CN110157617B - 宫颈癌细胞三维培养装置及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物组织工程和生物医药领域，具体涉及一种宫颈癌细胞三维培养装置及其应用。所述装置由外筒2、内筒4、减速装置8和电机9构成，所述内筒4由聚碳酸酯膜11、内筒顶盖6、内筒底盖5和培养基质层10构成，所述培养基质层10按重量份计由以下组份组成：鼠尾胶原蛋白Ⅰ10‑20份、琼脂糖50‑100份、纤粘连蛋白5‑10份和丝素蛋白1‑3份。所述宫颈癌细胞三维培养装置和培养方法实用性强，对细胞无毒副作用，对人和环境友好，并且价格较低，大大降低了细胞三维培养的成本，可应用于体外抗宫颈癌药物筛选和细胞毒性检测中，对宫颈癌的检查、诊断和治疗具有重要的科学意义和商业价值。
Description
技术领域
本发明属于生物组织工程和生物医药领域，具体涉及一种宫颈癌细胞三维培养装置和一种培养基质层10的制备方法及其应用，一种体外三维培养宫颈癌细胞的方法和一种体外研究宫颈癌细胞侵袭的方法。
背景技术
宫颈癌对于人类尤其是女性而言，是一种发病率仅次于乳腺癌的恶性癌瘤，它在女性癌症死亡率中高居第二。其发病原因包括性生活不健康、生育年龄过早、思想轻视、营养元素不均衡、吸烟、病毒感染(如HPV等)等。
目前针对宫颈癌的检查和诊断方法包括细胞学诊断、病毒检测以及特异性标志物的检测。临床上多采用放疗、化疗、手术、药物等方法进行治疗，对于宫颈癌的研究离不开细胞的培养以及肿瘤细胞研究。
多项研究表明，细胞在人体内生长时处于三维立体环境，其形态和功能与单层二维细胞在体外培养时差别甚大。不断有文献证实细胞在二维与三维培养方式下具有显著差异。
通常的二维细胞培养与人体或动物体内的细胞生长方式并不相同，常常不能正确体现正常或病理组织条件下的结构或功能，因而使用该方法进行如药物筛选等实验时可能结果并不准确。
与二维细胞培养相比，细胞三维培养是更加接近细胞在体内生长的最佳培养方式，因为这种培养方式充分考虑了细胞之间以及细胞与环境间关键性的相互作用。多项研究均证实了细胞三维培养方式能够更好地模拟细胞在体内的生长情况，使体外细胞试验所获得的结果更精确，因而在体外毒性检测和药物筛选等方面具有重要作用和巨大应用价值。
目前的三维培养技术包括自发性细胞聚集、基质覆盖培养、旋转烧瓶培养、微载体培养、预置支架培养和旋转细胞培养系统等。上述三维培养技术各有优缺点，本申请发明人在宫颈癌细胞三维培养领域有着非常丰富的经验，针对宫颈癌细胞培养过程中出现的问题开发出了一种宫颈癌细胞三维培养装置及相应的培养方法。
发明内容
有鉴于此，本发明目的之一在于提供一种宫颈癌细胞三维培养装置，所述装置可应用于对宫颈癌的研究，能够更好地模拟宫颈癌细胞细胞在体内的生长情况，使体外细胞试验所获得的结果更精确。
为实现上述目的，本发明采用以下方案：
一种宫颈癌细胞三维培养装置，其特征在于，所述装置由外筒2、内筒4、减速装置8和电机9构成，所述内筒4由聚碳酸酯膜11、内筒顶盖6、内筒底盖5和培养基质层10构成，所述培养基质层10按重量份计由以下组份组成：鼠尾胶原蛋白Ⅰ10-20份、琼脂糖50-100份、纤粘连蛋白5-10份和丝素蛋白1-3份。
优选的，所述培养基质层10按重量份计由以下组份组成：鼠尾胶原蛋白Ⅰ12份、琼脂糖55份、纤粘连蛋白7份和丝素蛋白1份。
鼠尾胶原是一种天然培养基，它具有促进体外培养细胞(特别是上皮细胞)贴壁的作用，同时它也是一种天然的黏附剂，当我们需要在培养瓶或培养皿内放置小玻片，制备细胞爬片时，可在瓶底涂一层胶原，再放上小玻片，自然干燥后小玻片就固定于培养瓶之中。
琼脂糖是线性的多聚物，基本结构是1,3连结的β-D-半乳糖和1,4连结的3,6-内醚-L-半乳糖交替连接起来的长链[1-2]。琼脂果胶是由许多更小的分子组成的异质混合物。
纤粘连蛋白是一种大型的糖蛋白，存在于所有脊椎动物，分子含糖4.5－9.5％，糖链结构依组织细胞来源及分化状态而异。FN可将细胞连接到细胞外基质上。
丝素蛋白，是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，含量约占蚕丝的70％～80％，含有18种氨基酸，其中甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)和丝氨酸(Ser)约占总组成的80％以上。丝素本身具有良好的机械性能和理化性质，如良好的柔韧性和抗拉伸强度、透气透湿性、缓释性等，而且经过不同处理可以得到不同的形态，如纤维、溶液、粉、膜以及凝胶等。
对培养基质层成分以及配比的选择导致的结果本身具有不可预见性，需要研发人员的不断探索可调整，本申请发明人在经过大量的试验后终于得到所述的培养基质，使得该培养基质完全适合宫颈癌细胞的三维培养和宫颈癌细胞的生长活动。
进一步，如图1所示，所述外筒2的顶盖1可打开并加入细胞培养基，所述外筒2的底盖通过转轴12与所述减速装置8连接，所述减速装置8与所述电机9连接。
进一步，所述内筒顶盖6和内筒底盖5均与转轴12连接，所述内筒4的筒身为聚碳酸酯膜11，所述聚碳酸酯膜11内面覆有培养基质层10，所述聚碳酸酯膜11可拆卸。
进一步，使用时所述内筒4外与筒2之间充满细胞培养基。
进一步，所述细胞培养基的体积为5-10ml。
进一步，所述转轴12的转速为5r/min-15r/min。
本发明的目的之二在于提供一种所述培养基质层10的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用以下方案：
所述培养基质层10按重量份计由以下组份组成：鼠尾胶原蛋白Ⅰ10-20份、琼脂糖50-100份、纤粘连蛋白5-10份和丝素蛋白1-3份，制备方法包括以下步骤：
1)将配方量的琼脂糖于90-100℃用蒸馏水溶解；
2)鼠尾胶原蛋白Ⅰ用0.006mol/L的乙酸溶解，纤粘连蛋白用不含血清、钠镁的培养基溶解，丝素蛋白用氯化钙水醇体系溶解；
3)待琼脂糖溶解，温度降至60-70℃时，将溶解的鼠尾胶原蛋白Ⅰ、纤粘连蛋白和丝素蛋白加入琼脂糖溶液中迅速搅拌并均匀涂覆于聚碳酸酯膜11上，降至室温后，即得所述培养基质层10。
优选的，步骤1)的溶解温度为95℃。
本发明的目的之三在于提供一种体外三维培养宫颈癌细胞的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下方案：
使用所述的宫颈癌细胞三维培养装置，进行宫颈癌细胞三维培养时，先取聚碳酸酯膜11，并将制备好培养基质层10覆盖于聚碳酸酯膜11上，再将宫颈癌细胞接种于所述培养基质层10上，然后将装有所述聚碳酸酯膜11的内筒4置于外筒2内，并打开顶盖1注入适量细胞培养基，调节转轴12后将装置置于细胞培养箱中培养。
具体的，所述宫颈癌细胞包括但不限于Hela、siha、caski、c4-1、DoTc2-4510和C33A。
本发明的目的之四在于提供一种体外研究宫颈癌细胞侵袭的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下方案：
使用所述的体外三维培养宫颈癌细胞的方法后，去除细胞培养基，擦去培养基质层10上的宫颈癌细胞，再结晶紫染色，室温孵育并通过显微镜观察细胞的数目。
本发明的目的之五在于提供所述宫颈癌细胞三维培养装置和所述的培养基质层10的制备方法的一种应用。
具体为，所述的宫颈癌细胞三维培养装置和所述的培养基质层10的制备方法在体外抗宫颈癌药物筛选和细胞毒性检测中的应用。
本发明的有益效果在于：
1)本发明提供的所述宫颈癌细胞三维培养装置和培养方法实用性强，更加接近宫颈癌细胞在体内生长的最佳培养方式，更好地模拟细胞在体内的生长情况，使体外细胞试验所获得的结果更精确；
2)本发明提供的培养基质对细胞无毒副作用，对人和环境友好，并且价格较低，大大降低了细胞三维培养的成本；
3)本发明所述的宫颈癌细胞三维培养装置可应用于体外抗宫颈癌药物筛选和细胞毒性检测中，对宫颈癌的检查、诊断和治疗具有重要的科学意义和商业价值。
附图说明
图1为宫颈癌细胞三维培养装置的示意图；
图中，1为外筒的顶盖，2为外筒，3为细胞培养基，4为内筒，5为内筒底盖，6为内筒顶盖，7为外筒的底盖，8为减速装置，9为电机，10为培养基质层，11为聚碳酸酯膜，12为转轴。
图2为宫颈癌细胞三维培养装置内筒的纵切面剖面图；
图中，10为培养基质层，11为聚碳酸酯膜，13为hela细胞。
图3为宫颈癌细胞侵袭实验结晶紫染色图。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1培养基质层10的制备
所述培养基质层10按重量份计由以下组份组成：鼠尾胶原蛋白Ⅰ10份、琼脂糖50份、纤粘连蛋白5份和丝素蛋白1份，制备方法包括以下步骤：
1)将配方量的琼脂糖于90℃用蒸馏水溶解；
2)鼠尾胶原蛋白Ⅰ用0.006mol/L的乙酸溶解，纤粘连蛋白用不含血清、钠镁的培养基溶解，丝素蛋白用氯化钙水醇体系溶解；
3)待琼脂糖溶解，温度降至60℃时，将溶解的鼠尾胶原蛋白Ⅰ、纤粘连蛋白和丝素蛋白加入琼脂糖溶液中迅速搅拌并均匀涂覆于聚碳酸酯膜11上，降至室温后，即得所述培养基质层10。
实施例2培养基质层10的制备
所述培养基质层10按重量份计由以下组份组成：鼠尾胶原蛋白Ⅰ15份、琼脂糖75份、纤粘连蛋白8份和丝素蛋白2份，制备方法包括以下步骤：
1)将配方量的琼脂糖于95℃用蒸馏水溶解；
2)鼠尾胶原蛋白Ⅰ用0.006mol/L的乙酸溶解，纤粘连蛋白用不含血清、钠镁的培养基溶解，丝素蛋白用氯化钙水醇体系溶解；
3)待琼脂糖溶解，温度降至65℃时，将溶解的鼠尾胶原蛋白Ⅰ、纤粘连蛋白和丝素蛋白加入琼脂糖溶液中迅速搅拌并均匀涂覆于聚碳酸酯膜11上，降至室温后，即得所述培养基质层10。
实施例3培养基质层10的制备
所述培养基质层10按重量份计由以下组份组成：鼠尾胶原蛋白Ⅰ20份、琼脂糖100份、纤粘连蛋白10份和丝素蛋白3份，制备方法包括以下步骤：
1)将配方量的琼脂糖于100℃用蒸馏水溶解；
2)鼠尾胶原蛋白Ⅰ用0.006mol/L的乙酸溶解，纤粘连蛋白用不含血清、钠镁的培养基溶解，丝素蛋白用氯化钙水醇体系溶解；
3)待琼脂糖溶解，温度降至70℃时，将溶解的鼠尾胶原蛋白Ⅰ、纤粘连蛋白和丝素蛋白加入琼脂糖溶液中迅速搅拌并均匀涂覆于聚碳酸酯膜11上，降至室温后，即得所述培养基质层10。
实施例4宫颈癌细胞三维培养装置
如图1所示的一种宫颈癌细胞三维培养装置，所述装置由外筒2、内筒4、减速装置8和电机9构成，所述内筒4由聚碳酸酯膜11、内筒顶盖6、内筒底盖5和实施例1的培养基质层10构成，所述培养基质层10按重量份计由以下组份组成：鼠尾胶原蛋白Ⅰ10-20份、琼脂糖50-100份、纤粘连蛋白5-10份和丝素蛋白1-3份。
所述外筒2的顶盖1可打开并加入细胞培养基3，所述外筒2的底盖7通过转轴12与所述减速装置8连接，所述减速装置8与所述电机9连接。
所述内筒顶盖6和内筒底盖5均与转轴12连接，所述内筒4的筒身为聚碳酸酯膜11，所述聚碳酸酯膜11内面覆有培养基质层10，所述聚碳酸酯膜11可拆卸。
使用时所述内筒4外与筒2之间充满细胞培养基3。所述装置可装细胞培养基的体积为5ml，所述转轴12的转速为5r/min。
实施例5宫颈癌细胞三维培养装置
如图1所示的一种宫颈癌细胞三维培养装置，所述装置由外筒2、内筒4、减速装置8和电机9构成，所述内筒4由聚碳酸酯膜11、内筒顶盖6、内筒底盖5和实施例2的培养基质层10构成，所述培养基质层10按重量份计由以下组份组成：鼠尾胶原蛋白Ⅰ10-20份、琼脂糖50-100份、纤粘连蛋白5-10份和丝素蛋白1-3份。
所述外筒2的顶盖1可打开并加入细胞培养基3，所述外筒2的底盖7通过转轴12与所述减速装置8连接，所述减速装置8与所述电机9连接。
所述内筒顶盖6和内筒底盖5均与转轴12连接，所述内筒4的筒身为聚碳酸酯膜11，所述聚碳酸酯膜11内面覆有培养基质层10，所述聚碳酸酯膜11可拆卸。
使用时所述内筒4外与筒2之间充满细胞培养基3。所述装置可装细胞培养基的体积为10ml，所述转轴12的转速为15r/min。
实施例6宫颈癌细胞三维培养装置
如图1所示的一种宫颈癌细胞三维培养装置，所述装置由外筒2、内筒4、减速装置8和电机9构成，所述内筒4由聚碳酸酯膜11、内筒顶盖6、内筒底盖5和实施例3培养基质层10构成，所述培养基质层10按重量份计由以下组份组成：鼠尾胶原蛋白Ⅰ10-20份、琼脂糖50-100份、纤粘连蛋白5-10份和丝素蛋白1-3份。
所述外筒2的顶盖1可打开并加入细胞培养基3，所述外筒2的底盖7通过转轴12与所述减速装置8连接，所述减速装置8与所述电机9连接。
所述内筒顶盖6和内筒底盖5均与转轴12连接，所述内筒4的筒身为聚碳酸酯膜11，所述聚碳酸酯膜11内面覆有培养基质层10，所述聚碳酸酯膜11可拆卸。
使用时所述内筒4外与筒2之间充满细胞培养基3。所述装置可装细胞培养基的体积为7.5ml，所述转轴12的转速为10r/min。
实施例7宫颈癌细胞侵袭实验
使用实施例4-6所述的宫颈癌细胞三维培养装置(此实施例以实施例4所述的装置为例)，进行宫颈癌细胞三维培养时，先取聚碳酸酯膜11，并将制备好培养基质层10覆盖于聚碳酸酯膜11上，再将1*103个的宫颈癌细胞(Hela、siha、caski、c4-1、DoTc2-4510和C33A均进行了实验，此实施例以Hela为例)接种于所述培养基质层10上(同样的培养基质层10在等量接种细胞后进行结晶紫然后并显微镜观察)，然后将装有所述聚碳酸酯膜11的内筒4置于外筒2内，并打开顶盖1注入适量细胞培养基，调节转轴12后将装置置于细胞培养箱中培养。
培养48h后，去除细胞培养基，擦去培养基质层10上的宫颈癌细胞，结晶紫染色，室温孵育并通显微镜观察细胞的数目。如图3所示，与刚接种hela细胞时的细胞数目对比，培养了48h后的hela细胞因为侵袭原因，细胞数目减少，减少的细胞进入了细胞培养基3，因此说明本发明提供的所述的宫颈癌细胞三维培养装置能很好地模拟细胞在体内的生长情况并正确反映肿瘤细胞的侵袭能力，可应用于体外抗宫颈癌药物筛选和细胞毒性检测中。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (5)
1.一种体外三维培养宫颈癌细胞的方法，其特征在于，使用宫颈癌细胞三维培养的装置进行宫颈癌细胞三维培养，所述装置由外筒（2）、内筒（4）、减速装置（8）和电机（9）构成，所述内筒（4）由聚碳酸酯膜（11）、内筒顶盖（6）、内筒底盖（5）和培养基质层（10）构成，所述培养基质层（10）按重量份计由以下组份组成：鼠尾胶原蛋白Ⅰ10-20份、琼脂糖50-100份、纤粘连蛋白5-10份和丝素蛋白1-3份；培养时先取聚碳酸酯膜（11），并将制备好培养基质层（10）覆盖于聚碳酸酯膜（11）上，再将宫颈癌细胞接种于所述培养基质层（10）上，然后将装有所述聚碳酸酯膜（11）的内筒（4）置于外筒（2）内，并打开顶盖（1）注入适量细胞培养基，调节转轴（12）后将装置置于细胞培养箱中培养；所述内筒顶盖（6）和内筒底盖（5）均与转轴（12）连接，所述内筒（4）的筒身为聚碳酸酯膜（11），所述聚碳酸酯膜（11）内面覆有培养基质层（10），所述聚碳酸酯膜（11）可拆卸；所述外筒（2）的顶盖（1）可打开并加入细胞培养基（3），所述外筒（2）的底盖（7）通过转轴（12）与所述减速装置（8）连接，所述减速装置（8）与所述电机（9）连接；所述装置使用时，所述内筒（4）与外筒（2）之间充满细胞培养基3；所述培养基质层（10）制备方法包括以下步骤：
1）将配方量的琼脂糖于90-100℃用蒸馏水溶解；
2）鼠尾胶原蛋白Ⅰ用0.006mol/L的乙酸溶解，纤粘连蛋白用不含血清、钠镁的培养基溶解，丝素蛋白用氯化钙水醇体系溶解；
3）待琼脂糖溶解，温度降至60-70℃时，将溶解的鼠尾胶原蛋白Ⅰ、纤粘连蛋白和丝素蛋白加入琼脂糖溶液中迅速搅拌并均匀涂覆于聚碳酸酯膜（11）上，降至室温后，即得所述培养基质层（10）。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞培养基的体积为5-10 ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转轴（12）的转速为5 r/min-15r/min。
4.一种体外研究宫颈癌细胞侵袭的方法，其特征在于，使用权利要求1所述的体外三维培养宫颈癌细胞的方法后，去除细胞培养基，擦去培养基质层（10）上的宫颈癌细胞，结晶紫染色，室温孵育并通显微镜观察细胞的数目。
5.权利要求1-3任一项所述的方法在体外抗宫颈癌药物筛选和细胞毒性检测中的应用。
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