CN110172417A

CN110172417A - 一株芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN110172417A
Application number: CN201910374063.6A
Authority: CN
Inventors: 朱蠡庆; 付雪; 李勇昊; 姚波; 莫易; 汪小铃
Original assignee: Chongqing University of Science and Technology
Current assignee: Chongqing University of Science and Technology
Priority date: 2019-05-07
Filing date: 2019-05-07
Publication date: 2019-08-27
Anticipated expiration: 2039-05-07
Also published as: CN110172417B

Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，公开了一株芽孢杆菌及其应用。所述芽孢杆菌为芽孢杆菌(Bacillus sp.)CQUST1，于2018年9月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No:60448。本发明的芽孢杆菌，通过透明圈法发现发酵液具有显著的蛋白酶活性。本发明还公开了该芽孢杆菌产蛋白酶活性与发酵温度的关系和在农业废弃物堆积中的用途。秸秆主要由木质素、纤维素、半纤维素等难分解的成分组成，自然腐熟速度较慢。秸秆还田技术可有效提高土壤有机质含量，改善土壤物理性质，增强土壤微生物活性，提高土壤肥力，增加土壤含水量，提高作物产量，减少农业生产造成的污染，实现秸秆的资源化利用，从而促进循环农业的健康快速发展。

Description

一株芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一株芽孢杆菌CQUST1及其产蛋白酶的应用。

背景技术

蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶，该酶既可以将蛋白质分子内部切断，形成较小分子量的胨，也可由蛋白质分子中C端或N端的肽键水解，而游离出氨基酸，从而实现水解蛋白质。食物消化、血压调节、血液凝固等生物体的基本生理活动均离不开蛋白酶的参与，因此，蛋白酶被广泛运用于制革工业、明胶工业、食品工业以及洗涤剂等人类生活的各个领域(工业微生物,2008,38,4:49-61)。在临床上，蛋白酶在酶疗法中占据主要地位，常用于治疗消化不良、支气管炎等，还可用于消炎退肿，除去坏死组织，如术后炎症性肿胀以及膀胱炎等(生命科学信息,1991，8，2:8)，可见蛋白酶具有广泛的需求前景。

目前，蛋白酶主要分为内肽酶和外肽酶两类，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实、微生物中。产生蛋白酶的微生物在自然界中种类繁多，包括细菌、真菌、放线菌等，分布也非常广泛。影响蛋白酶生产的因素繁多,同一微生物在不同培养条件下产生多的蛋白酶种类也有所不同。在工业上用地衣芽孢杆菌C1213和2709、短小芽孢杆菌209和289以及嗜碱性芽孢杆菌B45等生产碱性蛋白酶，利用曲霉、根霉、米曲霉等生产中性和酸性蛋白酶,而栗疫霉、毛霉用于生产凝乳型的酶(青海科技,2018,2:73-76)。在细菌培养中，通常用液体深层培养法生产中、碱性蛋白酶,而采用固体培养法生产霉菌蛋白酶(科学通报,1974,19，1:34-37)。

芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌，能形成芽孢，其形态具有杆状和球状，广泛存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处，能抵抗外界有害因子，是工业上产碱性蛋白酶的主要菌种。该菌种繁殖能力极强，四小时能增殖10万倍，其能力远远超过其他普通菌种；同时具有耐受力高的特点，不仅耐强酸、耐强碱，有的菌还能耐低温-60℃或耐高温+280℃。主要运用于化肥添加、农药添加、堆肥与液肥制作，以及粗纤维降解等生产活动中(China Brewing,2009,205，4:102-103)。在生物工程方面，由于抗生素污染问题的日益严重，有益的芽孢杆菌的应用研究，可能是解决抗生素问题的一个有效方案。

发明内容

本发明的目的在于提供一株芽孢杆菌CQUST1及其应用；该芽孢杆菌(Bacillussp.)CQUST1的发酵产物具有显著的蛋白酶活性。

本发明涉及的芽孢杆菌(Bacillus sp.)CQUST1分离自重庆璧山国家产业园内农业产物自然堆肥中，纯化培养基为LB培养基，其在LB培养基上生长良好；芽孢杆菌CQUST1表面粗糙不透明，菌落为杆状呈微黄色。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明提供一株芽孢杆菌(Bacillus sp.)CQUST1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏编号为GDMCC No:60448，保藏单位地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2018年9月20日。

优选的，所述芽孢杆菌的纯化培养基为LB培养基；每1L所述LB培养基的组成为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水定容至1L，pH 7.2，121℃湿热灭菌30min。

优选的，所述芽孢杆菌的发酵产物具有蛋白酶活性。

第二方面，本发明还涉及所述的芽孢杆菌的用途。包括芽孢杆菌CQUST1在制备蛋白酶中的用途。和在发酵农业废弃物堆肥中的用途。

进一步，还可以将所述芽孢杆菌的发酵产物(蛋白酶)用于农业废弃物堆肥处理。

所述芽孢杆菌的发酵产物是通过如下步骤的方法制备而得：将从重庆璧山国家产业园内分离得到的菌种接种到LB培养基中，37℃恒温箱中过夜培养12h；每1L所述LB培养基的组成为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水定容至1L，pH 7.2，121℃湿热灭菌30min。

芽孢杆菌CQUST1发酵产物的确定：选择适宜的单菌落，接种到脱脂奶粉平板培养基中，37℃-50℃恒温箱中过夜培养12h。发酵产物确认所用的培养基为脱脂奶粉平板培养基，每1L所述脱脂奶粉平板培养基的组成为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，脱脂牛奶0.5-1μl,蒸馏水定容至1L，pH 7.2，121℃湿热灭菌30min。

本发明具有的有益效果为：本发明提供了一株芽孢杆菌，根据脱脂奶粉平板培养基透明圈显示其发酵液具有蛋白酶活性，能水解蛋白质。本发明还公开了此芽孢杆菌的产蛋白酶活性与发酵温度的关系，其证明方法通过控制芽孢杆菌脱脂奶粉平板培养基中发酵温度，证明了具有产蛋白酶活性的发酵产物与发酵温度的关系。

秸秆主要由木质素、纤维素、半纤维素等难分解的成分组成，自然腐熟速度较慢。芽孢杆菌CQUST1可以将高聚合度纤维素和半纤维素降解成小分子的葡聚糖和木聚糖，小分子物质溶于水提高秸秆还田效率。从而可以利用秸秆还田技术有效提高土壤有机质含量，改善土壤物理性质，增强土壤微生物活性，提高土壤肥力，增加土壤含水量，提高作物产量，减少农业生产造成的污染，实现秸秆的资源化利用，从而促进循环农业的健康快速发展。

附图说明

图1显示的是菌株CQUST1的菌落形态；

图2显示的是菌株CQUST1在脱脂奶粉平板培养基中出现的透明圈情况；

图3显示的是各组烟草干重和湿重算术平均值。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。

实施例1：芽孢杆菌CQUST1的分离

用无菌容器将从重庆璧山国家产业园内高温堆肥点取样带回实验室，用选择性LB培养基，37℃恒温箱中过夜培养12h，以秸秆为碳源分离出113种菌种，筛选菌株耐高温，且在高温下分泌活性高的纤维素酶和半纤维素酶，因此将该菌株分离，即获得CQUST1。

实施例2：菌株CQUST1的鉴定

针对实施例1中分离得到的菌株，综合该菌形态特征、生理生化特征、16S rRNA序列等，鉴定这株菌为芽孢杆菌属。具体鉴定结果如下：

1.菌体形态

菌株CQUST1在LB培养基上生长良好，粗糙不透明，表面褶皱，菌落为杆状，有微黄色孢子(见图1)。

2.生理生化特征

菌株CQUST1能在较高温度的LB培养基上生长，属于耐高温菌，其菌落在37℃、40℃、45℃、48℃、50℃的脱脂奶粉培养基中生长均较好。

3.16S rRNA鉴定

根据NCBI blast比较分析，该菌株CQUST1与芽孢杆菌Bacillus licheniformisstrain(100.00％)显示出最高的序列同源性。

芽孢杆菌CQUST1的16S rRNA核苷酸全序列总长为1427bp，序列如下所示：

ATAATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGT

实施例3：芽孢杆菌产蛋白酶活性与发酵温度的关系

(1)芽孢杆菌CQUST1的发酵

将从重庆璧山国家产业园内分离得到的菌种接种到LB培养基中，37℃恒温箱中过夜培养12h；

所述培养基为LB培养基，其组成：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水定容至1L，pH 7.2，121℃湿热灭菌30min。

(2)芽孢杆菌CQUST1发酵产物的确定

选择适宜的单菌落，接种到脱脂奶粉平板培养基中，37℃-50℃恒温箱中过夜培养12h；

所述培养基为脱脂奶粉平板培养基，其组成：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，脱脂牛奶0.5-1μl,蒸馏水定容至1L，pH 7.2，121℃湿热灭菌30min。

(3)芽孢杆菌CQUST1产蛋白酶活性与发酵温度关系的确定

分别将脱脂奶粉培养基在不同温度恒温箱下培养24h后,在分离培养基上可以观察到菌株周围产生肉眼可见的水解圈。共计5个培养基，每个培养中均有3个单菌落，可见15个菌株及其产生的透水解圈,分别衡量其菌落直径及其水解圈直径，结果如表1。

表1芽孢杆菌CQUST1产蛋白酶菌落直径与水解圈直径

分离出来的菌株在含脱脂奶粉平板上生长,对所得数据进行分析，水解圈直径和菌落直径的比值(R/r)最大的是。可见芽孢杆菌CQUST1在45℃时产蛋白酶活性最强，在37℃-45℃时,产蛋白酶活性随发酵温度的升高而呈上升趋势；而在发酵温度超过45℃后，产蛋白酶活性有所下降，分析见表2.

表2水解圈直径和菌落直径的比值

实施例4：芽孢杆菌CQUST1的用途

芽孢杆菌CQUST1在不添加任何无机盐的情况下，在8％的玉米秸秆粉末培养基中生长，并促进玉米秸秆分解，可有效降解农业生产废弃物。

实施例5：

芽孢杆菌CQUST1可以0.5％-3％的微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、玉米秸秆、青椒残枝、西红柿残枝等为唯一碳源生长，因此可以用于降解农业生产废弃物。以模式植物烟草为材料，称取0.1g左右烟草种子，播种于浸湿土壤表面，土壤各组分别为A组：蛭石：玉米秸秆堆肥：珍珠岩＝6:3:1，V/V；B组：蛭石：营养土：珍珠岩＝6:3:1，V/V；C组：蛭石：沙土：珍珠岩＝6:3:1，V/V，每组共12烟草，表面蒙保鲜膜5天后移除，待烟草种子发芽7天后将其移植到塑料花钵中，继续生长6周后开始对比烟草干重和湿重,该实验重复三次，图3所示为各组干重和湿重算术平均值，证明添加CQUST1堆肥处理组的烟草生物量最高。

序列表

<110> 重庆科技学院

<120> 一株芽孢杆菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1427

<212> DNA

<213> Bacillus sp.

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1427)

<223> 16S rRNA

<400> 1

ataatgcagt cgagcggaca gatgggagct tgctccctga tgttagcggc ggacgggtga 60

gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc cgggaaaccg gggctaatac 120

cggatggttg tttgaaccgc atggttcaaa cataaaaggt ggcttcggct accacttaca 180

gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg caacgatgcg 240

tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg 300

ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc tgacggagca acgccgcgtg 360

agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg gaagaacaag taccgttcga 420

atagggcggt accttgacgg tacctaacca gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc 480

cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag ggctcgcagg 540

cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccg gggagggtca ttggaaactg 600

gggaacttga gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg tagcggtgaa atgcgtagag 660

atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct gtaactgacg ctgaggagcg 720

aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg 780

ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta acgcattaag cactccgcct 840

ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg 900

gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga catcctctga 960

caatcctaga gataggacgt ccccttcggg ggcagagtga caggtggtgc atggttgtcg 1020

tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgatcttag 1080

ttgccagcat tcagttgggc actctaaggt gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg 1140

ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatggaca 1200

gaacaaaggg cagcgaaacc gcgaggttaa gccaatccca caaatctgtt ctcagttcgg 1260

atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagc tggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg 1320

ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccacg agagtttgta 1380

acacccgaag tcggtgaggt aaccttttag gagccagccg ccgaagt 1427

Claims

1.一株芽孢杆菌(Bacillus sp.)CQUST1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No:60448。

2.如权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)CQUST1，其特征在于：所述纯化培养芽孢杆菌(Bacillus sp.)CQUST1的培养基为为LB培养基；每1L所述LB培养基的组成为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水定容至1L，pH 7.2，121℃湿热灭菌30min。

3.权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)CQUST1在制备蛋白酶中的用途。

4.权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.)CQUST1在发酵农业废弃物堆肥中的用途。

5.如权利要求3或4所述的用途，其特征在于：所述芽孢杆菌CQUST1的发酵培养过程为：将菌种接种到LB培养基中，37℃恒温箱中过夜培养12h。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于：每1L所述LB培养基的组成为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水定容至1L，pH7.2，121℃湿热灭菌30min。