[go: up one dir, main page]

CN110229797A - 一种乙酰羟酸合成酶及其应用 - Google Patents

一种乙酰羟酸合成酶及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110229797A
CN110229797A CN201910484362.5A CN201910484362A CN110229797A CN 110229797 A CN110229797 A CN 110229797A CN 201910484362 A CN201910484362 A CN 201910484362A CN 110229797 A CN110229797 A CN 110229797A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ala
val
gly
leu
ile
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910484362.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110229797B (zh
Inventor
张成林
李英滋
韩世宝
徐庆阳
李燕军
张宇
芦楠
朱福周
董解荣
陈亭利
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin University of Science and Technology
Original Assignee
Tianjin University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin University of Science and Technology filed Critical Tianjin University of Science and Technology
Priority to CN201910484362.5A priority Critical patent/CN110229797B/zh
Publication of CN110229797A publication Critical patent/CN110229797A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110229797B publication Critical patent/CN110229797B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1022—Transferases (2.) transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y202/00—Transferases transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
    • C12Y202/01—Transketolases and transaldolases (2.2.1)
    • C12Y202/01006—Acetolactate synthase (2.2.1.6)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一个解除L‑异亮氨酸反馈抑制乙酰羟酸合成酶及其应用，属于代谢工程领域。本发明所述ilvBNM基因编码的乙酰羟酸合成酶具有如下特点：该酶在解除了L‑异亮氨酸对其的反馈抑制作用，在L‑异亮氨酸浓度为0‑12mmol/L条件下，ILVBNM酶活性无明显变化，且其活性较野生型ilvBN编码的乙酰羟酸合成酶未见明显降低，可应用于L‑异亮氨酸中的生产。

Description

一种乙酰羟酸合成酶及其应用
技术领域：
本发明涉及一个解除L-异亮氨酸反馈抑制乙酰羟酸合成酶及其应用，属于代谢工程领域。
背景技术：
L-异亮氨酸属于分支链氨基酸，是人体必需的八种氨基酸之一。L-异亮氨酸是合成人体激素和酶的原料，具有促进蛋白质合成和抑制其分解的作用，在人体生命活动中扮演着至关重要角色。因此，L-异亮氨酸在食品和医药等行业具有非常广泛的市场及应用前景。
L-异亮氨酸的合成方法有提取法、化学合成法和发酵法。工业化生产主要采用毛发提取法和发酵法合成L-异亮氨酸。由于提取法具有原料来源受限制、生产成本高、污染环境等不足，目前主要采用发酵法生产L-异亮氨酸。目前，L-异亮氨酸的工业生产菌种主要由诱变获得，具有营养缺陷、生长慢、遗传性状不稳定等不足，从而引起发酵周期长、发酵性能不稳定、产量和转化率低等问题。
发明内容：
为了克服目前野生型乙酰羟酸合成酶受L-异亮氨酸反馈抑制的不足，本发明提供一种解除L-异亮氨酸反馈抑制的乙酰羟酸合成酶突变体及其编码基因及其应用。
本发明解决述问题的技术方案之一是：提供一个解除L-异亮氨酸反馈抑制的乙酰羟酸合成酶突变体，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述乙酰羟酸合成酶突变体的编码基因为ilvBNM，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
所述乙酰羟酸合成酶突变体来自一株谷氨酸棒杆菌突变株，所述突变株筛选过程如下：以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032为出发菌株，通过常压室温等离子诱变，然后在含50mg/Lα-氨基丁酸的基本培养基上筛选出菌株ILE396；以ILE396为出发菌株，通过常压室温等离子诱变，然后在含50mg/L硫代异亮氨酸的基本培养基上筛选出菌株ILE693。
提取ILE693基因组，通过设计引物进行PCR扩增乙酰羟酸合成酶编码基因，将PCR产物回收后进行测序，发现该基因编码的乙酰羟酸合成酶相对于来自谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032的野生型乙酰羟酸合成酶发生如下氨基酸突变：K30Q，A84T，G128S，A226S，K227R，Y252H，T362S，H673L。
在本发明中采用如下定义：
1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法
使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，采用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。
2、乙酰羟酸合成酶突变体的标识
采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示乙酰羟酸合成酶突变体中突变的氨基酸。如K30Q，表示位置30的氨基酸由野生型乙酰羟酸合成酶的Lys替换成Gln，K30表示第30位的氨基酸为Lys，位置的编号对应于SEQ ID NO.3中野生型乙酰羟酸合成酶的氨基酸序列编号。
本发明中，ilvBN代表野生型乙酰羟酸合成酶编码基因(SEQ ID NO.4所示)，ILVBN代表野生型乙酰羟酸合成酶(SEQ ID NO.3所示)；ilvBNM为乙酰羟酸合成酶突变体基因(SEQ ID NO.2所示)；ILVBNM为乙酰羟酸合成酶突变体(SEQ ID NO.1所示)。突变前后的氨基酸对照如下表：
乙酰羟酸合成酶 氨基酸
ILVBN K30，A84，G128，A226，K227，Y252，T362，H673
ILVBN<sup>M</sup> K30Q，A84T，G128S，A226S，K227R，Y252H，T362S，H673L
所述乙酰羟酸合成酶突变体ILVBNM，具有如下酶学特性：在L-异亮氨酸浓度为0-12mmol/L条件下，ILVBNM酶活性无明显变化，即该突变体解除了L-异亮氨酸对其反馈抑制作用；且在L-异亮氨酸浓度为0-12mmol/L条件下，ILVBNM的酶活性与野生型乙酰羟酸合成酶ILVBN相比无降低。
本发明还提供乙酰羟酸合成酶突变体ILVBNM在生产L-异亮氨酸中的应用。
有益效果：
1、本发明所述ilvBNM基因编码的乙酰羟酸合成酶具有如下特点：该酶在解除了L-异亮氨酸对其的反馈抑制作用(图1)，在L-异亮氨酸浓度为0-12mmol/L条件下，ILVBNM酶活性无明显变化，且其活性较野生型ilvBN编码的乙酰羟酸合成酶未见明显降低(图2)。
附图说明：
图1 L-异亮氨酸对ilvBN和ilvBNM基因编码的乙酰羟酸合酶活性的影响；
图2 ilvBNM与ilvBN编码的乙酰羟酸合酶活性对比；
具体实施方式：
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。
实施例1：解除L-异亮氨酸反馈抑制的乙酰羟酸合成酶编码基因ilvBNM的获得
(1)抗L-异亮氨酸结构类似物突变株的筛选
①谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032菌悬液的制备
将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032接种至LB液体培养基，于32℃，200rpm，培养12h，离心收集菌体，无菌生理盐水洗涤3次后重悬，使得OD600＝0.6-0.8，取10μL菌悬液涂在载片上。
②常压室温等离子诱变
诱变参数为：载片置于气流端口2mm处，功率120W，气流量10SLM，作用时间25s。
③抗L-异亮氨酸结构类似物α-氨基丁酸突变株的筛选
将步骤②诱变后的菌悬液涂布在含50mg/L α-氨基丁酸的基本培养基上，35℃培养48h后，选取菌落较大的菌株。
④菌株产L-异亮氨酸能力测定
将步骤③筛选的菌株利用种子培养基进行96孔板培养，然后以10％的接种量接种至含发酵培养基的96孔板进行发酵实验，ILE396的L-异亮氨酸产量最高。
⑤抗L-异亮氨酸结构类似物硫代异亮氨酸突变株的筛选及产L-异亮氨酸能力测定
以ILE396为诱变对象，重复步骤①和②，将诱变后的菌悬液涂布在含50mg/L硫代异亮氨酸的基本培养基上，35℃培养48h后，选取菌落较大的菌株。重复步骤④，ILE693的L-异亮氨酸产量最高。
⑥培养基
种子培养基：葡萄糖25g/L，酵母粉5g/L，(NH4)2SO45g/L，KH2PO42g/L，MnSO4 0.6g/L，玉米浆40mL，pH 6.8-7.2，115℃高压蒸汽灭菌15min。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖80g/L，(NH4)2SO4 3g/L，KH2PO4 1.5g/L，MgSO4·7H2O0.6g/L，MnSO40.015g/L，VB1 0.001g/L，玉米浆30mL。pH 6.8-7.2，115℃高压蒸汽灭菌15min。
⑦检测方法
将发酵液于8000g离心5min后取上清液，使用0.8％(V/V)2，4-二硝基氟苯对其进行衍生反应，采用高效液相色谱测定L-异亮氨酸含量，其检测条件为：Agilent C18(15mm×4.6mm，5μm)，采用乙腈/醋酸钠二元梯度洗脱，柱温33℃，检测波长360nm，根据高效液相法的测定结果，根据与标准品出峰时间及峰面积对比，确定L-异亮氨酸产量。
(2)解除L-异亮氨酸反馈抑制乙酰羟酸合成酶编码基因ilvBNM突变体的获得
提取ILE693基因组，利用引物ilvBN-1和ilvBN-2进行PCR扩增，PCR条件为：94℃5min 1个循环，94℃30s、56℃30s、72℃1min 30个循环，72℃10min 1个循环，反应体系为100μL。取10μL PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR扩增的目的片段回收后连接至pMDTM 18-T Vector并转化至大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞中，然后涂布于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB固体培养上，于37℃倒置培养24h。挑取3个单克隆，提取重组质粒并测定其序列。
测序结果表明，与野生型ilvBN相比，突变后基因编码的乙酰羟酸合成酶发生了K30Q，A84T，G128S，A226S，K227R，Y252H，T362S，H673L突变，将该突变体命名为ILVBNM，编码基因命名为ilvBNM。
(3)乙酰羟酸合成酶突变体ILVBNM与野生型乙酰羟酸合成酶ILVBN的酶学性质比较
分别以谷氨酸棒杆菌ATCC13032和ILE693基因组为模板，利用引物IV-1和IV-2进行PCR扩增，产物回收后连接至经BamH I酶切的pET-His质粒，然后转化至大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)，获得菌株E.coli-ilvBN和E.coli-ilvBNM。利用IPTG对E.coli-ilvBN和E.coli-ilvBNM诱导表达重组蛋白ILVBN和ILVBNM，收集菌体，用100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 7.8)重悬后进行超声破碎并离心后取上清液。
ILVBNM和ILVBN的酶活性测定方法如下：取100μL上述上清液至1mL磷酸钾缓冲液(100mmol/L，pH 7.8含100mmol/L丙酮酸钠、100mmol/L 2-酮丁酸、10mmol/LMgCl2，0.2mmol/L焦磷酸硫胺素)，于37℃反应1h后，加入100μL硫酸(3mol/L)，并于65℃处理15min以终止反应。将上述反应液与1mL 0.5％肌酸和1mLα-萘酚溶液(含2.5mol/LNaOH)混合，于65℃处理20min后冷却取室温，利用分光光度测定2-酮基-2-羟基丁酸生成量(OD525)。结果如图2所示，ILVBNM和ILVBN的活性分别为16.7和16.9nmol/(min·mg总蛋白)，二者无明显差异。
L-异亮氨酸对ILVBNM和ILVBN的酶活性影响测定方法如下：向上述反应液中分别加入0、2、4、6、8、10、12mmol/LL-异亮氨酸，然后测定2-酮基-2-羟基丁酸生成量，以考察ILVBNM解除L-异亮氨酸的反馈抑制作用。将L-异亮氨酸添加浓度为0时的酶活性定义为100％，其余L-异亮氨酸浓度条件下的ILVBNM和ILVBN的酶活性与之相比即为相对酶活性。结果如图1所示，ILVBN的相对酶活性随L-异亮氨酸浓度增加迅速降低，L-异亮氨酸浓度高于8mmol/L时，几乎无活性，表明该酶受L-异亮氨酸反馈抑制作用；而突变体ILVBNM的相对活性随L-异亮氨酸浓度的增加无明显变化，表明其解除了L-异亮氨酸的反馈抑制作用。
综合以上结果，乙酰羟酸合成酶突变体ILVBNM解除了L-异亮氨酸的反馈抑制作用，同时其活性较野生型ILVBN相比未见降低。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种乙酰羟酸合成酶及其应用
<130> 1
<141> 2019-06-05
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 798
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 1
Met Asn Val Ala Ala Ser Gln Gln Pro Thr Pro Ala Thr Val Ala Ser
1 5 10 15
Arg Gly Arg Ser Ala Ala Pro Glu Arg Met Thr Gly Ala Gln Ala Ile
20 25 30
Val Arg Ser Leu Glu Glu Leu Asn Ala Asp Ile Val Phe Gly Ile Pro
35 40 45
Gly Gly Ala Val Leu Pro Val Tyr Asp Pro Leu Tyr Ser Ser Thr Lys
50 55 60
Val Arg His Val Leu Val Arg His Glu Gln Gly Ala Gly His Ala Ala
65 70 75 80
Thr Gly Tyr Thr Gln Val Thr Gly Arg Val Gly Val Cys Ile Ala Thr
85 90 95
Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Thr Pro Ile Ala Asp Ala Asn
100 105 110
Leu Asp Ser Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Gly Ser Ser
115 120 125
Leu Leu Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Ala Asp Ile Arg Gly Ile Thr
130 135 140
Met Pro Val Thr Lys His Asn Phe Met Val Thr Asn Pro Asn Asp Ile
145 150 155 160
Pro Gln Ala Leu Ala Glu Ala Phe His Leu Ala Ile Thr Gly Arg Pro
165 170 175
Gly Pro Val Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Val Gln Asn Ala Glu Leu
180 185 190
Asp Phe Val Trp Pro Pro Lys Ile Asp Leu Pro Gly Tyr Arg Pro Val
195 200 205
Ser Thr Pro His Ala Arg Gln Ile Glu Gln Ala Val Lys Leu Ile Gly
210 215 220
Glu Ser Arg Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly Val Ile Lys Ala
225 230 235 240
Asp Ala His Glu Glu Leu Arg Ala Phe Ala Glu His Thr Gly Ile Pro
245 250 255
Val Val Thr Thr Leu Met Ala Leu Gly Thr Phe Pro Glu Ser His Glu
260 265 270
Leu His Met Gly Met Pro Gly Met His Gly Thr Val Ser Ala Val Gly
275 280 285
Ala Leu Gln Arg Ser Asp Leu Leu Ile Ala Ile Gly Ser Arg Phe Asp
290 295 300
Asp Arg Val Thr Gly Asp Val Asp Thr Phe Ala Pro Asp Ala Lys Ile
305 310 315 320
Ile His Ala Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Ile Lys Gln Val
325 330 335
Glu Val Pro Ile Val Gly Asp Ala Arg Glu Val Leu Ala Arg Leu Leu
340 345 350
Glu Thr Thr Lys Ala Ser Lys Ala Glu Ser Glu Asp Ile Ser Glu Trp
355 360 365
Val Asp Tyr Leu Lys Gly Leu Lys Ala Arg Phe Pro Arg Gly Tyr Asp
370 375 380
Glu Gln Pro Gly Asp Leu Leu Ala Pro Gln Phe Val Ile Glu Thr Leu
385 390 395 400
Ser Lys Glu Val Gly Pro Asp Ala Ile Tyr Cys Ala Gly Val Gly Gln
405 410 415
His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Val Asp Phe Glu Lys Pro Arg Thr
420 425 430
Trp Leu Asn Ser Gly Gly Leu Gly Thr Met Gly Tyr Ala Val Pro Ala
435 440 445
Ala Leu Gly Ala Lys Ala Gly Ala Pro Asp Lys Glu Val Trp Ala Ile
450 455 460
Asp Gly Asp Gly Cys Phe Gln Met Thr Asn Gln Glu Leu Thr Thr Ala
465 470 475 480
Ala Val Glu Gly Phe Pro Ile Lys Ile Ala Leu Ile Asn Asn Gly Asn
485 490 495
Leu Gly Met Val Arg Gln Trp Gln Thr Leu Phe Tyr Glu Gly Arg Tyr
500 505 510
Ser Asn Thr Lys Leu Arg Asn Gln Gly Glu Tyr Met Pro Asp Phe Val
515 520 525
Thr Leu Ser Glu Gly Leu Gly Cys Val Ala Ile Arg Val Thr Lys Ala
530 535 540
Glu Glu Val Leu Pro Ala Ile Gln Lys Ala Arg Glu Ile Asn Asp Arg
545 550 555 560
Pro Val Val Ile Asp Phe Ile Val Gly Glu Asp Ala Gln Val Trp Pro
565 570 575
Met Val Ser Ala Gly Ser Ser Asn Ser Asp Ile Gln Tyr Ala Leu Gly
580 585 590
Leu Arg Pro Phe Phe Asp Gly Asp Glu Ser Ala Ala Glu Asp Pro Ala
595 600 605
Asp Ile His Glu Ala Val Ser Asp Ile Asp Ala Ala Val Glu Ser Thr
610 615 620
Glu Ala Met Ala Asn Ser Asp Val Thr Arg His Ile Leu Ser Val Leu
625 630 635 640
Val Gln Asp Val Asp Gly Ile Ile Ser Arg Val Ser Gly Met Phe Thr
645 650 655
Arg Arg Ala Phe Asn Leu Val Ser Leu Val Ser Ala Lys Thr Glu Thr
660 665 670
Leu Gly Ile Asn Arg Ile Thr Val Val Val Asp Ala Asp Glu Leu Asn
675 680 685
Ile Glu Gln Ile Thr Lys Gln Leu Asn Lys Leu Ile Pro Val Leu Lys
690 695 700
Val Val Arg Leu Asp Glu Glu Thr Thr Ile Ala Arg Ala Ile Met Leu
705 710 715 720
Val Lys Val Ser Ala Asp Ser Thr Asn Arg Pro Gln Ile Val Asp Ala
725 730 735
Ala Asn Ile Phe Arg Ala Arg Val Val Asp Val Ala Pro Asp Ser Val
740 745 750
Val Ile Glu Ser Thr Gly Thr Pro Gly Lys Leu Arg Ala Leu Leu Asp
755 760 765
Val Met Glu Pro Phe Gly Ile Arg Glu Leu Ile Gln Ser Gly Gln Ile
770 775 780
Ala Leu Asn Arg Gly Pro Lys Thr Met Ala Pro Ala Lys Ile
785 790 795
<210> 2
<211> 2413
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
gtgaatgtgg cagcttctca acagcccact cccgccacgg ttgcaagccg tggtcgatcc 60
gccgcccctg agcggatgac aggtgcacag gcaattgttc gatcgctcga ggagcttaac 120
gccgacatcg tgttcggtat tcctggtggt gcggtgctac cggtgtatga cccgctctat 180
tcctccacaa aggtgcgcca cgtcttggtg cgccacgagc agggcgcagg ccacgcagca 240
accggctaca cgcaggttac tggacgcgtt ggcgtctgca ttgcaacctc tggcccagga 300
gcaaccaact tggttacccc aatcgctgat gcaaacttgg actccgttcc catggttgcc 360
atcaccggcc aggtcggaag tagcctgctg ggtaccgacg ctttccagga agccgatatc 420
cgcggcatca ccatgccagt gaccaagcac aacttcatgg tcaccaaccc taacgacatt 480
ccacaggcat tggctgaggc attccacctc gcgattactg gtcgccctgg ccctgttctg 540
gtggatattc ctaaggatgt ccagaacgct gaattggatt tcgtctggcc accaaagatc 600
gacctgccag gctaccgccc agtttcaaca ccacatgctc gccagatcga gcaggcagtc 660
aagctgatcg gtgagtctag gaagcccgtc ctttacgttg gtggtggcgt aatcaaggct 720
gacgcacacg aagagcttcg tgcgttcgct gagcacaccg gcatcccagt tgtcaccacc 780
ttgatggctt tgggtacttt cccagagtct cacgagctgc acatgggtat gccaggcatg 840
catggcactg tgtccgctgt tggtgcactg cagcgcagcg acctgctgat tgctatcggc 900
tcccgctttg atgaccgcgt caccggtgac gttgacacct tcgcgcctga cgccaagatc 960
attcacgccg acattgatcc tgccgaaatc ggcaagatca agcaggttga ggttccaatc 1020
gtgggcgatg cccgcgaagt tcttgctcgt ctgctggaaa ccaccaaggc aagcaaggca 1080
gagtctgagg acatctccga gtgggttgac tacctcaagg gcctcaaggc acgtttcccg 1140
cgtggctacg acgagcagcc aggcgatctg ctggcaccac agtttgtcat tgaaaccctg 1200
tccaaggaag ttggccccga cgcaatttac tgcgccggcg ttggccagca ccaaatgtgg 1260
gcagctcagt tcgttgactt tgaaaagcca cgcacctggc tcaactccgg tggactgggc 1320
accatgggct acgcagttcc tgcggccctt ggagcaaagg ctggcgcacc tgacaaggaa 1380
gtctgggcta tcgacggcga cggctgtttc cagatgacca accaggaact caccaccgcc 1440
gcagttgaag gtttccccat taagatcgca ctaatcaaca acggaaacct gggcatggtt 1500
cgccaatggc agaccctatt ctatgaagga cggtactcaa atactaaact tcgtaaccag 1560
ggcgagtaca tgcccgactt tgttaccctt tctgagggac ttggctgtgt tgccatccgc 1620
gtcaccaaag cggaggaagt actgccagcc atccaaaagg ctcgagagat caacgaccgc 1680
ccagtagtca tcgacttcat cgtcggtgaa gacgcacagg tatggccaat ggtgtctgct 1740
ggatcatcca actccgatat ccagtacgca ctcggattgc gcccattctt tgatggtgat 1800
gaatctgcag cagaagatcc tgccgacatt cacgaagccg tcagcgacat tgatgccgcc 1860
gttgaatcga ccgaggcata aggagagacc caagatggct aattctgacg tcacccgcca 1920
catcctgtcc gtactcgttc aggacgtaga cggaatcatt tcccgcgtat caggtatgtt 1980
cacccgacgc gcattcaacc tcgtgtccct cgtgtctgca aagaccgaaa cactcggcat 2040
caaccgcatc acggttgttg tcgacgccga cgagctcaac attgagcaga tcaccaagca 2100
gctcaacaag ctgatccccg tgctcaaagt cgtgcgactt gatgaagaga ccactatcgc 2160
ccgcgcaatc atgctggtta aggtctctgc ggacagcacc aaccgtccgc agatcgtcga 2220
cgccgcgaac atcttccgcg cccgagtcgt cgacgtggct ccagactctg tggttattga 2280
atccacaggc accccaggca agctccgcgc actgcttgac gtgatggaac cattcggaat 2340
ccgcgaactg atccaatccg gacagattgc actcaaccgc ggtccgaaga ccatggctcc 2400
ggccaagatc taa 2413
<210> 3
<211> 798
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicumATCC13032)
<400> 3
Met Asn Val Ala Ala Ser Gln Gln Pro Thr Pro Ala Thr Val Ala Ser
1 5 10 15
Arg Gly Arg Ser Ala Ala Pro Glu Arg Met Thr Gly Ala Lys Ala Ile
20 25 30
Val Arg Ser Leu Glu Glu Leu Asn Ala Asp Ile Val Phe Gly Ile Pro
35 40 45
Gly Gly Ala Val Leu Pro Val Tyr Asp Pro Leu Tyr Ser Ser Thr Lys
50 55 60
Val Arg His Val Leu Val Arg His Glu Gln Gly Ala Gly His Ala Ala
65 70 75 80
Thr Gly Tyr Ala Gln Val Thr Gly Arg Val Gly Val Cys Ile Ala Thr
85 90 95
Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Thr Pro Ile Ala Asp Ala Asn
100 105 110
Leu Asp Ser Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Gly Ser Gly
115 120 125
Leu Leu Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Ala Asp Ile Arg Gly Ile Thr
130 135 140
Met Pro Val Thr Lys His Asn Phe Met Val Thr Asn Pro Asn Asp Ile
145 150 155 160
Pro Gln Ala Leu Ala Glu Ala Phe His Leu Ala Ile Thr Gly Arg Pro
165 170 175
Gly Pro Val Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Val Gln Asn Ala Glu Leu
180 185 190
Asp Phe Val Trp Pro Pro Lys Ile Asp Leu Pro Gly Tyr Arg Pro Val
195 200 205
Ser Thr Pro His Ala Arg Gln Ile Glu Gln Ala Val Lys Leu Ile Gly
210 215 220
Glu Ala Lys Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly Val Ile Lys Ala
225 230 235 240
Asp Ala His Glu Glu Leu Arg Ala Phe Ala Glu Tyr Thr Gly Ile Pro
245 250 255
Val Val Thr Thr Leu Met Ala Leu Gly Thr Phe Pro Glu Ser His Glu
260 265 270
Leu His Met Gly Met Pro Gly Met His Gly Thr Val Ser Ala Val Gly
275 280 285
Ala Leu Gln Arg Ser Asp Leu Leu Ile Ala Ile Gly Ser Arg Phe Asp
290 295 300
Asp Arg Val Thr Gly Asp Val Asp Thr Phe Ala Pro Asp Ala Lys Ile
305 310 315 320
Ile His Ala Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Ile Lys Gln Val
325 330 335
Glu Val Pro Ile Val Gly Asp Ala Arg Glu Val Leu Ala Arg Leu Leu
340 345 350
Glu Thr Thr Lys Ala Ser Lys Ala Glu Thr Glu Asp Ile Ser Glu Trp
355 360 365
Val Asp Tyr Leu Lys Gly Leu Lys Ala Arg Phe Pro Arg Gly Tyr Asp
370 375 380
Glu Gln Pro Gly Asp Leu Leu Ala Pro Gln Phe Val Ile Glu Thr Leu
385 390 395 400
Ser Lys Glu Val Gly Pro Asp Ala Ile Tyr Cys Ala Gly Val Gly Gln
405 410 415
His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Val Asp Phe Glu Lys Pro Arg Thr
420 425 430
Trp Leu Asn Ser Gly Gly Leu Gly Thr Met Gly Tyr Ala Val Pro Ala
435 440 445
Ala Leu Gly Ala Lys Ala Gly Ala Pro Asp Lys Glu Val Trp Ala Ile
450 455 460
Asp Gly Asp Gly Cys Phe Gln Met Thr Asn Gln Glu Leu Thr Thr Ala
465 470 475 480
Ala Val Glu Gly Phe Pro Ile Lys Ile Ala Leu Ile Asn Asn Gly Asn
485 490 495
Leu Gly Met Val Arg Gln Trp Gln Thr Leu Phe Tyr Glu Gly Arg Tyr
500 505 510
Ser Asn Thr Lys Leu Arg Asn Gln Gly Glu Tyr Met Pro Asp Phe Val
515 520 525
Thr Leu Ser Glu Gly Leu Gly Cys Val Ala Ile Arg Val Thr Lys Ala
530 535 540
Glu Glu Val Leu Pro Ala Ile Gln Lys Ala Arg Glu Ile Asn Asp Arg
545 550 555 560
Pro Val Val Ile Asp Phe Ile Val Gly Glu Asp Ala Gln Val Trp Pro
565 570 575
Met Val Ser Ala Gly Ser Ser Asn Ser Asp Ile Gln Tyr Ala Leu Gly
580 585 590
Leu Arg Pro Phe Phe Asp Gly Asp Glu Ser Ala Ala Glu Asp Pro Ala
595 600 605
Asp Ile His Glu Ala Val Ser Asp Ile Asp Ala Ala Val Glu Ser Thr
610 615 620
Glu Ala Met Ala Asn Ser Asp Val Thr Arg His Ile Leu Ser Val Leu
625 630 635 640
Val Gln Asp Val Asp Gly Ile Ile Ser Arg Val Ser Gly Met Phe Thr
645 650 655
Arg Arg Ala Phe Asn Leu Val Ser Leu Val Ser Ala Lys Thr Glu Thr
660 665 670
His Gly Ile Asn Arg Ile Thr Val Val Val Asp Ala Asp Glu Leu Asn
675 680 685
Ile Glu Gln Ile Thr Lys Gln Leu Asn Lys Leu Ile Pro Val Leu Lys
690 695 700
Val Val Arg Leu Asp Glu Glu Thr Thr Ile Ala Arg Ala Ile Met Leu
705 710 715 720
Val Lys Val Ser Ala Asp Ser Thr Asn Arg Pro Gln Ile Val Asp Ala
725 730 735
Ala Asn Ile Phe Arg Ala Arg Val Val Asp Val Ala Pro Asp Ser Val
740 745 750
Val Ile Glu Ser Thr Gly Thr Pro Gly Lys Leu Arg Ala Leu Leu Asp
755 760 765
Val Met Glu Pro Phe Gly Ile Arg Glu Leu Ile Gln Ser Gly Gln Ile
770 775 780
Ala Leu Asn Arg Gly Pro Lys Thr Met Ala Pro Ala Lys Ile
785 790 795
<210> 4
<211> 2413
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicumATCC13032)
<400> 4
gtgaatgtgg cagcttctca acagcccact cccgccacgg ttgcaagccg tggtcgatcc 60
gccgcccctg agcggatgac aggtgcaaag gcaattgttc gatcgctcga ggagcttaac 120
gccgacatcg tgttcggtat tcctggtggt gcggtgctac cggtgtatga cccgctctat 180
tcctccacaa aggtgcgcca cgtcttggtg cgccacgagc agggcgcagg ccacgcagca 240
accggctacg cgcaggttac tggacgcgtt ggcgtctgca ttgcaacctc tggcccagga 300
gcaaccaact tggttacccc aatcgctgat gcaaacttgg actccgttcc catggttgcc 360
atcaccggcc aggtcggaag tggcctgctg ggtaccgacg ctttccagga agccgatatc 420
cgcggcatca ccatgccagt gaccaagcac aacttcatgg tcaccaaccc taacgacatt 480
ccacaggcat tggctgaggc attccacctc gcgattactg gtcgccctgg ccctgttctg 540
gtggatattc ctaaggatgt ccagaacgct gaattggatt tcgtctggcc accaaagatc 600
gacctgccag gctaccgccc agtttcaaca ccacatgctc gccagatcga gcaggcagtc 660
aagctgatcg gtgaggccaa gaagcccgtc ctttacgttg gtggtggcgt aatcaaggct 720
gacgcacacg aagagcttcg tgcgttcgct gagtacaccg gcatcccagt tgtcaccacc 780
ttgatggctt tgggtacttt cccagagtct cacgagctgc acatgggtat gccaggcatg 840
catggcactg tgtccgctgt tggtgcactg cagcgcagcg acctgctgat tgctatcggc 900
tcccgctttg atgaccgcgt caccggtgac gttgacacct tcgcgcctga cgccaagatc 960
attcacgccg acattgatcc tgccgaaatc ggcaagatca agcaggttga ggttccaatc 1020
gtgggcgatg cccgcgaagt tcttgctcgt ctgctggaaa ccaccaaggc aagcaaggca 1080
gagaccgagg acatctccga gtgggttgac tacctcaagg gcctcaaggc acgtttcccg 1140
cgtggctacg acgagcagcc aggcgatctg ctggcaccac agtttgtcat tgaaaccctg 1200
tccaaggaag ttggccccga cgcaatttac tgcgccggcg ttggccagca ccaaatgtgg 1260
gcagctcagt tcgttgactt tgaaaagcca cgcacctggc tcaactccgg tggactgggc 1320
accatgggct acgcagttcc tgcggccctt ggagcaaagg ctggcgcacc tgacaaggaa 1380
gtctgggcta tcgacggcga cggctgtttc cagatgacca accaggaact caccaccgcc 1440
gcagttgaag gtttccccat taagatcgca ctaatcaaca acggaaacct gggcatggtt 1500
cgccaatggc agaccctatt ctatgaagga cggtactcaa atactaaact tcgtaaccag 1560
ggcgagtaca tgcccgactt tgttaccctt tctgagggac ttggctgtgt tgccatccgc 1620
gtcaccaaag cggaggaagt actgccagcc atccaaaagg ctcgagagat caacgaccgc 1680
ccagtagtca tcgacttcat cgtcggtgaa gacgcacagg tatggccaat ggtgtctgct 1740
ggatcatcca actccgatat ccagtacgca ctcggattgc gcccattctt tgatggtgat 1800
gaatctgcag cagaagatcc tgccgacatt cacgaagccg tcagcgacat tgatgccgcc 1860
gttgaatcga ccgaggcata aggagagacc caagatggct aattctgacg tcacccgcca 1920
catcctgtcc gtactcgttc aggacgtaga cggaatcatt tcccgcgtat caggtatgtt 1980
cacccgacgc gcattcaacc tcgtgtccct cgtgtctgca aagaccgaaa cacacggcat 2040
caaccgcatc acggttgttg tcgacgccga cgagctcaac attgagcaga tcaccaagca 2100
gctcaacaag ctgatccccg tgctcaaagt cgtgcgactt gatgaagaga ccactatcgc 2160
ccgcgcaatc atgctggtta aggtctctgc ggacagcacc aaccgtccgc agatcgtcga 2220
cgccgcgaac atcttccgcg cccgagtcgt cgacgtggct ccagactctg tggttattga 2280
atccacaggc accccaggca agctccgcgc actgcttgac gtgatggaac cattcggaat 2340
ccgcgaactg atccaatccg gacagattgc actcaaccgc ggtccgaaga ccatggctcc 2400
ggccaagatc taa 2413

Claims (4)

1.一种乙酰羟酸合成酶，其特征在于，所述乙酰羟酸合成酶具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
2.权利要求1所述乙酰羟酸合成酶的编码基因。
3.权利要求2所述的编码基因，其特征在于，如序列表SEQ ID No.5所示。
4.权利要求1所述乙酰羟酸合成酶在生产L-异亮氨酸中的应用。
CN201910484362.5A 2019-06-05 2019-06-05 一种乙酰羟酸合成酶及其应用 Active CN110229797B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910484362.5A CN110229797B (zh) 2019-06-05 2019-06-05 一种乙酰羟酸合成酶及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910484362.5A CN110229797B (zh) 2019-06-05 2019-06-05 一种乙酰羟酸合成酶及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110229797A true CN110229797A (zh) 2019-09-13
CN110229797B CN110229797B (zh) 2020-08-28

Family

ID=67858448

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910484362.5A Active CN110229797B (zh) 2019-06-05 2019-06-05 一种乙酰羟酸合成酶及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110229797B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110551670A (zh) * 2019-09-19 2019-12-10 天津科技大学 一种生产l-亮氨酸的基因工程菌及其应用
CN115052976A (zh) * 2019-11-22 2022-09-13 Cj第一制糖株式会社 新型乙酰羟酸合酶变体和包括其的微生物
WO2023054882A1 (ko) * 2021-09-29 2023-04-06 씨제이제일제당 (주) 신규한 아세토하이드록시산 신테아제 변이체 및 이를 이용한 l-이소류신 생산방법
WO2023054881A1 (ko) * 2021-09-29 2023-04-06 씨제이제일제당 (주) 신규한 아세토하이드록시산 신테아제 변이체 및 이를 이용한 l-이소류신 생산방법
CN116333956A (zh) * 2023-03-09 2023-06-27 江南大学 一种谷氨酸棒状杆菌及采用谷氨酸棒状杆菌发酵生产l-缬氨酸的方法
US11866737B2 (en) 2019-08-29 2024-01-09 Tianjin University Of Science And Technology 2-isopropylmalate synthetase and engineering bacteria and application thereof

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1813065A (zh) * 2003-06-26 2006-08-02 德古萨股份公司 反馈抗性乙酰羟酸合成酶突变体
CN104017816A (zh) * 2007-04-04 2014-09-03 巴斯福植物科学有限公司 Ahas 突变体
CN105378059A (zh) * 2013-06-11 2016-03-02 Cj第一制糖株式会社 产l-异亮氨酸微生物和使用该微生物生产l-异亮氨酸的方法
CN105886431A (zh) * 2016-04-27 2016-08-24 天津科技大学 一株谷氨酸棒状杆菌及其高产异亮氨酸的方法
CN106190921A (zh) * 2016-08-08 2016-12-07 天津科技大学 一种谷氨酸棒状杆菌与应用
US20170226488A1 (en) * 2014-08-05 2017-08-10 Cj Cheiljedang Corporation Feedback-resistant acetohydroxy acid synthase variant and method for producing l-valine using the same

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1813065A (zh) * 2003-06-26 2006-08-02 德古萨股份公司 反馈抗性乙酰羟酸合成酶突变体
CN104017816A (zh) * 2007-04-04 2014-09-03 巴斯福植物科学有限公司 Ahas 突变体
CN105378059A (zh) * 2013-06-11 2016-03-02 Cj第一制糖株式会社 产l-异亮氨酸微生物和使用该微生物生产l-异亮氨酸的方法
US20170226488A1 (en) * 2014-08-05 2017-08-10 Cj Cheiljedang Corporation Feedback-resistant acetohydroxy acid synthase variant and method for producing l-valine using the same
CN105886431A (zh) * 2016-04-27 2016-08-24 天津科技大学 一株谷氨酸棒状杆菌及其高产异亮氨酸的方法
CN106190921A (zh) * 2016-08-08 2016-12-07 天津科技大学 一种谷氨酸棒状杆菌与应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JUNG-DO CHOI ET AL.,: ""Site-directed mutagenesis of catalytic and regulatory subunits of Mycobacterium tuberculosis acetohydroxyacid synthase"", 《ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY》 *
LIANGHONG YIN ET AL.,: ""Co-expression of feedback-resistant threonine dehydratase and acetohydroxy acidsynthase increase L-isoleucine production in Corynebacterium glutamicum"", 《METABOLIC ENGINEERING》 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11866737B2 (en) 2019-08-29 2024-01-09 Tianjin University Of Science And Technology 2-isopropylmalate synthetase and engineering bacteria and application thereof
CN110551670A (zh) * 2019-09-19 2019-12-10 天津科技大学 一种生产l-亮氨酸的基因工程菌及其应用
CN110551670B (zh) * 2019-09-19 2020-09-25 天津科技大学 一种生产l-亮氨酸的基因工程菌及其应用
CN115052976A (zh) * 2019-11-22 2022-09-13 Cj第一制糖株式会社 新型乙酰羟酸合酶变体和包括其的微生物
CN115052976B (zh) * 2019-11-22 2023-12-19 Cj第一制糖株式会社 新型乙酰羟酸合酶变体和包括其的微生物
WO2023054882A1 (ko) * 2021-09-29 2023-04-06 씨제이제일제당 (주) 신규한 아세토하이드록시산 신테아제 변이체 및 이를 이용한 l-이소류신 생산방법
WO2023054881A1 (ko) * 2021-09-29 2023-04-06 씨제이제일제당 (주) 신규한 아세토하이드록시산 신테아제 변이체 및 이를 이용한 l-이소류신 생산방법
EP4403629A4 (en) * 2021-09-29 2025-01-15 CJ CheilJedang Corporation NOVEL MUTANT ACETOHYDROXYACID SYNTHASE AND METHOD FOR PRODUCING L-ISOLEUCINE USING SAME
EP4403628A4 (en) * 2021-09-29 2025-02-19 CJ CheilJedang Corporation Novel acetohydroxy acid synthase variant, and method for producing l-isoleucine using same
CN116333956A (zh) * 2023-03-09 2023-06-27 江南大学 一种谷氨酸棒状杆菌及采用谷氨酸棒状杆菌发酵生产l-缬氨酸的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN110229797B (zh) 2020-08-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110229797B (zh) 一种乙酰羟酸合成酶及其应用
CN110305829B (zh) 一种生产l-异亮氨酸的基因工程菌及其应用
CN110540976B (zh) 一种异丙基苹果酸合成酶及其应用
KR102055874B1 (ko) 신규한 이소프로필말레이트 신타제 변이체 및 이를 이용한 l-류신의 생산 방법
CN110551670B (zh) 一种生产l-亮氨酸的基因工程菌及其应用
CN107075496B (zh) 抗反馈乙酰羟酸合酶变体和使用其生产l-缬氨酸的方法
CN113234652B (zh) 高效合成麦角硫因的工程菌的构建方法与应用
CN111254129B (zh) 一种多聚磷酸激酶突变体及其应用
CN115427580A (zh) 用于改善依克多因产生的经修饰的微生物和方法
CN111808829B (zh) 一种γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体及其应用
CN108546698A (zh) 一种天冬氨酸酶突变体
CN106566823A (zh) 一种新型谷氨酸脱羧酶基因的克隆及其应用
CN108250278A (zh) 生产l-谷氨酸的菌株和生产l-谷氨酸的方法
CN104745562A (zh) 一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的制备及其应用
CN106754845A (zh) 一种panD突变基因、编码蛋白、载体、工程菌及其应用
CN105505969A (zh) 一种提高l-苏氨酸转化率的方法及其应用
CN108642100B (zh) 一种在钝齿棒杆菌中合成l-鸟氨酸的方法
CN104789539A (zh) 一种海藻糖合酶的突变体及其制备方法和应用
CN110872593B (zh) 一种丝氨酸羟甲基转移酶突变体及其应用
CN104099308B (zh) 一种具有天冬氨酸激酶活性的多肽及其应用
CN114134127B (zh) 用于合成依克多因的二氨基丁酸乙酰转移酶突变体
CN113462678B (zh) 一种谷氨酸脱羧酶突变体
CN113788881B (zh) 半胱氨酸转运蛋白突变体及其在生产l-半胱氨酸中的应用
EP2297329B1 (en) Method of l-lysine production
WO2021037190A1 (zh) 一种2-异丙基苹果酸合成酶及其工程菌与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant