依赖型细胞介导的细胞毒性作用等)及其药理特性。此外，本揭示内容的实施方式能够快速地评估多种治疗性抗体的Fc糖苷化在其效用功能上的作用，特别是那些预期要获得抗发炎活性的高唾液酸化复合型糖型的治疗性抗体的作用。
本揭示内容的一方式提供数种EndoS2突变体，其中该多个突变体具有至少80％的同源性且可增加各种诸如高甘露糖型、混合型以及复合型等N-聚糖对海藻糖化或非海藻糖化的GlcNAc受体的转糖甘化活性，其中该突变体能够有效率地将活化寡糖供体转移至海藻糖化或非海藻糖化的GlcNAc受体上，借以形成新的糖肽、糖蛋白或治疗性抗体的同构型糖型。
在另一个方式中，本发明提供具有优异转糖苷化活性但水解活性较弱的EndoS2突变体，其中该突变体较佳包含T138、D182、D226、T227及T228等定点突变(site specificmutation)，但不限于T138D(SEQ ID NO:6)、T138E(SEQ ID NO:7)、T138F(SEQ ID NO:8)、T138H(SEQ ID NO:9)、T138K(SEQ ID NO:10)、T138L(SEQ ID NO:11)、T138M(SEQ ID NO:12)、T138N(SEQ ID NO:13)、T138Q(SEQ ID NO:14)、T138R(SEQ ID NO:15)、T138V(SEQ IDNO:16)、T138W(SEQ ID NO:17)、D182Q(SEQ ID NO:2)、D226Q(SEQ ID NO:3)、T227Q(SEQ IDNO:4)、以及T228Q(SEQ ID NO:5)。
在另一方式中，本揭示内容提供了具有优异转糖苷化活性及较低水解活性的EndoS2突变体于将活化寡糖供体转移到海藻糖化或非海藻糖化的GlcNAc受体的用途，其中该活化寡糖供体包含合成的聚糖恶唑啉。在一实施方式中，包含高甘露糖型、混合型以及复合型等N-聚糖的合成聚糖恶唑啉具有以下的化学式：
其中，R1是透过β-1,4键合的-H或N-乙酰葡萄糖胺，且R2及R3可以相同或不同，且是独立地选自由：
所组成的群组。
在另一个方式中，本发明提供在核心海藻糖化或非海藻糖化的GlcNAc受体上进行转糖苷化作用的EndoS2突变体，其中该核心海藻糖化或非海藻糖化的GlcNAc受体包含核心海藻糖化或非海藻糖化的GlcNAc肽、蛋白质及IgG的Fc区域或其片段。
在进一步的方式中，本发明提供在核心海藻糖化或非海藻糖化的GlcNAc-IgG上进行转糖苷化作用的EndoS2突变体，其中该IgG是单克隆抗体且选自由西妥昔单抗(cetuximab)、利妥昔单抗(rituximab)、莫罗莫那-CD3(muromonab-CD3)、阿昔单抗(abciximab)、达昔单抗(daclizumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、帕利珠单抗(palivizumab)、英夫利西单抗(infliximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、吉妥单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、阿来组单抗(alemtuzumab)、ibritumomab tiuxetan、阿达木单抗(adalimumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、托西莫单抗(tositumomab)、I-131托西莫单抗(I-131tositumomab)、依法利珠单抗(efalizumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、那他珠单抗(natalizumab)、依那西普(etanercept)、IGN101、伏洛昔单抗(volociximab)、抗-CD80mAb、抗-CD23mAb、CAT-3888、CDP-791、eraptuzumab、MDX-010、MDX-060、MDX-070、马妥珠单抗、CP-675,206、CAL、SGN-30、扎木单抗(zanolimumab)、阿德木单抗(adecatumumab)、奥果伏单抗(oregovomab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、ABT-874、地诺单抗(denosumab)、AM 108、AMG 714、芳妥珠单抗(fontolizumab)、达昔单抗(daclizumab)、利木单抗(golimumab)、CNTO 1275、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、HuMax-CD20、贝利单抗(belimumab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、MLN1202、维西珠单抗(visilizumab)、托西珠单抗(tocilizumab)、ocrerlizumab、certolizumabpegol、艾库组单抗(eculizumab)、沛瑟珠单抗(pexelizumab)、阿昔单抗(abciximab)及兰尼单抗(ranibizimumab)所组成的群组。
在另一独立方式中，本发明提供用以重塑核心海藻糖化或非海藻糖化的GlcNAc-肽、蛋白质以及IgG或IgG-Fc片段的方法，其中该方法包含：提供肽/蛋白质/抗体-GlcNAc受体或Fc片段，且在酿脓链球菌(Streptococcus Pyogenes)EndoS2突变体的催化下与活化的寡糖供体反应，借此制备具有异质性糖苷化状态的肽、蛋白质及单克隆抗体的实质上纯糖型。
在另一方式中，本发明提供使用EndoS2突变体来聚糖重塑治疗性IgG或其Fc片段的方法，其中该方法包含：
A.以糖苷内切酶(野生型EndoS2)及细菌α海藻糖酶一同处理或仅以糖苷内切酶(野生型EndoS2)单独处理带有异质性N-聚糖的天然或重组核心海藻糖化或非海藻糖化的治疗性IgG或IgG-Fc片段，借以水解在两个还原端GlcNAc残基之间的键合，并形成核心海藻糖化或非海藻糖化的GlcNAc-IgG受体；
B.将活化寡糖供体形式的不同预定义寡糖建构单元转移至核心海藻糖化或非海藻糖化GlcNAc-IgG受体，利用酿脓链球菌(Streptococcus Pyogenes)EndoS2突变体进行转糖苷化作用以重新建构天然β-1,4键合，借此将预定义寡糖附接至重塑核心海藻糖化或非海藻糖化的IgG或其Fc片段。
在又一方式中，本揭示内容提供一种组合物，其包含海藻糖化或非海藻糖化的经糖工程改造的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段由在每侧Fc区域具有相同N-聚糖结构的IgG分子组成，其中N-聚糖是高甘露糖型、混合型及复合型，且选自由：
所组成的群组。其中，R1是透过β-1,4键合的–H或N-乙酰葡萄糖胺，且R2及R3可以相同或不同，且是独立地选自由：
所组成的群组。
在另一个方式中，本揭示内容提供经糖工程改造的抗体，其相较于未经修饰的抗体，具有较佳的效用功能(例如与FcγIIIA结合的能力及ADCC)。
本揭示内容的另一个方式揭示一种用于治疗癌症病患的药学组合物，其包含本揭示内容所述的经糖工程改造抗体的组合物以及药学上可接受的载体。
前述癌症包含，但不限于：B细胞淋巴瘤(B cell lymphomas)、NHL、前驱B细胞淋巴母细胞性白血病(precursor B cell lymphoblastic leukemia)或前驱B细胞淋巴胚细胞性淋巴瘤(precursor B cell lymphoblastic lymphoma)及成熟B细胞瘤(mature B cellneoplasms)、B细胞慢性淋巴球性白血病(B cell chronic lymphocytic leukemia，CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma，SLL)、B细胞幼淋巴球性白血病(Bcell prolymphocytic leukemia)、淋巴浆细胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)、外套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)、滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma，FL)、低度、中度及高度FL、皮肤毛囊中心淋巴瘤(cutaneous follicle center lymphoma)、边缘区B细胞淋巴瘤(marginal zone B cell lymphoma)、MALT型边缘区B细胞淋巴瘤(MALTtype marginal zone B cell lymphoma)、节点边缘区B细胞淋巴瘤(nodal marginal zoneB cell lymphoma)、脾型边缘区B细胞淋巴瘤(splenic type marginal zone B celllymphoma)、毛细胞白血病(hairy cell leukemia)、弥漫性大细胞淋巴瘤(diffuse largeB cell lymphoma)、柏基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、浆细胞瘤(plasmacytoma)、浆细胞骨髓瘤(plasma cell myeloma)、移植后淋巴增生性疾病(post-transplantlymphoproliferative disorder)、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom'smacroglobulinemia)以及退行性变化大细胞淋巴瘤(anaplastic large-cell lymphoma，ALCL)。
本发明欲进行糖工程改造的抗体是选自由西妥昔单抗(cetuximab)、利妥昔单抗(rituximab)、莫罗莫那-CD3(muromonab-CD3)、阿昔单抗(abciximab)、达昔单抗(daclizumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、帕利珠单抗(palivizumab)、英夫利西单抗(infliximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、吉妥单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、阿来组单抗(alemtuzumab)、ibritumomab tiuxetan、阿达木单抗(adalimumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、托西莫单抗(tositumomab)、I-131托西莫单抗(I-131tositumomab)、依法利珠单抗(efalizumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、那他珠单抗(natalizumab)、依那西普(etanercept)、IGN101、伏洛昔单抗(volociximab)、抗-CD80mAb、抗-CD23mAb、CAT-3888、CDP-791、eraptuzumab、MDX-010、MDX-060、MDX-070、马妥珠单抗、CP-675,206、CAL、SGN-30、扎木单抗(zanolimumab)、阿德木单抗(adecatumumab)、奥果伏单抗(oregovomab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、ABT-874、地诺单抗(denosumab)、AM 108、AMG 714、芳妥珠单抗(fontolizumab)、达昔单抗(daclizumab)、利木单抗(golimumab)、CNTO1275、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、HuMax-CD20、贝利单抗(belimumab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、MLN1202、维西珠单抗(visilizumab)、托西珠单抗(tocilizumab)、ocrerlizumab、certolizumab pegol、艾库组单抗(eculizumab)、沛瑟珠单抗(pexelizumab)、阿昔单抗(abciximab)、以及兰尼单抗(ranibizimumab)所组成的群组。
在参阅下文实施方式以及后附的申请专利范围之后，本发明所属技术领域中具有通常知识者当可轻易了解本发明的其他方式及优势。
附图说明
图1是关于野生型EndoS2的序列以及欲进行定点诱变的潜在氨基酸残基。
图2根据本发明一实施方式所阐述的EndoS2突变体T138D(SEQ ID NO:6)、T138E(SEQ ID NO:7)、T138F(SEQ ID NO:8)、T138H(SEQ ID NO:9)、T138K(SEQ ID NO:10)、T138L(SEQ ID NO:11)、T138M(SEQ ID NO:12)、T138N(SEQ ID NO:13)、T138Q(SEQ ID NO:14)、T138R(SEQ ID NO:15)、T138V(SEQ ID NO:16)、T138W(SEQ ID NO:17)、D182Q(SEQ ID NO:2)、D226Q(SEQ ID NO:3)、T227Q(SEQ ID NO:4)及T228Q(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列。
图3(A)小图：基于与EndoS序列比对的结果，卡通图显示EndoS2催化区域的推想第三个β褶板、第四个β褶板以及第五个β褶板。催化残基为E186，而围绕在E186周围的突变氨基酸包含T138、D182、D226、T227及T228。(B)小图：使用市售利妥昔单抗作为受体以测定野生型EndoS2以及每个选定位点的突变体的聚糖水解活性的结果。将EndoS2突变体(52nM)与市售利妥昔单抗(52μM)并同反应120分钟，并以SDS-PAGE分析。图标显示原始利妥昔单抗(Rtx-聚糖)的相对百分比。使用突变体D184Q作为对照。
图4显示使用GlcNAc-利妥昔单抗(67.5μM)作为受体而α-2,6唾液酸化双分支复合型聚糖(SCT)-恶唑啉(2.5mM)作为供体测试野生型EndoS2及每个选定位点突变体的(67.5nM)的转糖苷化活性的结果。反应进行2小时，并以SDS-PAGE分析。结果显示利妥昔单抗及Fc区域的α-2,6唾液酸化双分支复合型聚糖(Rtx-SCT)的相对百分比。使用突变体D184Q作为对照。
图5显示使用GlcNAc-利妥昔单抗作为受体且α-2,6唾液酸化双分支复合型聚糖(SCT)-恶唑啉作为供体，在T138位点突变的转糖苷化活性比较结果。将含有T138突变体(67.5nM)、GlcNAc-利妥昔单抗(67.5μM)以及SCT-恶唑啉(2.5mM)的反应物进行反应2小时且以SDS-PAGE分析。结果显示利妥昔单抗及Fc区域的α-2,6唾液酸化双分支复合型聚糖(Rtx-SCT)的相对百分比。
图6是借由使用GlcNAc-利妥昔单抗作为受体以及聚糖-恶唑啉(G1-G4)作为供体受体以测定选定的EndoS2突变体对高甘露糖型Man5GlcNAc2(聚糖G1)、Man9GlcNAc2(聚糖G2)以及混合型糖型系列聚糖(G3及G4)的转糖苷化活性结果。以十二基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)监测该反应过程。电泳道(Lane)1：标记物：电泳道2：GlcNAc-利妥昔单抗；时间点以分钟计；产物百分比(％)显示于底部。
图7是选定的EndoS2突变体对三分支复合型聚糖G5(末端为半乳糖残基)及G6(末端为α-2,6唾液酸)的转糖苷化活性结果。使用GlcNAc-利妥昔单抗作为受体，而聚糖-恶唑啉(G4-G5)作为供体受体以执行该反应。以十二基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)监测该反应过程。电泳道(Lane)1：标记物：电泳道2：GlcNAc-利妥昔单抗；时间点以分钟计；产物百分比(％)显示于底部。
图8是选定的EndoS2突变体对一系列双分支复合型糖型结构的转糖苷化活性的结果。聚糖G7是末端有二个半乳糖的双分支聚糖；聚糖G8是有等分GlcNAc且末端有二个半乳糖的双分支聚糖；聚糖G9是在二个半乳糖末端之一上带有α-1,2海藻糖的双分支聚糖；以及聚糖G10是在GlcNAc及末端二半乳糖上都有α-1,3海藻糖的双分支聚糖。使用GlcNAc-利妥昔单抗作为受体，而聚糖-恶唑啉(G7-G10)作为供体受体以执行该转糖苷化作用。以十二基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)监测该反应过程。电泳道1：标记物；电泳道2：GlcNAc-利妥昔单抗；时间点以分钟计。
图9是选定的EndoS2突变体对二分支复合型聚糖G7(末端为半乳糖残基)及G16(末端为α-2,6唾液酸)的转糖苷化活性结果。使用Fuc(α-1,6)-GlcNAc-利妥昔单抗作为受体，而聚糖-恶唑啉(G4-G16)作为供体受体以执行该反应。以十二基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)监测该反应过程。电泳道1：标记物：电泳道2：GlcNAc-利妥昔单抗；时间点以分钟计；产物百分比(％)显示于底部。
图10显示选定的EndoS2突变体对广泛范围的高甘露糖型、混合糖型、复合糖型聚糖的受体特异性。
图11显示利妥昔单抗与其Fc区域上多样糖型的结构。糖型包含一系列高甘露糖型、混合型以及双、三分支复合型结构。
图12是经糖工程改造利妥昔单抗(Rtx G1-G16)、GlcNAc-利妥昔单抗以及市售利妥昔单抗的SDS-PAGE分析结果。
具体实施方式
本发明的实施方式是关于选定的多种EndoS2突变体，该突变体展现出优异的转糖苷化活性，借以将来自活化寡糖恶唑啉的广泛范围高甘露糖型、混合型或复合型的N-聚糖转移至经海藻糖化或非经海藻糖化的GlcNAc-肽、蛋白质或IgGs受体上，同时具有很少或微不足道的水解产物。新颖EndoS2突变体有效地发挥作用以使同构型糖苷化的糖肽、糖蛋白以及治疗性抗体及其Fc片段具有各种确定的糖型。此外，本发明的实施方式可提供效用功能改善的糖工程改造抗体(诸如FcγIIIA结合及抗体依赖型细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)等)及其药理特性。本发明的实施方式也能够快速地评估多种治疗性抗体的Fc糖苷化在其效用功能上的效果。
配合参考形成本文一部分的图式进行以下说明，同时借由可实践的具体实施例而揭示/公开本发明的实施方式。详细描述这些实施方式以使所属技术领域具有通常知识者能够实践本发明。应当理解的是，可设计其他实施方式，或是可在不背离本发明本发明的范畴的情况下进行结构、逻辑及电学的变更。以下实施方式的实施例的描述因此不应被认为具有限制意味，且本发明的范畴应在后附的申请专利范围中进行界定。
除非本文另有定义，本文所有的技术及科学术语与本发明所属技术领域具有通常知识者已知的术语的意思相同。尽管与本文所描述相同或等同的方法及材料可以用于本发明的实施方式或测试中，以下将描述本发明的较佳方法及材料。出于各种目的，本文具体提到的所有出版物和专利文件(包括描述和揭示可以结合本发明使用的出版物中报导的化学物、细胞株、载体、动物、仪器、统计分析以及方法)借由引用而并入本文。在说明书中引用的参考文献可被视为所属技术领域具有通常知识者的指示。本文中的任何内容都不应被解释为本发明没有权利凭借现有发明而使本发明早于这样的公开内容。
描述本材料以及方法之前，应当理解的是，本发明不限于描述的特定方法、程序、材料以及试剂，特别是这些方法、程序、材料以及试剂可千变万化。应当被理解的是本文使用的术语是为了描述特定实施方式的目的，而非旨在限制本发明的范畴，而本发明的范畴应仅被限定在附加的申请专利范围中。
定义
除非上下文另有明确说明，应注意的是，如本文和后附的申请专利范围所使用的，单数形式「一」(a,an)以及「该」(the)包含复数形式。
本文所使用的「聚糖」(glycan)一词是指多糖、寡糖或单糖。聚糖可以是糖残基(residue)的单体或聚合物，也可以为直链或支链。聚糖可包含天然糖基团(residue)(例如：葡萄糖、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰神经胺酸(N-acetyl neuraminic acid)、半乳糖、甘露糖、海藻糖、六碳糖、阿拉伯糖、核糖、木糖等)及/或经修饰的糖(例如：2'-氟代核糖(2′-fluororibose)、2'-脱氧核糖(2′-deoxyribose)、磷甘露糖(phosphomannose)、6'磺基N-乙酰葡萄糖胺(6′sulfo N-acetylglucosamine)等)。
本文所使用的「海藻糖」(fucose)、「核心海藻糖」(core fucose)以及「核心海藻糖残基」(core fucose residue)这些术语可交互地使用，并且用来指称海藻糖的α-1,6位置连接至N-乙酰葡萄糖胺。
本文所使用的「N-聚糖」(N-glycan)、「N-键合聚糖」(N-linked glycan)、「Fc聚糖」(Fc glycan)以及「Fc糖苷化」(Fc glycosylation)该些术语是可交互使用，且被用以指称借由与含Fc多肽天冬酰胺酸残基的酰胺氮键合的N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)所附着的N-键合寡糖。术语「含Fc多肽」(Fc-containing polypeptide)是指称包含Fc区域的多肽，像是抗体。
本文使用的「糖苷化模式」(glycosylation pattern)以及「糖苷化特征」(glycosylation profile)的词语可交互使用，并用以指称N-聚糖种类的特征「指纹」(fingerprint)，N-聚糖是已经从糖蛋白或抗体释出(不论是透过酶处理地或是化学性地)，接着经LC-HPLC、或MALDI-TOF MS等分析其碳水化合物结构。举例来说，可参阅在CurrentAnalytical Chemistry,Vol.1,No.1(2005),pp.28-57中的评论文章；在此透过引用将全文并入。
本文使用的「经糖工程改造的Fc」(glycoengineered Fc)一词是指称Fc区域上被改变或是被改造的N-聚糖，不论是经酶处理地或是化学地。本文所使用的「Fc糖工程改造」(Fc glycoengineering)术语是指用于制作经工程改造的Fc的酶处理程序或是化学程序。
Fc区域的糖苷化特征的内文中，「同质的」(homogeneous)、「均质」(uniform)、「均质地」(uniformly)以及「同构型」(homogeneity)可交互使用，且旨在表示以一种期望的N-聚糖种类为代表，且没有极微量前驱物N-聚糖的单一糖苷化模式。
本文使用的术语「IgG」、「IgG分子」(IgG molecule)、「单克隆抗体」(monoclonalantibody)、「免疫球蛋白」(immunoglobulin)以及「免疫球蛋白分子」(immunoglobulinmolecule)可交互地使用。
本文所载的「Fc受体」(Fc receptor)或「FcR」一词描述与抗体的Fc区域结合的受体。较佳的FcR是一人类FcR的天然序列。此外，较佳的FcR是结合IgG抗体的受体(γ受体)，且包含FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体(包括这些受体的对偶基因变体和选择性剪接型)。FcγRII受体包括具有相似氨基酸序列的FcγRIIA(「活化受体」(activatingreceptor))及FcγRIIB(「抑制受体」(inhibiting receptor))，其主要区别在于其细胞质内区域。活化受体FcγRIIA在其细胞质内区域中含有免疫受体酪胺酸为基础的活化基位(activation motif，ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质内区域中含有免疫受体酪胺酸为基础的抑制基序(inhibition motif，ITIM)。(请参阅总论M.in Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcRs的总论则参照Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol9:457-92(1991)；Capel et al.,Immunomethods 4:25-34(1994)；andde Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。本文「FcR」一词亦包含其他将来将要被鉴定的FcR。该术语还包括负责将母体IgGs转移到胎儿的新生儿受体：FcRn(Guyer etal.,J.Immunol.117:587(1976)and Kim et al.,J.Immunol.24:249(1994))。
本文使用的「效用功能」(effector function)是指抗体Fc区域与Fc受体或配体的交互作用所造成的生化事件。例示性的「效用功能」包含C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖型细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体的下调(例如：B细胞受体；BCR)。可以使用所属技术领域中具有通常知识者已知的各种测定方法来评估此类的效用功能。
本文使用的「抗体依赖型细胞介导的细胞毒性作用」(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)或「ADCC」是指一种细胞毒性作用。在该作用中，经分泌的Ig会结合到在特定效用细胞(effector cell)(例如：自然杀手细胞、嗜中性球以及巨噬细胞)所表现的Fc受体后，促使这些效用细胞特异性的辨认抗原的标的细胞，并以细胞毒素(cytotoxin)杀死该多个标的细胞。抗体「武装」(arm)这些效用细胞对于这种杀伤作用中是绝对需要的。介导ADCC的NK细胞主要表现FcγRIII，而单核球则表现FcγRI、FcγRII及FcγRIII。在造血细胞上表现的FcR总结在Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464页的表三中。为了达成感兴趣分子的ADCC活性，可执行美国专利号：5,500,362或美国专利号：5,821,337所描述的活体外ADCC测定方法。有效的效用细胞包括外周血单核细胞(PBMC)以及自然杀手细胞(NK)。或者是，可在活体内评估感兴趣的分子的ADCC活性，例如，揭示/公开在Clynes et al.PNAS(USA)95:652-656(1998)中的动物模型中。
在市面上可取得及/或近来在各阶段临床试验中的治疗性蛋白，大约有二分的三是单克隆抗体，这些单克隆抗体中的30个抗体以及其衍生物被批准作为不同病症(主要是肿瘤疾病、发炎反应以及自体免疫疾病)的治疗用途。然而，天然和重组糖蛋白的聚糖微异质性是开发以糖蛋白为基础的药物的主要障碍。蛋白质或抗体表现通常产生只有在侧边寡糖结构有所差异的糖型混合物，而且这些混合物可能具有不同的生物活性，因此在蛋白质或抗体表现的过程中控制糖苷化阶段是相当困难的。近来引起人们对治疗性抗体的糖工程的高度关注的两个酶是来自人类病原体酿脓链球菌的EndoS及EndoS2(Collin and Olsén2001； et al.2013)。首先发现此酶是作为可借由水解抗体的N-键合聚糖以取消免疫球蛋白G(IgG)的效用功能的细菌回避因子。
在IgGs的每个CH2区域上的复合体N-键合寡糖的结构对Fc区域的结构是至关重要的，同时也事关与Fc受体的交互作用(Krapp et al.2003；Woof and Burton 2004)。在IgG-Fc区域的寡糖链含有一些N-乙酰基-葡萄糖胺(N-Acetyl-Glucosamine，GlcNAc)及甘露糖(Man)残基，最后是半乳糖(Gal)及海藻糖(Fuc)残基以及唾液酸(Sia或N-乙酰基神经胺酸(N-acetylneuraminic acid，NANA)。GlcNAc不论有没有α1-6Fuc都附接至Asn297。GlcNAcβ1-4则附接至前述第一个GlcNAc。接着两个Manα1-6及Manα1-3双臂彼此附接以形成Manβ1-4。双臂均包含额外的GlcNAcβ1-2，而Galβ1-4可附接或可不附接在GlcNAcβ1-2上。如此，糖链可含有0、1或2个半乳糖残基，其分别定义为G0、G1、及G2糖型。糖型也可产生其他变异，其包括双分支GlcNAcβ1-4及以唾液酸或甚至是Galα1-3残基对其中一分支或双分支的末端半乳糖残基加帽。以糖苷内切酶对Fc-聚糖进行酶切割造成Fc区域的变形，且会剧烈地降低IgG与Fcγ受体结合的能力(Allhorn et al.2008)。虽然EndoS及EndoS2彼此的序列有37％的相似度，两者均可催化人类IgG的N-键合聚糖核心内部两个N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamines，GlcNAcs)之间的β-1,4键合的水解作用。然而，除了复合型聚糖之外，EndoS2比起EndoS，可水解混合型结构及寡甘露糖结构的程度更甚( et al.2015)。
自从1980年代首个抗体治疗问世以来，在临床试验有超过240种治疗性抗体且此领域稳定地发展(Chan and Carter 2010)。IgG-Fc聚糖在抗体功能性上扮演的角色已经吸引单株治疗性抗体的成长领域中巨大的注意。因此，为了增进治疗性抗体的效能，主要焦点将转移到可特异性地与所挑选的Fcγ受体反应的Fc-聚糖糖工程学。(Sondermann etal.2013；Bournazos et al.2014；Monnet et al.2014；Quast and Lünemann 2014)。某些重要的聚糖修饰可显著地影响效用功能，包括i)缺乏核心海藻糖残基附接至减少的末端GlcNAc残基会导致FcγRIIIa的亲和力增加且接着增加抗体依赖型细胞毒性(Iidaetal.2006)；ii)IgG富含唾液酸的聚糖则声称会透过增加与树突细胞及巨噬细胞上DC-SIGN受体的交互作用而增加IgGs的抗发炎反应(Anthony et al.2008；Anthony and Ravetch2010；Pincetic et al.2014)；iii)具有双分支的GlcNAc的其中一分支相较于另一个同源的对应物具有较强的ADCC。近年来，控制Fc-糖苷化状态的生物技术工具的改善促进预定义糖型的治疗性抗体的发展。因此，为着功能性及结构性研究，将感兴趣的肽、蛋白质以及抗体附接至广泛范围的高甘露糖型、混合型以及复合型N-聚糖的糖工程领域中，本发明的EndoS2突变体可说是取得重大的进步。
本发明的特征及优点将透过以下非限制性的实施例更清楚地说明。本发明所属技术领域中具有通常知识者应当理解到，这些实施例仅用于说明，且不背离本发明的范畴的情形下，当可对其进行各种更动与修饰。
实施例
制备用以糖工程改造肽、治疗性蛋白质及完整IgGs或其Fc片段的EndoS2突变体
目前为止，可借由在水解过程中负责促进恶唑啉离子中间物形成的关键天冬酰胺酸残基的定点诱变，而从一些GH85糖苷内切酶(ENGases，包含：EndoA、EndoM以及EndoD)生产糖苷合成酶。
来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的EndoS属于糖苷水解酶第18族(GH18)，该族也包括EndoFl、EndoF2及EndoF3。这些GH18酶裂解人类IgGs的天冬酰胺酸-键合双分支聚糖以产生单GlcNAc抗体的高效率水解活性广为人知。即便EndoS也可作为糖苷合成酶，将聚糖恶唑啉作为受体来合成谷质双糖键合，但这些酶类的内生水解活性将造成主要的阻碍，这导致合成糖蛋白的产量显著地下降。酶活性的进一步改善则导致糖苷内切酶突变体的产生，其包括D233Q。这ENGase活性位点上提供重要基位(motif)：GH18的D-X-E。此基位对参与的邻近基团进行双置换反应的ENGase催化机制提供支持。在本机制中，GlcNAc的2-乙酰胺基团作为亲核剂以取代在异构体中心的脱离基团，同时Asp的羧酸盐促进恶唑啉离子中间物的形成。催化残基(谷氨酸盐)则作为可质子化该聚糖脱离基团并去质子化亲核性的H2O的一般酸/碱，借此造成恶唑啉离子中间物的水解作用，以形成水解产物。也有报导指出天门冬胺酸盐的羧酸盐(也就是E的N-端的两个残基)可促进恶唑啉离子中间物的稳定成形。EndoS的D突变成Q则被指出可增进转糖苷化作用并减少水解活性。
虽然EndoS D233Q突变体及D233A突变体均展现合成同构型抗体的强大潜力，为了达成更有效的反应还是需要额外添加大量的酶。酶的制备以及反应之后去除酶的后续步骤将变得繁琐且耗费人力。近来，EndoS2作为一种新的酶，从另一种酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的血清型中被定义出来。除了在EndoS催化的所有物中，内-β-N-乙酰葡萄糖胺苷酶对复合型N-聚糖的活性之外，EndoS2相较于EndoS可具有更大程度的切割N-聚糖的混合型及寡甘露糖结构(Jonathan et al.,2013and 2015)。
EndoS2与EndoS仅有37％的序列相似度，而EndoS的结构采用催化域常用的(β/α)8桶状构型。根据这两种酶类的序列排列结果，位于EndoS2第四个β褶板的残基E186对应于EndoS的一般酸/碱性D235残基。
为了探索EndoS2转糖苷化作用的催化效率，着手进行检测在催化位点附近的氨基酸转化是否会调控其转糖苷化活性。发明人选择在催化域附近的一些残基，以定点诱变进行突变。突变的残基包含第三个β褶板上的T138、在第四个β褶板上的D182、在第五个β褶板上的D226、T227及T228(图3A小图)。进行测试的EndoS2突变体包含T138D(SEQ ID NO:：6)、T138E(SEQ ID NO:：7)、T138F(SEQ ID NO:：8)、T138H(SEQ ID NO:：9)、T138K(SEQ ID NO:：10)、T138L(SEQ ID NO:：11)、T138M(SEQ ID NO:：12)、T138N(SEQ ID NO:：13)、T138Q(SEQID NO:：14)、T138R(SEQ ID NO:：15)、T138V(SEQ ID NO:：16)、T138W(SEQ ID NO:：17)、D182Q(SEQ ID NO:：2)、D226Q(SEQ ID NO:：3)、T227Q(SEQ ID NO:：4)、以及T228Q(SEQ IDNO:：5)(图2及表1)。这些突变体在大肠杆菌(E.coli)中以高产率表现His-tag融合蛋白，其可以透过Ni-NTA亲和管柱进行纯化。结果显示靠近活性位点的突变会剧烈地增进转糖苷化活性且降低糖苷内切酶活性，而导致显著的糖苷合成酶效率。此外，这些突变体能够将复合型N-聚糖由活化聚糖恶唑啉转移至去糖基化的完整抗体上，同时不产生水解反应。
表1显示各种EndoS2突变体的序列
根据本发明的实施方式，新颖的EndoS2突变体包含选自SEQ ID NO:：2至17的序列。这些突变体展现出改善的转糖苷化活性以及减少的水解活性。因此，他们可有效地催化活性寡糖供体对核心GlcNAc受体(其可为海藻糖化或非海藻糖化)的转移。
根据某些较佳实施方式，EndoS2突变体可与SEQ ID NO:2至17的序列或其具有转糖苷化活性的片段具有至少80％(例如：80％、85％、90％、95％或98％)的序列相似性，且具有期望的转糖苷化活性。
在其他的较佳实施方式中，本发明的EndoS2突变体中，该突变位点是位于选自由残基133-143、残基177-187及残基221-233所组成的区域中。
在其他较佳的实施方式中，本发明的EndoS2突变体包含T138D(SEQ ID NO:：6)、T138E(SEQ ID NO:：7)、T138F(SEQ ID NO:：8)、T138H(SEQ ID NO:：9)、T138K(SEQ ID NO:：10)、T138L(SEQ ID NO:：11)、T138M(SEQ ID NO:：12)、T138N(SEQ ID NO:：13)、T138Q(SEQID NO:：14)、T138R(SEQ ID NO:：15)、T138V(SEQ ID NO:：16)、T138W(SEQ ID NO:：17)、D182Q(SEQ ID NO:：2)、D226Q(SEQ ID NO:：3)、T227Q(SEQ ID NO:：4)、以及T228Q(SEQ IDNO:：5)。
EndoS2及其突变体的聚糖水解活性
透过使用市售的利妥昔单抗(Rituximab)作为受体以检测EndoS2突变体的聚糖水解活性。利妥昔单抗是一种治疗性的抗CD20单克隆抗体，常作为模式mAb来检测水解活性以及潜在EndoS2突变体的转糖苷化活性。市售利妥昔单抗主要的Fc聚糖是核心海藻糖化的双分支复合型寡糖，同时携带0至2个半乳糖基位，分别名为G0F、G1F、以及G2F糖型。以1：1000(酶：利妥昔单抗)的摩尔比例将利妥昔单抗与野生型EndoS2及EndoS2突变体混合处理。透过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)监控聚糖水解过程。
以野生型EndoS2处理会导致快速去糖苷化，借此在糖苷化位点(N297)上产生相应的GlcNAc-Fc N-聚糖。这些结果确认野生型EndoS2对完整IgG的优异Fc聚糖-水解活性，却也意味着其无法应用于糖苷化重塑mAbs第一步骤(水解作用)。然而，相较于野生型(WT)EndoS2，EndoS2突变体则具有降低的水解活性。具体来说，在长达2小时的处理期间，T138及D226的突变均展现相当低的N-聚糖水解能力或几乎没有N-聚糖水解能力，而在D182Q的突变则显示较低的反应速率(与WT EndoS2相比是低超过60倍)。这些结果显示残基D182、T138及D226对糖苷水解酶活性极为重要(图3)。
利用2,6唾液酸化的双分支复合型(SCT)恶唑啉作为供体受体来检测EndoS2以其 突变体的转糖苷化作用。
接着使用GlcNAc-利妥昔单抗作为受体，而α-2,6-唾液酸化双分支复合型(SCT)恶唑啉作为供体受体来检测EndoS2及其突变体的转糖苷化能力，如图4所显示。透过SDS-PAGE监控糖苷化重塑过程。将GlcNAc-利妥昔单抗及SCT-恶唑啉(供体/受体以1：1的重量比)与野生型EndoS2及其突变体(酶/抗体的体积摩尔比为1：1000)一起反应，并以SDS-PAGE监测的条件下显示相应的野生型EndoS2的转糖苷化产物的短暂成形，这有可能是肇因于野生型酶在原位快速水解该产物。尽管缺乏水解能力，所有突变体(T138Q、D182Q、D226Q、T227Q及T228Q)皆具有显著的转糖苷化活性。这些结果指出EndoS2突变体为一种新颖的有效糖苷合成酶，可使去糖苷化的完整IgG在不产生水解作用的情况下与复合型N-聚糖进行糖苷化反应。
T138上的各种氨基酸残基对其转糖苷化活性的效应
为了鉴别在T138位点上具潜力的转糖苷化活性且较低的水解活性的最佳氨基酸残基，在该位点上执行多种突变。接着使用GlcNAc-利妥昔单抗作为受体，而α-2,6-唾液酸化双分支复合型(SCT)恶唑啉作为供体受体来检测这些突变体的转糖苷化能力(图5)。在T138(67.5nM)的各种突变体是与67.5μM的GlcNAc-利妥昔单抗及2.5mM的SCT-恶唑啉同时反应2小时。以SDS-PAGE分析产物，且图5显示GlcNAc-利妥昔单抗(IgG)及利妥昔单抗-SCT(IgG-聚糖)的相对百分比。在众多检测的突变体中，T138E、T138R、T138W、T138M以及T138Q具有最大的转糖苷化潜力。
使用高甘露糖型、混合型以及复合型的N-聚糖的EndoS2突变体的转糖苷化效能
人类IgGs分子的每个Fc CH2区域上含有N-聚糖。这些聚糖包含高甘露糖型、混合型以及复合型。已经有研究指出Fc N-聚糖成分是抗体促发炎反应及抗发炎反应的重要决定因素。举例来说，缺乏核心海藻糖，或缺乏等分GlcNAc部分的附接，会剧烈地增进抗体对负责抗体依赖型细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)的FcγIIIa受器(FcγRIIIa)的亲和力。已显示含有高甘露糖聚糖的重组IgG分子在人类血液中清除更快，且具有降低的热稳定性。此外，含有高甘露糖型及混合型聚糖的IgG分子的CH2区域具有更多的构形可挠性。个别生产高甘露糖型、混合型及复合型Fc聚糖的IgGs的最常规方法是使用各种表现系统，包括哺乳类、植物及酵母宿主细胞。然而，这些表现系统通常产生糖型混合物，而非产生单一聚糖结构。因此，对于聚糖改造工程领域的技术人员来说有极大的兴趣要获得可用于生物物理及结构研究的治疗性抗体的纯糖型。因此，需要能够有效地将个别高甘露糖型、混合型及复合型聚糖转移到肽、蛋白质及IgGs的GlcNAc受体的糖苷合成酶。
接着，使用一系列的高甘露糖型、混合型及复合型聚糖恶唑啉来评估本发明的EndoS2突变体的转糖苷化能力(表2)。结果则表明，针对抗体的糖工程改造用途，除了唾液酸化复合型N-聚糖恶唑啉之外，EndoS2突变体也可同样有效地转移高甘露糖型系列Man5GlcNAc-恶唑啉(G1)、Man9GlcNAc-恶唑啉(G2)、混合型聚糖G3及G4、以及双分支及三分支复合型系列聚糖G5-G16，借此形成相应的同质糖型的成形。此研究使用利妥昔单抗作为模式抗体。然而，本发明所属技术领域中具有通常知识者应当理解到，也可以相似方式对其他糖蛋白进行修饰。这些结果显示，除了唾液酸化复合型N-聚糖恶唑啉之外，EndoS2突变体也同样可有效地转移高甘露糖型、混合型聚糖及三分支复合型聚糖。
表2列出用于评估EndoS2突变体的转糖苷化活性的多种聚糖恶唑啉结构
表2
基于在Man-GlcNAc-GlcNAc核心上的分支数量将复合型的聚糖区分成双分支、三分支及四分支类型。较特别的是，虽然三分支或四分支的聚糖结构庞大，但一般来说只接受双分支聚糖恶唑啉的糖苷合成酶也可接受三分支或四分支的聚糖恶唑啉。为了证明这些新颖EndoS2突变体的有效性，使用一系列复合型聚糖恶唑啉(表2)检测转糖苷化作用，其中使用利妥昔单抗作为模式抗体。图7及图8显示结果。这些结果证明EndoS2糖苷合成酶突变体具有将多种高甘露糖型、混合型及复合型聚糖转移至IgG-Fc区域的优异转糖苷化效率。因此，由于本发明的新颖EndoS2糖苷合成酶突变体缺乏(或具有非常少的)产物水解活性，因此该突变体可对不同治疗性抗体有效且完整地进行转糖苷化作用，借此以增强其效用功能。
本发明揭示对广泛种类N-聚糖(其包含高甘露糖型、混合型以及复合型)具有优异的转糖苷化活性的选定EndoS2突变体。
在较佳实施方式中，N-聚糖的高甘露糖型、混合型及复合型是活化的恶唑啉形式，如表2所列的通式。
在某些实施方式中，本揭示内容的高甘露类型的N-聚糖可选自由Man3GlcNAc、Man5GlcNAc、Man6GlcNAc、Man7GlcNAc、Man8GlcNAc及Man9GlcNAc所组成的群组。在较佳的实施方式中，高甘露糖型的N-聚糖是Man5GlcNAc。
在某些实施方式中，本揭示内容的混合型N-聚糖的α-1,3臂上包含至少一个α-2,6-或α-2,3末端唾液酸，其中α-1,6臂含有三甘露糖残基。
在某些实施方式，本文的混合型N-聚糖包含在α-1,3臂上的末端半乳糖，其中α-1,6臂含有三甘露糖残基。
在某些实施方式，本文的混合型N-聚糖包含在α-1,3臂上的末端GlcNAc，其中α-1,6臂含有三甘露糖残基。
在某些实施方式中，复合型聚糖是双分支、三分支及四分支复合型。
在某些实施方式中，本揭示内容的双分支复合型N-聚糖包含至少一α-2,6或α-2,3末端唾液酸。在较佳实施方式中，N-聚糖包含两个α-2,6及/或α-2,3末端唾液酸。
在某些实施方式中，本揭示内容的双分支复合型N-聚糖包含至少一个末端半乳糖或GlcNAc。在较佳实施方式中，N-聚糖包含两个末端半乳糖及/或GlcNAc。
在某些实施方式中，本揭示内容的双分支复合型N-聚糖包含至少一个α-1,2-海藻糖。在某些实施方式中，N-聚糖包含两个α-1,2-海藻糖。
在某些实施方式中，本揭示内容的双分支复合型N-聚糖包含至少一个α-1,2-海藻糖。在某些实施方式中，N-聚糖包含两个α-1,3-海藻糖。
在某些实施方式中，本揭示内容的双分支复合型N-聚糖包含等分GlcNAc。
在某些实施方式中，本揭示内容的双分支复合型N-聚糖包含至少一LacNAc重复单元。在较佳实施方式中，N-聚糖包含两个LacNAc重复单元。
在较佳实施方式中，本揭示内容的三分支复合体类型N-聚糖包含至少一α-2,6或α-2,3末端唾液酸。在较佳实施方式中，N-聚糖包含三个α-2,6及/或α-2,3末端唾液酸。
在某些实施方式中，本揭示内容的三分支复合型N-聚糖包含至少一个末端半乳糖或GlcNAc。在较佳实施方式中，N-聚糖包含三个末端半乳糖及/或GlcNAc。
在某些实施方式中，复合型聚糖是包含在α-1,3臂或α-1,6臂上不对称分支的双分支及三分支复合型。
在某些实施方式中，本揭示内容的双分支及三分支复合型N-聚糖包含α-2,6或α-2,3末端唾液酸。在较佳的实施方式中，混合型及双分支及三分支复合型N-聚糖包含α-2,6末端唾液酸。
对利妥昔单抗进行糖工程改造以提供可增进效用功能的多种非海藻糖化糖型
利妥昔单抗是一种标的CD20蛋白质(其主要可见于95％的B细胞淋巴瘤上)的单克隆抗体。利妥昔单抗摧毁B细胞，借此用于治疗病征为过多数量的B细胞、过度活化的B细胞、或功能异常的B细胞的疾病。在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中产生的利妥昔单抗通常包含异质性的聚糖混合物模式，而各种聚糖不会显示相似的生物特质。由于IgG分子对Fc受体及C1q补体的结合会因抗体上不同糖苷化而产生巨大差异，从而影响抗体效用功能并且可能引发病患的不良反应，如此则产生安全性的疑虑。
因此，有需要以改善的抗CD20抗体增进单克隆抗体疗法。在糖苷化模式的异质性混合物中，已知一些特异的糖型可赋予所需的生物功能。此外，在复合型糖型的情况下，除了一些修饰物像是核心海藻糖及等分GlcNAc之外，多种天然修饰物(像是在外围GlcNAc的α-1,2海藻糖、在半乳糖上的α-1,3海藻糖、聚LacNAc基位以及三分支及四分支)对生物活性的效应从未被揭示/公开。如此一来，因治疗目的，本领域相关技术人员对生产含有明确定义的聚糖结构及序列的所需糖型治疗性抗体具有相当大的兴趣。
本揭示内容是包含最适糖型的功能性活化经糖工程改造的抗-CD20抗体，其相较于治疗性单克隆抗体展现更强的生物活性。
本揭示内容揭示/公开一种新颖的抗-CD20抗体，其可借由Fc糖工程从抗-CD20单克隆抗体来制备。这些经糖工程改造的抗-CD20抗体包含同构型族群及含有明确的聚糖结构及序列的相同Fc聚糖。根据本发明，经糖工程改造的抗-CD20抗体可以向其亲代抗体一样特异性地结合至细胞膜上的人类CD20抗原的相同表位。此外，相同抗体的同构型族群都具有相同的效用物结合位置。
本文使用的「亲代抗体」(parental antibody)一词是指抗-CD20单克隆抗体，其用于产生经糖工程改造的抗-CD20抗体。可透过细胞培养(像是哺乳类细胞培养、毕赤酵母(Pichia pastoris)或昆虫细胞株)获得亲代抗体。较佳地，亲代抗体是在哺乳类细胞培养中生产。例示性亲代抗体包括，但不限于：利妥昔单抗、奥法木单抗(Ofatumumab)、托西莫单抗(Tositumomab)、奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)、11B8或7D8(揭示/公开于专利号WO2004/035607)。
在某些实施方式中，本揭示内容描述的例示性经糖工程改造的抗-CD20抗体包含具有氨基酸序列如SEQ ID NO：18的重链，以及具有如SEQ ID NO：19的氨基酸序列的轻链。在较佳的实施方式中，每个经糖工程改造的抗-CD20抗体包含利妥昔单抗的轻链序列及重链序列。
下表3显示利妥昔单抗的重链及轻链序列。
表3
在某些实施方式中，N-聚糖是连接至利妥昔单抗的Fc区域的Asn-297。
根据本发明的N-聚糖可具有高甘露糖型、混合型及双分支及三分支复合型结构，其中N-聚糖结构具有下列通式：
其中，R1是透过β-1,4键合的–H或N-乙酰葡萄糖胺，且R2及R3是相同或相异，且独立地选自由：
所组成的群组。
在某些实施方式中，本揭示内容的N-聚糖可具有额外的链内取代基，其包含「等分」(bisecting)的GlcNAc，α-1,2海藻糖、α-1,3海藻糖(不论有没有α-2,3及/或α-2,6唾液酸)，且可以是延伸的聚LacNAc基位。
在某些实施方式中，本揭示内容的高甘露类型的N-聚糖可选自由Man3GlcNAc、Man5GlcNAc、Man6GlcNAc、Man7GlcNAc、Man8GlcNAc及Man9GlcNAc所组成的群组。在较佳的实施方式中，高甘露糖型的N-聚糖是Man5GlcNAc。
在某些实施方式中，本文描述的混合型的N-聚糖包含至少一个α-2,6或α-2,3末端唾液酸或至少一个末端半乳糖，或至少一个在α-1,3臂上的末端GlcNAc，而α-1,6臂含有三甘露糖残基。
在某些实施方式中，复合型聚糖是双分支、三分支及四分支复合型。
在某些实施方式中，本揭示内容的双分支复合型N-聚糖包含至少一α-2,6或α-2,3末端唾液酸。在较佳实施方式中，N-聚糖包含两个α-2,6及/或α-2,3末端唾液酸。
在某些实施方式中，本揭示内容的双分支复合型N-聚糖包含至少一个末端半乳糖或GlcNAc。在较佳实施方式中，N-聚糖包含两个末端半乳糖及/或GlcNAc。
在某些实施方式中，本揭示内容的双分支复合型N-聚糖包含至少一个α-1,2-海藻糖。在较佳实施方式中，N-聚糖包含两个α-1,2-海藻糖。
在某些实施方式中，本揭示内容的双分支复合型N-聚糖包含至少一个α-1,3-海藻糖。在较佳实施方式中，N-聚糖包含两个α-1,3-海藻糖。
在某些实施方式中，本揭示内容的双分支复合型N-聚糖包含等分GlcNAc。
在某些实施方式中，本揭示内容的双分支复合型N-聚糖包含至少一LacNAc重复单元。在较佳实施方式中，N-聚糖包含两个LacNAc重复单元。
在较佳实施方式中，本揭示内容的三分支复合体类型N-聚糖包含至少一α-2,6或-2,3末端唾液酸。在较佳实施方式中，N-聚糖包含三个α-2,6及/或α-2,3末端唾液酸。
在某些实施方式中，本揭示内容的三分支复合型N-聚糖包含至少一个末端半乳糖或GlcNAc。在较佳实施方式中，N-聚糖包含三个末端半乳糖及/或GlcNAc。
在某些实施方式中，复合型的聚糖是双分支、三分支或四分支复合型，其包含在不论α-1,3或在α-1,6臂上的不对称的分支。
在某些实施方式中，本揭示内容的双分支及三分支复合型N-聚糖包含α-2,6或α-2,3末端唾液酸。在较佳的实施方式中，混合型及双分支、三分支及四分支复合型N-聚糖包含α-2,6末端唾液酸。
较佳地，根据本发明的实施方式的N-聚糖是不含核心海藻糖。
表4列出经糖工程改造的抗-CD20抗体的例示性N-聚糖。本揭示内容的实施方式可包含或排除任何表列的N-聚糖。
表4
经糖工程改造的利妥昔单抗的生物功能
各种抗体的Fc-糖苷化作用会显著地影响诸如ADCC、CDC及循环半衰期等效用物介导(effector-mediated)作用。增强的ADCC是用于改善治疗性抗体药物效率的重要策略。其具有降低有效药物剂量的潜能，进而降低药物的成本。本揭示内容经糖工程改造的抗-CD20抗体具有细胞生长抑制活性，包括造成人类CD20表现细胞的细胞凋亡。在某些实施方式中，经糖工程改造的抗-CD20抗体相较于其亲代抗体而言，具有更强的细胞生长抑制能力。
FcγRIIIA和经糖工程改造的利妥昔单抗之间的结合
表5列出经糖工程改造的抗-CD20抗体及利妥昔单抗的例示性FcγRIIIA结合。
表5
可使用已知的测定方法来测定FcγRIIIA结合。实施例阐述例示性的测定方法。可借由糖工程改造的抗-CD20抗体及利妥昔单抗的相对比例来测定Fc受体的结合。例示性实施方式的Fc受体结合至少增加2.5倍、3倍、4倍,5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍或20倍、30倍或更高。高甘露糖系列的Man9GlcNAc2糖型不具有预期的结合能力。然而，Man5GlcNAc2糖型比不经修饰的利妥昔单抗要佳。两种混合型糖型仅可增强2-3倍与FcγRIIIA的结合能力。有趣的是，相较于原有的利妥昔单抗，所有的复合型糖型(包括双分支及三分支类型)与FcγRIIIA的结合能力均增强超过30倍。在GlcNAc上带有α-1,3海藻糖不会影响FcγRIIIA结合能力。然而，1,2海藻糖会些微地减少该结合能力。此外，具有多种分支(例如三分支糖类型)不会显著影响结合能力。然而，一直以来被认为若增加聚糖内的唾液酸含量则可获得抗发炎反应的活性。
相较于利妥昔单抗，结合能力数据显示经糖工程改造的抗-CD20抗体(特别是那些具有复合型糖型的抗体)对FcγRIIIA具有较强的结合亲和力。
经糖工程改造的利妥昔单抗的ADCC活性
根据本发明，经糖工程改造的利妥昔单抗的ADCC活性相较于其亲代抗体的ADCC活性，至少增加3倍，较佳地增加至少9倍、更佳地增加至少10倍的ADCC活性、更佳地增加至少12倍的ADCC活性、更佳地增加至少20倍的ADCC活性、更佳地至少增加30倍的ADCC活性。
表6列出选定的经糖工程改造的抗-CD20抗体及市售利妥昔单抗的例示性改善ADCC活性。实施例阐述了例示性的测定方法。
表6
相较于亲代抗体(利妥昔单抗)，本揭示内容一系列经糖工程改造的抗-CD20抗体(特别是那些含有复合糖型抗体)具有较强的ADCC活性。本发明经糖工程改造的抗体可作为治疗剂，借以对B细胞介导的恶性肿瘤及免疫疾病产生优异的治疗效果，其中这些恶性肿瘤及免疫疾病是与B细胞或B细胞产生的抗体相关。本发明目的在于使用经糖工程改造的抗-CD20抗体以发展治疗剂。
总结来说，相较于利妥昔单抗，经糖工程改造的抗-CD20抗体具有较佳的ADCC活性及较强的FcγRIIIA结合亲和力。本发明糖抗体不论单独使用或在含有两个以上类似抗体的组合物中，且可选地与其他疗程(像是化学疗法)组合，均可提供优异的临床反应。ADCC-增强的经糖工程改造的抗-CD20抗体为B细胞淋巴瘤及其他疾病提供替代性的疗法。本发明经糖工程改造的抗体具有增强的效用意味着其可以较低的浓度及较低的频率投予至个体体内，借以降低抗体毒性的可能性及/或抗体耐受性的发展；据此，这些抗体可用以改变目前的给药途径及目前的治疗方案。此外，改善的效用功能对以前在重组宿主系统所生产的相应抗-CD20单克隆抗体的治疗具有抗性或顽性的临床适应症，产生新的治疗方法。
抗-CD20抗体的糖工程改造方法
可借由Fc糖工程学从任何抗-CD20单克隆抗体(亲代抗体)制得本发明的经糖工程改造的抗-CD20抗体，其中该抗-20单克隆抗体可以购自供货商或正在临床前期或临床开发。Fc糖工程学可经酶处理或化学酶处理。在较佳的实施方式中，亲代抗体是利妥昔单抗。
本发明的经糖工程改造的抗体中的N-聚糖较佳是去海藻糖化的。
本揭示内容包含用以制备经糖工程改造的抗体(例如经糖工程改造的抗-CD20抗体)的改善方法。本发明的方法可包含下列步骤：(a)将α-海藻糖酶及糖苷内切酶与一抗-CD20单克隆抗体接触，借以产生具有单一N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)的去海藻糖化的抗体；以及(b)在合适条件下将一碳水化合物(糖)基团加入GlcNAc中。
在某些实施方式中，根据本发明的方法，该抗-CD20单克隆抗体是利妥昔单抗。
任何合适的糖苷内切酶可用于剔除N-聚糖中各种部分的寡糖。本文使用的糖苷内切酶的实例包含EndoS2。
本发明方法的步骤(a)可产生一具有单一个N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)去海藻糖化抗体。之后，EndoS2突变体介导转糖苷化作用，将广泛的选定碳水化合物基团加到GlcNAc上以延展糖链。借此可产生糖抗体的同构型族群。例示性的本揭示内容所述的转糖苷酶包含具有SEQ ID NO：2至17任一氨基酸序列的EndoS2突变体。
在某些实施方式中，本揭示内容的碳水化合物基团可包含多种高甘露糖型、混和型以及复合型的N-聚糖，其具有以下化学式：
其中，R1是透过β-1,4键合的–H或N-乙酰葡萄糖胺，且R2及R3可以相同或不同，且是独立选自由：
所组成的群组。
在某些实施方式中，碳水化合物基团是糖恶唑啉。
合适的条件也包含将反应混合物反应至少20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟或100分钟，较佳可少于60分钟。较佳的反应条件是在室温下进行，较佳约为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃或45℃，且较佳约为37℃。
药学制剂
含有本发明抗体的治疗制剂可借由将具有所需纯化程度的抗体与一或多种自选的生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，以水溶液、冻干或其他干燥形式制剂的形式以储存待用(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980))。对接受者执行的可接受的载体、赋形剂或稳定剂的剂量及浓度必须是无毒的，且包含缓冲液/缓冲剂，像是磷酸盐、柠檬酸盐、以及其他有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸以及甲硫氨酸)；防腐剂(例如：十八烷二甲基苄基氯化铵(octadecyldimethylbenzylammonium chloride)、氯化六甲双铵(hexamethonium chloride)、氯化苯甲烷铵(benzalkonium chloride)、氯化本索宁(benzethonium chloride)、酚、丁基或苄基醇类)；烷基对羟基苯甲酸酯例如：甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；儿茶酚；间苯二酚(resorcinol)；环己醇(cyclohexanol)；3-戊醇(3-pentanol)；及间甲酚(m-cresol)；低分子量(小于约10个基团)的多肽；蛋白质，像是血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物例如聚乙烯氢吡咯酮；氨基酸例如甘氨酸、谷酰胺、天冬酰胺酸、组胺酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖以及其他碳水化合物例如：葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA；糖类例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相对离离子，例如钠；金属复合物(例如：锌-蛋白质(Zn-protein)复合物)；以及/或非离子型表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
本揭示内容的药学制剂也可含有对特定治疗的病症所需的一种以上有效化合物，其包含，但不限于，有互补活性也不会不利地影响彼此的有效化合物。这类分子适合以对预期目的有效量的组合形式存在。
举例来说，在胶质药物递送系统(例如：微脂体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒及纳米胶囊)或在巨乳液中，也可将活性成分包埋在分别借由凝聚技术或借由界面聚合作用(例如：羟甲基纤维素或明胶微胶囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)制备的微胶囊中。Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)已公开此类技术。
用于活体内投药的药学制剂必须为无菌状态。可透过无菌过滤膜进行过滤来完成灭菌。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实施例包括含有本发明的免疫球蛋白的固体疏水性聚合物的半透性基质，其中该基质是以有形固体存在，例如膜、或微胶囊。持续释放基质的实例包含聚酯、水胶(举例来说：聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯(poly(2-hydroxyethyl-methacrylate))、或聚(乙烯醇)(poly(vinylalcohol))、聚乳酸酯(polylactides)(美国专利号：3,773,919))、L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、非降解型乙烯乙酸乙酯(ethylene-vinyl acetate)、降解型乳酸-羟乙酸共聚物，例如LUPRONDEPOTTM(含有乳酸-羟乙酸共聚物以及利普安(leuprolide acetate)的可注射微球体)、以及聚-D-(-)-3-羟丁酸(poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid)。虽然聚合物(像是乙烯乙酸乙酯及乳酸-羟乙酸)能够释放分子超过100天，特定的水胶只能在较短的时效内释放蛋白质。当密封的免疫球蛋白在体内停留长时间，暴露在37℃的潮湿环境将造成免疫球蛋白变性或聚集，导致其生物活性的损失及免疫原性的可能变化。根据所涉及的机制，可设计合理的策略来实现免疫球蛋白的稳定性。举例来说，若已发现聚集作用的机制是透过硫代二硫化物互换形成分子间S-S键合，可借由修饰氢硫基残基、从酸性溶液冻干、控制含水量、使用合适的添加剂以及发展特定聚合物基质组合物来达成分子间的稳定性。
可依据所需的剂量体积、给药模式等因素来决定预冻干制剂中抗体的含量。例示性的初始蛋白质浓度是从每毫升约2毫克至每毫升约50毫克，较佳地是从每毫升约5毫克至每毫升约40毫克，而最佳的是从每毫升约20毫克至每毫升约30毫克，其中所选的蛋白质是完整抗体(全长抗体)。蛋白质通常存于溶液中。举例来说，蛋白质可存于pH值从约4至8(较佳地从5-7)的pH缓冲溶液中。例示性缓冲溶液包含组胺酸、磷酸盐、Tris缓冲液、柠檬酸盐、琥珀酸盐及其他有机酸类。举例来说，取决于缓冲液及制剂(如：回溶的制剂)所需的等渗性，缓冲液浓度可从约1mM至约20mM、或从约3mM至约15mM。如下所述，较佳的缓冲液是可具有冻干保护性能的组胺酸。琥珀酸盐也是另一个有效的缓冲液。
将冻干保护剂加入预冻干制剂中。在较佳实施方式中，冻干保护剂是诸如蔗糖或海藻糖等非还原糖。在预冻干制剂中的冻干保护剂的量通常是使得在回溶时所得的制剂是等渗的。然而，上述也可适用于高张的回溶制剂。此外，冻干保护剂的量必不能过低使得在冻干作用时发生不可接受的蛋白质变性或聚集的量。虽然冻干保护剂是糖(诸如蔗糖或海藻糖)且蛋白质是抗体，在预冻干制剂中的例示性冻干保护剂浓度是从约10mM至约400mM，且较佳地是从约30mM至约300mM，且最佳的是从约50mM至约100mM。
根据蛋白质与冻干保护剂的组合选定蛋白质与冻干保护剂的比例。在抗体作为所选蛋白质而糖类(例如蔗糖或海藻糖)作为冻干保护剂用以产生有高蛋白质浓度的等渗回溶制剂的情况下，冻干保护剂与抗体的摩尔比率是从约100至约1500摩尔的冻干保护剂比1摩尔的抗体，且较佳地是约从200至约1000摩尔的冻干保护剂比1摩尔的抗体，举例来说，从约200至约600摩尔的冻干保护剂至1摩尔的抗体。
在本发明的较佳实施方式中，是将一表面活性剂加入预冻干制剂中。或者是或此外，将表面活性剂添加到冻干制剂及/或回溶制剂中。例示性表面活性剂包含非离子型表面活性剂，像是聚山梨醇酯(polysorbates)(例如：聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)；泊洛沙姆(poloxamer)(例如：泊洛沙姆188)；Triton；十二基硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；辛基糖苷钠；月桂硫代甜菜碱(lauryl-sulfobetaine)、肉豆蔻硫代甜菜碱(myristyl-sulfobetaine)、亚麻硫代甜菜碱(linoleyl-sulfobetaine)、或硬脂酰硫代甜菜碱(stearyl-sulfobetaine)；月桂肌胺酸(lauryl-sarcosine)、肉豆蔻肌胺酸(myristyl-sarcosine)、亚麻肌胺酸(linoleyl-sarcosine)或硬脂酰肌胺酸(stearyl-sarcosine)；亚麻甜菜碱(linoleyl-betaine)、肉豆蔻甜菜碱(myristyl-betaine)、或鲸蜡基甜菜碱(cetyl-betaine)；月桂酰胺丙基甜菜碱(lauroamidopropyl-betaine)、椰油酰胺丙基甜菜碱(cocamidopropyl-betaine)、亚麻酰胺丙基甜菜碱(linoleamidopropyl-betaine)、肉豆蔻酰胺丙基甜菜碱(myristamidopropyl-betaine)、棕榈酰胺丙基甜菜碱(palmidopropyl-betaine)或异硬脂酰胺丙基(isostearamidopropyl-betaine)(例如：月桂酰胺丙基二甲胺(lauroamidopropyl-dimethylamine)、肉豆蔻酰胺丙基二甲胺(myristamidopropyl-dimethylamine)、棕榈酰胺丙基二甲胺(palmidopropyl-dimethylamine)或异硬脂酰胺丙基二甲胺(isostearamidopropyl-dimethylamine)；椰油甲基牛磺酸钠(sodium methylcocoyl-taurate)或油基甲基牛磺酸二钠(disodium methyl oleyl-taurate)；以及MONAQUATTM系列(Mona Industries,Inc.,Paterson,N.J.)、丙二醇(polyethyl glycol)、聚丙二醇(polypropyl glycol)以及乙烯及丙二醇共聚物(例如：Pluronics,PF68等)。添加的表面活性剂的量使得其降低重构蛋白的聚集且最小化回溶之后的颗粒形成。举例来说，表面活性剂可占预冻干制剂约0.001％至0.5％的量，较佳是占约0.005％至0.05％的量。
在本发明的特定实施方式中，制备预冻干制剂的时候使用冻干保护剂的混合物(像是蔗糖或海藻糖)及填充剂(例如：甘露醇或甘氨酸)。填充剂可产生其中没有多余孔洞的均一冻干饼。
在Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)所揭示的其他药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂可被包含在预冻干制剂(及/或冻干制剂及/或回溶制剂)中，前提是这些成分对制剂所需性质没有产生不良影响。对受体采用的可接受的载体、赋形剂或稳定剂的剂量及浓度是无毒的，且可接受的载体、赋形剂或稳定剂包括其他缓冲液、防腐剂、共溶剂、抗氧化剂(包括抗坏血酸及甲硫氨酸)、螯合剂例如EDTA；金属复合物(例如：Zn-蛋白质复合物)、生物可降解聚合物(例如聚酯)及/或诸如成盐相对离子如钠。
较佳的情况下，本揭示内容的药学组合物及制剂是稳定的。一「稳定」(stable)的制剂/组合物的其中一种是在储存状态下可实质上保留其物理及化学稳定性与整体性的抗体。Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)and Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)总结出本领域中可用以测量蛋白质稳定性的各种分析技术。可在选定的温度下以选定的时间测量稳定性。
用于活体内投药的药学制剂必须为无菌状态。可在冻干及回溶之前或之后可透过无菌过滤膜进行过滤来完成灭菌。举例来说，或是可借由约120℃高压蒸气灭菌这些成分(除了蛋白质)约30分钟来完成整个混合物的灭菌状态。.
将蛋白质、冻干保护剂及其他可选的成分混合在一起之后，将该制剂冻干。可采用不同的冷冻干燥机来实现前述目的，例如型冷冻干燥机(Hull，美国)或型冷冻干燥机(Leybold-Heraeus，德国)。冷冻干燥机是先将制剂冷冻，随后在适合初步干燥的温度下使冷冻内容物的冰升华。在此条件下，产物温度低于制剂的共熔点或崩溃温度。通常初步干燥的搁架温度为约-30℃至25℃(在初步干燥期间产物应保持冷冻状态)，合适的压力通常为50至250mTorr。干燥所需的时间主要由制剂、放置样品的容器(如玻璃瓶)的大小和类型以及液体的体积来决定，而该时间可从几小时至几天(如40-60小时)。主要根据所用的容器的类型和尺寸以及蛋白质的种类，在约0至40℃下进行第二干燥步骤。然而,本文也指出第二干燥步骤是非必要的。举例来说，在整个冻干作用中用以除去全部水相的搁架温度为约15-30℃(如约20℃)。取决于温度及其他参数，第二干燥步骤所需的时间和压力能生成合适的冻干饼。第二干燥步骤时间由产物中所需残余湿润程度来决定，通常需要至少5小时(如10-15小时)。压力可与初步干燥步骤中所执行的压力相同。冷冻干燥条件可根据制剂和瓶的尺寸而变化。
在一些例子中，较理想的是在容器中对蛋白质制剂进行冻干，如此则可在该容器中回溶(重构)蛋白质以避免转移步骤。该例子中的容器可以是，举例来说，3、5、10、20、50或100cc的小瓶。通常来说，冻干作用应使冻干制剂中的水分含量约小于5％，较佳约小于3％。
在所需步骤时，特别是需要对病患投予该蛋白质时，可以稀释剂来回溶该冻干制剂，使得回溶制剂中的蛋白质浓度至少为每毫升50毫克、举例来说从每毫升50毫克至每毫升400毫克，更佳是从约每毫升80毫克至每毫升300毫克，且最佳是从约每毫升90毫克至约每毫升150毫克。回溶制剂中的高蛋白浓度有利于皮下投予回溶制剂。然而，对于其它给药途径，如静脉内给药，则需要较低的回溶制剂的蛋白质浓度(例如回溶制剂中的蛋白质浓度为约每毫升5毫克至50毫克，或约为每毫升10毫克至40毫克)。在特定实施方式中，回溶制剂中的蛋白质浓度显著地高于预冻干制剂中的蛋白质浓度。例如，回溶制剂的蛋白质浓度是预冻干制剂蛋白质浓度的约2至40倍，较佳为3至10倍，最佳为3至6倍(如至少3倍或至少4倍)。
回溶通常是在约25℃的温度下进行以保证完全水合，但也可依照需求采用其它温度。回溶所需的时间与，例如稀释剂的种类、赋形剂和蛋白质的量有关。例示性稀释剂包括无菌水、注射用抑菌溶液(BWFI)、一种pH缓冲液(如磷酸盐缓冲液)、无菌食盐水、林格氏溶液或葡萄糖溶液。稀释剂可非必要地含有防腐剂。例示性防腐剂如上所述，较佳的防腐剂是有芳香醇如苯基或酚基醇。借由测定不同的防腐剂浓度下与蛋白质的兼容性和防腐效力来决定防腐剂的用量。举例来说，如果防腐剂是芳香醇(如苯甲醇)，其含量可从约0.1％至2.0％，较佳为0.5％至1.5％，最佳为1.0％至1.2％。较佳地，每一瓶回溶制剂中尺寸大于10微米的颗粒应少于6000个。
治疗应用
本揭示内容中经糖工程改造的抗体可用于治疗患有癌症的病患。该治疗方法包含对该病患投予本发明一有效量的经糖工程改造的抗体或一药学组合物。该癌症包含，但不限于：B细胞淋巴瘤(B cell lymphomas)、NHL、前驱B细胞淋巴母细胞性白血病(precursorB cell lymphoblastic leukemia)或前驱B细胞淋巴胚细胞性淋巴瘤(precursor B celllymphoblastic lymphoma)及成熟B细胞瘤(mature B cell neoplasms)、B细胞慢性淋巴球性白血病(B cell chronic lymphocytic leukemia，CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(smalllymphocytic lymphoma，SLL)、B细胞幼淋巴球性白血病(B cell prolymphocyticleukemia)、淋巴浆细胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)、外套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)、滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma，FL)、低度、中度及高度FL、皮肤毛囊中心淋巴瘤(cutaneous follicle center lymphoma)、边缘区B细胞淋巴瘤(marginal zone B cell lymphoma)、MALT型边缘区B细胞淋巴瘤(MALT type marginalzone B cell lymphoma)、节点边缘区B细胞淋巴瘤(nodal marginal zone B celllymphoma)、脾型边缘区B细胞淋巴瘤(splenic type marginal zone B cell lymphoma)、毛细胞白血病(hairy cell leukemia)、弥漫性大细胞淋巴瘤(diffuse large B celllymphoma)、柏基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、浆细胞瘤(plasmacytoma)、浆细胞骨髓瘤(plasma cell myeloma)、移植后淋巴增生性疾病(post-transplantlymphoproliferative disorder)、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom'smacroglobulinemia)以及退行性变化大细胞淋巴瘤(anaplastic large-cell lymphoma，ALCL)。
在特定实施方式中，癌症是B细胞淋巴瘤像是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin'slymphoma)。
此外，本揭示内容的经糖工程改造的抗体可用于治疗患有自体免疫疾病或发炎性疾病的病患。该治疗方法包含对该病患投予本发明一有效量的经糖工程改造的抗体或一药学组合物。自体免疫性疾病或发炎性疾病的实例包括，但不限于：类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、青少年期的类风湿性关节炎(juvenile rheumatoidarthritis)、全身性红斑性狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)、华格纳氏疾病(Wegener's disease)、炎症性肠病(inflammatory bowel disease)、特发性血小板减少性紫癫(idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP)、栓塞性血小板减少性紫癫(thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP)、自体免疫性血小板减少症(autoimmunethrombocytopenia)、多发性硬化症(multiple sclerosis)、干癣(psoriasis)、IgA肾病变(IgA nephropathy)、IgM多发性神经病变(IgM polyneuropathies)、重症肌无力(myasthenia gravis)、血管炎(vasculitis)、糖尿病(diabetes mellitus)、雷诺氏综合症(Reynaud's syndrome)、克隆氏症(Crohn's disease)、溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis)、胃炎(gastritis)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、僵直性脊椎炎(ankylosing spondylitis)、C型肝炎相关的冷凝球蛋白血管炎(hepatitis C-associatedcryoglobulinemic vasculitis)、慢性局部脑炎(chronic focal encephalitis)、大疱性类天疱疮(bullous pemphigoid)、甲型血友病(hemophilia A)、膜性增生性肾丝球肾炎(membranoproliferative glomerulnephritis)、成人型和青少年型皮肌炎(adult andjuvenile dermatomyositis)、成人多发性肌炎(adult polymyositis)、慢性荨麻疹(chronic urticaria)、原发性胆性肝硬化(primary biliary cirrhosis)、视神经脊随炎(neuromyelitis optica)、葛瑞夫兹氏甲状腺发育不良疾病(Graves'dysthyroiddisease)、大疱性类天疱疮(bullous pemphigoid)、膜性增生性肾丝球肾炎(membranoproliferative glonerulonephritis)、Churg-Strauss二氏症候群(Churg-Strauss syndrome)、气喘(asthma)、牛皮癣性关节炎(psoriatic arthritis)、皮肤炎(dermatitis)、呼吸窘迫症候群(respiratory distress syndrome)、脑膜炎(meningitis)、脑炎(encephalitits)、眼色素层炎(uveitis)、湿疹(eczema)、动脉粥样硬化(atherosclerosis)、白血球粘附缺陷(leukocyte adhesion deficiency)、青少年型糖尿病(juvenile onset diabetes)、Reiter氏病(Reiter's disease)、白塞氏病(Behcet'sdisease)、溶血性贫血(hemolytic anemia)、异位性皮肤炎(atopic dermatitis)、华格纳氏肉芽病(Wegener's granulomatosis)、Omenn氏症候群(Omenn's syndrome)、慢性肾衰竭(chronic renal failure)、急性传染性单核白血球增多症(acute infectiousmononucleosis)、HIV及疱疹相关疾病(HIV and herpes-associated disease)、全身性硬化症(systemic sclerosis)、薛格连氏症候群及肾丝球肾炎(Sjorgen's syndrome andglomerulonephritis)、皮肌炎(dermatomyositis)、ANCA、再生不良性贫血(aplasticanemia)、自体免疫溶血性贫血(autoimmune hemolytic anemia，AIHA)、第八凝血因子缺陷(factor VIII deficiency)、甲型血友病(hemophilia A)、自体免疫性嗜中性白血球减少症(autoimmune neutropenia)、Castleman氏症(Castleman's syndrome)、Goodpasture氏症候群(Goodpasture's syndrome)、实体器官移植排斥(solid organ transplantrejection)、移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)、自体免疫性肝炎(autoimmune hepatitis)、淋巴细胞性间质性肺炎(lymphoid interstitialpneumonitis，HIV)、阻塞性细支气管炎(非移植性)(bronchiolitis obliterans(non-transplant))、格巴二氏症候群(Guillain-Barre Syndrome)、大血管血管炎(largevessel vasculitis)、巨细胞(Takayasu氏)动脉炎(giant cell(Takayasu's)arteritis)、中血管血管炎(medium vessel vasculitis)、川崎病(Kawasaki's Disease)以及结节性多动脉炎(polyarteritis nodosa)。
在特定实施方式中，自体免疫疾病或发炎性疾病是类风湿性关节炎。
在这些治疗方法中，可单独投予经糖工程改造的抗-CD20抗体，或是将经糖工程改造的抗-CD20抗体与第二治疗剂合并投予，该第二治疗剂可为一第二抗体、一化学治疗剂或一免疫抑制剂。第二抗体可与CD20或其他B细胞抗原、或NK细胞或T细胞抗原结合。
将透过以下特定的实施例进一步说明本发明的实施方式。本发明所属技术领域中具有通常知识者应当理解到，这些实施例仅用于说明，且不悖离本发明的范畴的情形下，当可对其进行各种更动与修饰。举例来说，本发明EndoS2突变体可用于对任何糖蛋白或糖肽(包含抗体)进行糖工程改造。本文描述的特定实施例是使用抗-CD20抗体。然而，本发明所述技术领域中具有通常知识者应当理解到，也可以相似方法使用其他糖蛋白或抗体。
材料与方法
从外部供货商获得或从内部生产单克隆抗体利妥昔单抗。根据前述的程序合成高甘露糖型、混合型及复合型的N-聚糖(20,21)。
EndoS2及其突变体的转殖株建构、过表现及纯化
合成来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)GAS NZ131菌株的EndoS2编码基因：ndoS2，并在pET28a表现载体中进行次转殖。ndoS2的讯号肽序列(氨基酸1-36)的N端被His6-标签取代。根据供货商的使用操作说明(Agilent Technologies)(其透过使用ndoS2表现载体作为模板，以含有所需突变的寡核苷酸对作为引子来执行PCR反应)，以定点诱变方式产生ndoS2的突变体。接着，以DpnI处理扩增的DNA，并将其转形至DH5α胜任细胞中。利用DNA定序(基因体)确认突变的序列。在为了表现而转形至BL21(DE3)胜任细胞之后，以0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)诱导该细胞，并在20℃的温度反应16小时使重组EndoS2突变体蛋白与其His6标签表现，接着以6500rpm离心30分钟沉淀蛋白质颗粒(pelleted)。将细胞在在裂解缓冲液(30mM的HEPES，pH值8.0、300mM的NaCl)中再悬浮，并使用超音波震荡器(ChromTech)震碎细胞(10分钟，开启4秒/关闭5秒)。以10000rpm对全部的细胞溶胞产物(裂解后产物)进行离心45分钟，并以固定化金属离子色谱分析法的Ni-NTA管柱(GE Healthcare)纯化重组EndoS2蛋白及其突变体蛋白。使用离心过滤器(Amicon ultra centrifugal filters 10 kDa)收集洗脱的蛋白质分液并在储存缓冲液(30mM的HEPES、pH值为8.0、100mM的NaCl)中进行浓缩。以SDS-PAGE分析浓缩的蛋白质样品，并使用分光亮度计(Nano-Drop2000c)定量蛋白质浓度。野生型EndoS2的过表现的产量大约为每升35毫克；而突变体的产物产量大约为每升25毫克。
从市售的利妥昔单抗制备GlcNAc-利妥昔单抗
将市售的利妥昔单抗(2.5毫克)溶于pH值7.0、浓度为50mM的1.25毫升磷酸钠缓冲液中，并与EndoS2(125微克)及海藻糖酶(2.5毫克)在37℃的温度下反应22小时。以SDS-PAGE分析确认重链上的N-聚糖被完全剪切后，将反应混合物通过1毫升的蛋白质A-琼脂糖树酯(protein A-agarose resin)管柱(事先以pH值7.0、浓度为20mM的磷酸钠进行平衡)进行亲和力层析。洗涤之后，以pH值3.0、浓度50mM的10ml甘氨酸盐酸溶液洗脱被结合的IgG。接着立即以pH值8.3、浓度1M的Tris-Cl中和该洗脱液的分液，并借由离心过滤器(AmiconUltra centrifugal filter)浓缩该分液以获得GlcNAc-利妥昔单抗(1.93毫克)。以胰蛋白酶处理产物，而使用电喷洒游离质谱仪(仪器名：nanospray LC/MS)分析糖肽(TKPREEQYNSTYR及EEQYNSTYR)以确认GlcNAc-利妥昔单抗的糖苷化模式。
聚糖-恶唑啉的制备
将各别聚糖(3-5毫克)的溶液、2-氯基-1,3-二甲基咪唑啉氯化物(2-chloro-1,3-dimethylimidazolinium chloride，DMC)(6-10毫克)及Et3N(10-20微升)溶于水(300-500微升)中，并于4℃搅拌1小时。将反应混合物通过Sephadex G-25管柱，以0.05％的水性Et3N洗脱，以执行凝胶过滤色谱分析法。可将含有该产物G1-G16(聚糖恶唑啉)的分液组合，并冻干以获得白色粉末(2.5-4毫克，产率～80-90％)。
EndoS2及其突变体的水解活性测定
将含有52μM的利妥昔单抗(400微克)及52nM的EndoS2(或其选定的突变蛋白质)溶于pH值7.0、浓度为100mM的HEPES缓冲液中，并在37℃下以700rpm的摇动该溶液。在指定的时间点以10％的SDS-PAGE收集并分析2微克的等分试样。有水解聚糖的利妥昔单抗在PAGE胶片上移动较快。可使用图像处理软件(Image J)根据在SDS-PAGE上条带的光强度计算水解产物的相对百分比(图3)。
利用SCT-恶唑啉作为供体受体测定EndoS2及其突变体的转糖苷化活性
将含有67.5μM的单体GlcNAc-利妥昔单抗(400微克)及浓度2.5mM的唾液酸化复合型聚糖(SCT)-恶唑啉(200微克)的HEPES缓冲液(pH值7.0、浓度为100mM)与67.5nM的EndoS2或选定的突变蛋白质在37℃下混合，并以700rpm摇动使该溶液反应。在指定的时间点以10％的SDS-PAGE收集并分析2微克的等分试样。糖苷化的利妥昔单抗在PAGE胶片上移动较慢。使用图像处理软件(Image J)基于在SDS-PAGE上条带的光强度计算利妥昔单抗-SCT的相对百分比。
利用EndoS2突变体对含有各种聚糖恶唑啉的GlcNAc-利妥昔单抗进行转糖苷化作 用
常规程序：将聚糖恶唑啉(2-3毫克)添加至溶有EndoS2突变体(16.8μM)及GlcNAc-利妥昔单抗(2毫克、0.337mM)的混合物的HEPES缓冲液(浓度：100mM，pH值7.0)中，并该混合液中，于37℃的温度下以700rpm摇动该混合液1至2小时。将0.1mM的EDTA溶液加入该混合液中以终止反应。以Protein A亲和管柱纯化反应混合物，随后通过一阴离子交换管柱(captoQ)收集所需的产物：经糖工程改造的抗-CD20的利妥昔单抗。以胰蛋白酶处理产物，且使用电喷洒游离质谱仪(仪器名：nanospray LC/MS)分析糖肽(TKPREEQYNSTYR及EEQYNSTYR)以确认预期的糖苷化模式。
表7列出用于制备每种利妥昔单抗糖型的最适反应条件
表7
经糖工程改造的抗-CD20抗体对FcγRIIIA的结合亲和力
以ELISA测定利妥昔单抗的重塑糖型对FcγIIA受体的亲和力。
以每孔50ng的重组可溶性FcγRIIIA(经50mM的重碳酸盐/碳酸盐涂层缓冲液(pH值10)稀释)对微量滴定板(型号：#9018，聚苯乙烯高结合的96孔透明平底盘)于4℃进行涂层并放置隔夜。以PBST溶液(0.05％的Tween 20溶于PBS)洗涤三次，并以含有5％BSA的PBST在室温下反应1小时以阻断反应。以八次连续稀释测定经糖工程改造的抗体(RtxG1-G16)的结合活性，2％的BSA/PBST中初始浓度为每毫升100微克，并稀释双重复。使微量滴定板在室温下反应1小时，并以PBST洗涤三次。接着，在每个孔中加入100微升的与山葵过氧化酶共轭的山羊抗人类IgG(溶于2％的BSA/PBST中)(商品名：Jackson immune,#109-035-088)，并于室温下反应30分钟。以PBST洗涤该滴定板5次，并接着在每个孔中加入100微升的TMB受体(eBioscience,#00-4201-56)，并将该滴定板在室温下进行暗反应15分钟。在酶免疫测定法读取器(Molecular Devices Corporation,Sunnyvale,CA，美国)中以波长450nm测定吸光值。
经糖工程改造的抗CD-20抗体的ADCC活性
使用钙黄绿素释放测定法(calcein release assay)评估抗体介导的ADCC。将从BCRC取得的Raji氏细胞(一种人类柏基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)细胞株)作为标的细胞。使用单核球细胞分离液(商品名：Ficoll-Paque(GE healthcare))从健康受试者的血液中分离外周血单核球(Peripheral blood-mononuclear cells，PBMC)作为效用细胞。以10μM的钙黄绿素-乙酰氧基甲基酯(Thermo Fisher Scientific)在37℃下标记标的细胞(每毫升1×106)30分钟。洗涤之后，将经标记的标的细胞以每孔50微升体积中含有1×104个细胞数的密度分布在96孔板中。接着加入各种浓度的抗体以及加入E/T比例为25：1的效用细胞(每孔2.5×105个)。在37℃的温度静置4小时之后，离心沉积细胞并收集150微升的上清液，并使用荧光微量盘分析仪分析该上清液以测量钙黄绿素的释放量。为了最大的程度的释放量，以1％的Triton X-100裂解细胞。实验结果的荧光值要先消除培养基背景的荧光值。
虽然仅根据有限的实施方式来描述本发明，所属技术领域具有通常知识者(特别是受益于本揭示内容的那些)应当理解可在不背离本发明范畴的情况下设计其他的实施方式。因此，本发明的范畴应限定于后附的申请专利范围中。
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序列表
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中央研究院
林南宏
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<130> CHO-001PCT
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 842
<212> PRT
<213> 酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)
<400> 1
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Ala Thr Leu Met Gly Ala Ala Leu Ala Thr His His Asp Ser Leu Asn
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100 105 110
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145 150 155 160
Asn Lys Ala Leu Ala Ala Ala Ile Val Lys Ala Phe Val Thr Asp Arg
165 170 175
Gly Val Asp Gly Leu Asp Ile Asp Ile Glu His Glu Phe Thr Asn Lys
180 185 190
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Asn Tyr Ile Asp Ala Ser Gln Phe Met Ile Gly Phe Ser Phe Phe Glu
275 280 285
Glu Ser Ala Ser Lys Gly Asn Leu Trp Phe Asp Val Asn Glu Tyr Asp
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565 570 575
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Gly Asp Glu Glu Ala Phe Ala Ile Tyr Lys Glu Gly Ala Val Asp Gly
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Val Thr Ser Lys Val Thr Ala Thr Thr Asp Glu Thr Tyr Leu Val Asp
645 650 655
Val Ser Asp Gly Glu Lys Val Val His His Met Lys Leu Asn Ile Gly
660 665 670
Ser Gly Ala Ile Met Met Glu Asn Leu Ala Lys Gly Ala Lys Val Ile
675 680 685
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725 730 735
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Gly Arg Leu Gln Ile Leu Lys Asp Thr Thr Ile Asp Leu Glu Lys Met
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<223> 合成
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Asn Lys Ala Leu Ala Ala Ala Ile Val Lys Ala Phe Val Thr Asp Arg
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成
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595 600 605
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Ser Asn Val Leu Ser Arg Tyr Trp Arg Phe Cys Val Asp Gly Gly Ala
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Ser Ser Tyr Tyr Pro Gln Tyr Thr Glu Leu Gln Ile Leu Gly Gln Arg
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Leu Ser Asn Asp Val Ala Asn Thr Leu Asp
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Gly Asp Glu Glu Ala Phe Ala Ile Tyr Lys Glu Gly Ala Val Asp Gly
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<210> 9
<211> 842
<212> PRT
<213> 人工序列
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<400> 9
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Leu Arg Gln Leu Ser Asn Val Lys Glu Ile Thr Pro Glu Leu Leu Pro
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Glu Ser Met Lys Lys Asp Ala Glu Leu Val Met Val Gly Met Thr Gly
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Leu Glu Lys Leu Asn Leu Ser Gly Leu Asn Arg Gln Thr Leu Asp Gly
485 490 495
Ile Asp Val Asn Ser Ile Thr His Leu Thr Ser Phe Asp Ile Ser His
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Asn Ser Leu Asp Leu Ser Glu Lys Ser Glu Asp Arg Lys Leu Leu Met
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Leu Thr Asp Phe Val Phe Gly Thr Val Thr Lys Arg Asn Thr Phe Ile
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Gly Asp Glu Glu Ala Phe Ala Ile Tyr Lys Glu Gly Ala Val Asp Gly
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Tyr Lys Gly Tyr Lys Val His Leu Thr Ala Ser Asn Leu Gly Glu Thr
625 630 635 640
Val Thr Ser Lys Val Thr Ala Thr Thr Asp Glu Thr Tyr Leu Val Asp
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Val Ser Asp Gly Glu Lys Val Val His His Met Lys Leu Asn Ile Gly
660 665 670
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<220>
<223> 合成
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85 90 95
Pro Lys Glu Val Asp Ile Leu Phe Val Phe His Asp His Thr Ala Ser
100 105 110
Asp Ser Pro Phe Trp Ser Glu Leu Lys Asp Ser Tyr Val His Lys Leu
115 120 125
His Gln Gln Gly Thr Ala Leu Val Gln Gln Ile Gly Val Asn Glu Leu
130 135 140
Asn Gly Arg Thr Gly Leu Ser Lys Asp Tyr Pro Asp Thr Pro Glu Gly
145 150 155 160
Asn Lys Ala Leu Ala Ala Ala Ile Val Lys Ala Phe Val Thr Asp Arg
165 170 175
Gly Val Asp Gly Leu Asp Ile Asp Ile Glu His Glu Phe Thr Asn Lys
180 185 190
Arg Thr Pro Glu Glu Asp Ala Arg Ala Leu Asn Val Phe Lys Glu Ile
195 200 205
Ala Gln Leu Ile Gly Lys Asn Gly Ser Asp Lys Ser Lys Leu Leu Ile
210 215 220
Met Asp Thr Thr Leu Ser Val Glu Asn Asn Pro Ile Phe Lys Gly Ile
225 230 235 240
Ala Glu Asp Leu Asp Tyr Leu Leu Arg Gln Tyr Tyr Gly Ser Gln Gly
245 250 255
Gly Glu Ala Glu Val Asp Thr Ile Asn Ser Asp Trp Asn Gln Tyr Gln
260 265 270
Asn Tyr Ile Asp Ala Ser Gln Phe Met Ile Gly Phe Ser Phe Phe Glu
275 280 285
Glu Ser Ala Ser Lys Gly Asn Leu Trp Phe Asp Val Asn Glu Tyr Asp
290 295 300
Pro Asn Asn Pro Glu Lys Gly Lys Asp Ile Glu Gly Thr Arg Ala Lys
305 310 315 320
Lys Tyr Ala Glu Trp Gln Pro Ser Thr Gly Gly Leu Lys Ala Gly Ile
325 330 335
Phe Ser Tyr Ala Ile Asp Arg Asp Gly Val Ala His Val Pro Ser Thr
340 345 350
Tyr Lys Asn Arg Thr Ser Thr Asn Leu Gln Arg His Glu Val Asp Asn
355 360 365
Ile Ser His Thr Asp Tyr Thr Val Ser Arg Lys Leu Lys Thr Leu Met
370 375 380
Thr Glu Asp Lys Arg Tyr Asp Val Ile Asp Gln Lys Asp Ile Pro Asp
385 390 395 400
Pro Ala Leu Arg Glu Gln Ile Ile Gln Gln Val Gly Gln Tyr Lys Gly
405 410 415
Asp Leu Glu Arg Tyr Asn Lys Thr Leu Val Leu Thr Gly Asp Lys Ile
420 425 430
Gln Asn Leu Lys Gly Leu Glu Lys Leu Ser Lys Leu Gln Lys Leu Glu
435 440 445
Leu Arg Gln Leu Ser Asn Val Lys Glu Ile Thr Pro Glu Leu Leu Pro
450 455 460
Glu Ser Met Lys Lys Asp Ala Glu Leu Val Met Val Gly Met Thr Gly
465 470 475 480
Leu Glu Lys Leu Asn Leu Ser Gly Leu Asn Arg Gln Thr Leu Asp Gly
485 490 495
Ile Asp Val Asn Ser Ile Thr His Leu Thr Ser Phe Asp Ile Ser His
500 505 510
Asn Ser Leu Asp Leu Ser Glu Lys Ser Glu Asp Arg Lys Leu Leu Met
515 520 525
Thr Leu Met Glu Gln Val Ser Asn His Gln Lys Ile Thr Val Lys Asn
530 535 540
Thr Ala Phe Glu Asn Gln Lys Pro Lys Gly Tyr Tyr Pro Gln Thr Tyr
545 550 555 560
Asp Thr Lys Glu Gly His Tyr Asp Val Asp Asn Ala Glu His Asp Ile
565 570 575
Leu Thr Asp Phe Val Phe Gly Thr Val Thr Lys Arg Asn Thr Phe Ile
580 585 590
Gly Asp Glu Glu Ala Phe Ala Ile Tyr Lys Glu Gly Ala Val Asp Gly
595 600 605
Arg Gln Tyr Val Ser Lys Asp Tyr Thr Tyr Glu Ala Phe Arg Lys Asp
610 615 620
Tyr Lys Gly Tyr Lys Val His Leu Thr Ala Ser Asn Leu Gly Glu Thr
625 630 635 640
Val Thr Ser Lys Val Thr Ala Thr Thr Asp Glu Thr Tyr Leu Val Asp
645 650 655
Val Ser Asp Gly Glu Lys Val Val His His Met Lys Leu Asn Ile Gly
660 665 670
Ser Gly Ala Ile Met Met Glu Asn Leu Ala Lys Gly Ala Lys Val Ile
675 680 685
Gly Thr Ser Gly Asp Phe Glu Gln Ala Lys Lys Ile Phe Asp Gly Glu
690 695 700
Lys Ser Asp Arg Phe Phe Thr Trp Gly Gln Thr Asn Trp Ile Ala Phe
705 710 715 720
Asp Leu Gly Glu Ile Asn Leu Ala Lys Glu Trp Arg Leu Phe Asn Ala
725 730 735
Glu Thr Asn Thr Glu Ile Lys Thr Asp Ser Ser Leu Asn Val Ala Lys
740 745 750
Gly Arg Leu Gln Ile Leu Lys Asp Thr Thr Ile Asp Leu Glu Lys Met
755 760 765
Asp Ile Lys Asn Arg Lys Glu Tyr Leu Ser Asn Asp Glu Asn Trp Thr
770 775 780
Asp Val Ala Gln Met Asp Asp Ala Lys Ala Ile Phe Asn Ser Lys Leu
785 790 795 800
Ser Asn Val Leu Ser Arg Tyr Trp Arg Phe Cys Val Asp Gly Gly Ala
805 810 815
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820 825 830
Leu Ser Asn Asp Val Ala Asn Thr Leu Asp
835 840
<210> 15
<211> 842
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 15
Met Asp Lys His Leu Leu Val Lys Arg Thr Leu Gly Cys Val Cys Ala
1 5 10 15
Ala Thr Leu Met Gly Ala Ala Leu Ala Thr His His Asp Ser Leu Asn
20 25 30
Thr Val Lys Ala Glu Glu Lys Thr Val Gln Thr Gly Lys Thr Asp Gln
35 40 45
Gln Val Gly Ala Lys Leu Val Gln Glu Ile Arg Glu Gly Lys Arg Gly
50 55 60
Pro Leu Tyr Ala Gly Tyr Phe Arg Thr Trp His Asp Arg Ala Ser Thr
65 70 75 80
Gly Ile Asp Gly Lys Gln Gln His Pro Glu Asn Thr Met Ala Glu Val
85 90 95
Pro Lys Glu Val Asp Ile Leu Phe Val Phe His Asp His Thr Ala Ser
100 105 110
Asp Ser Pro Phe Trp Ser Glu Leu Lys Asp Ser Tyr Val His Lys Leu
115 120 125
His Gln Gln Gly Thr Ala Leu Val Gln Arg Ile Gly Val Asn Glu Leu
130 135 140
Asn Gly Arg Thr Gly Leu Ser Lys Asp Tyr Pro Asp Thr Pro Glu Gly
145 150 155 160
Asn Lys Ala Leu Ala Ala Ala Ile Val Lys Ala Phe Val Thr Asp Arg
165 170 175
Gly Val Asp Gly Leu Asp Ile Asp Ile Glu His Glu Phe Thr Asn Lys
180 185 190
Arg Thr Pro Glu Glu Asp Ala Arg Ala Leu Asn Val Phe Lys Glu Ile
195 200 205
Ala Gln Leu Ile Gly Lys Asn Gly Ser Asp Lys Ser Lys Leu Leu Ile
210 215 220
Met Asp Thr Thr Leu Ser Val Glu Asn Asn Pro Ile Phe Lys Gly Ile
225 230 235 240
Ala Glu Asp Leu Asp Tyr Leu Leu Arg Gln Tyr Tyr Gly Ser Gln Gly
245 250 255
Gly Glu Ala Glu Val Asp Thr Ile Asn Ser Asp Trp Asn Gln Tyr Gln
260 265 270
Asn Tyr Ile Asp Ala Ser Gln Phe Met Ile Gly Phe Ser Phe Phe Glu
275 280 285
Glu Ser Ala Ser Lys Gly Asn Leu Trp Phe Asp Val Asn Glu Tyr Asp
290 295 300
Pro Asn Asn Pro Glu Lys Gly Lys Asp Ile Glu Gly Thr Arg Ala Lys
305 310 315 320
Lys Tyr Ala Glu Trp Gln Pro Ser Thr Gly Gly Leu Lys Ala Gly Ile
325 330 335
Phe Ser Tyr Ala Ile Asp Arg Asp Gly Val Ala His Val Pro Ser Thr
340 345 350
Tyr Lys Asn Arg Thr Ser Thr Asn Leu Gln Arg His Glu Val Asp Asn
355 360 365
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370 375 380
Thr Glu Asp Lys Arg Tyr Asp Val Ile Asp Gln Lys Asp Ile Pro Asp
385 390 395 400
Pro Ala Leu Arg Glu Gln Ile Ile Gln Gln Val Gly Gln Tyr Lys Gly
405 410 415
Asp Leu Glu Arg Tyr Asn Lys Thr Leu Val Leu Thr Gly Asp Lys Ile
420 425 430
Gln Asn Leu Lys Gly Leu Glu Lys Leu Ser Lys Leu Gln Lys Leu Glu
435 440 445
Leu Arg Gln Leu Ser Asn Val Lys Glu Ile Thr Pro Glu Leu Leu Pro
450 455 460
Glu Ser Met Lys Lys Asp Ala Glu Leu Val Met Val Gly Met Thr Gly
465 470 475 480
Leu Glu Lys Leu Asn Leu Ser Gly Leu Asn Arg Gln Thr Leu Asp Gly
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Thr Leu Met Glu Gln Val Ser Asn His Gln Lys Ile Thr Val Lys Asn
530 535 540
Thr Ala Phe Glu Asn Gln Lys Pro Lys Gly Tyr Tyr Pro Gln Thr Tyr
545 550 555 560
Asp Thr Lys Glu Gly His Tyr Asp Val Asp Asn Ala Glu His Asp Ile
565 570 575
Leu Thr Asp Phe Val Phe Gly Thr Val Thr Lys Arg Asn Thr Phe Ile
580 585 590
Gly Asp Glu Glu Ala Phe Ala Ile Tyr Lys Glu Gly Ala Val Asp Gly
595 600 605
Arg Gln Tyr Val Ser Lys Asp Tyr Thr Tyr Glu Ala Phe Arg Lys Asp
610 615 620
Tyr Lys Gly Tyr Lys Val His Leu Thr Ala Ser Asn Leu Gly Glu Thr
625 630 635 640
Val Thr Ser Lys Val Thr Ala Thr Thr Asp Glu Thr Tyr Leu Val Asp
645 650 655
Val Ser Asp Gly Glu Lys Val Val His His Met Lys Leu Asn Ile Gly
660 665 670
Ser Gly Ala Ile Met Met Glu Asn Leu Ala Lys Gly Ala Lys Val Ile
675 680 685
Gly Thr Ser Gly Asp Phe Glu Gln Ala Lys Lys Ile Phe Asp Gly Glu
690 695 700
Lys Ser Asp Arg Phe Phe Thr Trp Gly Gln Thr Asn Trp Ile Ala Phe
705 710 715 720
Asp Leu Gly Glu Ile Asn Leu Ala Lys Glu Trp Arg Leu Phe Asn Ala
725 730 735
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740 745 750
Gly Arg Leu Gln Ile Leu Lys Asp Thr Thr Ile Asp Leu Glu Lys Met
755 760 765
Asp Ile Lys Asn Arg Lys Glu Tyr Leu Ser Asn Asp Glu Asn Trp Thr
770 775 780
Asp Val Ala Gln Met Asp Asp Ala Lys Ala Ile Phe Asn Ser Lys Leu
785 790 795 800
Ser Asn Val Leu Ser Arg Tyr Trp Arg Phe Cys Val Asp Gly Gly Ala
805 810 815
Ser Ser Tyr Tyr Pro Gln Tyr Thr Glu Leu Gln Ile Leu Gly Gln Arg
820 825 830
Leu Ser Asn Asp Val Ala Asn Thr Leu Asp
835 840
<210> 16
<211> 842
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 16
Met Asp Lys His Leu Leu Val Lys Arg Thr Leu Gly Cys Val Cys Ala
1 5 10 15
Ala Thr Leu Met Gly Ala Ala Leu Ala Thr His His Asp Ser Leu Asn
20 25 30
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35 40 45
Gln Val Gly Ala Lys Leu Val Gln Glu Ile Arg Glu Gly Lys Arg Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Gly Ile Asp Gly Lys Gln Gln His Pro Glu Asn Thr Met Ala Glu Val
85 90 95
Pro Lys Glu Val Asp Ile Leu Phe Val Phe His Asp His Thr Ala Ser
100 105 110
Asp Ser Pro Phe Trp Ser Glu Leu Lys Asp Ser Tyr Val His Lys Leu
115 120 125
His Gln Gln Gly Thr Ala Leu Val Gln Val Ile Gly Val Asn Glu Leu
130 135 140
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145 150 155 160
Asn Lys Ala Leu Ala Ala Ala Ile Val Lys Ala Phe Val Thr Asp Arg
165 170 175
Gly Val Asp Gly Leu Asp Ile Asp Ile Glu His Glu Phe Thr Asn Lys
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Arg Thr Pro Glu Glu Asp Ala Arg Ala Leu Asn Val Phe Lys Glu Ile
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Ala Glu Asp Leu Asp Tyr Leu Leu Arg Gln Tyr Tyr Gly Ser Gln Gly
245 250 255
Gly Glu Ala Glu Val Asp Thr Ile Asn Ser Asp Trp Asn Gln Tyr Gln
260 265 270
Asn Tyr Ile Asp Ala Ser Gln Phe Met Ile Gly Phe Ser Phe Phe Glu
275 280 285
Glu Ser Ala Ser Lys Gly Asn Leu Trp Phe Asp Val Asn Glu Tyr Asp
290 295 300
Pro Asn Asn Pro Glu Lys Gly Lys Asp Ile Glu Gly Thr Arg Ala Lys
305 310 315 320
Lys Tyr Ala Glu Trp Gln Pro Ser Thr Gly Gly Leu Lys Ala Gly Ile
325 330 335
Phe Ser Tyr Ala Ile Asp Arg Asp Gly Val Ala His Val Pro Ser Thr
340 345 350
Tyr Lys Asn Arg Thr Ser Thr Asn Leu Gln Arg His Glu Val Asp Asn
355 360 365
Ile Ser His Thr Asp Tyr Thr Val Ser Arg Lys Leu Lys Thr Leu Met
370 375 380
Thr Glu Asp Lys Arg Tyr Asp Val Ile Asp Gln Lys Asp Ile Pro Asp
385 390 395 400
Pro Ala Leu Arg Glu Gln Ile Ile Gln Gln Val Gly Gln Tyr Lys Gly
405 410 415
Asp Leu Glu Arg Tyr Asn Lys Thr Leu Val Leu Thr Gly Asp Lys Ile
420 425 430
Gln Asn Leu Lys Gly Leu Glu Lys Leu Ser Lys Leu Gln Lys Leu Glu
435 440 445
Leu Arg Gln Leu Ser Asn Val Lys Glu Ile Thr Pro Glu Leu Leu Pro
450 455 460
Glu Ser Met Lys Lys Asp Ala Glu Leu Val Met Val Gly Met Thr Gly
465 470 475 480
Leu Glu Lys Leu Asn Leu Ser Gly Leu Asn Arg Gln Thr Leu Asp Gly
485 490 495
Ile Asp Val Asn Ser Ile Thr His Leu Thr Ser Phe Asp Ile Ser His
500 505 510
Asn Ser Leu Asp Leu Ser Glu Lys Ser Glu Asp Arg Lys Leu Leu Met
515 520 525
Thr Leu Met Glu Gln Val Ser Asn His Gln Lys Ile Thr Val Lys Asn
530 535 540
Thr Ala Phe Glu Asn Gln Lys Pro Lys Gly Tyr Tyr Pro Gln Thr Tyr
545 550 555 560
Asp Thr Lys Glu Gly His Tyr Asp Val Asp Asn Ala Glu His Asp Ile
565 570 575
Leu Thr Asp Phe Val Phe Gly Thr Val Thr Lys Arg Asn Thr Phe Ile
580 585 590
Gly Asp Glu Glu Ala Phe Ala Ile Tyr Lys Glu Gly Ala Val Asp Gly
595 600 605
Arg Gln Tyr Val Ser Lys Asp Tyr Thr Tyr Glu Ala Phe Arg Lys Asp
610 615 620
Tyr Lys Gly Tyr Lys Val His Leu Thr Ala Ser Asn Leu Gly Glu Thr
625 630 635 640
Val Thr Ser Lys Val Thr Ala Thr Thr Asp Glu Thr Tyr Leu Val Asp
645 650 655
Val Ser Asp Gly Glu Lys Val Val His His Met Lys Leu Asn Ile Gly
660 665 670
Ser Gly Ala Ile Met Met Glu Asn Leu Ala Lys Gly Ala Lys Val Ile
675 680 685
Gly Thr Ser Gly Asp Phe Glu Gln Ala Lys Lys Ile Phe Asp Gly Glu
690 695 700
Lys Ser Asp Arg Phe Phe Thr Trp Gly Gln Thr Asn Trp Ile Ala Phe
705 710 715 720
Asp Leu Gly Glu Ile Asn Leu Ala Lys Glu Trp Arg Leu Phe Asn Ala
725 730 735
Glu Thr Asn Thr Glu Ile Lys Thr Asp Ser Ser Leu Asn Val Ala Lys
740 745 750
Gly Arg Leu Gln Ile Leu Lys Asp Thr Thr Ile Asp Leu Glu Lys Met
755 760 765
Asp Ile Lys Asn Arg Lys Glu Tyr Leu Ser Asn Asp Glu Asn Trp Thr
770 775 780
Asp Val Ala Gln Met Asp Asp Ala Lys Ala Ile Phe Asn Ser Lys Leu
785 790 795 800
Ser Asn Val Leu Ser Arg Tyr Trp Arg Phe Cys Val Asp Gly Gly Ala
805 810 815
Ser Ser Tyr Tyr Pro Gln Tyr Thr Glu Leu Gln Ile Leu Gly Gln Arg
820 825 830
Leu Ser Asn Asp Val Ala Asn Thr Leu Asp
835 840
<210> 17
<211> 842
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 17
Met Asp Lys His Leu Leu Val Lys Arg Thr Leu Gly Cys Val Cys Ala
1 5 10 15
Ala Thr Leu Met Gly Ala Ala Leu Ala Thr His His Asp Ser Leu Asn
20 25 30
Thr Val Lys Ala Glu Glu Lys Thr Val Gln Thr Gly Lys Thr Asp Gln
35 40 45
Gln Val Gly Ala Lys Leu Val Gln Glu Ile Arg Glu Gly Lys Arg Gly
50 55 60
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Gly Ile Asp Gly Lys Gln Gln His Pro Glu Asn Thr Met Ala Glu Val
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100 105 110
Asp Ser Pro Phe Trp Ser Glu Leu Lys Asp Ser Tyr Val His Lys Leu
115 120 125
His Gln Gln Gly Thr Ala Leu Val Gln Trp Ile Gly Val Asn Glu Leu
130 135 140
Asn Gly Arg Thr Gly Leu Ser Lys Asp Tyr Pro Asp Thr Pro Glu Gly
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Asn Lys Ala Leu Ala Ala Ala Ile Val Lys Ala Phe Val Thr Asp Arg
165 170 175
Gly Val Asp Gly Leu Asp Ile Asp Ile Glu His Glu Phe Thr Asn Lys
180 185 190
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210 215 220
Met Asp Thr Thr Leu Ser Val Glu Asn Asn Pro Ile Phe Lys Gly Ile
225 230 235 240
Ala Glu Asp Leu Asp Tyr Leu Leu Arg Gln Tyr Tyr Gly Ser Gln Gly
245 250 255
Gly Glu Ala Glu Val Asp Thr Ile Asn Ser Asp Trp Asn Gln Tyr Gln
260 265 270
Asn Tyr Ile Asp Ala Ser Gln Phe Met Ile Gly Phe Ser Phe Phe Glu
275 280 285
Glu Ser Ala Ser Lys Gly Asn Leu Trp Phe Asp Val Asn Glu Tyr Asp
290 295 300
Pro Asn Asn Pro Glu Lys Gly Lys Asp Ile Glu Gly Thr Arg Ala Lys
305 310 315 320
Lys Tyr Ala Glu Trp Gln Pro Ser Thr Gly Gly Leu Lys Ala Gly Ile
325 330 335
Phe Ser Tyr Ala Ile Asp Arg Asp Gly Val Ala His Val Pro Ser Thr
340 345 350
Tyr Lys Asn Arg Thr Ser Thr Asn Leu Gln Arg His Glu Val Asp Asn
355 360 365
Ile Ser His Thr Asp Tyr Thr Val Ser Arg Lys Leu Lys Thr Leu Met
370 375 380
Thr Glu Asp Lys Arg Tyr Asp Val Ile Asp Gln Lys Asp Ile Pro Asp
385 390 395 400
Pro Ala Leu Arg Glu Gln Ile Ile Gln Gln Val Gly Gln Tyr Lys Gly
405 410 415
Asp Leu Glu Arg Tyr Asn Lys Thr Leu Val Leu Thr Gly Asp Lys Ile
420 425 430
Gln Asn Leu Lys Gly Leu Glu Lys Leu Ser Lys Leu Gln Lys Leu Glu
435 440 445
Leu Arg Gln Leu Ser Asn Val Lys Glu Ile Thr Pro Glu Leu Leu Pro
450 455 460
Glu Ser Met Lys Lys Asp Ala Glu Leu Val Met Val Gly Met Thr Gly
465 470 475 480
Leu Glu Lys Leu Asn Leu Ser Gly Leu Asn Arg Gln Thr Leu Asp Gly
485 490 495
Ile Asp Val Asn Ser Ile Thr His Leu Thr Ser Phe Asp Ile Ser His
500 505 510
Asn Ser Leu Asp Leu Ser Glu Lys Ser Glu Asp Arg Lys Leu Leu Met
515 520 525
Thr Leu Met Glu Gln Val Ser Asn His Gln Lys Ile Thr Val Lys Asn
530 535 540
Thr Ala Phe Glu Asn Gln Lys Pro Lys Gly Tyr Tyr Pro Gln Thr Tyr
545 550 555 560
Asp Thr Lys Glu Gly His Tyr Asp Val Asp Asn Ala Glu His Asp Ile
565 570 575
Leu Thr Asp Phe Val Phe Gly Thr Val Thr Lys Arg Asn Thr Phe Ile
580 585 590
Gly Asp Glu Glu Ala Phe Ala Ile Tyr Lys Glu Gly Ala Val Asp Gly
595 600 605
Arg Gln Tyr Val Ser Lys Asp Tyr Thr Tyr Glu Ala Phe Arg Lys Asp
610 615 620
Tyr Lys Gly Tyr Lys Val His Leu Thr Ala Ser Asn Leu Gly Glu Thr
625 630 635 640
Val Thr Ser Lys Val Thr Ala Thr Thr Asp Glu Thr Tyr Leu Val Asp
645 650 655
Val Ser Asp Gly Glu Lys Val Val His His Met Lys Leu Asn Ile Gly
660 665 670
Ser Gly Ala Ile Met Met Glu Asn Leu Ala Lys Gly Ala Lys Val Ile
675 680 685
Gly Thr Ser Gly Asp Phe Glu Gln Ala Lys Lys Ile Phe Asp Gly Glu
690 695 700
Lys Ser Asp Arg Phe Phe Thr Trp Gly Gln Thr Asn Trp Ile Ala Phe
705 710 715 720
Asp Leu Gly Glu Ile Asn Leu Ala Lys Glu Trp Arg Leu Phe Asn Ala
725 730 735
Glu Thr Asn Thr Glu Ile Lys Thr Asp Ser Ser Leu Asn Val Ala Lys
740 745 750
Gly Arg Leu Gln Ile Leu Lys Asp Thr Thr Ile Asp Leu Glu Lys Met
755 760 765
Asp Ile Lys Asn Arg Lys Glu Tyr Leu Ser Asn Asp Glu Asn Trp Thr
770 775 780
Asp Val Ala Gln Met Asp Asp Ala Lys Ala Ile Phe Asn Ser Lys Leu
785 790 795 800
Ser Asn Val Leu Ser Arg Tyr Trp Arg Phe Cys Val Asp Gly Gly Ala
805 810 815
Ser Ser Tyr Tyr Pro Gln Tyr Thr Glu Leu Gln Ile Leu Gly Gln Arg
820 825 830
Leu Ser Asn Asp Val Ala Asn Thr Leu Asp
835 840
<210> 18
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 18
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
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Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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115 120 125
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130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
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355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 19
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 19
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp
65 70 75 80
Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser
100 105 110
Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala
115 120 125
Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
130 135 140
Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser
145 150 155 160
Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr
165 170 175
Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys
180 185 190
Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
195 200 205
Arg Gly Glu Cys
210

Claims (15)

1.一种糖苷内切酶S2(endoglycosidase,EndoS2)突变体，其于一野生型糖苷内切酶S2(SEQ ID NO:1)序列中包含一或多个突变点，其中该一或多个突变点是位于残基133-143、残基177-182、残基184-189、残基221-231及/或残基227-237内的一肽区域内，其中该糖苷内切酶S2突变体的水解活性低于该野生型糖苷内切酶S2的水解活性，且该糖苷内切酶S2突变体的转糖苷化活性高于该野生型糖苷内切酶S2的转糖苷化活性。
2.如权利要求1所述的糖苷内切酶S2突变体，其特征在于，该一或多个突变点是位于残基T138、D182、D226、T227及/或T228。
3.如权利要求1所述的糖苷内切酶S2突变体，其特征在于，该一或多个突变点是选自由T138D、T138E、T138F、T138H、T138K、T138L、T138M、T138N、T138Q、T138R、T138V、T138W、D182Q、D226Q、T227Q及T228Q所组成的群组。
4.如权利要求1所述的糖苷内切酶S2突变体，其特征在于，该糖苷内切酶S2突变体包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的序列。
5.一种使用如权利要求1-4所述的任一种糖苷内切酶S2突变体来制备一经糖工程改造的糖蛋白的方法，包含将一活化寡糖耦合至一糖蛋白受体。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，该活化寡糖是一聚糖恶唑啉。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，该聚糖恶唑啉包含一具有以下化学式的N-聚糖：
其中，R1是透过β-1,4键合的–H或N-乙酰葡萄糖胺；以及
R2及R3可以相同或不同，且是独立选自由：
所组成的群组。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，该糖蛋白受体含有一GlcNAc单糖。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，该糖蛋白受体是一非海藻糖化GlcNAc-受体。
10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，该糖蛋白受体是一糖肽、一糖蛋白、一抗体或其片段。
11.如权利要求5所述的方法，其特征在于，该糖蛋白受体为一核心海藻糖化或非海藻糖化的GlcNAc-IgG受体或其片段。
12.如权利要求5所述的方法，其特征在于，该GlcNAc-IgG受体是源自一单克隆抗体，其是选自由西妥昔单抗(cetuximab)、利妥昔单抗(rituximab)、莫罗莫那-CD3(muromonab-CD3)、阿昔单抗(abciximab)、达昔单抗(daclizumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、帕利珠单抗(palivizumab)、英夫利西单抗(infliximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、吉妥单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、阿来组单抗(alemtuzumab)、ibritumomab tiuxetan、阿达木单抗(adalimumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、托西莫单抗(tositumomab)、I-131托西莫单抗(I-131 tositumomab)、依法利珠单抗(efalizumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、那他珠单抗(natalizumab)、依那西普(etanercept)、IGN101、伏洛昔单抗(volociximab)、抗-CD80 mAb、抗-CD23 mAb、CAT-3888、CDP-791、eraptuzumab、MDX-010、MDX-060、MDX-070、马妥珠单抗、CP-675,206、CAL、SGN-30、扎木单抗(zanolimumab)、阿德木单抗(adecatumumab)、奥果伏单抗(oregovomab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、ABT-874、地诺单抗(denosumab)、AM 108、AMG 714、芳妥珠单抗(fontolizumab)、达昔单抗(daclizumab)、利木单抗(golimumab)、CNTO 1275、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、HuMax-CD20、贝利单抗(belimumab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、MLN1202、维西珠单抗(visilizumab)、托西珠单抗(tocilizumab)、ocrerlizumab、certolizumabpegol、艾库组单抗(eculizumab)、沛瑟珠单抗(pexelizumab)、阿昔单抗(abciximab)以及兰尼单抗(ranibizimumab)所组成的群组。
13.一种如权利要求5-12所述的任一种方法制备的糖蛋白。
14.一种组合物，包含如权利要求13所述的糖蛋白以及一药学上可接受的载体或赋形剂。
15.一种治疗癌症的方法，包含对一亟需的个体投予一有效量如权利要求14所述该的组合物。
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