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CN110218776A - Pcr油相组合物及其制备方法 - Google Patents

Pcr油相组合物及其制备方法 Download PDF

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CN110218776A CN201910517591.2A CN201910517591A CN110218776A CN 110218776 A CN110218776 A CN 110218776A CN 201910517591 A CN201910517591 A CN 201910517591A CN 110218776 A CN110218776 A CN 110218776A
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胡佳
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Suzhou Tianhe Youcai Biotechnology Co.,Ltd.
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Suzhou Diadian Biological Technology Co Ltd
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

本发明公开了一种PCR油相组合物，包括以下体积份组分：氟化油、矿物油、聚氧乙烯月桂醚、三聚甘油单硬脂酸酯、双乙酰酒石酸单双甘油酯、大豆磷脂、聚乙二醇、D‑海藻糖、月桂醇聚氧乙烯醚琥珀酸单酯。具有静置稳定性和热循环稳定性良好的有益效果。公开了一种PCR油相组合物的制备方法，包括：将氟化油和矿物油混合均匀；加入聚氧乙烯月桂醚、三聚甘油单硬脂酸酯、双乙酰酒石酸单双甘油酯、大豆磷脂混合均匀，得第一混合液；将聚乙二醇、D‑海藻糖、月桂醇聚氧乙烯醚琥珀酸单酯混合均匀，加入至第一混合液中混合均匀，然后冷却，超声处理，冷却，超声处理，冷冻，超声处理，制备的油相组合物的耐热变化性能良好。

Description

PCR油相组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一种PCR油相组合物及其制备方法。
背景技术
微滴式数字PCR系统结合了油包水乳化微滴技术与微流体技术，将每个样品生成数万个均一的纳升级微滴，目的片段和背景序列在微滴中随机分布，每个微滴都是一个独立的PCR反应器，完成PCR扩增后，微滴分析仪对微滴逐个进行荧光检测。微滴生成油的是制备油包水微滴的核心试剂，生成的微滴的稳定性，尤其是热循环稳定性是扩增的关键技术，因此，提供一种热循环稳定的油相组合物是值得本领域技术人员思量的。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种PCR油相组合物，生成的微滴静置稳定性和热循环稳定性均良好，提供了一种PCR油相组合物的制备方法，可以提升油相组合物的耐热变化性能。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种PCR油相组合物，包括以下体积份组分：氟化油、矿物油、聚氧乙烯月桂醚、三聚甘油单硬脂酸酯、双乙酰酒石酸单双甘油酯、大豆磷脂、聚乙二醇、D-海藻糖、月桂醇聚氧乙烯醚琥珀酸单酯，其中，氟化油与矿物油的质量比为5～6:1，氟化油和矿物油的总质量占油相组合物总质量的88～95％。
优选的是，氟化油为聚全氟异丙醚油或氟氯碳油。
优选的是，聚乙二醇的平均分子量为400或1450。
优选的是，聚氧乙烯月桂醚、三聚甘油单硬脂酸酯、双乙酰酒石酸单双甘油酯、大豆磷脂的质量比为1:0.05:0.2:0.1。
优选的是，聚乙二醇、D-海藻糖、月桂醇聚氧乙烯醚琥珀酸单酯的质量比为1:0.5:0.2。
提供一种PCR油相组合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将氟化油和矿物油置于45℃下振荡混合均匀；
步骤二、然后加入聚氧乙烯月桂醚、三聚甘油单硬脂酸酯、双乙酰酒石酸单双甘油酯、大豆磷脂混合，置于60℃下超声处理，直至混合均匀，得第一混合液；
步骤三、将聚乙二醇、D-海藻糖、月桂醇聚氧乙烯醚琥珀酸单酯混合，置于80℃下超声处理，直至混合均匀，然后加入至步骤二中的第一混合液中，置于60℃下超声处理，直至混合均匀，然后置于10℃下冷却1h，再置于45℃下超声处理40min，然后置于0℃下冷却1h，再置于45℃下超声处理40min，然后置于-18℃下冷冻30min，再置于45℃下超声处理40min，即得油相组合物。
优选的是，超声处理的频率均为80kHz。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、PCR油相组合物，生成的微滴静置稳定性和热循环稳定性均良好。
第二、经过反复多次冷却、热处理、冷冻的处理后，可以提升油相组合物的耐热变化性能。
第三、可应用于单细胞检测实验，经过一天时间使用显微镜观察，细胞存活于液滴中心，而没有附着于液滴表面。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为实施例3制备的油相组合物所制的微滴在未静置的形态图；
图2为实施例4制备的油相组合物所制的微滴在未静置的形态图；
图3为实施例3制备的油相组合物所制的微滴在静置7天后的形态图；
图4为实施例4制备的油相组合物所制的微滴在静置7天后的形态图；
图5为实施例3制备的油相组合物所制的微滴在热循环后的形态图；
图6为实施例4制备的油相组合物所制的微滴在热循环后的形态图；
图7为实施例4制备的油相组合物在微流控芯片中形成油包水微滴静置24h后的细胞形态图；
图8为实施例3制备的油相组合物生成的微滴快速升降温后的形态图；
图9为对比例1制备的油相组合物生成的微滴快速升降温后的形态图；
图10为实施例4制备的油相组合物生成的微滴快速升降温后的形态图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
<实施例1>
PCR油相组合物，包括以下体积份组分：氟化油、矿物油、聚氧乙烯月桂醚、三聚甘油单硬脂酸酯、双乙酰酒石酸单双甘油酯、大豆磷脂、聚乙二醇、D-海藻糖、月桂醇聚氧乙烯醚琥珀酸单酯，其中，氟化油与矿物油的质量比为5:1，氟化油和矿物油的总质量占油相组合物总质量的88％。
其中，氟化油为聚全氟异丙醚油。
聚乙二醇的平均分子量为400。
聚氧乙烯月桂醚、三聚甘油单硬脂酸酯、双乙酰酒石酸单双甘油酯、大豆磷脂的质量比为1:0.05:0.2:0.1。
聚乙二醇、D-海藻糖、月桂醇聚氧乙烯醚琥珀酸单酯的质量比为1:0.5:0.2。
将氟化油、矿物油、聚氧乙烯月桂醚、三聚甘油单硬脂酸酯、双乙酰酒石酸单双甘油酯、大豆磷脂、聚乙二醇、D-海藻糖、月桂醇聚氧乙烯醚琥珀酸单酯混合均匀，即得PCR油相组合物。
<实施例2>
PCR油相组合物，包括以下体积份组分：氟化油、矿物油、聚氧乙烯月桂醚、三聚甘油单硬脂酸酯、双乙酰酒石酸单双甘油酯、大豆磷脂、聚乙二醇、D-海藻糖、月桂醇聚氧乙烯醚琥珀酸单酯，其中，氟化油与矿物油的质量比为6:1，氟化油和矿物油的总质量占油相组合物总质量的95％。
其中，氟化油为氟氯碳油。
聚乙二醇的平均分子量为1450。
聚氧乙烯月桂醚、三聚甘油单硬脂酸酯、双乙酰酒石酸单双甘油酯、大豆磷脂的质量比为1:0.05:0.2:0.1。
聚乙二醇、D-海藻糖、月桂醇聚氧乙烯醚琥珀酸单酯的质量比为1:0.5:0.2。
将氟化油、矿物油、聚氧乙烯月桂醚、三聚甘油单硬脂酸酯、双乙酰酒石酸单双甘油酯、大豆磷脂、聚乙二醇、D-海藻糖、月桂醇聚氧乙烯醚琥珀酸单酯混合均匀，即得PCR油相组合物。
<实施例3>
PCR油相组合物，包括以下体积份组分：氟化油、矿物油、聚氧乙烯月桂醚、三聚甘油单硬脂酸酯、双乙酰酒石酸单双甘油酯、大豆磷脂、聚乙二醇、D-海藻糖、月桂醇聚氧乙烯醚琥珀酸单酯，其中，氟化油与矿物油的质量比为5.5:1，氟化油和矿物油的总质量占油相组合物总质量的90％。
其中，氟化油为聚全氟异丙醚油。
聚乙二醇的平均分子量为400。
聚氧乙烯月桂醚、三聚甘油单硬脂酸酯、双乙酰酒石酸单双甘油酯、大豆磷脂的质量比为1:0.05:0.2:0.1。
聚乙二醇、D-海藻糖、月桂醇聚氧乙烯醚琥珀酸单酯的质量比为1:0.5:0.2。
将氟化油、矿物油、聚氧乙烯月桂醚、三聚甘油单硬脂酸酯、双乙酰酒石酸单双甘油酯、大豆磷脂、聚乙二醇、D-海藻糖、月桂醇聚氧乙烯醚琥珀酸单酯混合均匀，即得PCR油相组合物。
<实施例4>
PCR油相组合物，包括以下体积份组分：氟化油、矿物油、聚氧乙烯月桂醚、三聚甘油单硬脂酸酯、双乙酰酒石酸单双甘油酯、大豆磷脂、聚乙二醇、D-海藻糖、月桂醇聚氧乙烯醚琥珀酸单酯，其中，氟化油与矿物油的质量比为5.5:1，氟化油和矿物油的总质量占油相组合物总质量的90％。
其中，氟化油为聚全氟异丙醚油。
聚乙二醇的平均分子量为400。
聚氧乙烯月桂醚、三聚甘油单硬脂酸酯、双乙酰酒石酸单双甘油酯、大豆磷脂的质量比为1:0.05:0.2:0.1。
聚乙二醇、D-海藻糖、月桂醇聚氧乙烯醚琥珀酸单酯的质量比为1:0.5:0.2。
PCR油相组合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将氟化油和矿物油置于45℃下振荡混合均匀；
步骤二、然后加入聚氧乙烯月桂醚、三聚甘油单硬脂酸酯、双乙酰酒石酸单双甘油酯、大豆磷脂混合，置于60℃下超声处理，直至混合均匀，得第一混合液；
步骤三、将聚乙二醇、D-海藻糖、月桂醇聚氧乙烯醚琥珀酸单酯混合，置于80℃下超声处理，直至混合均匀，然后加入至步骤二中的第一混合液中，置于60℃下超声处理，直至混合均匀，然后置于10℃下冷却1h，再置于45℃下超声处理40min，然后置于0℃下冷却1h，再置于45℃下超声处理40min，然后置于-18℃下冷冻30min，再置于45℃下超声处理40min，即得油相组合物。
其中，超声处理的频率均为80kHz。
<对比例1>
PCR油相组合物的制备方法同实施例4，其中，步骤三不同，步骤三具体为：将聚乙二醇、D-海藻糖、月桂醇聚氧乙烯醚琥珀酸单酯混合，置于80℃下超声处理，直至混合均匀，然后加入至步骤二中的第一混合液中，置于60℃下超声处理，直至混合均匀，即得油相组合物。
其中，超声处理的频率均为80kHz。
<PCR油相组合物应用试验>
实验材料：
噬菌体λDNA模板(Fermentas)，引物探针(上海生工)；探针(thermo合成)QX200微滴式数字PCR系统(Bio-Rad)，Master cycler nexus gradient PCR仪(Eppendorf)；预混液，微滴检测油(Bio-Rad)，微滴生成卡(Bio-Rad)。
引物序列：
λDNA-F：CCCAGCAACAGCACAACCC
λDNA-R：GCCGCAGCGTAACTATTACTAATG
探针序列：6-FAM---ACTGAGCCGTAGCCACTGTCTGTCCT--BHQ1
水相组合物包括下表所示物质组成：
表1水相组合物
组分 终浓度 20ul反应体系所需加入量
双蒸水 补齐至20ul 补齐至20ul
预混液 15ul
正向引物 300-700nM 0.6ul
反向引物 300-700nM 0.6ul
探针 100-400nM 0.3ul
DNA模板 适量 适量
试验1、静置稳定性试验
将微滴生成卡放入微滴生成卡卡座，向中间一排细孔中每孔加入20ul水相组合物；将实施例1～4制备的油相组合物70ul每孔加入生成卡最下面一排；在卡座上装好密封垫后，放入微滴生成仪，生生微滴。
将微滴进行液滴静置稳定性的测试，使用生成后立即取样的液滴不放置和放置7天后的微滴进行对比，图1和图2分别为实施例3和4制备的油相组合物所制的微滴在未静置的形态图，图3和图4分别为实施例3和4制备的油相组合物所制的微滴在静置7天后的形态图，在显微镜可以观察到放置前后几乎没有区别，微滴均呈现蜂巢式均一性排布，可以说明本发明的油相组合物所制的液滴具备良好的静置稳定性能。
2、扩增热循环稳定性试验
将微滴生成卡放入微滴生成卡卡座，向中间一排细孔中每孔加入20ul水相组合物；将将实施例3和实施例4制备的油相组合物70ul每孔加入生成卡最下面一排；在卡座上装好密封垫后，放入微滴生成仪，生生微滴；
PCR扩增：
上述每一个步骤PCR仪升降温速率需调至1℃/s。
图5和图6分别是实施例3和4制备的油相组合物所制的微滴在热循环后的形态图，显微镜下观察到微滴形态在PCR扩增热循环前后基本保持一致。经过40轮热循环后，其均一性状态依然保持良好，仍然呈现蜂窝形貌。说明本发明的油相组合物所制的液滴具备良好的热循环稳定性能。
试验3、微滴单细胞包裹试验
如图7所示，采用CHO细胞培养基作为分散相，与实施例4制备的油相组合物在微流控芯片中形成油包水微滴。经过一天时间使用显微镜观察，细胞存活于液滴中心，并没有附着于液滴表面，可以实现单细胞检测实验。
试验4、升降温速度对微滴稳定性的影响
采用实施例3、实施例4、对比例1制备的油相组合物，采用微滴PCR仪生成微滴，PCR扩增时，升降温速度为5℃/s，检测扩增热循环40次后微滴的形态，图8、图9、图10分别为实施例3、实施例4、对比例1制备的油相组合物生成的微滴的形态图，从图中可以看出，实施例3和对比例1的微滴形态均有不同呈度的破裂，合并，而实施例4的微滴形态保持良好，说明油相组合物经过反复多次冷却、热处理、冷冻的处理后，其耐热变化的性能显著提升。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例和实施例。

Claims (7)

1.PCR油相组合物，其特征在于，包括以下体积份组分：氟化油、矿物油、聚氧乙烯月桂醚、三聚甘油单硬脂酸酯、双乙酰酒石酸单双甘油酯、大豆磷脂、聚乙二醇、D-海藻糖、月桂醇聚氧乙烯醚琥珀酸单酯，其中，氟化油与矿物油的质量比为5～6:1，氟化油和矿物油的总质量占油相组合物总质量的88～95％。
2.如权利要求1所述的PCR油相组合物，其特征在于，氟化油为聚全氟异丙醚油或氟氯碳油。
3.如权利要求1所述的PCR油相组合物，其特征在于，聚乙二醇的平均分子量为400或1450。
4.如权利要求1所述的PCR油相组合物，其特征在于，聚氧乙烯月桂醚、三聚甘油单硬脂酸酯、双乙酰酒石酸单双甘油酯、大豆磷脂的质量比为1:0.05:0.2:0.1。
5.如权利要求1所述的PCR油相组合物，其特征在于，聚乙二醇、D-海藻糖、月桂醇聚氧乙烯醚琥珀酸单酯的质量比为1:0.5:0.2。
6.如权利要求1～5任一项所述的PCR油相组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将氟化油和矿物油置于45℃下振荡混合均匀；
步骤二、然后加入聚氧乙烯月桂醚、三聚甘油单硬脂酸酯、双乙酰酒石酸单双甘油酯、大豆磷脂混合，置于60℃下超声处理，直至混合均匀，得第一混合液；
步骤三、将聚乙二醇、D-海藻糖、月桂醇聚氧乙烯醚琥珀酸单酯混合，置于80℃下超声处理，直至混合均匀，然后加入至步骤二中的第一混合液中，置于60℃下超声处理，直至混合均匀，然后置于10℃下冷却1h，再置于45℃下超声处理40min，然后置于0℃下冷却1h，再置于45℃下超声处理40min，然后置于-18℃下冷冻30min，再置于45℃下超声处理40min，即得油相组合物。
7.如权利要求6所述的PCR油相组合物的制备方法，其特征在于，超声处理的频率均为80kHz。
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