CN110179786A

CN110179786A - 高良姜素或其盐在制备防治肺纤维化的药品或保健品中的用途

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Publication number: CN110179786A
Application number: CN201910502116.8A
Authority: CN
Inventors: 阴文娅; 叶庭洪; 王礼群; 刘红垚; 张倩钰; 李亚丽; 甘彩玲
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2019-06-11
Filing date: 2019-06-11
Publication date: 2019-08-30

Abstract

本发明涉及高良姜素或其盐在制备防治肺纤维化的药品或保健品中的用途，属于医药领域。为解决肺纤维化现有治疗药物疗效不佳、病人依从性差的问题，本发明提供了高良姜素或其盐在制备防治肺纤维化的药品或保健品中的用途。体内外实验证明，高良姜素对肺纤维化能够发挥确切的治疗作用，而且对人正常肝细胞的毒性较小，安全性良好。本发明的应用将有助于为肺纤维化患者提供一种疗效好、毒性低、价格低廉的药品或保健品，具有显著的临床和社会意义。

Description

高良姜素或其盐在制备防治肺纤维化的药品或保健品中的用途

技术领域

本发明涉及高良姜素或其盐在制备防治肺纤维化的药品或保健品中的用途，属于医药领域。

背景技术

肺纤维化(lung fibrosis)是一种慢性的、进展性的肺损伤或肺病至晚期的结果。其病理特征为成纤维细胞大量增殖，肺组织中细胞外基质积累同时伴随炎症损伤，肺泡结构被破坏，组织损伤后被异常修复导致瘢痕形成，从而使得肺部与外界气体交换受阻，最终导致呼吸衰竭和死亡。肺纤维化的临床症状主要表现为呼吸困难、低血氧症以及干咳等。随着人类生存环境的恶化、污染等因素，肺纤维化的发病率随着时间的推移而增加，且其预后性差，诊断后平均生存期短，死亡率较高。

肺纤维化的发病机制目前尚不清楚，可由包括吸烟、环境、药物等在内的多种因素引起，这些因素导致炎症反应和氧化损伤，破坏肺泡基底细胞的正常结构，同时释放出一系列的细胞因子，刺激成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化和增殖，胶原沉积以及细胞外基质大量形成，最终导致不可逆转的肺纤维化。

目前针对肺纤维化的临床药物主要为吡非尼酮和尼达尼布，但其治疗效果和安全性存在争议，且并未改善疾病预后。传统的治疗方式主要是抑制炎症，但长期使用糖皮质激素、免疫抑制剂、环磷酰胺等药物会导致肝肾损伤，致使机体免疫力下降，并且可能诱发新的病灶或其它疾病，增加呼吸衰竭的风险，甚至引起严重的继发性感染导致死亡。因此，迫切需要寻找新的肺纤维化防治药物。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供高良姜素或其盐在制备防治肺纤维化的药品或保健品中的用途。

本发明提供了高良姜素或其盐在制备防治肺纤维化的药品或保健品中的用途。

进一步地，所述的肺纤维化是化学品导致的肺纤维化。

优选地，所述的肺纤维化是博来霉素导致的肺纤维化。

进一步地，所述的药品或保健品降低肺组织中纤维化相关蛋白MMP-9、Vimentin、α-SMA的表达。

进一步地，高良姜素或其盐治疗C57BL/6肺纤维化的剂量为25～50mg/kg。

进一步地，所述的药品或保健品抑制成纤维细胞、肺泡基底上皮细胞增殖。

进一步地，所述的药品或保健品抑制上皮间质转化。

进一步地，所述的药品或保健品降低肺泡基底上皮细胞中上皮间质转化相关蛋白α-SMA、Vimentin的表达，上调E-cadherin的表达。

进一步地，所述的药品或保健品是以高良姜素或其盐为活性成分，加入药学或保健品中可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

进一步地，所述的药品或保健品中高良姜素或其盐为唯一活性成分。

进一步地，所述的制剂是口服制剂、注射制剂或气溶胶剂。

本发明通过建立体内外模型证实了高良姜素能够对肺纤维化发挥确切的治疗作用，而且对人正常肝细胞的毒性较小，安全性良好。高良姜素是药食同源植物高良姜根茎中的主要生物活性物质，其来源广泛、成本低。本发明的应用将有助于为肺纤维化患者提供一种疗效好、毒性低、价格低廉的药品或保健品，具有显著的临床和社会意义。

附图说明

图1为实施例1中小鼠胚胎成纤维细胞生存率图；

图2为实施例1中胰癌人类肺泡基底上皮细胞生存率图；

图3为实施例1高良姜素对TGF-β1刺激A549细胞的形态变化影响图；

图4为实施例1中高良姜素对TGF-β1刺激A549细胞的上皮间质转化相关蛋白的表达影响图；

图5为实施例2中高良姜素治疗14天小鼠肺组织纤维化相关蛋白的表达变化图；

图6为实施例2中高良姜素治疗14天对小鼠肺部病理及胶原沉积变化的影响图；

图7为实施例3中人正常肝细胞生存率图。

具体实施方式

高良姜素(Galangin)主要存在于蜂胶以及姜科植物高良姜(Alpiniaofficinarum Hance)中，是一种天然生物黄酮，其结构式如下：

已知高良姜素具有镇痛消炎、抗菌抗肿瘤的生物活性，对黑色素瘤和胃癌有较好的防治作用。本发明则证实了高良姜素还具有防治肺纤维化的作用。通过构建体外模型证明，高良姜素能以浓度和时间依赖的方式抑制小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)、胰癌人类肺泡基底上皮细胞(A549)的增殖，能够显著改善TGF-β1刺激所导致的胰癌人类肺泡基底上皮细胞(A549)上皮间质转化相关蛋白的表达变化，使得α-SMA，Vimentin的表达降低，E-Cadherin的表达增加。动物实验进一步证明，高良姜素能够显著改善肺纤维化小鼠肺部的病变范围，减轻肺实质结构的破坏，对肺纤维化具有确切的治疗作用。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1高良姜素防治肺纤维化的体外细胞实验

小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)、胰癌人类肺泡基底上皮细胞(A549)的过度增殖会造成胶原的沉积，因此，抑制它们的增殖可抑制胶原的表达和沉积。

在肺纤维化的过程中，TGF-β是主要的纤维化因子，可在体外促进上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)，抑制成纤维细胞的凋亡，促进活性氧的产生；体内研究也表明，TGF-β的大量释放会加速肺纤维化的进程。A549被TGF-β1刺激后会加速上皮间质转化(EMT)的过程，进而加速肺纤维化的形成，因此，抑制EMT的转化可以降低肺纤维化的形成。

本实验从以上两个方面来证实高良姜素防治肺纤维化的作用。

1、细胞培养

小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)、胰癌人类肺泡基底上皮细胞(A549)用含有10％小牛血清的DMEM高糖培养基培养，细胞培养及实验过程中培养基中加入100U/mL的青霉素和链霉素，培养在37℃，5％CO₂的孵箱中。

2、MTT法检测高良姜素对两种细胞增殖的影响

取平板中对数生长期的细胞，消化后进行计数，铺96孔板，正常培养。选取对数生长期且状态良好的细胞，根据细胞的生长速度接种96孔板，每孔100μL，细胞个数约为1500-4000个，正常培养。接种第二天，每孔加入用培养基稀释的高良姜素，使其终浓度为0μmol/L、6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L，每个浓度5个复孔，放置于37℃，5％CO₂的孵箱中分别培养24、48、72h。然后每孔加入5mg/mL的MTT储备液20μL，放入孵箱中再培养2-4h，从边缘轻轻吸走孔中的细胞上清液，每孔加入150μL的DMSO，放置在水平摇床上以150r/min的速度摇晃10min，然后用酶标仪测定570nm处的OD值。实验重复三次，整理数据，根据吸光度值计算高良姜素的浓度与生长抑制率。实验结果见图1、图2。

从图1可以看出，高良姜素能以浓度和时间依赖的方式抑制小鼠胚胎肺成纤维细胞(NIH3T3)的增殖。

从图2可以看出，高良姜素能以浓度和时间依赖的方式抑制胰癌人类肺泡基底上皮细胞(A549)增殖。

3、测定高良姜素对TGF-β1刺激后胰癌人类肺泡基底上皮细胞(A549)形态变化的影响

取对数生长的细胞，消化后收集细胞，弃去上清液，加入新鲜培养基后吹打混匀，测定细胞密度并均匀的接种于6孔板，每孔2mL细胞悬液，密度为接种48h后对照孔能长满为宜。接种24h后，用无血清的培养基饥饿6h，然后用含有5ng/mL TGF-β1的完全新鲜培养基刺激，1h后加入50μM的高良姜素继续培养。加样24h后，取出6孔板，用倒置显微镜白光观察细胞形态变化。

从图3可以看出，TGF-β1刺激使得胰癌人类肺泡基底上皮细胞(A549)形态发生变化，从短梭状变为长梭型，而高良姜素可以抑制A549细胞的形态变化。

4、检测高良姜素对TGF-β1刺激后胰癌人类肺泡基底上皮细胞(A549)的EMT转化蛋白表达的影响

取对数生长期的细胞，进行细胞传代，传代的细胞密度以对照组48h后长到80％-90％为宜，分为4皿。24h后，用无血清的培养基饥饿6h，加入含有5ng/mL TGF-β1的完全新鲜培养基刺激，1h后加入50μM的高良姜素干预然后继续放入培养箱培养。干预24h后，取出培养皿，置于冰上10min，弃去上清液，用预冷的PBS轻轻洗两遍，然后每皿加入1mL PBS，用细胞刮收集皿中的细胞。4℃，3000rpm/min离心3min，沉淀再用预冷的PBS洗涤2次，然后充分将上清液吸干，加入适量的RIPA裂解液，用移液枪吹打混匀，使裂解液与细胞充分接触，裂解细胞，每隔15min涡旋一次，裂解60min。然后超声辅助裂解使得蛋白裂解液澄清透明。然后4℃，13500rpm/min离心15min，取上清液，用Bradford法进行蛋白定量，加入5×SDS上样缓冲液，100℃加热5-10min使蛋白变性，放入-20℃保存。按照目的蛋白的大小，根据SDS-PAGE凝胶试剂盒的步骤，配制相应的凝胶。每孔上样量为40μg，80V，400mA跑上层胶，100V，400mA跑下层胶，当样品跑到下层分离胶底部时可停止电泳。电泳结束后，将与分离胶大小相当的PVDF膜放入甲醇活化45s左右，然后放入转膜缓冲液中，将凝胶和PVDF膜按照(白面)海绵→3张滤纸→PVDF膜→凝胶→3张滤纸→海绵(黑面)的顺序制成转膜“三明治”结构，排除各层之间的气泡，并迅速插入转膜夹中，电压100V进行转膜，转膜时间由目的蛋白分子量大小决定。转膜结束后，将膜放入封闭缓冲液中，室温封闭1h。封闭过后的膜用TBST洗膜液洗3～5min，然后根据抗体说明书用一抗稀释液将一抗稀释至合适的浓度，把膜放入稀释过后的一抗中，4℃孵育过夜。之后将膜取出置于水平摇床上，用TBST洗膜液洗5次，每次10min，用封闭液稀释二抗，37℃孵育膜1h。取出膜，TBST中洗3-4次，每次10min，将显影液均匀滴加到PVDF膜上，在曝光仪中曝光。

从图4可以看出，TGF-β1刺激使得胰癌人类肺泡基底上皮细胞(A549)上皮间质转化相关蛋白表达变化，上调α-SMA、Vimentin的表达，抑制E-cadherin的表达，而高良姜素可以改善这种变化。

实施例2高良姜素防治博来霉素诱导肺纤维化的体内动物实验

博来霉素(Bleomycin,BLM)是一种抗鳞癌的药物，但会导致肺纤维化。支气管滴注博来霉素后，Ⅰ型肺泡上皮细胞受到炎症损伤分泌促炎因子，在第2天即可观察到Ⅱ型上皮细胞的增殖和分化，肌成纤维细胞被募集，合成胶原蛋白并造成细胞外基质积累，造成组织及间质纤维化。这与人类弥漫性肺纤维化或纤维化肺泡炎的诱导一致，表明博来霉素诱导的损伤可以为这种病因及致病机制不明的疾病提供合适的模型。基于此，本实验建立C57BL/6小鼠博来霉素诱导肺纤维化模型(CNV)，评价高良姜素在体内治疗肺纤维化的作用。

(1)麻醉：10％水合氯醛，按小鼠体重5mL/kg腹腔注射给药。

(2)实验准备：注射器，手术器械及缝合线，碘伏，2mg/kg博来霉素，生理盐水，酒精棉。

(3)实验步骤及注意事项：

1)腹腔注射麻醉小鼠。

2)小鼠麻醉成功后，用无菌器械剪开其颈部皮肤，暴露出支气管，注意不能破坏小鼠血管等其他重要组织。

3)找到其支气管后，用注射器注入2mg/kg/10mL博来霉素，注意不要漏出，缓慢注射所有博来霉素后再缓慢拔出针尖，然后双手提起小鼠前肢，上下左右均匀摇晃，使博来霉素均匀分布在其肺部。

4)然后用手术缝合线将剪开的颈部皮肤缝合，并喷以碘伏消毒。

5)造模完成后，将小鼠平放于干净笼具内复苏，头部稍仰起，注意保暖，观察小鼠心跳、呼吸情况，防止窒息。

(4)应用博来霉素模型对高良姜素抗肺纤维化效果进行评估。

1)实验分组：博来霉素模型组、高良姜素正常对照组，高良姜素剂量组(50、25mg/kg)以及假手术组。

2)给药途径：经口灌胃给药，模型组为建模后给予同等剂量的溶剂，正常对照组小鼠给予与高剂量组同等剂量的高良姜素，假手术组以同等体积的生理盐水造模，给予与等体积的溶剂。

3)给药时间：造模24h后开始给药，高良姜素25mg/kg/只/天，50mg/kg/只/天，连续给药14天。

4)评价指标：在给药14天后，观察小鼠状态，称重并处死后，取肺组织浸泡于福尔马林中。后将肺组织石蜡包埋并，切片。用蛋白印迹法测定小鼠肺组织中纤维化相关蛋白表达的变化；用HE染色和Masson染色来评价小鼠的组织病理结构和胶原沉积状况。

如图5所示，蛋白印迹法结果显示，高良姜素可以抑制肺组织中纤维化相关蛋白MMP-9、α-SMA和Vimentin的表达。

如图6所示，H&E染色结果显示，假手术组及正常组小鼠肺组织结构完整清晰，肺泡壁未见增厚，肺泡腔透亮，腔内未见明显渗出，无炎性细胞浸润，无成纤维细胞增生。模型组小鼠肺泡结构破坏，肺泡间隔增宽，大量炎性细胞浸润及成纤维细胞增生，肺纤维化形成。高良姜素的各给药组与模型组比较情况好转，病变范围明显减少，肺实质结构破坏较少。Masson染色结果显示，假手术组及正常对照组小鼠肺组织结构正常，纤维化模型组小鼠在肺泡间隔、肺泡壁，以及终末细支气管、呼吸性细支气管和小支气管管壁周围均可见到大量増生的蓝色胶原纤维，高良姜素各剂量组与模型组相比纤维化程度轻，胶原总含量较少。

以上实验结果表明，高良姜素有减轻胶原纤维增生，改善肺间质纤维化的作用。

实施例3高良姜素的体外安全性评价

1.细胞的培养

人正常肝细胞(LO₂)用含10％FBS DMEM高糖培养基培养，在培养和实验过程中均需要加入100U/mL的青霉素和链霉素，培养在环境条件为37℃、5％CO₂的孵箱中。

2.MTT法检测高良姜素对人正常肝细胞(LO₂)增殖的影响

选取对数期生长状态良好的细胞，根据细胞生长速度接种96孔板，每孔约1500-2000个细胞，每孔100μL，在37℃、5％CO₂培养箱培养。接种第二天，每孔加入100μL用新鲜培养基配制的高良姜素稀释液，使其终浓度为0μmol/L、6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L，相同浓度设置5个复孔，于37℃、5％CO₂培养箱分别培养24，48，72h后，每孔中加入MTT储存液20μL放入培养箱培养2-4h，轻轻吸走细胞上清液，每孔加入150μL的DMSO，放置在水平摇床上150r/min摇晃5min，酶标仪于570nm处测定OD值。实验重复三次，整理数据，根据吸光度值得出的生长抑制率以及高良姜素浓度。

如图7所示，在48h内，50μM的高良姜素对人正常肝细胞(LO₂)无明显的增殖抑制作用，在72h时，对人正常肝细胞有一定的抑制作用，但其毒性明显小于实施例中的其它细胞。

需要说明的是，本说明书中描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例以及不同实施例的特征进行结合和组合。

Claims

1.高良姜素或其盐在制备防治肺纤维化的药品或保健品中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征是：所述的肺纤维化是化学品导致的肺纤维化；优选地，所述的肺纤维化是博来霉素导致的肺纤维化。

3.如权利要求1或2所述的用途，其特征是：所述的药品或保健品降低肺组织中纤维化相关蛋白MMP-9、Vimentin、α-SMA的表达。

4.如权利要求1～3任意一项所述的用途，其特征是：高良姜素或其盐治疗C57BL/6肺纤维化的剂量为25～50mg/kg。

5.如权利要求1所述的用途，其特征是：所述的药品或保健品抑制成纤维细胞、肺泡基底上皮细胞增殖。

6.如权利要求1所述的用途，其特征是：所述的药品或保健品抑制上皮间质转化。

7.如权利要求6所述的用途，其特征是：所述的药品或保健品降低肺泡基底上皮细胞中上皮间质转化相关蛋白α-SMA、Vimentin的表达，上调E-cadherin的表达。

8.如权利要求1～7任意一项所述的用途，其特征是：所述的药品或保健品是以高良姜素或其盐为活性成分，加入药学或保健品中可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

9.如权利要求8所述的用途，其特征是：所述的药品或保健品中高良姜素或其盐为唯一活性成分。

10.如权利要求8所述的用途，其特征是：所述的制剂是口服制剂、注射制剂或气溶胶剂。