CN110172504A - 一种外源基因的检测方法与试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种外源基因的检测方法与试剂盒，属于生物检测领域。所述检测方法包括：确定待测样品中需要检测的外源基因和待测样品中的内源标准基因；根据外源基因的人工序列、外源基因的边界序列或内源标准基因的序列制备杂交探针；提取并纯化待测样品的基因组DNA和质控样品的基因组DNA并分别进行片段化；在待测样品DNA片段和质控样品DNA片段上分别连接上接头序列；利用模板片段和外源基因的特征片段对待测样品中的外源基因进行检测，判定外源基因是否存在于待测样品中。该方法能够避免因微生物感染、气溶胶污染造成的假阳性结果，还能够避免因PCR扩增效率等因素导致的定量不准确的问题。

Description

一种外源基因的检测方法与试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及一种外源基因的检测方法与试剂盒。

背景技术

转基因作物的商业化开发出现在1996年，随着生物技术的发展，转基因植物产品的种类逐年增加。根据国际农业生物技术应用服务组织(International Service for theAcquisition of Agri-biotech Applications，ISAAA)的报告，截止到2013年，全世界已经有27种转基因作物类型和336种转基因作物品种被开发出来，在这27年中，全球转基因作物种植面积达到1.75亿公顷。在中国，截止到 2015年，已经有37种转基因作物被批准进口，并用作加工原料。在中国在内的许多国家中，因为政府和公众担心转基因产品的食品安全或环境安全，对转基因产品持有不信任的态度。为了保护公众的知情权，中国在内的许多国家均通过立法对转基因产品中的转基因食品与饲料进行管制和跟踪。为了适应转基因产品立法要求和确保产品的合法与可追踪，有效且精准的转基因筛选、鉴定和定量方法是十分必要的。

目前用于检测外源基因的方法基本上是通过一次转基因事件来确认外源基因是否存在，例如，以cryIAb基因上的序列和水稻上的序列为组合的引物进行 PCR(PolymeraseChain Reaction，聚合酶链式反应)扩增，若有扩增产物，则证明有cryIAb基因与水稻序列的连接产物，从而确认存在外源基因cryIAb。

在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：

但当cryIAb转到另一种水稻品种或玉米品种中时，就得根据cryIAb在新的转基因事件中连接的新的水稻品种或玉米品种的基因组序列设计新的引物组合来进行检测新的转基因事件，新的转基因事件层出不穷，这意味着要设计无数种引物组合进行检测，这工作量是极大的。同时，若新的转基因事件未知或者与cryIAb连接的序列未知，就没有办法设计新的引物组合，导致该转基因事件不可检测。同时，大部分转基因元件都起源于微生物，而在生物生长过程中可能受到微生物感染，因此，检出转基因元件不代表一定是转基因阳性产品。现有的所有检测技术仅能根据转基因元件对转基因产品进行筛选，同时，还需要根据转基因事件的检测结果进行确定。因此，目前的检测技术不能直接确认转基因产品。转基因事件检测也同样存在问题。由于转基因产品与转基因新事件都十分繁杂，现有的技术都只能检测有限的几种已知的转基因事件。如果希望确认产品为非转基因产品，就需要进行大量的转基因检测，这不仅耗时而且极大的增加了检测的成本，致使其在转基因检测应用中不具有可行性。

现有的转基因检测方法都是基于PCR反应进行的，PCR产物形成的气溶胶可能污染实验室。为了避免气溶胶的影响，转基因检测的实验室要求很高，需要形成负压，对实验人员操作要求也十分严格。即使如此，由于污染导致的转基因检测的假阳性也时常出现，即使是取得了资质的实验室，也常常因为气溶胶的污染而影响检测结果。现有的转基因检测方法可能受到微生物的感染，从而造成假阳性检测结果。

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种外源基因检测方法与试剂盒。所述技术方案如下：

本发明实施例提供了一种外源基因的检测方法，所述检测方法包括：

确定待测样品中需要检测的外源基因和所述待测样品中的内源标准基因；

根据所述外源基因的人工序列、所述外源基因的边界序列或所述内源标准基因的序列制备杂交探针；

提取并纯化所述待测样品的基因组DNA和质控样品的基因组DNA；

将所述待测样品的基因组DNA和所述质控样品的基因组DNA均片段化，获得待测样品DNA片段和质控样品DNA片段；

在所述待测样品DNA片段和所述质控样品DNA片段上分别连接上接头序列，获得带有所述接头序列的所述待测样品DNA片段和带有所述接头序列的质控样品DNA片段；

采用聚合酶链式反应扩增所述带有接头序列的所述待测样品DNA片段和所述带有接头序列的质控样品DNA片段，获得第一扩增产物；

利用所述杂交探针富集所述第一扩增产物，获得富集产物；

采用PCR扩增所述富集产物，获得第二扩增产物；

纯化所述第二扩增产物，获得测序文库；

对所述测序文库进行高通量测序，获得高通量测序数据；

对所述高通量测序数据进行质量控制，获得合格的测序数据；

根据所述合格的测序数据获得模板片段和所述外源基因的特征片段；

利用所述模板片段和所述特征片段对所述待测样品中的所述外源基因进行检测，判定所述外源基因是否存在于所述待测样品中。

具体地，所述需要检测的外源基因为至少一种。

具体地，所述人工序列为人为对自然界存在的所述外源基因改造后的序列。

具体地，所述接头序列包括样品条形码序列和随机条形码序列中的至少一种；

在同一实验室，所述检测方法小于或等于一天时，所述样品条形码不重复使用。

进一步地，获得所述模板片段的方法包括：

利用具有相同的所述随机条形码，在参考基因组上有具有相同比对起点位置和相同的比对终点位置的一组所述测序片段的序列计算获得所述模板片段；所述一组测序片段中比例超过R1的碱基序列为所述模板片段的所述碱基序列；若无比例超过R1的所述碱基序列，则将所述模板片段的中所述碱基序列计为任意碱基，所述任意碱基为A、T、C或G。

具体地，所述特征片段包括所述外源基因的序列但在自然界中不存在的所述模板片段；

所述特征片段包括以下两种序列中的至少一种：

a)所述人工序列；

b)所述外源基因的序列与除所述外源基因在起源物种中的边界序列之外的序列的连接序列。

具体地，所述质量控制的方法包括：

统计所述待测样品中所述内源标准基因的模板片段的数目TRF；统计在所述待测样品的内源标准基因的模板片段中，仅包含1个所述测序片段的模板片段的比例，记作TRFs；

当TRF>N2时，判定所述测序数据为合格，N2为判定所述测序数据合格的阈值。

具体地，所述待测样品中的外源基因进行检测的方法包括：

计算所述待测样品中的外源基因的特征片段的数目TEF；

当TEF>N3时，判定所述待测样品中存在所述外源基因；

当TEF≤N3时，判定所述待测样品中不存在所述外源基因。

另一方面，本发明实施例提供了一种用于上述的检测方法的试剂盒，所述试剂盒包括：所述杂交探针和所述接头序列，

所述杂交探针根据所述外源基因的人工序列、所述外源基因的边界序列或所述内源标准基因的序列制备；

所述接头序列包括：样品条形码序列和随机条形码序列中的至少一种。

本发明实施例中的特征片段是指自然界中不存在的模板片段，使得其不可能来源于外源基因的生物感染，因此，可以通过特征片段确认外源基因的存在。

本发明实施例利用外源基因的序列制备的杂交探针去钓取特征片段，由于外源基因的序列是基本固定的，所以，制备的杂交探针适用于所有外源基因，可以检测具有相同外源基因的所有物种中所有转基因事件，包括未知的转基因事件。

本发明实施例中，每一个测试样品在PCR扩增前均采用不同的样本条形码进行标定，以此获知气溶胶中的测序片段的样品条形码与测试样品中的样品条形码是否一致，据此鉴定并排除待测样品中气溶胶污染。例如，在本实施例的测试样品中，检测到了546条带有非测试样品条形码的外源基因的测序片段，包括125条带有非测试样品条形码的Bar基因的测序片段，在基于已有的外源基因检测方法中，Bar基因将被判定为阳性的外源基因，产生转基因检测的假阳性错误。但本实施例中，依据样品条形码，将其判定为气溶胶污染来源的Bar 基因的测序片段，从而正确判定测试样品中没有Bar基因的测序片段。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述。本发明实施例中未注明或详细描述的操作流程或操作规范均为普通分子生物学技术人员所熟知的操作。本发明实施例中未注明的试剂或生物材料均为市场上销售的常用试剂或生物材料，均为普通分子生物学技术人员所熟知的，且可以在市场上购买到。

实施例

本发明实施例提供了一种外源基因的检测方法，适用于检测转基因产品。具体地，在转基因水稻与转基因玉米的混合样品中，对外源基因35S启动子与外源基因cryIAb进行定性与定量检测。

本实施例的检测样品为转基因水稻标准样品粉末和转基因玉米标准样品粉末，转基因水稻标准样品粉末和转基因玉米标准样品粉末均由农业农村部科技发展中心提供，其中，转基因水稻标准样品粉末和转基因玉米标准样品粉末均含有1％的来源于烟草花叶病毒的外源基因35S启动子与1％的来源于苏云金芽孢杆菌的杀虫毒蛋基因的外源基因cryIAb，转基因水稻标准样品粉末和转基因玉米标准样品粉末均不含有抗除草剂的解淀粉芽孢杆菌的核糖核酸酶外源基因 Bar。将1克转基因水稻标准样品粉未和1克转基因玉米标准样品粉未混合，得到混合样品，将混合样品作为待测样品。在待测样品中，外源基因35S启动子与外源基因cryIAb的含量均为1％。

待测样品外源基因检测方法，具体步骤如下：

步骤1、确定待测样品中需要检测的外源基因和待测样品中的内源标准基因。

需要检测的外源基因可以为一种或多种。若确定多种外源基因，只需要在步骤2中针对多种外源基因分别制备杂交探针，可以实现在同一个检测过程中同时检测多种外源基因且不增加检测成本。

在本实施例中，确定待测样品中需要检测的外源基因为35S启动子与cryIAb 基因，确定待测样品中的内源标准基因为核酮糖-二磷酸羧化酶基因RBCL，该核酮糖-二磷酸羧化酶基因在植物中保守，所以同时存在于转基因水稻与转基因玉米之中。

步骤2、根据外源基因的边界序列或外源基因的人工序列和内源标准的序列制备杂交探针。

根据外源基因的边界序列制备的杂交探针可以钓取到两种外源基因的特征片段中的一种，即外源基因序列与除外源基因在起源物种中的边界序列之外的序列的连接序列。外源基因的人工序列为人为对自然界存在的外源基因进行改造的序列。根据外源基因的人工序列制备的杂交探针，可以钓取到两种外源基因的特征片段中的另一种，即外源基因的人工序列。因为外源基因的特征片段不可能来自于自然界存在的微生物感染，所以，避免了微生物感染造成的外源基因检测的假阳性的结果。

本实施例中，根据内源标准基因RBCL的序列制备的杂交探针的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，根据外源基因35S启动子的边界序列制备的杂交探针的序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，根据外源基因cryIAb的人工序列，同时也为cryIAb的边界序列制备的杂交探针的序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，根据外源基因Bar的人工序列，同时也为cryIAb的边界序列制备的杂交探针的序列如序列表中SEQ ID NO:4所示。

烟草花叶病毒常常侵染生物，造成待测样品的微生物感染，这使得待测样品中能够检测到烟草花叶病毒的35S启动子，从而导致检测外源基因35S启动子的假阳性结果，为了获知待测样品是否被烟草花叶病毒感染，可根据烟草花叶病毒基因组的35S启动子之外的区域制备杂交探针，用于显示待测样品是否被烟草花叶病毒感染，以此制备的杂交探针序列如序列表中SEQ ID NO:5所示。

步骤3、提取并纯化待测样品基因组DNA和质控样品基因组DNA。

按天根生化科技有限公司生产的新型植物基因组提取试剂盒的操作说明提取待测样品的基因组DNA和质控样品的基因组DNA，并均溶解于20μL纯水中。

步骤4、将待测样品的基因组DNA和质控样品的基因组DNA片段化，获得待测样品DNA片段和质控样品DNA片段。

在待测样品制样过程中，将纯水从待测样品制样开始暴露于制样环境中，待测样品制样结束后，向暴露于制样环境中的纯水中加入鲑鱼精DNA，使鲑鱼精DNA的总量大于DNA提取的最低阈值限。加入鲑鱼精DNA后的纯水即为质控样品。本实施例中，DNA提取的最低阈值限设定为50ng，实际加入了100ng 鲑鱼精DNA。暴露于制样环境中的纯水可用于获知待测样品在制备过程中是否发生交叉污染。具体地，因为纯水中不含有任何核酸成份，所以若在质控样品中检出的除鲑鱼精DNA以外的任何核酸成份均应来自于交叉污染，即检测时已经发生了交叉污染。

利用超声波或声纳将100ng的待测样品的基因组DNA和100ng的质控样品的基因组DNA片段化，本实施例中，利用超声波进行片段化处理，片段化后的两种基因组DNA分别经1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，并按天根生化科技有限公司生产PCR产物回收试剂盒的操作说明回收DNA片段，获得的DNA片段均在300bp到800bp之间。

步骤5、将待测样品DNA片段和质控样品DNA片段分别连接上接头序列，获得带有接头序列的待测样品DNA片段和带有接头序列的质控样品DNA片段。

接头序列包括样品条形码序列和随机条形码序列中的至少一种。现有的高通量测序的方法通过PCR扩增的方式加入样品条形码，可通过“条形码跳跃”的方式导致一个样品的测序数据混入另一个样品中，若在不含有外源基因的待测样品中混合了含有外源基因的待测样品的序列，就会导致外源基因检测的假阳性。在实验室通风良好的情况下，一天(24小时)可以实现实验室空气与外界的充分交换，因此，在同一实验室，在一天内(不超过24小时)，不可以使用相同的样品条形码。若在同一实验室，检测时间大于或等于一天(24小时)时，则样品条形码可以重复使用，这样可以避免因气溶胶污染造成的外源基因的假阳性判定。若实验室通风不良或者为了最大可能防止气溶胶污染，可以延长样品条形码不重复使用的周期。在本实施例中，采用30天内样品条形码不重复使用。

在本实施例中，PCR扩增前加入样品条形码。在测序数据中，随机条形码的序列、基因组上比对的起点位置与终点位置均相同的测序片段来源于相同的模板片段，从而可以判定测序数据中的模板片段的数目，避免了PCR扩增效率对检测外源基因准确性的影响。

将接头序列的两条双链DNA在PCR仪上进行退火，退火可使两条双链DNA 分别形成双链形式的接头序列，退火程序为：94℃5分钟和37℃10分钟。本实施例中，测序样品中的两条双链DNA的序列分别如序列表中SEQ ID NO:6 和序列表中SEQ ID NO:7所示，在序列表SEQ ID NO:6和序列表SEQ ID NO:7 中，acacgatgactc和gagtcatcgtgt均为待测样品的样品条形码的序列，待测样品的样品条形码和质控样品的样品条形码的序列均不相同，质控样品的样品条形码为ctcgcatactac及其互补序列。在序列表SEQ ID NO:7中n为随机条形码序列， n代表A、T、C和G四种碱基中任意一种碱基。

按GenoBaits DNA-seq Kit for illumina试剂盒(购置于石家庄博瑞迪生物技术有限公司，货号：K00 002)的操作说明，将待测样品的DNA片段和质控样品的DNA片段分别连接上上述经过退火形成的接头序列。

将连接上接头序列的待测样品和质控样品混合在一起作为测试样品。由于测试样品中的待测样品和质控样品都有不同的样品条形码，因此，可以从最终的测序数据中区分出来。

步骤6、采用PCR扩增带有接头序列的待测样品DNA片段和带有接头序列的质控样品DNA片段，获得第一扩增产物。

按GenoBaits DNA-seq Kit for illumina试剂盒(购置于石家庄博瑞迪生物技术有限公司，货号：K00 002)的操作说明扩增测试样品中，带有接头序列的待测样品DNA片段和带有接头序列的质控样品DNA片段，得到扩增产物，纯化扩增产物后，获得第一扩增产物。为保证第一扩增产物增长在线性扩增期内，以增加检测的稳定性，PCR循环数不能超过20个。在本实施例中，PCR循环数为20个，PCR扩增的引物的序列分别如序列表中SEQ ID NO:8和序列表中SEQ ID NO:9所示。

步骤7、利用杂交探针富集第一扩增产物，获得富集产物；

采用PCR扩增富集产物，获得第二扩增产物；

纯化第二扩增产物，获得测序文库。

按GenoBaits DNA-seq Kit for illumina试剂盒(购置于石家庄博瑞迪生物技术有限公司，货号：K00 002)的操作说明，利用杂交探针捕获并富集第一扩增产物，捕获第一扩增产物后进行纯化，获得富集产物。所使用的杂交探针为步骤2中所制备的所有杂交探针的混合探针。

同样利用GenoBaits DNA-seq Kit for illumina试剂盒(购置于石家庄博瑞迪生物技术有限公司，货号：K00 002)的操作说明采用PCR扩增富集产物，PCR 扩增循环数为25个，获得第二扩增产物，纯化第二扩增产物，获得测序文库。 PCR扩增的引物序列分别如序列表中SEQ ID NO:10和序列表中SEQ ID NO:11 所示。

步骤8、对测序文库进行高通量测序，获得高通量测序数据。

按Illumina公司的HiSeq Xten测序仪和2×150bp双端测序试剂盒的操作说明，采用2×150bp的双端测序模式对构建的文库进行高通量测序检测，测序的碱基数据量设置为大于2G。

在测试样品的同一个通道中，还测序检测了人的DNA序列，人的DNA序列带有与待测样品和质控样品均不相同的样品条形码。因此，若测试样品的测序片段只能比对到的人参考基因组上，说明存在“条形码的跳跃”。但是在本实施例中，没有检测到条形码跳跃现象。

步骤9、对高通量测序数据进行质量控制，获得合格的测序数据；根据合格的测序数据获得模板片段和外源基因的特征片段。

高通量测序数据进行质量控制的主要方法为质量值达到Q30标准的比例超过70％，则认为质量合格。在本实施例中，该比例达到85％，因此，测序数据是合格的。

获得模板片段的方法包括：利用具有相同的随机条形码，在参考基因组上有具有相同比对起点位置和相同的比对终点位置的一组测序片段的序列计算获得模板片段。在本实施例中，参考基因组包括所有外源基因和内源标准基因。该组测序片段中比例超过R1的碱基序列为模板片段的碱基序列，R1的值应大于或等于50％。若无比例超过R1的碱基序列，则将模板片段中的碱基序列计为任意碱基；任意碱基为A、T、C或G四种碱基中的一种。

随机条形码的中的碱基为A、T、C或G四种碱基中的任意一种，因此，随机条形码有4^m种，(m≥4，且为正整数)，其中，m为随机条形码的碱基序列的长度。在本实施例中，m＝8，因此，随机条形码的种类可以达到4⁸，即65536 种，再加上参考基因上的比对起点位置与比对终点位置，其组合数是十分巨大的，这样可以保证不同的模板片段连接不同的随机条形码。参考基因组序列为所有外源基因序列和内源标准基因序列。

在本实施例中，按BWA软件(版本号：0.7.9a-r786)及其默认参数将测序获得的Reads比对到参考基因组上，按上述方法，即具有相同的随机条形码，在参考基因组上有具有相同比对起点位置和相同的比对终点位置的原则，确定属于每一个模板片段的一组测序片段。本实施例设置的R1＝60％，根据R1的值确定模板片段中的每个碱基，从而获得所有模板片段。

利用样品条形码，将测试样品中的模板片段区分为待测样品的模板片段和质控样品的模板片段。

通过简单的累加的方式，统计待测样品中内源标准基因的模板片段的数目，该数目TRF，在本实施例中，TRF＝312.12K，其中1K＝1000；统计待测样品的内源标准基因的模板片段中，仅包含1个测序片段的模板片段的比例TRFs，本实施例中，TRFs＝2.11％。根据TRF和TRFs的值，判定测序数据是否合格，若不合格，判定不合格的原因，并给出后续操作方式，具体判断原则如下：

当TRF>N2时，判定测序数据合格，则可以进行外源基因进行检测；

当N1<TRF≤N2且TRFs≥R时，判定测序数据的量不足，需要重新进行高通量测序；N1<N2。

当N1<TRF≤N2且TRFs<R，或者TRF≤N1时，判定测序文库构建不成功，需要重新构建测序文库。

具体地，N2为判定测序数据合格的阈值。N2的值取决于希望达到的外源基因的检测下限。例如，在转基因检测中，一般希望达到的外源基因的检测下限为0.1％，那么，当N2＝10000时，0.1％的外源基因平均可以被检出10条模板片段。根据二项分布计算，检出2条以上的外源基因的模板片段的概率大于 99.95％。因此，在本实施例中，取N2＝10000。相应地，本实施例的TRF>N2，判定测序数据合格，可以进行外源基因的检测。

当TRF≤N2时，内源标准基因的模板数量不足以满足外源基因检测下限的要求，需要重新实验。此时，又分为两种情况：第一种情况，当N1<TRF≤N2 且TRFs≥R时(其中，N1为构建测序文库不成功的阈值，N1≤1000。R为测序饱和度阈值，且R>50％)，说明外源基因的模板数量虽然达不到N2的值，但已经超过了一定的数量，即超过了N1的值，同时，由于TRFs≥R，说明测序数据中还有一定量的仅有一个测序片段的模板片段，同时，也说明还有一定量的0个测序片段的模板片段，即还有一定量的未检出的模板片段。因此，可以通过加大测序量的方法获得足够数目的模板片段，以满足外源基因检测下限的要求。我们对200多次的测序数据量不足但通过补测测序文库可以补足内源标准基因的测序片段的实际检测实验统计，当N1设置为1000，R设置为70％时， 95％的实验加大测序量一倍可以补够内源标准基因的测序片段。因此，本实施例中，N1设置为1000，R设置为70％。

当TRF≤N1时，内源标准基因测序片段太少，大概率原因是文库构建不成功，需要重新构建文库。当N1<TRF≤N2且TRFs<R时，显然有一定数据的测序片段，但由于TRFs值较小，说明未检测到的模板片段数量有限，因此，也需要重新构建文库。

本发明实施例可以通过最终的检测数据对检测过程的多个关键节点进行监控。例如，通过PCR方式检测外源基因失败，可能是模板量不足，也可能是PCR 引物失效。原因不同，后续处理方式不同，由于两种原因均有可能，后续如何处理是不明确的。

步骤10、利用模板片段和特征片段对待测样品中的外源基因进行检测，判定外源基因是否存在于待测样品中。

获得外源基因的特征片段指包括外源基因的序列但在自然界中不存在的模板片段；外源基因的特征片段包括以下两种序列中的至少一种：(a)人工序列； (b)外源基因的序列与除外源基因在起源物种中的边界序列之外的序列的连接序列。

按BWA软件(版本号：0.7.9a-r786)及其默认参数将步骤9中获得的模板片段比对到参考基因组上。由于外源基因cryIAb的序列与苏云金芽孢杆菌中的天然抗虫基因的序列同源性在85％以上，因此，外源基因cryIAb的全部序列均不可能来自于自然界中的苏云金芽孢杆菌的感染，因此，比对了外源基因cryIAb 序列的模板片段均认为包含了人工序列，作为外源基因的特征片段。外源基因 35S启动子中的序列与自然界的烟草花叶病毒的序列一致，因此，当保留具有以下比对特征的模板片段作为外源基因35S的特征片段：仅部分模板序列的序列与外源基因35S启动子序列比对成功，另一部分没有比对成功的模板序列与烟草花叶病毒参考基因组比对也不成功。

本实施例中，按以上方法，计算待测样品中外源基因的特征片段的数目，记作TEF；其中，外源基因35S启动子的特征片段的数目，即TEF(35S)＝1.58 K(1K＝1000)，外源基因基因cryIAb的特征片段的数目，即TEF(cryIAb)＝ 3.21K(1K＝1000)。外源基因Bar的特征片段的数目，即TEF(Bar)＝0。

当TEF>N3时，判定待测样品中存在外源基因；当TEF≤N3时，判定待测样品中不存在外源基因。由于特征片段不可能来自于生物感染，而样品条形码又避免了气溶胶的污染和条形码跳跃的问题，因此，只要有一条特征片段，都可以判定待测样品中存在外源基因。但为了安全起见，在本实施例中，取N3＝5。由于TEF(35S)＝1.58K>5且TEF(cryIAb)＝3.21K(1K＝1000)>5，因此，判定待测样品中存在外源基因35S启动子和外源基因基因cryIAb。由于TEF (Bar)＝0≤5，因此，判定待测样品中不存在外源基因Bar。

本发明实施例还提供了一种用于上述检测方法的试剂盒，该试剂盒包括：杂交探针和接头序列，

杂交探针根据外源基因的人工序列、外源基因的边界序列或内源标准基因的序列制备；

接头序列包括：样品条形码序列和随机条形码序列中的至少一种。

由于已有的外源基因检测方法没有办法绝对排除含有外源基因的生物感染，因此，在待测样品中检测到生物来源的外源基因时候，无法判定外源基因的种类。例如，利用已有的方法检测到35S启动子的存在，其可能是转入的35S 启动子，即外源基因，也可能是待测样品被烟草花叶病毒感染后的35S启动子，因此，没有办法确认待测样品中存在外源基因35S启动子。

本发明实施例中的特征片段是指自然界中不存在的模板片段，使得其不可能来源于外源基因的生物感染，因此，可以通过特征片段确认外源基因的存在。例如，本实施例中确认了35S启动子来源于外源基因，而非来源于烟草花叶病毒，因此，确认了待测样品为转基因产品。在步骤2中，在烟草花叶病毒基因组上35S启动子之外的区域设计了杂交探针序列，用于显示测试样品是否被烟草花叶病毒的感染。事实上，检测到了杂交探针对应的烟草花叶病毒测序片段共321条，这足以证明该测试样品存在烟草花叶病的感染。实验室共检测了近 10000个测试样品，证明大部分生物样品都存在烟草花叶病，这是为什么传统的方法只能将35S启动子等来源于自然界的外源基因作为筛选，而不能确认产品是否为转基因产品的原因。

本发明实施例利用外源基因的序列制备的杂交探针去钓取特征片段，由于外源基因的序列是基本固定的，所以，制备的杂交探针适用于所有外源基因，可以检测具有相同外源基因的所有物种中所有转基因事件，包括未知的转基因事件。例如35S启动子及抗性标记等序列基本固定的外源基因，几乎在所有转基因产品中都使用，因此，本发明实施例通过35S启动子制备的杂交探针可以检测确认绝大部分转基因产品，不论该产品中的转基因事件是否已知，这是传统的方法做不到的技术效果。

本发明实施例中，每一个测试样品在PCR扩增前均采用不同的样本条形码进行标定，以此获知气溶胶中的测序片段的样品条形码与测试样品中的样品条形码是否一致，据此鉴定并排除待测样品中气溶胶污染。例如，在本实施例的测试样品中，检测到了546条带有非测试样品条形码的外源基因的测序片段，包括125条带有非测试样品条形码的Bar基因的测序片段，在基于已有的外源基因检测方法中，Bar基因将被判定为阳性的外源基因，产生转基因检测的假阳性错误。但本实施例中，依据样品条形码，将其判定为气溶胶污染来源的Bar 基因的测序片段，从而正确判定测试样品中没有Bar基因的测序片段。

本发明可以同时检测并确认多种外源基因，仅当每种外源基因均检测失败时，才会导致将转基因产品误判为非转基因产品，假阴性率也极大的降低了。例如，本实施例中，同时确认了外源基因cryIAb和35S启动子存在于待测样品中，显著降低了已有方法中，仅依赖于外源基因cryIAb的转基因事件判定转基因阳性的假阳性结论的风险。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 武汉明了生物科技有限公司

<120>一种外源基因的检测方法与试剂盒

<160>11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211>110

<212>DNA

<213> Oryza.sativa

<400> 1

ttgtgagaat tcttaattca tgagttgtag ggagggacgt atgtcaccac aaacagaaac 60

taaagcaagt gttggattta aagctggtgt taaggattat aaattgactt 110

<210> 2

<211>120

<212> DNA

<213> Oryza.sativa

<400> 2

ggattgatgt gacatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcccact atccttcgca 60

agacccttcc tctatataag gaagttcatt tcatttggag aggacacgct gaaatcacca 120

<210> 3

<211>120

<212> DNA

<213> Tobacco mosaic virus

<400> 3

acgaatgcat tccatacaac tgcttgagta acccagaagt tgaagtactt ggtggagaac 60

gcattgaaac cggttacact cccatcgaca tctccttgtc cttgacacag tttctgctca 120

<210> 4

<211>120

<212> DNA

<213> Streptomyces hygroscopicus

<400> 4

tggggatcta ccatgagccc agaacgacgc ccggccgaca tccgccgtgc caccgaggcg 60

gacatgccgg cggtctgcac catcgtcaac cactacatcg agacaagcac ggtcaacttc 120

<210> 5

<211>120

<212> DNA

<213>苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis ）

<400> 5

attacatccc gaagctagct caaatcagaa agcctctgca agccaagctt aaagaaaacg 60

ttccatggag atggacaaaa gaggataccc tctacatgca aaaggtgaag aaaaatctgc 120

<210> 6

<211>42

<212> DNA

<213> Tobacco mosaic virus

<400> 6

tctttcccta cacgacgctc ttccgatcta cacgatgact ct 42

<210> 7

<211>45

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<400> 7

gagtcatcgt gtnnnnnnnn atggaattct cgggtgccaa ggaac 45

<210> 8

<211>71

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<400> 8

aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca tgcaatgnac actctttccc tacacgacgc 60

tcttccgatc t 71

<210>9

<211>66

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<400>9

caagcagaag acggcatacg agatgcattg gcgtgactgg agttccttgg cacccgagaa 60

ttccat 66

<210>10

<211>29

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<400>10

aatgatacgg cgaccaccga gatctacac 29

<210>11

<211>24

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<400>11

caagcagaag acggcatacg agat 24

Claims (9)

1.一种外源基因的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：

确定待测样品中需要检测的外源基因和所述待测样品中的内源标准基因；

根据所述外源基因的人工序列、所述外源基因的边界序列或所述内源标准基因的序列制备杂交探针；

提取并纯化所述待测样品的基因组DNA和质控样品的基因组DNA；

将所述待测样品的基因组DNA和所述质控样品的基因组DNA均片段化，获得待测样品DNA片段和质控样品DNA片段；

在所述待测样品DNA片段和所述质控样品DNA片段上分别连接上接头序列，获得带有所述接头序列的所述待测样品DNA片段和带有所述接头序列的质控样品DNA片段；

采用聚合酶链式反应扩增所述带有接头序列的所述待测样品DNA片段和所述带有接头序列的质控样品DNA片段，获得第一扩增产物；

利用所述杂交探针富集所述第一扩增产物，获得富集产物；

采用PCR扩增所述富集产物，获得第二扩增产物；

纯化所述第二扩增产物，获得测序文库；

对所述测序文库进行高通量测序，获得高通量测序数据；

对所述高通量测序数据进行质量控制，获得合格的测序数据；

根据所述合格的测序数据获得模板片段和所述外源基因的特征片段；

利用所述模板片段和所述特征片段对所述待测样品中的所述外源基因进行检测，判定所述外源基因是否存在于所述待测样品中。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述需要检测的外源基因为至少一种。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述人工序列为人为对自然界存在的所述外源基因改造后的序列。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述接头序列包括样品条形码序列和随机条形码序列中的至少一种；

在同一实验室，所述检测方法小于或等于一天时，所述样品条形码不重复使用。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，获得所述模板片段的方法包括：

利用具有相同的所述随机条形码，在参考基因组上有具有相同比对起点位置和相同的比对终点位置的一组所述测序片段的序列计算获得所述模板片段；所述一组测序片段中比例超过R1的碱基序列为所述模板片段的所述碱基序列；若无比例超过R1的所述碱基序列，则将所述模板片段的中所述碱基序列计为任意碱基，所述任意碱基为A、T、C或G。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述特征片段包括所述外源基因的序列但在自然界中不存在的所述模板片段；

所述特征片段包括以下两种序列中的至少一种：

a)所述人工序列；

b)所述外源基因的序列与除所述外源基因在起源物种中的边界序列之外的序列的连接序列。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述质量控制的方法包括：

统计所述待测样品中所述内源标准基因的模板片段的数目TRF；统计在所述待测样品的内源标准基因的模板片段中，仅包含1个所述测序片段的模板片段的比例，记作TRFs；

当TRF>N2时，判定所述测序数据为合格，N2为判定所述测序数据合格的阈值。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测样品中的外源基因进行检测的方法包括：

计算所述待测样品中的外源基因的特征片段的数目TEF；

当TEF>N3时，判定所述待测样品中存在所述外源基因；

当TEF≤N3时，判定所述待测样品中不存在所述外源基因。

9.一种用于如权利要求1～8任一项所述的检测方法的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：所述杂交探针和所述接头序列，

所述杂交探针根据所述外源基因的人工序列、所述外源基因的边界序列或所述内源标准基因的序列制备；

所述接头序列包括：样品条形码序列和随机条形码序列中的至少一种。