CN110229225A - 一种南极磷虾中富硫和/或富铯蛋白的制备方法 - Google Patents
一种南极磷虾中富硫和/或富铯蛋白的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本公开提供了一种南极磷虾中富硫和/或富铯蛋白的制备方法，首先通过水溶液提取从南极磷虾中提取总蛋白，通过实验表明水溶液提取法、稀酸溶液提取法、稀碱溶液提取法、稀盐溶液提取法和醇溶液提取法中，水溶液提取法提取的总蛋白硫和铯含量更高。同时通过葡聚糖凝胶层析分离法能够进一步获得南极磷虾富硫蛋白或南极磷虾富铯蛋白。
Description
技术领域
本公开属于食品和化工技术领域，涉及富硫或富铯蛋白的提取与分离技术领域，尤其是一种南极磷虾中富硫和/或富铯蛋白的制备方法。
背景技术
这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。
南极磷虾(Euphausia superba)，也被称为大磷虾，是一种生活在南极海域的甲壳动物，数量庞大。南极磷虾的营养价值丰富，含有丰富的脂肪酸(必需脂肪酸)、蛋白质、维生素、微量元素以及生物活性物质。鲜南极磷虾中蛋白质含量约为11.9％～15.4％，是优质的蛋白资源库，具有很高的营养价值和研究价值。蛋白质是有机体的生命物质基础之一，也是生物生长代谢所必需的重要组成部分。随着对基因组学、结构生物学及分子生物学等研究的深入，科学家对蛋白质的生物活性、结构及功能的认识不断提升，许多学者开始将生物学研究的焦点从基因组的研究转向蛋白质结构及功能的研究。要研究蛋白质的结构与功能，首先要分离出待研究的高纯度的具有生物活性的蛋白质，高效的提取、分离、纯化的方法技术是研究蛋白质活性性能的基础和关键之一。
硫元素普遍存在于各类细胞之中，硫元素不仅是人体所需的元素，也是构成氨基酸的组成成分之一。富硫蛋白在营养价值、生理功能以及对人体代谢等方面具有重要的作用。与金属相结合的富硫蛋白(金属硫蛋白)通过与有毒重金属结合可以有效的减轻重金属对机体的毒害，从而实现解毒功能。富硫蛋白的食品中富含含硫氨基酸，这使得食品不仅在色、香、味上有所不同，在营养价值、抑制褐变、防衰老抗氧化等诸多方面都有重要作用。富硫蛋白在食品中的营养功能以及生理调节功能概括起来主要体现在以下几个方面。第一，蛋氨酸是人体的必需的氨基酸，即人体无法合成，必须通过膳食摄入。第二，目前有很多防止食品褐变的方法，广泛使用的亚硫酸盐是化学方法处理上常用的试剂，亚硫酸盐虽然能有效抑制食品的褐变，但会造成一定不良后果，所以需要寻找安全可靠的亚硫酸盐替代物。研究发现，含硫氨基酸对酶促褐变和非酶促褐变都有强烈的抑制作用，且其添加效果与亚硫酸盐的效果近似。含硫氨基酸尤其是半胱氨酸能抑制蛋白质或其它氨基酸与糖发生美拉德反应，因而可以防止由于褐变引起的食物蛋白的营养价值的降低。第三，胱氨酸和半胱氨酸有强烈的抗氧化作用，半胱氨酸的巯基是非常强的亲核集团，它可以以还原剂的形式清除活性氧，从而达到防治食物氧化腐败乃至机体的氧化衰老的作用，因而可以防止食品中的VC、VE、多不饱和脂肪酸以及酚类生物活性物质的氧化，从而间接提高了食品的营养价值。
金属铯是一种金黄色、软而轻、熔点低的活泼金属，在空气中极易被氧化，能与水剧烈反应生成氢气且爆炸。碘化铯与三碘化铋反应能生成难溶的亮红色复盐，此反应用来定性和定量测定铯；铯的火焰成紫红色，可用来检验铯。铯在自然界没有单质形态，铯元素以盐的形式极少的分布于陆地和海洋中。放射性核素Cs-137是日本福岛第一核电站泄露出的放射性污染中的一种。铯也是制造真空件器、光电管等的重要材料，化学上可做催化剂。铯可产生突出的光电效应，极易电离而放出电子，是光电管的主要材料；近年来在离子火箭、磁流体发电机和热电换能器等方面也有新的应用。
发明内容
本公开的目的是提供一种南极磷虾中富硫和/或富铯蛋白的制备方法，能够从南极磷虾中提取富硫蛋白和/或富铯蛋白。
为了实现上述目的，本公开的技术方案为：
一方面，一种水溶液提取南极磷虾总蛋白的方法，将南极磷虾的虾泥置于水中分散均匀获得混合液，再将混合液进行超声提取，然后将超声提取后的混合液中的沉淀去除，获得南极磷虾总蛋白。
本公开通过研究发现南极磷虾蛋白质的水解产物中氨基酸含量丰富，其中，含硫氨基酸含量高，由于含硫氨基酸参与转录与翻译等过程，能够减弱肝硬化与老年痴呆等，富硫蛋白也助于维护皮肤及指甲的健康和光泽、维持氧平衡、帮助脑功能正常运作。为了将富硫蛋白从南极磷虾中提取处理，本公开在研究过程中分别采用了水溶液提取法、稀酸溶液提取法、稀碱溶液提取法、稀盐溶液提取法和醇溶液提取法对南极磷虾进行提取南极磷虾中的总蛋白，而通过电感耦合等离子发射光谱法(ICP-5000)进行硫元素定性、定量检测，发现本公开的水溶液提取的南极磷虾总蛋白中硫元素的含量最高。
另一方面，一种上述方法获得的南极磷虾总蛋白。
第三方面，一种南极磷虾中富硫和/或富铯蛋白的制备方法，包括上述方法，将南极磷虾总蛋白的干粉加入水放置在涡旋混合器上混合均匀，再通过离心分离除去滤渣收集上清液，然后以水为洗脱剂采用Sephadex G-75凝胶层析法对上清液进行分离纯化，获得若干份蛋白样品，通过电感耦合等离子发射光谱法(ICP-5000)进行若干份蛋白样品的硫元素或铯元素定性、定量检测，获取硫元素或铯元素含量最高的蛋白样品即为南极磷虾富硫蛋白或南极磷虾富铯蛋白。
本公开通过进一步研究发现，能够从南极磷虾总蛋白中进一步提取南极磷虾富硫蛋白或南极磷虾富铯蛋白。
第四方面，一种上述制备方法获得的南极磷虾富硫蛋白或南极磷虾富铯蛋白。
本公开的有益效果为：
1.本公开提供了一种水溶液提取南极磷虾总蛋白的方法，该方法提取的南极磷虾总蛋白中硫元素的含量最高。
2.本公开对南极磷虾总蛋白进行葡聚糖凝胶层析法分离，利用电感耦合等离子发射光谱法(ICP-5000)进行硫元素或铯元素的检测，得到含硫量高的南极磷虾富硫蛋白或含铯量高的南极磷虾富铯蛋白。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本公开提出了一种南极磷虾中富硫和/或富铯蛋白的制备方法，能够从南极磷虾中提取富硫蛋白和/或富铯蛋白。
本公开的一种典型实施方式，提供了一种水溶液提取南极磷虾总蛋白的方法，将南极磷虾的虾泥置于水中分散均匀获得混合液，再将混合液进行超声提取，然后将超声提取后的混合液中的沉淀去除，获得南极磷虾总蛋白。
本公开通过研究发现南极磷虾蛋白质的水解产物中氨基酸含量丰富，其中，含硫氨基酸含量高，由于含硫氨基酸参与转录与翻译等过程，能够减弱肝硬化与老年痴呆等，富硫蛋白也助于维护皮肤及指甲的健康和光泽、维持氧平衡、帮助脑功能正常运作。为了将富硫蛋白从南极磷虾中提取处理，本公开在研究过程中分别采用了水溶液提取法、稀酸溶液提取法、稀碱溶液提取法、稀盐溶液提取法和醇溶液提取法对南极磷虾进行提取南极磷虾中的总蛋白，而通过电感耦合等离子发射光谱法(ICP-5000)进行硫元素定性、定量检测，发现本公开的水溶液提取的南极磷虾总蛋白中硫元素的含量最高。
该实施方式的一种或多种实施例中，步骤如下：
(1)将冷冻的新鲜南极磷虾解冻、去水后进行破碎获得鲜南极磷虾虾泥；
(2)取鲜南极磷虾虾泥，加入三蒸水，磁力搅拌；
(3)进行超声提取；
(4)进行离心后收集上清液；
(5)旋转蒸发至完全干燥，得南极磷虾水溶性的干蛋白粉。
该系列实施例中，步骤(1)中采用高速粉碎机进行破碎。高速粉碎机有助于增大与溶剂的接触面积，能够完全提取南极磷虾中的总蛋白。
该系列实施例中，步骤(2)中，虾泥质量与三蒸水体积比(料液比)为1:5～20。当虾泥质量与三蒸水体积比为1:15时，提取的总蛋白的提取率更高，且再继续增加料液比时提取率升高不明显。当料液比过大时，物料反应不完全，蛋白质提取不彻底导致提取率较低；当料液比过小时，物料虽然提取彻底，但不利于后续提取工作。
该系列实施例中，步骤(2)中，当搅拌时间为80min时蛋白质提取率高。提取时间较短时，蛋白质溶解不完全，提取不彻底；提取时间过长时，蛋白质提取率增长不明显，且增加后续旋转蒸发处理时的工作量。
该系列实施例中，步骤(3)中，超声提取的条件为：温度为20℃～40℃，功率为200～300W，频率30～50kHz，超声提取时间为10～120min。通过超声提取，使水溶液充分的浸入南极磷虾粉碎组织中，最大化的发挥水溶液的提取率。当25℃、250W、40kHz的条件下超声提取40min时，测得总蛋白提取率为17.76％±0.02％。当提取时间为40min时蛋白质提取率更高。提取时间较短时，蛋白质溶解不完全，提取不彻底；提取时间过长时，蛋白质的结构和性质受到不同程度的破坏，不仅会降低蛋白质的提取率，且影响蛋白质性能。
该系列实施例中，步骤(4)中，离心条件为：转速为1000～5000r/min，时间为5～15min。离心效果更好的条件为：3000r/min，10min。
该系列实施例中，步骤(5)中，旋转蒸发的温度为25～45℃。当旋转蒸发的温度为40℃时，提取总蛋白的效果更好。
本公开的另一种实施方式，提供了一种上述方法获得的南极磷虾总蛋白。
本公开的第三种实施方式，提供了一种南极磷虾中富硫或富铯蛋白的制备方法，包括上述方法，将南极磷虾总蛋白的干粉加入水放置在涡旋混合器上混合均匀，再通过离心分离除去滤渣收集上清液，然后以水为洗脱剂采用Sephadex G-75凝胶层析法对上清液进行分离纯化，获得若干份蛋白样品，通过电感耦合等离子发射光谱法(ICP-5000)进行若干份蛋白样品的硫元素或铯元素定性、定量检测，获取硫元素或铯元素含量最高的蛋白样品即为南极磷虾富硫蛋白或南极磷虾富铯蛋白。
该实施方式的一种或多种实施例中，步骤如下：
<1>将南极磷虾总蛋白的干粉溶于三蒸水中，在涡旋混合器上混合均匀，混合液通过用高速离心机离心后出去滤渣收集上清液；
<2>以水为洗脱剂采用Sephadex G-75凝胶层析法对上清液进行洗脱，每隔一定量取一份标记，取一定量份数蛋白液后，分别旋转蒸发浓缩获得对应的蛋白粉；
<3>通过电感耦合等离子发射光谱法进行若干份蛋白粉的硫元素或铯元素定性、定量检测，获取硫元素或铯元素含量最高的蛋白粉对应的蛋白液，即为南极磷虾富硫蛋白或南极磷虾富铯蛋白。
该系列实施例中，步骤<1>中，在涡旋混合器上混合1～5min，混合液通过用高速离心机1000～5000r/min，离心1～10min后除去滤渣收集上清液。在涡旋混合器上混合2min，混合液通过用高速离心机3000r/min，离心5min后除去滤渣收集的上清液的提取效果更好。
该系列实施例中，步骤<2>中，Sephadex G-75凝胶层析法的制备色谱柱的方法为：
<2-1>将Sephadex G-75干粉加入至洗脱剂中，吸水溶胀，获得凝胶溶液；
<2-2>将凝胶溶液加入至柱管中，自然沉降，凝胶沉集后，将溶剂放出，同时通过加入溶剂使柱床稳定。
该系列实施例中，步骤<2-1>中，采用沸水浴进行溶胀。可缩短溶胀时间至几小时，且能杀死细菌和霉菌，并且可排除凝胶内总包藏着的气泡。
该系列实施例中，步骤<2-1>中，溶胀比为1:15～20。当在室温下进行吸水溶胀时，使之充分吸水溶胀即可。当在沸水浴进行溶胀时，溶胀时间为60～180min。当溶胀比为1:15时，沸水浴溶胀时间为120min。
该系列实施例中，步骤<2-2>中，加入2～3倍柱床体积的溶剂使柱床稳定。
该系列实施例中，步骤<2>中，向Sephadex G-75凝胶色谱柱中加样的过程为：将上清液加到Sephadex G-75凝胶色谱柱上，打开凝胶色谱柱底部管夹，使上清液流入柱内，控制上清液加入量和流速。
该系列实施例中，上清液的加入量为1～3mL，流速为2～5mL/10min。当上清液的加入量为2mL，流速为3mL/10min时，分离效果更好。
该系列实施例中，步骤<3>中，每隔30～50mL取一份作为一份蛋白液，取8～20份蛋白液后，分别旋转蒸发浓缩。当每隔50mL取一份作为一份蛋白液，取10份时，更容易区别并获得南极磷虾富硫蛋白或南极磷虾富铯蛋白。
本公开的第四种实施方式，提供了一种上述制备方法获得的南极磷虾富硫蛋白或南极磷虾富铯蛋白。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。
实施例1：南极磷虾富硫蛋白的制备
1、南极磷虾总蛋白的水溶液提取方法
(1)将冷冻的新鲜南极磷虾解冻、去水后用高速组织粉碎机破碎。
(2)取20g鲜南极磷虾虾泥于烧杯中，加入三蒸水，南极磷虾(W)和三蒸水(V)以1：15的比例加入，磁力搅拌机搅拌80min。
(3)在数控超声清洗机中超声提取，条件为：25℃、250W、40kHz的条件下超声提取40min。
(4)用高速离心机离心后收集上清液，离心条件为：3000r/min，10min。
(5)40℃旋转蒸发至完全干燥，得南极磷虾水溶性的干蛋白粉，蛋白质的提取率为17.76％。
经过经电感耦合等离子发射光谱法(ICP-5000)进行硫元素定性、定量检测，测得该干蛋白粉中硫的含量为54.1435ppm。
2、南极磷虾富硫蛋白的葡聚糖凝胶层析分离法，步骤如下：
(1)取上述步骤1中的步骤(5)提取的南极磷虾水溶性的干蛋白粉复溶于三蒸水中，在涡旋混合器上混合2min，混合液通过用高速离心机3000r/min，离心5min后出去滤渣收集上清液。
(2)葡聚糖凝胶选用Sephadex G-75，取干粉，将称好的干粉倾入洗脱液中，选择纯水为洗脱液，放置在室温下，使之充分吸水溶胀，溶胀比为1:15。注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。在沸水浴上加热120min，能杀死细菌和霉菌，并且可排除凝胶内总包藏着的气泡。
(3)装柱，柱管可用一般柱层析管，装柱时将浓浆的凝胶一次倾入柱中，使之自然沉降，要注意颗粒间没有夹杂气泡，不用分次填装法或稀的凝胶悬浮液装柱。凝胶沉集后，将溶剂放出，并且要通过3倍柱床体积的溶剂使柱床稳定。
(4)上样，加样量为2mL，流速3mL/10min。
(5)洗脱，用纯水溶液作为该实验的洗脱剂。每隔50mL取一份标记，取10份蛋白液后，分别旋转蒸发浓缩到2mL，备用。
(6)洗脱后的几份蛋白液经电感耦合等离子发射光谱法(ICP-5000)进行硫元素定性、定量检测，其中第5份蛋白液中硫元素含量最高(14.92ppm，其他9份均在10ppm以下)，即将第5份蛋白液作为南极磷虾富硫蛋白。
实施例2：南极磷虾富硫蛋白的制备
1、南极磷虾总蛋白的水溶液提取方法
(1)将冷冻的新鲜南极磷虾解冻、去水后用高速组织粉碎机破碎。
(2)取20g鲜南极磷虾虾泥于烧杯中，加入三蒸水，南极磷虾(W)和三蒸水(V)以1：15的比例加入，磁力搅拌机搅拌80min。
(3)在数控超声清洗机中超声提取，条件为：25℃、250W、40kHz的条件下超声提取20min。
(4)用高速离心机离心后收集上清液，离心条件为：3000r/min，10min。
(5)40℃旋转蒸发至完全干燥，得南极磷虾水溶性的干蛋白粉，蛋白质的提取率为16.37％。
2、南极磷虾富硫蛋白的葡聚糖凝胶层析分离法，步骤如下：
(1)取上述步骤1中的步骤(5)提取的南极磷虾水溶性的干蛋白粉复溶于三蒸水中，在涡旋混合器上混合1min，混合液通过用高速离心机3000r/min，离心5min后出去滤渣收集上清液。
(2)葡聚糖凝胶选用Sephadex G-75，取干粉，将称好的干粉倾入洗脱液中，选择纯水为洗脱液，放置在室温下，使之充分吸水溶胀，溶胀比为1:15。注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。在沸水浴上加热120min，能杀死细菌和霉菌，并且可排除凝胶内总包藏着的气泡。
(3)装柱，柱管可用一般柱层析管，装柱时将浓浆的凝胶一次倾入柱中，使之自然沉降，要注意颗粒间没有夹杂气泡，不用分次填装法或稀的凝胶悬浮液装柱。凝胶沉集后，将溶剂放出，并且要通过2倍柱床体积的溶剂使柱床稳定。
(4)上样，加样量为2mL，流速3mL/10min。
(5)洗脱，用纯水溶液作为该实验的洗脱剂。每隔50mL取一份标记，取10份蛋白液后，分别旋转蒸发浓缩到2mL，备用。
(6)洗脱后的几份蛋白液经电感耦合等离子发射光谱法(ICP-5000)进行硫元素定性、定量检测，其中第5份蛋白液中硫元素含量最高(14.89ppm，其他9份均在10ppm以下)，即将第5份蛋白液作为南极磷虾富硫蛋白。
实施例3：南极磷虾富硫蛋白的制备
1、南极磷虾总蛋白的水溶液提取方法
(1)将冷冻的新鲜南极磷虾解冻、去水后用高速组织粉碎机破碎。
(2)取20g鲜南极磷虾虾泥于烧杯中，加入三蒸水，南极磷虾(W)和三蒸水(V)以1：15的比例加入，磁力搅拌机搅拌80min。
(3)在数控超声清洗机中超声提取，条件为：25℃、250W、40kHz的条件下超声提取40min。
(4)用高速离心机离心后收集上清液，离心条件为：3000r/min，10min。
(5)10℃旋转蒸发至完全干燥，得南极磷虾水溶性的干蛋白粉，蛋白质的提取率为17.07％。
2、南极磷虾富硫蛋白的葡聚糖凝胶层析分离法，步骤如下：
(1)取上述步骤1中的步骤(5)提取的南极磷虾水溶性的干蛋白粉复溶于三蒸水中，在涡旋混合器上混合4min，混合液通过用高速离心机3000r/min，离心5min后出去滤渣收集上清液。
(2)葡聚糖凝胶选用Sephadex G-75，取干粉，将称好的干粉倾入洗脱液中，选择纯水为洗脱液，放置在室温下，使之充分吸水溶胀，溶胀比为1:15。注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。在沸水浴上加热60min，能杀死细菌和霉菌，并且可排除凝胶内总包藏着的气泡。
(3)装柱，柱管可用一般柱层析管，装柱时将浓浆的凝胶一次倾入柱中，使之自然沉降，要注意颗粒间没有夹杂气泡，不用分次填装法或稀的凝胶悬浮液装柱。凝胶沉集后，将溶剂放出，并且要通过3倍柱床体积的溶剂使柱床稳定。
(4)上样，加样量为2mL，流速3mL/10min。
(5)洗脱，用纯水溶液作为该实验的洗脱剂。每隔50mL取一份标记，取10份蛋白液后，分别旋转蒸发浓缩到2mL，备用。
(6)洗脱后的几份蛋白液经电感耦合等离子发射光谱法(ICP-5000)进行硫元素定性、定量检测，其中第5份蛋白液中硫元素含量最高(14.87ppm，其他9份均在10ppm以下)，即将第5份蛋白液作为南极磷虾富硫蛋白。
实施例4：南极磷虾富硫蛋白的制备
1、南极磷虾总蛋白的水溶液提取方法
(1)将冷冻的新鲜南极磷虾解冻、去水后用高速组织粉碎机破碎；
(2)取20g鲜南极磷虾虾泥于烧杯中，加入三蒸水，南极磷虾(W)和三蒸水(V)以1：10的比例加入，磁力搅拌机搅拌80min；
(3)在数控超声清洗机中超声提取，条件为：25℃、250W、40kHz的条件下超声提取40min；
(4)用高速离心机离心后收集上清液，离心条件为：3000r/min，10min；
(5)40℃旋转蒸发至完全干燥，得南极磷虾水溶性的干蛋白粉，蛋白质的提取率为16.58％。
2、南极磷虾富硫蛋白的葡聚糖凝胶层析分离法，步骤如下：
(1)取上述步骤1中的步骤(5)提取的南极磷虾水溶性的干蛋白粉复溶于三蒸水中，在涡旋混合器上混合2min，混合液通过用高速离心机3000r/min，离心5min后出去滤渣收集上清液；
(2)葡聚糖凝胶选用Sephadex G-75，取干粉，将称好的干粉倾入洗脱液中，选择纯水为洗脱液，放置在室温下，使之充分吸水溶胀，溶胀比为1:15。注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。在沸水浴上加热60min，能杀死细菌和霉菌，并且可排除凝胶内总包藏着的气泡；
(3)装柱，柱管可用一般柱层析管，装柱时将浓浆的凝胶一次倾入柱中，使之自然沉降，要注意颗粒间没有夹杂气泡，不用分次填装法或稀的凝胶悬浮液装柱。凝胶沉集后，将溶剂放出，并且要通过2倍柱床体积的溶剂使柱床稳定；
(4)上样，加样量为2mL，流速3mL/10min；
(5)洗脱，用纯水溶液作为该实验的洗脱剂。每隔50mL取一份标记，取10份蛋白液后，分别旋转蒸发浓缩到2mL，备用；
(6)洗脱后的几份蛋白液经电感耦合等离子发射光谱法(ICP-5000)进行硫元素定性、定量检测，其中第5份蛋白液中硫元素含量最高(14.88ppm，其他9份均在10ppm以下)，即将第5份蛋白液作为南极磷虾富硫蛋白。
实施例5：南极磷虾富铯蛋白的制备
1、南极磷虾总蛋白的水溶液提取方法
(1)将冷冻的新鲜南极磷虾解冻、去水后用高速组织粉碎机破碎。
(2)取20g鲜南极磷虾虾泥于烧杯中，加入三蒸水，南极磷虾(W)和三蒸水(V)以1：15的比例加入，磁力搅拌机搅拌80min。
(3)在数控超声清洗机中超声提取，条件为：25℃、250W、40kHz的条件下超声提取40min。
(4)用高速离心机离心后收集上清液，离心条件为：3000r/min，10min。
(5)40℃旋转蒸发至完全干燥，得南极磷虾水溶性的干蛋白粉。
2、南极磷虾富铯蛋白的葡聚糖凝胶层析分离法，步骤如下：
(1)取上述步骤1中的步骤(5)提取的南极磷虾水溶性的干蛋白粉复溶于三蒸水中，在涡旋混合器上混合3min，混合液通过用高速离心机3000r/min，离心5min后出去滤渣收集上清液。
(2)葡聚糖凝胶选用Sephadex G-75，取干粉，将称好的干粉倾入洗脱液中，选择纯水为洗脱液，放置在室温下，使之充分吸水溶胀，溶胀比为1:15。注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。在沸水浴上加热120min，能杀死细菌和霉菌，并且可排除凝胶内总包藏着的气泡。
(3)装柱，柱管可用一般柱层析管，装柱时将浓浆的凝胶一次倾入柱中，使之自然沉降，要注意颗粒间没有夹杂气泡，不用分次填装法或稀的凝胶悬浮液装柱。凝胶沉集后，将溶剂放出，并且要通过3倍柱床体积的溶剂使柱床稳定。
(4)上样，加样量为2mL，流速3mL/10min。
(5)洗脱，用纯水溶液作为该实验的洗脱剂。每隔50mL取一份标记，取10份蛋白液后，分别旋转蒸发浓缩到2mL，备用。
(6)洗脱后的几份蛋白液经电感耦合等离子发射光谱法(ICP-5000)进行铯元素定性、定量检测，其中第2份蛋白液中铯元素含量最高(20.06ppm，其他9份均在19ppm以下)，即将第2份蛋白液作为南极磷虾富铯蛋白。
实施例6：南极磷虾富铯蛋白的制备
1、南极磷虾总蛋白的水溶液提取方法
(1)将冷冻的新鲜南极磷虾解冻、去水后用高速组织粉碎机破碎。
(2)取20g鲜南极磷虾虾泥于烧杯中，加入三蒸水，南极磷虾(W)和三蒸水(V)以1：15的比例加入，磁力搅拌机搅拌80min。
(3)在数控超声清洗机中超声提取，条件为：25℃、250W、40kHz的条件下超声提取20min。
(4)用高速离心机离心后收集上清液，离心条件为：3000r/min，10min。
(5)40℃旋转蒸发至完全干燥，得南极磷虾水溶性的干蛋白粉。
2、南极磷虾富铯蛋白的葡聚糖凝胶层析分离法，步骤如下：
(1)取上述步骤1中的步骤(5)提取的南极磷虾水溶性的干蛋白粉复溶于三蒸水中，在涡旋混合器上混合3min，混合液通过用高速离心机3000r/min，离心5min后出去滤渣收集上清液。
(2)葡聚糖凝胶选用Sephadex G-75，取干粉，将称好的干粉倾入洗脱液中，选择纯水为洗脱液，放置在室温下，使之充分吸水溶胀，溶胀比为1:15。注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。在沸水浴上加热120min，能杀死细菌和霉菌，并且可排除凝胶内总包藏着的气泡。
(3)装柱，柱管可用一般柱层析管，装柱时将浓浆的凝胶一次倾入柱中，使之自然沉降，要注意颗粒间没有夹杂气泡，不用分次填装法或稀的凝胶悬浮液装柱。凝胶沉集后，将溶剂放出，并且要通过2倍柱床体积的溶剂使柱床稳定。
(4)上样，加样量为2mL，流速3mL/10min。
(5)洗脱，用纯水溶液作为该实验的洗脱剂。每隔50mL取一份标记，取10份蛋白液后，分别旋转蒸发浓缩到2mL，备用。
(6)洗脱后的几份蛋白液经电感耦合等离子发射光谱法(ICP-5000)进行铯元素定性、定量检测，第2份蛋白液中铯元素含量最高(20.05ppm，其他9份均在19ppm以下)，即将第2份蛋白液作为南极磷虾富铯蛋白。
实施例7：南极磷虾富铯蛋白的制备
1、南极磷虾总蛋白的水溶液提取方法
(1)将冷冻的新鲜南极磷虾解冻、去水后用高速组织粉碎机破碎。
(2)取20g鲜南极磷虾虾泥于烧杯中，加入三蒸水，南极磷虾(W)和三蒸水(V)以1：15的比例加入，磁力搅拌机搅拌80min。
(3)在数控超声清洗机中超声提取，条件为：25℃、250W、40kHz的条件下超声提取40min。
(4)用高速离心机离心后收集上清液，离心条件为：3000r/min，10min。
(5)10℃旋转蒸发至完全干燥，得南极磷虾水溶性的干蛋白粉。
2、南极磷虾富铯蛋白的葡聚糖凝胶层析分离法，步骤如下：
(1)取上述步骤1中的步骤(5)提取的南极磷虾水溶性的干蛋白粉复溶于三蒸水中，在涡旋混合器上混合3min，混合液通过用高速离心机3000r/min，离心5min后出去滤渣收集上清液。
(2)葡聚糖凝胶选用Sephadex G-75，取干粉，将称好的干粉倾入洗脱液中，选择纯水为洗脱液，放置在室温下，使之充分吸水溶胀，溶胀比为1:15。注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。在沸水浴上加热60min，能杀死细菌和霉菌，并且可排除凝胶内总包藏着的气泡。
(3)装柱，柱管可用一般柱层析管，装柱时将浓浆的凝胶一次倾入柱中，使之自然沉降，要注意颗粒间没有夹杂气泡，不用分次填装法或稀的凝胶悬浮液装柱。凝胶沉集后，将溶剂放出，并且要通过3倍柱床体积的溶剂使柱床稳定。
(4)上样，加样量为2mL，流速3mL/10min。
(5)洗脱，用纯水溶液作为该实验的洗脱剂。每隔50mL取一份标记，取10份蛋白液后，分别旋转蒸发浓缩到2mL，备用。
(6)洗脱后的几份蛋白液经电感耦合等离子发射光谱法(ICP-5000)进行铯元素定性、定量检测，第2份蛋白液中铯元素含量最高(20.03ppm，其他9份均在19ppm以下)，即将第2份蛋白液作为南极磷虾富铯蛋白。
实施例8：南极磷虾富铯蛋白的制备
1、南极磷虾总蛋白的水溶液提取方法
(1)将冷冻的新鲜南极磷虾解冻、去水后用高速组织粉碎机破碎；
(2)取20g鲜南极磷虾虾泥于烧杯中，加入三蒸水，南极磷虾(W)和三蒸水(V)以1：10的比例加入，磁力搅拌机搅拌80min；
(3)在数控超声清洗机中超声提取，条件为：25℃、250W、40kHz的条件下超声提取40min；
(4)用高速离心机离心后收集上清液，离心条件为：3000r/min，10min；
(5)40℃旋转蒸发至完全干燥，得南极磷虾水溶性的干蛋白粉。
2、南极磷虾富铯蛋白的葡聚糖凝胶层析分离法，步骤如下：
(1)取上述步骤1中的步骤(5)提取的南极磷虾水溶性的干蛋白粉复溶于三蒸水中，在涡旋混合器上混合2min，混合液通过用高速离心机3000r/min，离心5min后出去滤渣收集上清液；
(2)葡聚糖凝胶选用Sephadex G-75，取干粉，将称好的干粉倾入洗脱液中，选择纯水为洗脱液，放置在室温下，使之充分吸水溶胀，溶胀比为1:15。注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。在沸水浴上加热60min，能杀死细菌和霉菌，并且可排除凝胶内总包藏着的气泡；
(3)装柱，柱管可用一般柱层析管，装柱时将浓浆的凝胶一次倾入柱中，使之自然沉降，要注意颗粒间没有夹杂气泡，不用分次填装法或稀的凝胶悬浮液装柱。凝胶沉集后，将溶剂放出，并且要通过2倍柱床体积的溶剂使柱床稳定；
(4)上样，加样量为2mL，流速3mL/10min；
(5)洗脱，用纯水溶液作为该实验的洗脱剂。每隔50mL取一份标记，取10份蛋白液后，分别旋转蒸发浓缩到2mL，备用；
(6)洗脱后的几份蛋白液经电感耦合等离子发射光谱法(ICP-5000)进行铯元素定性、定量检测，第2份蛋白液中铯元素含量最高(20.04ppm，其他9份均在19ppm以下)，即将第2份蛋白液作为南极磷虾富铯蛋白。
对比例1：南极磷虾富硫蛋白的制备
1、南极磷虾总蛋白的稀酸提取方法
(1)将冷冻的新鲜南极磷虾解冻、去水后用高速组织粉碎机破碎。
(2)取20g鲜南极磷虾虾泥于烧杯中，加入0.1mol/L CH3COOH溶液，南极磷虾(W)和0.1mol/L CH3COOH溶液(V)以1：15的比例加入，磁力搅拌机搅拌80min。
(3)在数控超声清洗机中超声提取，条件为：25℃、250W、40kHz的条件下超声提取40min。
(4)用高速离心机离心后收集上清液，离心条件为：3000r/min，10min。
(5)40℃旋转蒸发至完全干燥，得南极磷虾水溶性的干蛋白粉。
经过经电感耦合等离子发射光谱法(ICP-5000)进行硫元素定性、定量检测，测得该干蛋白粉中硫的含量为40.3002ppm。
对比例2：南极磷虾富硫蛋白的制备
1、南极磷虾总蛋白的稀碱提取方法
(1)将冷冻的新鲜南极磷虾解冻、去水后用高速组织粉碎机破碎。
(2)取20g鲜南极磷虾虾泥于烧杯中，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液，南极磷虾(W)和0.1mol/L氢氧化钠溶液(V)以1：15的比例加入，磁力搅拌机搅拌80min。
(3)在数控超声清洗机中超声提取，条件为：25℃、250W、40kHz的条件下超声提取40min。
(4)用高速离心机离心后收集上清液，离心条件为：3000r/min，10min。
(5)40℃旋转蒸发至完全干燥，得南极磷虾水溶性的干蛋白粉。
经过经电感耦合等离子发射光谱法(ICP-5000)进行硫元素定性、定量检测，测得该干蛋白粉中硫的含量为34.3026ppm。
对比例3：南极磷虾富硫蛋白的制备
1、南极磷虾总蛋白的稀盐提取方法
(1)将冷冻的新鲜南极磷虾解冻、去水后用高速组织粉碎机破碎。
(2)取20g鲜南极磷虾虾泥于烧杯中，加入质量份数为1％的氯化钠溶液，南极磷虾(W)和1％的氯化钠溶液(V)以1：10-20的比例加入，磁力搅拌机搅拌80min。
(3)在数控超声清洗机中超声提取，条件为：25℃、250W、40kHz的条件下超声提取40min。
(4)用高速离心机离心后收集上清液，离心条件为：3000r/min，10min。
(5)40℃旋转蒸发至完全干燥，得南极磷虾水溶性的干蛋白粉。
经过经电感耦合等离子发射光谱法(ICP-5000)进行硫元素定性、定量检测，测得该干蛋白粉中硫的含量为15.5492ppm。
对比例4：南极磷虾富硫蛋白的制备
1、南极磷虾总蛋白的醇溶液提取方法
(1)将冷冻的新鲜南极磷虾解冻、去水后用高速组织粉碎机破碎。
(2)取20g鲜南极磷虾虾泥于烧杯中，加入体积份数为95％的乙醇溶液，南极磷虾(W)和95％的乙醇溶液(V)以1：15的比例加入，磁力搅拌机搅拌80min。
(3)在数控超声清洗机中超声提取，条件为：25℃、250W、40kHz的条件下超声提取40min。
(4)用高速离心机离心后收集上清液，离心条件为：3000r/min，10min。
(5)40℃旋转蒸发至完全干燥，得南极磷虾水溶性的干蛋白粉。
经过经电感耦合等离子发射光谱法(ICP-5000)进行硫元素定性、定量检测，测得该干蛋白粉中硫的含量为7.0660ppm。
以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种水溶液提取南极磷虾总蛋白的方法，其特征是，将南极磷虾的虾泥置于水中分散均匀获得混合液，再将混合液进行超声提取，然后将超声提取后的混合液中的沉淀去除，获得南极磷虾总蛋白。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是，步骤如下：
(1)将冷冻的新鲜南极磷虾解冻、去水后进行破碎获得鲜南极磷虾虾泥；
(2)取鲜南极磷虾虾泥，加入三蒸水，磁力搅拌；
(3)进行超声提取；
(4)进行离心后收集上清液；
(5)旋转蒸发至完全干燥，得南极磷虾水溶性的干蛋白粉。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是，步骤(1)中采用高速粉碎机进行破碎；
或，步骤(2)中，虾泥质量与三蒸水体积比为1:5～20；优选的，虾泥质量与三蒸水体积比为1:15；
或，步骤(3)中，超声提取的条件为：温度为20℃～40℃，功率为200～300W，频率30～40kHz，超声提取时间为10～120min；优选的，25℃、250W、40kHz的条件下超声提取40min；
或，步骤(4)中，离心条件为：转速为1000～5000r/min，时间为5～15min；优选的，离心条件为：3000r/min，10min；
或，步骤(5)中，旋转蒸发的温度为25～45℃；优选的，旋转蒸发的温度为40℃。
4.一种权利要求1～3任一所述的方法获得的南极磷虾总蛋白。
5.一种南极磷虾中富硫和/或富铯蛋白的制备方法，其特征是，包括权利要求1～3任一所述的方法，将南极磷虾总蛋白的干粉加入水放置在涡旋混合器上混合均匀，再通过离心分离除去滤渣收集上清液，然后以水为洗脱剂采用Sephadex G-75凝胶层析法对上清液进行分离纯化，获得若干份蛋白样品，通过电感耦合等离子发射光谱法进行若干份蛋白样品的硫元素或铯元素定性、定量检测，获取硫元素或铯元素含量最高的蛋白样品即为南极磷虾富硫蛋白或南极磷虾富铯蛋白。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征是，步骤如下：
<1>将南极磷虾总蛋白的干粉溶于三蒸水中，在涡旋混合器上混合均匀，混合液通过用高速离心机离心后出去滤渣收集上清液；
<2>以水为洗脱剂采用Sephadex G-75凝胶层析法对上清液进行洗脱，每隔一定量取一份标记，取一定量份数蛋白液后，分别旋转蒸发浓缩获得对应的蛋白粉；
<3>通过电感耦合等离子发射光谱法进行若干份蛋白粉的硫元素或铯元素定性、定量检测，获取硫元素或铯元素含量最高的蛋白粉对应的蛋白液，即为南极磷虾富硫蛋白或南极磷虾富铯蛋白。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征是，步骤<1>中，在涡旋混合器上混合1～5min，混合液通过用高速离心机1000～5000r/min，离心1～10min后除去滤渣收集上清液；优选的，在涡旋混合器上混合2min，混合液通过用高速离心机3000r/min，离心5min后除去滤渣收集的上清液。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征是，步骤<2>中，Sephadex G-75凝胶层析法的制备色谱柱的方法为：
<2-1>将Sephadex G-75干粉加入至洗脱剂中，吸水溶胀，获得凝胶溶液；
<2-2>将凝胶溶液加入至柱管中，自然沉降，凝胶沉集后，将溶剂放出，同时通过加入溶剂使柱床稳定；
优选的，步骤<2-1>中，采用沸水浴进行溶胀；
优选的，步骤<2-1>中，溶胀比为1:15～20；
优选的，步骤<2-2>中，加入2～3倍柱床体积的溶剂使柱床稳定。
9.如权利要求6所述的制备方法，其特征是，步骤<2>中，向Sephadex G-75凝胶色谱柱中加样的过程为：将上清液加到Sephadex G-75凝胶色谱柱上，打开凝胶色谱柱底部管夹，使上清液流入柱内，控制上清液加入量和流速；
或，上清液的加入量为1～3mL，流速为2～5mL/10min；优选的，上清液的加入量为2mL，流速为3mL/10min；
或，步骤<3>中，每隔30～50mL取一份作为一份蛋白液，取8～20份蛋白液后，分别旋转蒸发浓缩；优选的，每隔50mL取一份作为一份蛋白液，取10份。
10.一种权利要求5～9任一所述的制备方法获得的南极磷虾富硫蛋白或南极磷虾富铯蛋白。
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