CN110229323A - 还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的聚合物囊泡及其在制备治疗肝癌药物中的应用 - Google Patents
还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的聚合物囊泡及其在制备治疗肝癌药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的聚合物囊泡及其在制备治疗肝癌药物中的应用。囊泡高效装载蛋白药物用于小鼠原位肝癌的靶向治疗。合成的三嵌段聚合物和偶联肿瘤靶向多肽的聚合物混合后能自组装并装载蛋白药物，形成载蛋白药物的膜交联囊泡。这种双硫交联具有还原敏感解交联的特性，既能保持循环稳定又能在细胞内还原环境中解交联快速释放药物。
Description
技术领域
本发明属于药物技术，具体涉及还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的聚合物囊泡在制备治疗肝癌药物中的应用。
背景技术
肝癌目前尚缺乏有效的治疗方法，化疗、分子靶向治疗和免疫检查点疗法还不能使最广大的患者受益。多种纳米药物在不同阶段的临床试验中，多年的研究已有大量研究论文发表，然而，纳米药物临床转化的成功率却不到10%，这主要是因为纳米药物无法在肿瘤部位高浓度富集使得治疗剂量不足；纳米药物在起效前遇到的多种生理屏障等都会影响纳米药物的疗效；纳米载体自身的理化性质，包括大小、分布、形状、表面电荷等都影响其在体内的表现，进一步影响其EPR效应和疗效。所以，如何制备理化性质可控的纳米载体、稳定装载药物并能靶向性地提高在肿瘤组织和肿瘤细胞中的药物浓度是该领域发展的关键。
发明内容
本发明公开了还原敏感可逆交联的聚合物及其制备方法、还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的聚合物囊泡及其制备方法与在制备治疗肝癌药物中的应用。
本发明采用如下技术方案：
还原敏感可逆交联的聚合物，其分子结构式如下一种：
其中，PEG链段的分子量为2000-10000Da；疏水链段的总分子量为PEG链段分子量的2.5～10倍；疏水链段中PDTC链段的分子量占疏水链段总分子量的10%～35%；n为1～20。优选的，PEG链段的分子量为3400-8000Da；疏水链段的总分子量为PEG链段分子量的2.8～6倍；疏水链段中PDTC链段的分子量占疏水链段总分子量的11%～25%；n为5～15，优选5、10或者15。
本发明公开了上述还原敏感可逆交联的聚合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将PEG-P(A-DTC)与氯甲酸对硝基苯酯反应，制备PEG-P(A-DTC)-NPC；所述A为TMC、LA或者CL；
（2）将PEG-P(A-DTC)-NPC与KDn反应，制备还原敏感可逆交联的聚合物，称为PEG-P(A-DTC)-KDn。
本发明公开了还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的聚合物囊泡及其制备方法，其制备方法包括以下步骤：
（1）将PEG-P(A-DTC)与氯甲酸对硝基苯酯反应，制备PEG-P(A-DTC)-NPC；所述A为TMC、LA或者CL；
（2）将PEG-P(A-DTC)-NPC与KDn反应，制备还原敏感可逆交联的聚合物PEG-P(A-DTC)-KDn；
（3）将Mal-PEG-P(A-DTC)或NHS-PEG-P(A-DTC)与靶向分子反应，制备靶向分子-PEG-P(A-DTC)；
（4）将PEG-P(A-DTC)-KDn自组装得到还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的聚合物囊泡；或者将PEG-P(A-DTC)-KDn与靶向分子- PEG-P(A-DTC) 自组装得到还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的聚合物囊泡；。
本发明公开了还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的囊泡纳米药物及其制备方法，其制备方法包括以下步骤：
（1）将PEG-P(A-DTC)与氯甲酸对硝基苯酯反应，制备PEG-P(A-DTC)-NPC；所述A为TMC、LA或者CL；
（2）将PEG-P(A-DTC)-NPC与KDn反应，制备还原敏感可逆交联的聚合物PEG-P(A-DTC)-KDn；
（3）将Mal-PEG-P(A-DTC)或NHS-PEG-P(A-DTC)与靶向分子反应，制备靶向分子-PEG-P(A-DTC)；
（4）将PEG-P(A-DTC)-KDn与药物自组装得到还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的纳米药物；或者将PEG-P(A-DTC)-KDn、靶向分子- PEG-P(A-DTC) 与药物自组装得到还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的纳米药物。
本发明公开了上述还原敏感可逆交联的聚合物或者还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的聚合物囊泡或者还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的囊泡纳米药物在制备治疗肝癌药物中的应用。
本发明中，靶向分子为多肽，比如A6或者GE11或者ApoE。
本发明中，氯甲酸对硝基苯酯、PEG-P(A-DTC)的摩尔比为2～10∶1；PEG-P(A-DTC)-NPC、KDn的摩尔比为1∶1.1～4。Mal-PEG-P(A-DTC)、靶向分子的摩尔比为1∶1.2～5；NHS-PEG-P(A-DTC)、靶向分子的摩尔比为1∶1.2～5。A为TMC、LA或者CL。
本发明中，KDn的化学结构式如下：
n为1～20，优选5～15。优选的，n为5、10、15。
以TMC单体为例，本发明制备还原敏感可逆交联的聚合物的反应示意图如下（LA单体除了单体不同之外，其余与此一样）：
本发明制备A6-PEG-P(TMC-DTC)的反应示意图如下（GE11-PEG-P(TMC-DTC)、ApoE-PEG-P(TMC-DTC)的反应除了靶向分子外，其余一样）：
DTC、TMC、LA、CL对应单体的化学结构式分别如下，开环聚合形成重复单元：
、、、
本发明中，Mal-PEG-P(A-DTC)或者NHS-PEG-P(A-DTC)，PEG链段的分子量为3000-10000Da；疏水链段的总分子量为PEG链段分子量的2.5～10倍；疏水链段中PDTC链段的分子量占疏水链段总分子量的10%～35%。优选的，PEG链段的分子量为3400-8000Da；疏水链段的总分子量为PEG链段分子量的2.8～6倍；疏水链段中PDTC链段的分子量占疏水链段总分子量的11%～25%。
本发明中，DTC与TMC无规共聚形成疏水链段PDTC链段、PTMC链段，DTC与LA无规共聚形成疏水链段PDTC链段、PLA链段，DTC与CL无规共聚形成疏水链段PDTC链段、PCL链段，x、y分别表示疏水链段中DTC的重复单元数以及TMC或者LA的重复单元数，中括号表示疏水部分为整体，其一端接有亲水PEG；亲水段1为PEG，其分子量为3000-10000Da；亲水段2为聚天冬氨酸。
本发明中，自组装具体可以为取聚合物DMSO溶液打入到持续缓慢搅拌的Hepes缓冲溶液中，磁力搅拌后静置，然后透析，得到还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的聚合物囊泡；取聚合物DMSO溶液打入到持续缓慢搅拌（150 rpm）的带有药物的Hepes缓冲溶液中，磁力搅拌后静置，然后透析，得到还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的纳米药物。其中，聚合物为PEG-P(A-DTC)-KDn或者聚合物为PEG-P(A-DTC)-KDn与靶向分子- PEG-P(A-DTC)，A为TMC或者LA、CL；药物为蛋白质药物，比如皂草毒素蛋白（Sap）、细胞色素C（CC）、Cy5-CC，或者多肽，比如LfcinB6、B25或LTX 315；Hepes缓冲溶液为pH 6.8、5 mM的Hepes缓冲溶液。缓慢搅拌的转速为150 rpm，磁力搅拌的转速为150 rpm，磁力搅拌的时间为3分钟；静置为室温下静置0.5~6小时后，透析为用PB透析3~12小时（MWCO 1000 kDa）。该过程中聚合物自交联形成囊泡或者聚合物自交联形成囊泡并包载药物得到囊泡纳米药物。优选的，聚合物为PEG-P(A-DTC)-KDn与靶向分子- PEG-P(A-DTC)时，靶向分子摩尔含量为0~40%，A为TMC或者LA、CL。
本发明中，肝癌优选为原发性肝细胞癌（HCC）；目前HCC治疗缺乏有效的方法，分子靶向药只能平均提高患者生存期两个月，基本无满意疗效；不同HCC患者肝癌细胞表面PD-L1表达量不同，只有25%的HCC患者能从PD-1治疗中受益。本发明纳米载体能改变药物的生物分布，延长药物的体内循环时间，可通过EPR效应被动靶向到肿瘤，能提高药物在肿瘤组织的富集量，并且在纳米载体表面偶联肿瘤靶向分子还能使其主动靶向到肿瘤细胞，增加其对纳米药物的摄入量，从而实现癌症的高效治疗，因此，制备HCC主动靶向的纳米药物有助于实现更有效的HCC治疗。
作为一种单链RIPs，皂草毒素蛋白（saporin）没有能插入细胞膜的β链，所以仅在进入细胞时才显示强毒性；然而，皂草毒素蛋白的免疫原性是一个主要问题，限制其应用。聚合物囊泡纳米药物和其他纳米粒子一样，在进入肿瘤细胞发挥抗肿瘤作用前都需要跨越多种生理屏障和限制，然而，经过多重阻碍，真正进入肿瘤细胞内的药物很少，治疗效果不佳。同时，过于稳定的交联不利于药物的释放，研究者们通过设计交联稳定的聚合物囊泡来提高其在血液循环中的稳定性，保证药物不被提前释放出来，但稳定的聚合物囊泡有可能会阻止药物在肿瘤细胞中的释放，导致药物浓度过低疗效差或导致耐药性，聚（三亚甲基碳酸酯）-聚（L-谷氨酸）嵌段聚合物制备的装载 Dox·HCl 的囊泡具有极强的稳定性，24 h内药物仅仅释放了5%，导致治疗效果下降。因此囊泡纳米药物在肿瘤细胞中能否快速释放对治疗效果有很大的影响；值得注意的是，PNIPAM和PNIPAM-Dox对机体有潜在的累积毒性。本发明的生物可降解聚合物PEG-P(A-DTC)-KDn和靶向分子-PEG-P(A-DTC)混合在水中能自组装形成粒径小（28-59 nm）、粒径分布窄的具有不对称膜结构聚合物囊泡（A为TMC、CL或者LA），能高效装载多种多肽和蛋白质；载药囊泡的血液循环显著长于自由蛋白质尤其是，在治疗期间，小鼠体重、腹围、AFP和GP73浓度基本不变，小鼠生存中值显著延长（99天）。
附图说明
图1为 PEG-P(TMC-DTC)-NPC的1H NMR谱图（400 MHz, CDCl3）；
图2为 PEG-P(TMC-DTC)-KDn（n = 5, 10, 15）的1H NMR谱图（600 MHz, DMSO-d6）。（A）n = 5；（B）n = 10 ；（C）n = 15；
图3为Mal-PEG-P(TMC-DTC)（A）和A6-PEG-P(TMC-DTC)（B）的1H NMR谱图（600 MHz,DMSO-d 6 ）；
图4为囊泡A6-LCPs/KD15的二维1H NMR核磁谱图（2D Nosey，DMSO-d 6 ）；
图5为载蛋白质囊泡的表征。（A）不同A6含量的Sap-A6-LCPs粒径和粒径分布，插图是Sap-30A6-LCPs的TEM图。（B）Sap-30A6-LCPs经100倍稀释、在含10% FBS的PB以及4ºC储存30天的粒径变化。（C）载Cy5-CC的三种囊泡在模拟细胞内还原环境（PB，pH 7.4，10 mM）和 PB（pH 7.4，10 mM）、37度下的Cy5-CC的释放。（D）CC-A6-LCPs中释放CC、自由CC和未经处理的CC的圆二色谱（CD）图谱；
图6为MTT实验结果，Sap-20A6-LCPs/KD5（A）和Sap-20A6-LCPs/KD10（B）对SMMC-7721、MDA-MB-231和B16F10细胞的毒性（样品制备条件：孵育6小时、透析12小时）。空囊泡A6-LCPs（C）和自由Sap（D）对SMMC-7721细胞的毒性；
图7为Sap-A6-LCPs对SMMC-7721细胞的毒性实验（细胞与样品孵育4小时后更换新鲜培养基继续培养68小时）。（A）不同A6含量的Sap-A6-LCPs/KD5的毒性，（B）内壳有相同天冬氨酸摩尔量的Sap-20A6-LCPs/KDn的毒性；
图8为Cy5标记的囊泡在和SMMC-7721细胞孵育4小时后的内吞。（A）流式细胞术测量和（B）CLSM图片。细胞核用DAPI染色，细胞骨架用罗丹明标记的鬼笔环肽染色；
图9为囊泡的血液循环和载体体内毒性研究。（A）Cy5-CC-A6-LCPs/KD5、Cy5-CC-A6-LCPs/KD10、Cy5-CC-A6-LCPs/KD15（Cy5剂量: 7.8 µM）在BALB/c小鼠体内血液循环情况。（B）空载体A6-LCPs/KD5对小鼠的安全性评估；
图10为小鼠原位肝癌模型的建立和监控。接种SMMC-7721细胞后血浆中AFP（A）和GP73（B）浓度随时间的变化。(C) 第14、18、30、40天解剖的小鼠肝脏图片；
图11为小鼠接种原位肝癌15天后，尾静脉注射Cy5-CC-A6-LCPs和Cy5-CC-CPs（0.4 μMCy5/kg）10小时的主要器官的离体成像（A）、肝脏荧光强度的半定量分析（B），和Cy5-CC在主要器官的生物分布（C）；
图12为Sap-A6-LCPs在原位肝癌小鼠中的抗肿瘤实验。（A）小鼠体重变化（****p <0.0001），# 表示开始有老鼠死亡；（B）第42天小鼠肝脏，（C）小鼠生存期，统计学分析：PBSvs CPs：ns；Sap-A6-LCPs vs CPs/PBS：**P < 0.01；AFP浓度（D）、GP73浓度（E）及腹围（F）变化；
图13为接种42天Sap-A6-LCPs治疗后荷原位肝癌小鼠的组织学分析。（A）肿瘤的H&E和TUNEL 染色；（B）主要器官切片的H&E染色。L：正常肝组织；T：肿瘤组织。比例尺60 µm；
图14为GE11-PEG-P(TMC-DTC)的1H NMR谱图（600 MHz，DMSO-d 6 ）；
图15为不同GE11含量的Sap-GE11-LCPs对SMMC-7721细胞的毒性；
图16为Cy5-CC-10GE11-LCPs 和 Cy5-CC-CPs与SMMC-7721细胞孵育4小时后的CLSM图片。细胞核用DAPI染色，细胞骨架用罗丹明标记的鬼笔环肽染色。比例尺25 µm；
图17为小鼠接种SMMC-7721原位肝癌25天后，尾静脉注射Cy5-CC-GE11-LCPs和Cy5-CC-CPs（0.4 μM Cy5 equiv./ kg）10 h的主要器官的离体荧光成像（A）、肿瘤的离体成像（B）、Cy5-CC在主要器官的生物分布（C）和肿瘤荧光强度的半定量（D）；
图18为Sap-GE11-LCPs在荷原位肝癌小鼠体内的抗肿瘤实验。（A）治疗期间小鼠体重变化（****p < 0.0001）。# 表示开始有老鼠死亡；（B）接种第42天的小鼠肝脏照片，（C）小鼠生存期，统计学分析：PBS vs CPs：ns；Sap-10GE11-LCPs vs Sap-20GE11-LCPs：ns；Sap-GE11-LCPs（low and high）vs CPs/PBS：**P < 0.01；Sap-GE11-LCPs（low）vs Sap-GE11-LCPs（high）：*p< 0.1；和血浆中AFP（D）和GP73（E）的含量，以及腹围（F）的变化。
图19为Sap-GE11-LCPs在荷原位肝肿瘤小鼠治疗后，接种42天后主要器官切片的H&E染色。L：正常肝组织；T：肿瘤组织。比例尺60 µm；
图20为Sap-GE11-LCPs在荷原位肝肿瘤小鼠治疗后，接种42天后肿瘤的H& E和TUNEL染色。比例尺60 µm。
具体实施方式
本发明中，A6为多肽（Ac-KPSSPPEEC-NH2，98％）购自上海吉尔生化，末端带有巯基；GE11多肽（CYHWYGYTPQNVI，98％）购自上海吉尔生化，末端带有巯基；多肽ApoE（LRKLRKRLLLRKLRKRLLC，95%），购自中肽生化公司，末端带有巯基。使用Prism 6软件通过Bonferroni校正的单因素方差分析（ANOVA）评估不同组别间的差异性，生存中期采用Prism6中的Kaplan-Meier技术进行分析。* p < 0.05表示具有统计意义上的差异，** p <0.01、*** p <0.001和**** p <0.0001表示具有显著差异。本发明设计了装载皂草毒素蛋白的聚合物囊泡纳米药物(Sap-A6-LCPs)用于小鼠原位肝癌的治疗。成功建立了小鼠原位SMMC7721肝癌模型，用血浆AFP和GP73浓度、腹围作为小鼠原位肝肿瘤进展的有效指标，用于筛选、监测和评估肝癌的治疗功效和复发。制备的蛋白质囊泡纳米药物展示出了令人惊喜的优点：（1）囊泡粒径小（28-59 nm），具有生物相容性和无毒性，载体浓度600 mg/kg以下都安全。（2）制备流程快速简单（4小时内可完成），可稳定装载蛋白质、多肽类药物，且在还原条件下触发药物的快速释放。（3）载药囊泡在进入肿瘤细胞内在还原环境下快速释放Sap，具有显著的细胞毒性（IC50为10 nM）。（4）其在小鼠体内的循环时间和自由蛋白质相比显著延长（3.9 h vs 0.8 h）。（5）载药囊泡在肝肿瘤富集，具有低全身毒性，能显著抑制小鼠原位肝癌的生长、延长荷瘤小鼠生存期，其生存中值分别为99天。所以，本发明设计制备的纳米增强了小鼠原位肝肿瘤的治疗效果，减少了毒副作用，在肿瘤的靶向治疗上具有应用前景。
实施例一
在氮气手套箱内，依次称取MeO-PEG-OH (M n =5.0 kg/mol, 0.50 g, 100 μmol), TMC(1.52 g, 14.55 mmol) 和DTC (0.23 g, 1.18 mmol) 并溶解在二氯甲烷(DCM，7.0 mL)中，搅拌加入催化剂磷酸二苯酯（DPP，DPP/OH 摩尔比为10/1)。密闭反应器密封好放置40℃油浴中磁力搅拌下反应2天。三乙胺终止、冰乙醚中沉淀两次、抽滤、真空干燥后得到PEG5k-P(TMC15k -DTC2k)。用Mal-PEG-OH(Mn=7.5 kg/mol)替代MeO-PEG-OH(M n =5.0 kg/mol)做引发剂，引发DTC和TMC的开环聚合得到Mal-PEG7.5k-P(DTC2k-TMC15k) ，图3A为核磁图。
氮气环境下，将1 mL p-NPC的干燥的二氯甲烷溶液（0.031 g，0.15 mmol）滴加到持续搅拌着的、浸在冰水浴中的PEG-P(TMC-DTC)（M n= 5.0-15.0-2.0 kg/mol、 0.64 g，0.029 mmol）和吡啶（Py，12µL，0.14 mmol）的二氯甲烷（5 mL）混合溶液中。30分钟滴加完成，反应器避光、室温继续反应24 h后，抽滤除去吡啶盐，将滤液浓缩后在冰乙醚中沉淀、真空干燥48小时，得到产物PEG-P(TMC-DTC)-NPC。产率：~90%。NPC的取代度通过1HNMR（图1）端基分析计算为接近100%。在氮气环境下，往加有4 mL的KDn（45.4 μmol，n = 5, 10, 15）的无水DMSO溶液和130 μL三乙胺（0.944 mmol）的双颈圆底烧瓶中，通过恒压滴液漏斗将5 mL的PEG-P(TMC-DTC)-NPC（500 mg，22.7 μmol）的无水DMSO溶液在持续搅拌下逐滴加入，在30min滴加完成。然后在30℃油浴锅内反应48小时后，反应溶液先后用DMSO和DCM透析（MWCO3500 Da）以除去未反应的KDn，DMSO透析18小时（换5次介质），DCM 透析6小时（换2次介质）。然后，得到的溶液旋蒸浓缩至约100 mg/mL，在冰乙醚中沉淀、过滤、真空干燥，得到白色的PEG-P(TMC-DTC)-KDn。产率：~95％。KDn（n = 5, 10, 15）的接枝率通过1H NMR（图2）端基分析和TNBSA测定来计算，分别是95％、92％和88％。
在氮气环境下，将1 mL Mal-PEG-P(TMC-DTC) (100 mg，4.1 µmol， M n=7.5-15.0-2.0 kg/mol) 的无水DMSO溶液通过恒压滴液漏逐滴加入到2 mL持续搅拌的A6（7.47 mg，8.2 µmol）溶液中。40分钟滴加完毕后25ºC反应48小时, 聚合物的纯化处理过程和上面所描述的相同。产率：~95％。A6的接枝率通过1H NMR（图4B）分析和TNBSA测定聚合物和反应液中未反应的量来计算，大约是92%。
聚合物囊泡由PEG-P(TMC-DTC)-KDn和A6-PEG-P(TMC-DTC)在水溶液中自组装形成，其内壳由生理条件下带负电荷的聚天冬氨酸组成，和前面带正电荷的PEI和精胺不同，具有更好的生物相容性；表1为聚合物表征。
表1 嵌段共聚物的表征
根据上述方法，更换靶向分子、单体可以得到多种聚合物ApoE-PEG-P(TMC-DTC)、GE11-PEG-P(TMC-DTC)、ApoE-PEG-P(LA-DTC)、GE11-PEG-P(LA-DTC) 、A6-PEG-P(CL-DTC)、GE11-PEG-P(CL-DTC) 、ApoE-PEG-P(CL-DTC)、A6-PEG-P(CL-DTC)。
实施例二
将实施例一制备的A6-PEG-P(TMC-DTC)和PEG-P(TMC-DTC)-KDn按比例（A6摩尔含量为0、10％、20％、30％）溶解在DMSO中（40 mg/mL）。蛋白质、多肽从冷冻冰箱取出后在冰浴上解冻、配溶液待用。取25 μL聚合物溶液打入到持续缓慢搅拌（150 rpm）的0.975 mL的Hepes缓冲溶液（pH 6.8，5 mM），或是含蛋白质（皂草毒素蛋白（Sap）、细胞色素C（CC）、Cy5-CC（每个CC分子上Cy5的数量约为0.8个））或多肽（LfcinB6、B25或LTX 315）的Hepes溶液中。磁力搅拌（150 rpm）3分钟后，在室温下静置2小时后，然后用PB透析8小时（MWCO 1000 kDa）。该过程中聚合物囊泡自交联，分别用A6-LCPs（空载体）和Sap-A6-LCPs（载SapA6靶向囊泡）、LfcinB6-A6-LCPs（载LfcinB6A6靶向囊泡）、Sap-CPs（载Sap非靶向囊泡、A6摩尔含量为0）等标示。用动态光散射（DLS）和电泳测量囊泡的粒径、粒径分布和zeta电位。通过跟踪粒径变化来研究A6-LCPs在10％胎牛血清（FBS）溶液、在4℃下长期储存及稀释下纳米粒的稳定性。蛋白质和多肽的载药量和包封率通过BCA或UV-vis测定。
A6-PEG-P(TMC-DTC)和PEG-P(TMC-DTC)-KDn在水溶液中自组装可形成聚合物囊泡（A6-LCPs），表征结果见表2；相比之下，基于PEG-P(TMC-DTC) 的囊泡的粒径为60-70 nm，Zeta电位接近0 mv。A6-LCPs/KD15的2D Nosey核磁图谱显示了KD15的特征峰（g，δ 4.54）和PEG特征峰（b，δ 3.63）之间没有空间相关性，表面两个亲水链在空间分布上是分离的，带负电荷的KDn位于囊泡的内腔，PEG位于囊泡的外壳，验证了囊泡膜的不对称结构（图4）。
表2. 空囊泡A6-LCPs的性质表征
将聚合物的DMSO溶液加入到含多肽或蛋白质的Hepes缓冲溶液（pH 6.8，5 mM）中，可快速将带正电荷的多肽或蛋白质装载到囊泡的内腔中。囊泡的尺寸和zeta电位随KDn和A6含量的变化而变化的趋势和空囊的一样（表3）。图5A是不同A6含量的Sap-A6-LCPs粒径和粒径分布，图5A中插图Sap-30A6-LCPs（30表示A6摩尔含量为30%）的TEM图显示纳米粒是中空的球形形态。另外，Sap-30A6-LCPs在稀释到低浓度（0.01 mg/mL）模拟静脉注射情况、在含10%胎牛血清的PB溶液中、以及在4ºC储存4周后，其粒径及其粒径分布变化不大，表明载蛋白质的囊泡具有优异的胶体稳定性（图5 B）。
像抗菌肽LfcinB25和LfcinB6、溶瘤肽LTX-315，以及CC和Sap都可以高效载到CPs或A6-LCPs中（表3—表6），可能是由于聚合物囊泡内壳的聚天冬氨酸在pH 6.8电离、与蛋白质或多肽的静电相互作用和氢键相互作用的结果。低载药量使得其尺寸和空囊泡基本一样，如Sap-A6-LCPs粒径为28-46 nm并有很窄的粒径分布（图5 A）。同时，低载药量也使得Sap-A6-LCPs的表面电位的增加程度显著低于载多肽和CC的囊泡。利用Kataoka实验室报道的计算蛋白质表面电荷密度的算法（蛋白质分子量除以其在等电点所带电荷数），可计算出Sap分子的电荷密度较低，为大约 +3000 Da/每个电荷（Sap等电点是12，分子量约为30kDa；而CC分子的电荷密度较高，为大约+1391 Da/每个电荷（CC的等电点是10，分子量约为13 kDa）。
表 3.装载多肽的CPs性质的表征
表4. 不同A6含量的A6-LCPs/KD10装载多肽（理论载药量为15 wt%）的性质表征
表5装载蛋白质的20A6-LCPs/KD10的性质表征
表 6. 含不同聚天冬氨酸链长的囊泡装载Cy5-CC（理论载药量为20 wt%）的性质表征
表7. Sap-A6-LCPs（理论Sap载药量为5 wt%）的性质表征
a囊泡装载多肽和蛋白质的效率通过UV-vis和BCA测定。b用动态光散射DLS和电泳（Zetasizer Nano-ZS）在25 ºC PB（10 mM, pH 7.4）中测试。更换聚合物可以得到不同靶向分子、不同疏水链段的载药囊泡。
将0.5 mL载Cy5-CC的A6-LCPs(0.08 mg/mL)加入到透析袋（MWCO 300kDa）中，浸入含或不含10 mM GSH的25 mL PB (pH 7.4，50 mM)溶液中，并持续搅拌（200 rpm）。在预定时间点取出5 mL透析介质，再加入5 mL新鲜介质维持介质量恒定。取出的5 mL介质冷冻干燥后加入1 mL二次蒸馏水复溶，通过荧光光谱仪测量（Ex. 645 nm，Em. 650-750 nm）其中的和释放结束后保留在聚合物囊泡中的蛋白质的含量。每组平行3次。以Cy5-CC为模型蛋白来研究Cy5-CC从20A6-LCPs中的释放的行为。实验结果表明，在模拟血液循环的条件下（PB，pH7.4，37°C），24小时内Cy5-CC从三种A6-LCPs囊泡中均释放很少（大约20％），以从A6-LCPs/KD15中释放最慢。而在模拟细胞质内的还原条件下，即加入10 mM GSH，24小时内Cy5-CC从A6-LCPs/KD5、A6-LCPs/KD10、A6-LCPs/KD15分别释放了78%、67%、59%（图5C）。A6-LCPs/KD5囊泡中蛋白的释放最快，可能是因为组成聚合物囊泡的聚合物中聚天冬氨酸段越短，囊泡内壳的羧基与蛋白质的静电相互作用越弱，在囊泡膜的通透性变好之后蛋白质更容易从囊泡中释放。将1 mL 载CC的A6-LCPs（0.08 mg /mL）加入到透析袋（MWCO 300kDa）中，将其浸入含10 mM GSH的20 mL的PB（pH 7.4，50 mM）中，然后在37℃下搅拌（200 rpm）24小时后，将20 mL透析介质全部冷冻干燥，加1 mL二次蒸馏水复溶后用蒸馏水透析12小时，以除去无机盐。通过BCA试剂盒定量蛋白质含量，最后使用圆二色性光谱仪（CD，J-1500，Jasco，Japan）在200-250 nm下测量。未经任何处理的相同浓度的CC（2 μg/mL）作为对照。通过圆二色谱（CD）测量了从聚合物囊泡中释放出的蛋白质的二级结构。图5D显示了从CC-A6-LCPs释放的CC与自由的CC以及未经任何处理的CC具有相同的二级结构，这表明蛋白质在经制备、装载和GSH处理过程后仍保持其二级结构不变，蛋白质从囊泡释放出来后仍保持活性。
将SMMC-7721、MDA-MB-231和B16F10细胞接种在96孔板（3×103细胞/孔）中，在含5％CO2的37℃培养箱内培养16小时后，加入20 μL Sap-A6-LCPs/KD5或Sap-A6-LCPs/KD10（A6含量为30％，KD5、KD10表示PEG-P(TMC-DTC)-KDn中n为5或者10，Sap的浓度范围为2.5nM至220 nM）孵育4小时，然后用100 μL新鲜培养基替换孔板内的培养基，再培养68小时。然后，加入10 μL的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四唑溴化物（MTT）的PBS溶液（5.0 mg/mL）孵育4小时后，小心吸出上清液并加入150 μL DMSO以溶解活细胞产生的紫色甲瓒。10分钟后，用酶标仪（Multiskan FC）测量570 nm处的吸光度，并通过比较PBS孔的吸光度来获得细胞存活率（％）。数据表示为平均值±SD（n = 6）。A6-LCPs（空载体）和自由Sap对SMMC-7721细胞的毒性实验也采用相同方法。结果表明，Sap-20A6-LCPs对这三种细胞均有显著的、Sap浓度依赖性的毒性，其中SMMC-7721细胞对Sap-20A6-LCPs最为敏感（IC50为33 nM）（图6），值得注意的是，Sap-20A6-LCPs/KD5（图6A）比Sap-20A6-LCPs/KD10对B16F10和SMMC-7721细胞均显示出更强的毒性（图6 B），空囊泡20A6-LCPs在聚合物浓度£ 0.8 mg/mL和自由Sap浓度£ 200 nM时都没有明显的细胞毒性（图6 C, D）。然而，Sap-20A6-LCPs对MDA-MB-231细胞的毒性却很小。
将SMMC-7721细胞与20 μL Sap-A6-LCPs孵育4小时（其中A6含量分别为0、10％、20%，30%，Sap的浓度范围为0.003 nM至133 nM），然后更换培养基继续培养68小时。其余操作同上。总体说来，偶联不同量A6的囊泡Sap-A6-LCPs都比无A6的囊泡Sap-CPs对SMMC-7721细胞有更优异的抗肿瘤活性（表8）。例如，Sap-20A6-LCPs/KD5的IC50（8.4 nM）比非靶向组的（30.0 nM）有显著的降低（图7A）。Sap-A6-LCPs/KD5在A6含量20%时毒性最强，而Sap-A6-LCPs/KD10和Sap-A6-LCPs/KD15却在A6含量为30％时毒性最强，并且Sap-A6-LCPs的最佳IC50值随聚天冬氨酸链长的降低而降低（表8）。所以，若无特殊说明，本实施例后续的Sap-A6-LCPs就特指Sap-20A6-LCPs/KD5。同时表8给出了更换靶向分子的结果。以Sap-20A6-LCPs/KD5为对照，将KD更换为精胺，其余不变，得到的载药囊泡尺寸为88nm，PDI为0.13，DLE为51.6%，DLC为2.5wt%，对SMMC-7721细胞的IC50为147.9nM。
表8.载药囊泡对SMMC-7721细胞的半致死浓度（IC50 nM）
制备三种含20% A6的囊泡时，在PEG-P(TMC-DTC)-KD10和PEG-P(TMC-DTC)-KD15聚合物中混入未接枝KDn的聚合物PEG-P(TMC-DTC)，使得到的Sap-20A6-LCPs/KD5、Sap-20A6-LCPs/KD10和Sap-20A6-LCPs/KD15的内壳都含有总摩尔量相同的天冬氨酸。20 μL的这些Sap-20A6-LCPs 加入SMMC-7721细胞中孵育4小时（Sap浓度范围为0.003 nM至120 nM），然后更换培养基继续培养68小时。其余操作同上。在确定总的天冬氨酸（D）的摩尔量一定的条件下，以Sap-20A6-LCPs/KD5中D摩尔量为基准，在含KD10和KD15的聚合物中混入PEG-P(TMC-DTC)，使得最终在含KD5、KD10和KD15的囊泡中都有相同D摩尔量。这样得到三个囊泡的粒径分别为43.7、61.2 和 83.4 nm，对SMMC-7721细胞的IC50分别为11.2、29.7和42.8 nM（图7B）。Sap-20A6-LCPs/KD5的IC50最低，这和Sap与短链KD5之间的多价（multivalence）相互作用比长链的KD10及KD15的更弱、导致其蛋白质释放更快有直接关系。另外，其更小的粒径也会对其细胞内吞有帮助。
将SMMC-7721细胞接种在6孔板（2 mL，5×105细胞/孔）24小时后，向其中加入200µL含不同A6表面密度的Cy5-CC-A6-LCPs（Cy5：1 μM）的PB。 孵育4小时后，用胰酶消化、离心（1000×g，3分钟）、PBS洗涤（×2）、加500 μL PBS重新分散，立即用BD FACS Calibur流式细胞仪测定Cy5荧光（采集10000个细胞），用Cell Quest软件分析。在相同Cy5-CC剂量下，细胞内吞量呈现显著的A6含量的依赖性，Cy5-CC-A6-LCPs的细胞内吞与A6含量呈现“U”型效应关系。A6含量为20%时SMMC-7721细胞内Cy5荧光强度最高、细胞内吞量最高，是非靶向Cy5-CC-CPs的1.6倍（图8 A）。使用CLSM研究Cy5-CC-A6-LCPs在SMMC-7721细胞的内吞和细胞内蛋白质释放情况。将SMMC-7721细胞（1.8 mL，8×104细胞/孔）接种于含有小圆盖玻片的24孔板中24小时后，加入200 μl 含Cy5-CC-A6-LCP或Cy5-CC-CPs（Cy5：5.89 μM）的PB溶液孵育4小时。加入200 μL的4％多聚甲醛溶液固定15分钟，加鬼笔环肽-四甲基罗丹明B（10 µg/ml，200 μL）孵育染色80分钟，再加DAPI（10 µg /ml，200 μL）染色5分钟。每个步骤后面都接着三次PBS洗涤。最后用共聚焦显微镜（TCS SP5，Leica）拍摄细胞的荧光图片。进一步用CLSM观察发现，孵育4 小时后，Cy5-CC-20A6-LCP处理的SMMC-7721细胞质内有显著更强的Cy5荧光，来自释放的蛋白质。而相比之下，Cy5-CC-CPs仅向细胞中递送了少量的Cy5-CC（图8 B）。
A6-LCPs载体的体内毒性和载蛋白囊泡的药代动力学研究
所有的动物实验均获得了苏州大学实验动物中心和苏州大学动物保护和使用委员会的批准。为了评估空囊泡A6-LCPs的安全性，将6只健康雌性Balb/c小鼠随机称重并分成两组（n = 3），通过尾静脉注射200 µL聚合物为150 mg/kg或600 mg/kg的A6-LCPs，在十天内连续监测小鼠的体重和行为的变化。
将健康Balb/c小鼠随机称重分组（n = 3），通过尾静脉注射200 µL的Cy5-CC-A6-LCPs/KD5、Cy5-CC-A6-LCPs/KD10、Cy5-CC-A6-LCPs/KD15、Cy5-CC-CPs/KD5和自由Cy5-CC（Cy5：7.8 μM）的PB。在预定时间点，从小鼠的眼眶中取约60 μL血液到预先肝素化的EP管中，立即离心取20 µL血浆，加入1 mL含20 mM DTT的DMSO萃取24小时。最后，通过荧光光谱仪测定血浆中的Cy5-CC浓度，绘制药物浓度对时间的函数曲线，利用Origin8软件指数衰减来拟合，计算半衰期（t1/2,α和t1/2,β）和曲线下面积（AUC）y=A1×exp(-x/t1)+A2×exp(-x/t2)+y0， 其中t1/2,α=0.693×t1，t1/2,β=0.693×t2。
从绘制的曲线均可看出，Cy5-CC在血液循环中明显呈两相（图9A），在分布相Cy5-CC浓度迅速减少（I阶段），消除相Cy5-CC浓度缓慢降低（II阶段）。但是，蛋白质囊泡纳米药物的清除半衰期（t1/2,β）明显长于游离蛋白（0.8 h）。随着囊泡中D重复单元从15减少到10和5，Cy5-CC-20A6-LCPs的清除半衰期由2.7小时增加到3.1和3.9 小时，AUC值也从45依次增加到85和158 µg/mL·h（图9A和表9），这个结果要归因于聚合物囊泡粒径由30纳米增加到36和50纳米。此外，Cy5-CC-A6-LCPs/KD5具有比Cy5-CC-CPs/KD5更长的循环时间（3.9小时vs 3.0小时），这也是因为A6-LCPs囊泡修饰A6用的Mal-PEG（分子量为7500 g/mol）要大于无A6的聚合物的PEG（分子量为5000 g/mol），导致囊泡粒径增大（50 nm vs 38 nm）。
表9.载药囊泡的循环半衰期（T1/2,a和T1/2,β）和曲线下面积（AUC）
为建立小鼠皮下肝癌模型，将50 μL含30％BD Matrigel的SMMC-7721细胞（~3×106个细胞/只）的PBS注入5周龄雌性Balb/c裸鼠的右后腿上方（n = 6）。当肿瘤长到200-300 mm3时，开始用于小鼠活体成像研究。为建立小鼠原位肝癌模型，将50 μL含30％BD Matrigel的SMMC-7721细胞（~3×106个细胞/只）的PBS溶液通过29号针头注射器缓慢注入5周龄雌性Balb/c裸鼠的左叶肝的上方（n = 6）。肿瘤接种当天指定为第0天。接种前和接种后的预定时间点，眼眶取血，测量血浆中甲胎蛋白（AFP）和高尔基体蛋白73（GP-73）的含量，来跟踪肿瘤的进展；牺牲小鼠观察肝脏中肿瘤生长以及腹水发展情况。在第-2、7、10、14、18、30、40天，眼眶取血约90 µL血液到肝素处理的EP管中，立即离心取血浆，按照供应商的使用步骤用Elisa试剂盒检测其中AFP和GP73的浓度。在第14、18、30、40天分别牺牲一只小鼠以观察肝脏中肿瘤的生长和肿瘤转移情况。通过测量肿瘤生长过程中血浆里甲胎蛋白（AFP）和高尔基体蛋白（GP73）的浓度以及小鼠腹水发展情况来监测原位肝肿瘤的进展（图10），小鼠原位肝癌建模的监测结果表明，健康小鼠（12只）血浆的AFP和GP73的浓度在较窄的范围内，AFP为13.2 ± 2.4 ng/mL（9.7-15.5 ng/mL），GP73为4.5 ±1.4 ng/mL（2.7-6.5 ng/mL）。小鼠接种SMMC-7721细胞后的最开始10天内，AFP和GP73的浓度随时间几乎线性增加到25和24 ng/mL（图10 A，B）。在10-14天，AFP和GP73浓度迅速增加，且GP73比AFP增加得更快，分别到了36和57 ng/mL，这以后更是迅速增加，第40天AFP和GP73分别增加到了130和170 ng/mL。从解剖出的肝脏看到，第14、18、30和40天肿瘤逐渐清晰和增大（图10 C）。接种后25天左右小鼠腹部两侧明显鼓起，第30天明显有肝腹水现象，腹水里的AFP和GP73分别是70和130ng/mL。解剖小鼠发现，肿瘤不仅在肝叶内转移，还在其他主要器官和肠中有转移，有明显脾肿大和肺部损伤。第40天腹水量大且黄，肝脏被腹水染成淡黄色，可明显看到肝硬化、胆囊增大现象。因此，血浆AFP和GP73浓度是小鼠原位肝肿瘤进展的有效指标，可用于筛选、监测和评估肝癌的治疗功效和复发。在该模型里，当AFP和GP73浓度分别达到25和20 ng/mL及以上，表明肝癌严重，需要开始干预。
小鼠在接种SMMC-7721原位肝癌后第15天，称重、随机分成2组（n = 3）。通过尾静脉分别注射200 µL Cy5-CC-A6-LCPs和Cy5-CC-CPs（Cy5：7.8 μM），在4、6、8、12小时后用IVIS Lumina II成像系统跟踪Cy5-CC在小鼠中的分布。在另外的小鼠中，给药8小时后牺牲小鼠，收集主要器官和切除的肿瘤、洗涤、称重、用IVIS Lumina II系统离体成像。活体成像图片显示，随着时间的延长，小鼠肝部的荧光强度先增强后减弱，10小时荧光强度最高，Cy5-CC-A6-LCPs组肝脏的荧光强度明显高于非靶向组，解刨小鼠取主要器官后进行离体荧光成像发现，Cy5-CC-A6-LCPs组比Cy5-CC-CPs组肝脏中显示更强的Cy5-CC荧光（图11 A，B）。为定量分析Cy5-CC的生物分布，将剩余的3/4的肿瘤和主要器官称重后加入0.6 mL的1％Triton X-100，匀浆机磨碎。然后加入0.9 mL含20 mM DTT的DMSO溶液，在37℃、200 rpm的摇床中萃取Cy5-CC一天。最后离心收集上清液，用荧光光谱仪测量其中Cy5-CC的浓度，结果换算为每克组织的注射剂量（％ID/g）。结果表明，Cy5-CC-A6-LCPs组在肝脏组织的富集量比在正常心、脾、肺、肾都高很多，达到16.7%ID/g（每克组织的注射剂量的百分量），是Cy5-CC-CPs组的1.4倍（图11 C），这可能来自在肝叶中有大量转移的肿瘤。
如前，小鼠接种原位SMMC-7721肝癌后第12天（肿瘤接种当天指定为第0天），称重、随机分成三组（n = 6），分别尾静脉注射200 µL的不同剂量的Sap-A6-LCPs、Sap-CPs或PBS，每四天给药一次，其中Sap-A6-LCPs和Sap-CPs 组在第12、16和20天以 25 nmol Sap/kg药量给药，在第24、28、32、36和40天以18 nmol Sap/kg给药，PBS作对照组。在治疗期间，每2天称重小鼠，计算相对第0天的相对体重。监测小鼠血浆AFP和GP73的浓度以及小鼠腹围作为肿瘤发展的量化指标。给药后第44天，每组随机牺牲一只小鼠，收集主要器官、洗涤、固定、石蜡包埋、切片用于组织学分析。组织切片固定在载玻片上并用苏木精和伊红（H＆E）染色，用20倍正置荧光显微镜观察及拍摄图片。肿瘤组织切片固定在载玻片上并用TUNEL染色，用CLSM观察肿瘤组织的凋亡情况。剩余小鼠用于监测观察生存情况，绘制生存曲线（n = 5）。观察期间出现小鼠死亡、特别虚弱或体重减少大于20％、因肝腹水等使腹围超过100 mm，均判定小鼠死亡。在小鼠接种12天后、AFP和GP73血浆浓度分别达到26.9和25.9 ng/mL，尾静脉给药Sap-A6-LCPs和Sap-CPs开始治疗。治疗期间小鼠的体重、AFP和GP73浓度、小鼠腹围以及小鼠生存期作为评估治疗效果的指标（图12）。随着肿瘤的生长，PBS组小鼠越发虚弱，接种20天后可明显看到腹部两侧鼓起，肝腹水症状愈发严重，体重不断增加。PBS组在接种后第30天开始死亡，解剖发现，肿瘤不仅有肝内转移，在主要器官和肠中也有转移。到第37天时，PBS组已有3只小鼠死亡（图12 A）。治疗期间，PBS组AFP和GP73浓度随着肿瘤增长迅速上升，接种后第12到33天内，AFP浓度从26.9上升到111.4 ng/mL，GP73浓度从25.9上升到153.2 ng/mL。图12 B展示的是第42天牺牲小鼠解剖出的肝脏的图片，可以观察到，PBS组小鼠肝肿瘤非常突出，已经遮蔽了大半个肝脏，Sap-CPs和Sap-A6-LCPs显示出有效的抑瘤效果，Sap-A6-LCPs组肝部只有很小的肿瘤。这些结果也和建立该肿瘤模型类似。
Sap-A6-LCPs和Sap-CPs治疗时在最初的三次给药后，小鼠体重基本没有变化，第四次给药后，体重迅速下降，延缓一次给药，并将Sap剂量从25 nmol/kg调整到18 nmol/kg。非靶向组（Sap-CPs）小鼠也有肝腹水现象，但小鼠比较瘦弱，所以体重没有增加，到第39天时已有2只小鼠死亡。Sap-A6-LCPs治疗组AFP和GP73浓度在治疗期间变化不大，第56天的AFP和GP73浓度分别为28.6 和46.7 ng/mL，腹围也没有明显增长（图12 D，E，F），这些都说明Sap-A6-LCPs能有效抑制肝肿瘤的增长。而Sap-CPs组的AFP和GP73浓度虽比PBS组的值低，对肝肿瘤生长有一定抑制作用；但和Sap-A6-LCPs组相比，其AFP和GP73浓度增加较大，第33天时浓度就分别高达44.5 和87 ng/mL，腹围也有一定的增长。
观察第42天取出的主要器官和肿瘤的切片H&E染色图片可发现，Sap-A6-LCPs组肿瘤组织中出现了大量细胞凋亡和坏死（图13 A），而Sap-CPs组肿瘤细胞凋亡和坏死明显少于Sap-A6-LCPs组。肝肿瘤的TUNEL染色结果显示，Sap-A6-LCPs组肝肿瘤有明显的绿色荧光，表明显著的细胞凋亡，而Sap-CPs组的肿瘤组织则只有较少的细胞凋亡。此外，对小鼠各主要器官的H&E染色图片分析发现，PBS组和Sap-CPs组小鼠肺部都有损伤，Sap-CPs组脾脏有水肿现象，Sap-A6-LCPs和Sap-CPs对小鼠其他主要器官和正常肝组织均没有明显的毒副作用。注意到Sap-A6-LCPs组小鼠非癌肝脏组织有大量的炎症细胞存在（图13 B）。考虑到前面活体成像时观察到的Cy5-CC在肝脏的积累，该实验结果说明在肝部积累的囊泡并没有进入肝细胞中释放药物，没有损伤到肝脏。从小鼠的生存曲线发现，Sap-A6-LCPs组小鼠的生存期显著长于Sap-CPs组和PBS组（Sap-A6-LCPs vs CPs/PBS：**P < 0.01），其生存中值分别为72、40和30天（图12 C）。
实施例三
根据实施例一A6-PEG-P(TMC-DTC)的制备，将A6（7.47 mg，8.2 µmol）替换为GE11（9.5mg，8.2 µmol），其余不变，得到GE11-PEG-P(TMC-DTC)，GE11的接枝率通过1H NMR（图14）分析和TNBSA测定聚合物和反应液中未反应的多肽的量来计算，大约是95%，分子式如下：
将GE11-PEG-P(TMC-DTC) 和PEG-P(TMC-DTC)-KD5按比例（GE11聚合物的摩尔含量为0、10％、20％、30％）溶解在DMSO中（40 mg/mL）。Sap从冷冻冰箱取出后在冰浴上解冻、配溶液待用。取25 μL聚合物溶液打入到持续缓慢搅拌（150 rpm）的0.975 mL的Hepes缓冲溶液（pH6.8，5 mM），或是含Sap的Hepes溶液中。搅拌（150 rpm）3分钟后，在25℃静置0.5小时后，用PB（pH 7.4，10 mM）透析3小时（MWCO 1000 kDa）。该过程中聚合物囊泡自交联，得到GE11修饰的聚合物囊泡和载皂草毒素蛋白聚合物囊泡，分别用GE11-LCPs（空载体）和Sap-GE11-LCPs（载Sap靶向囊泡）、Sap- CPs（载Sap非靶向囊泡，与前文一致）来标示。载其他蛋白如Cy5-CC的方法类似。PEG-P(TMC-DTC)-KD5 和GE11-PEG-P(TMC-DTC) 按不同摩尔比（0-30%）制备的囊泡，通过其内壳的KD5和Sap静电复合可高效装载Sap，得到Sap-GE11-LCPs，用于以下测试。由表1可知，Sap-GE11-LCPs也和Sap-A6-LCPs类似具有胶体稳定性高、还原响应性好的特点；更换TMC为CL或者LA，得到的载药囊泡性质见表10。
表10 载药囊泡性质表征（理论载药量为5 wt%）
a 囊泡蛋白质的效率通过UV-vis和BCA测定。b用动态光散射DLS和电泳（ZetasizerNano-ZS）在25 ºC PB（10 mM, pH 7.4）中测试。
通过MTT实验（与实施例二一致，仅更换药物）研究了不同GE11含量的Sap-GE11-LCPs的细胞毒性和靶向性。总体说来，GE11含量为10%-30%的囊泡Sap-GE11-LCPs都比无GE11的囊泡Sap-CPs对SMMC-7721细胞显示出有更优异的抗肿瘤活性，IC50要低，体现了显著的靶向性。其中Sap-10GE11-LCPs和Sap-20GE11-LCPs的IC50（11 nM）相当，比非靶向组的IC50（36.3 nM）低3倍多（图15）；和Sap-20A6-LCPs的IC50差不多，而Sap-30GE11-LCPs的IC50（22 nM）增大很多。
与实施例二一致，以Cy5-CC为模型蛋白，制备了载Cy5-CC的囊泡Cy5-CC-10GE11-LCPs。通过CLSM来观察和研究Cy5-CC-10GE11-LCPs 在SMMC-7721细胞中的内吞和蛋白质的释放。可明显观察到，孵育4小时后，Cy5-CC-10GE11-LCPs处理的SMMC-7721细胞质内有显著更强的Cy5-CC荧光，主要来自从囊泡中释放的蛋白质Cy5-CC。其细胞内荧光强度比Sap-20A6-LCPs的明显要高，说明GE11体系对SMMC-7721细胞具有更强的靶向性。而Cy5-CC-CPs处理的细胞质中Cy5-CC荧光极弱（图16），说明很少有Cy5-CC-CPs内吞进入细胞和/或向细胞中释放了少量的Cy5-CC。
与实施例二一致，用近红外活体成像技术研究了Cy5-CC-GE11-LCPs和Cy5-CC-CPs在荷SMMC-7721原位肝癌小鼠体内的肿瘤富集情况。小鼠接种原位肝癌25天后，尾静脉注射Cy5-CC-GE11-LCPs和Cy5-CC-CPs到小鼠体内，4、6、8、10小时扫描小鼠，其活体成像图片显示，随着时间的延长，小鼠肝部的荧光强度先增强后减弱，10小时荧光强度最高，Cy5-CC-GE11-LCPs组小鼠的荧光强度明显高于非靶向组（数据未给出）。10小时的离体图像显示了肝部的荧光强度最高（图17 A）。Cy5-CC-GE11-LCPs在非癌肝组织和切除的肝肿瘤中的荧光强度均显著高于Cy5-CC-CPs组（图17 B）。定量的生物分布结果显示，Cy5-CC-10GE11-LCPs在肝脏组织的富集量比在正常器官心、脾、肺、肾都高很多，达13.6%ID/g，是无靶Cy5-CC-CPs的1.5倍（图17C）。Cy5-CC-10GE11-LCPs在肿瘤的荧光强度半定量是无靶Cy5-CC-CPs的2倍（图17 D）。所以，Cy5-CC-GE11-LCPs在肿瘤组织的高富集性使得其在治疗肝癌方面有发展前景。
小鼠接种原位SMMC-7721肝癌后第12天（肿瘤接种当天指定为第0天），APF为26.9ng/mL，GP73为25.9 ng/mL时，称重，随机分成6组（n = 6），分别尾静脉注射200 µL的Sap-10GE11-LCPs（高、低剂量）、Sap-20GE11-LCPs（高、低剂量）、Sap-CPs（高剂量）及PBS，每四天给药一次。高剂量组在第12、16和20天以25 nmol Sap/kg的剂量给药，在第24、28、32、36和40天以18 nmol Sap/kg给药；低剂量组以12.5 nmol Sap/kg的剂量给药。在治疗期间，每2天称重小鼠，计算相对第0天的相对体重。监测小鼠血浆中AFP和GP73的浓度以及小鼠的腹围作为肿瘤发展的量化指标。给药后第42天，每组随机牺牲一只小鼠，收集主要器官、洗涤、固定、石蜡包埋、切片用于组织学分析。组织切片固定在载玻片上并用苏木精和伊红（H＆E）染色，用20倍正置荧光显微镜拍摄图片。肿瘤组织切片固定在载玻片上，用Tunel染色，用CLSM观察肿瘤组织的凋亡情况。剩余小鼠用于监测观察生存情况，绘制生存曲线（n = 5）。观察期间出现小鼠死亡、小鼠特别虚弱或体重减少大于20％、小鼠因肝腹水等使腹围超过100 mm，均判定小鼠死亡。建立了小鼠原位肝癌，在接种12天后、AFP和GP73血浆浓度分别为26.9 ng/mL和25.9 ng/mL时，小鼠分成六组，分别尾静脉给药Sap-GE11-LCPs和Sap-CPs。治疗期间监控小鼠的体重、血浆AFP和GP73浓度、小鼠腹围以及小鼠生存期作为评估治疗效果的指标。结果发现，治疗期间，PBS组小鼠体重快速增加，AFP和GP73浓度迅速上升，反映了其较快的肝肿瘤生长速度（图18 A）。
在本次治疗实验中高剂量组也是在最初四次给药25 nmol Sap/kg、第五次开始按18 nmol Sap/kg给药。前三次给药后小鼠体重基本没有变化，第四次给药后，体重也迅速下降。其中的GE11-LCPs高剂量两组小鼠正常无腹水，减少剂量后体重基本没有变化；非靶向组（Sap-CPs）和PBS组类似，有肝腹水现象，但由于比较瘦弱，所以体重没有增加，接种第39天时2只小鼠死亡（图18 C）。而Sap-GE11-LCPs低剂量两组小鼠也有肝腹水症状，小鼠较为瘦弱（图18 A）。图18 B展示的是第42天牺牲小鼠解剖出的肝脏，可以观察到，PBS组小鼠肝肿瘤非常大，Sap-CPs和Sap-GE11-LCPs低剂量两组的肿瘤尺寸相类似，和PBS组相比大为减小，显示出有效的抑瘤效果。令人惊喜的是，Sap-20GE11-LCPs高剂量组小鼠肝部只有很小的肿瘤，而Sap-10GE11-LCPs高剂量组小鼠肝部没有发现明显的肿瘤或结节。治疗中监控数据也表明，Sap-GE11-LCPs高剂量两组小鼠的血浆中AFP和GP73浓度在治疗期间变化一直不大，如Sap-10GE11-LCPs高剂量组在接种后第56天的AFP和GP73浓度分别为16 ng/mL和41ng/mL，腹围也基本不变（图18 D，E，F），充分说明Sap-GE11-LCPs高剂量组能非常有效地抑制肝肿瘤的进展。相比之下，Sap-GE11-LCPs低剂量的两组和非靶向Sap-CPs组的血浆AFP和GP73浓度和腹围，都要高于靶向的高剂量两组；但是也都显著低于PBS组的值，如Sap-10GE11-LCPs低剂量组在接种第56天的AFP和GP73浓度分别为48.1 ng/mL和76.8 ng/mL，腹围也增长到80 mm左右。该结果也证实了Sap-GE11-LCPs低剂量的两组和非靶向Sap-CPs组对肝肿瘤生长有一定抑制作用。小鼠生存曲线显示，PBS组小鼠由于肿瘤的快速发展，其生存中值仅为37天。非靶向Sap-CPs组仅仅能把生存中值延长到42天。四个靶向组则能够显著延长小鼠的生存期，Sap-10GE11-LCPs和Sap-20GE11-LCPs低剂量量组的生存中值分别为66和57天，而相应的高剂量组小鼠的生存期则在低剂量组基础上又有显著的延长：分别为99天和91天（图18 C），这均比Sap-A6-LCPs的生存中值（72天）要长很多。从该治疗实验结果可以看出，治疗小鼠原位肝癌的Sap-GE11-LCPs具有显著的靶向性和剂量依赖性的疗效。
接种42天的小鼠治疗后其主要器官的切片经H&E染色后，从显微镜图片可以发现，Sap-GE11-LCPs和Sap-CPs对小鼠各主要器官和正常肝组织均没有明显的毒副作用（图19）。在肝脏的切片上，Sap-10GE11-LCPs高剂量组小鼠未发现肿瘤，而Sap-20GE11-LCPs高剂量组的肝脏肿瘤组织清晰可见，可观察到大量细胞凋亡和坏死；而Sap-GE11-LCPs低剂量组和Sap-CPs组肝脏的肿瘤细胞组织呈现的细胞凋亡和坏死明显要少。肝肿瘤切片的TUNEL染色结果显示，Sap-20GE11-LCPs高剂量组肝肿瘤有最为显著的绿色荧光，表明最显著的细胞凋亡，高于Sap-10GE11-LCPs低剂量组、Sap-20GE11-LCPs低剂量组和Sap-CPs组的肿瘤组织（图20）。
综上，本发明囊泡纳米药物内腔可无损高效装载蛋白质、表面可修饰多种靶向分子，可显著提高原位肝癌疗效，同时其生物可降解、体内安全、制备工艺简单，具有临床转化前景。
Claims (10)
1.还原敏感可逆交联的聚合物，其分子结构式如下：
或者
或者
其中，PEG链段的分子量为2000-10000Da；疏水链段的总分子量为PEG链段分子量的2.5～10倍；疏水链段中PDTC链段的分子量占疏水链段总分子量的10%～35%；n为1～20。
2.根据权利要求1所述还原敏感可逆交联的聚合物，其特征在于，PEG链段的分子量为3400-8000Da；疏水链段的总分子量为PEG链段分子量的2.8～6倍；疏水链段中PDTC链段的分子量占疏水链段总分子量的11%～25%；n为5～15。
3.根据权利要求1所述还原敏感可逆交联的聚合物，其特征在于，所述还原敏感可逆交联的聚合物的制备方法包括以下步骤：
（1）将PEG-P(A-DTC)与氯甲酸对硝基苯酯反应，制备PEG-P(A-DTC)-NPC；所述A为TMC、LA或者CL；
（2）将PEG-P(A-DTC)-NPC与KDn反应，制备还原敏感可逆交联的聚合物；所述KDn的化学结构式如下：
。
4.根据权利要求3所述还原敏感可逆交联的聚合物，其特征在于，氯甲酸对硝基苯酯、PEG-P(A-DTC)的摩尔比为2～10∶1；PEG-P(A-DTC)-NPC、KDn的摩尔比为1∶1.1～4。
5.还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的聚合物囊泡，其特征在于，所述还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的聚合物囊泡的制备方法包括以下步骤：
（1）将PEG-P(A-DTC)与氯甲酸对硝基苯酯反应，制备PEG-P(A-DTC)-NPC；所述A为TMC、LA或者CL；
（2）将PEG-P(A-DTC)-NPC与KDn反应，制备还原敏感可逆交联的聚合物PEG-P(A-DTC)-KDn；所述KDn的化学结构式如下：
n为1～20；
（3）将Mal-PEG-P(A-DTC)或NHS-PEG-P(A-DTC)与靶向分子反应，制备靶向分子-PEG-P(A-DTC)；所述A为TMC、LA或者CL；
（4）将PEG-P(A-DTC)-KDn自组装得到还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的聚合物囊泡；或者将PEG-P(A-DTC)-KDn与靶向分子- PEG-P(A-DTC) 自组装得到还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的聚合物囊泡。
6.还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的囊泡纳米药物，其特征在于，所述还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的囊泡纳米药物的制备方法包括以下步骤：
（1）将PEG-P(A-DTC)与氯甲酸对硝基苯酯反应，制备PEG-P(A-DTC)-NPC；所述A为TMC、LA或者CL；
（2）将PEG-P(A-DTC)-NPC与KDn反应，制备还原敏感可逆交联的聚合物PEG-P(TMC-DTC)-KDn或者PEG-P(LA-DTC)-KDn；所述KDn的化学结构式如下：
n为1～20；
（3）将Mal-PEG-P(A-DTC)或NHS-PEG-P(A-DTC)与靶向分子反应，制备靶向分子-PEG-P(A-DTC)；所述A为TMC、LA或者CL；
（4）将PEG-P(A-DTC)-KDn与药物自组装得到还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的纳米药物；或者将PEG-P(A-DTC)-KDn、靶向分子- PEG-P(A-DTC) 与药物自组装得到还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的纳米药物。
7.根据权利要求5所述还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的聚合物囊泡或者6所述还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的囊泡纳米药物，其特征在于，靶向分子为多肽；Mal-PEG-P(A-DTC)、靶向分子的摩尔比为1∶1.2～5； NHS-PEG-P(A-DTC)、靶向分子的摩尔比为1∶1.2～5；Mal-PEG-P(A-DTC) 或NHS-PEG-P(A-DTC)中，PEG链段的分子量为3000-10000Da；疏水链段的总分子量为PEG链段分子量的2.5～10倍；疏水链段中PDTC链段的分子量占疏水链段总分子量的10%～35%；。
8.根据权利要求5所述还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的聚合物囊泡或者6所述还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的囊泡纳米药物，其特征在于，PEG-P(A-DTC)-KDn、靶向分子- PEG-P(A-DTC)混合物中，靶向分子的摩尔量为0～40%。
9.根据权利要求6所述还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的纳米药物，其特征在于，所述药物为蛋白质药物或者多肽药物。
10.权利要求1所述还原敏感可逆交联的聚合物或者权利要求5所述还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的聚合物囊泡或者权利要求6所述还原敏感可逆交联的具有不对称膜结构的囊泡纳米药物在制备治疗肝癌的药物中的应用。
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