CN110151590A - 视黄醇视黄酸酯纳米制剂及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了视黄醇视黄酸酯纳米制剂及其制备方法和用途，具体地，本发明制备的纳米制剂含有黄醇视黄酸酯、抗坏血酸棕榈酸酯和α‑生育酚作为活性成分，表现出了显著得协同效果，能够显著的提高皮肤内透明质酸水平，对皮肤无刺激，并且表现出了明显的抗衰老效果。

Description

视黄醇视黄酸酯纳米制剂及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地，本发明涉及一种视黄醇视黄酸酯纳米制剂及其制备方法和用途。

背景技术

维生素A(vitamin A,VA)是属全反式视黄醇(alltrans-retinol)的一组有活性的β-紫香酮(β-ionone)的衍生物,包括视黄醇、视黄醛、视黄酸及酯类。VA是人体必需的微量营养素,对视觉发育、免疫功能、生殖系统、生长发育等均有重要作用。

由于VA衍生物(视黄醇、视黄酸等)对光、氧气、温度、金属离子比较敏感，而且比较容易引发皮肤红肿、痒、紧绷等刺激，VA衍生物在护肤品中的应用一直比较受限。

视黄醇视黄酸酯是通过视黄醇的羟基和视黄酸的酯化反应得到的。视黄醇视黄酸酯保留了环端基和侧链烯基，依然具有视黄醇和视黄酸的生物活性，体内测试表明：促进皮肤再生能力要优于视黄醇和视黄酸。视黄醇视黄酸酯的IC 50比视黄醇高60％，因此视黄醇视黄酸酯的细胞毒性更低，使用更安全。视黄醇视黄酸酯在改善了视黄醇的光学稳定定、化学稳定性的同时，减少了视黄醇和黄酸的刺激性。

视黄醇视黄酸酯的生物利用度较差，直接添加到制剂中很难发挥应有的效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种视黄醇视黄酸酯纳米制剂及其制备方法和用途。

本发明的第一方面，提供了一种视黄醇视黄酸酯纳米制剂，所述视黄醇视黄酸酯纳米制剂为脂质体纳米制剂，并且包括：

视黄醇视黄酸酯、抗坏血酸棕榈酸酯和α-生育酚。

在另一优选例中，所述视黄醇视黄酸酯纳米制剂的平均粒径为10-50nm。

在另一优选例中，所述视黄醇视黄酸酯纳米制剂包括：

视黄醇视黄酸酯 2-10重量份；

抗坏血酸棕榈酸酯 0.1-1重量份；和

α-生育酚 0.1-1重量份。

在另一优选例中，所述视黄醇视黄酸酯纳米制剂包括：

视黄醇视黄酸酯 4-6重量份；

抗坏血酸棕榈酸酯 0.2-0.5重量份；和

α-生育酚 0.2-0.5重量份。

本发明的第二方面，提供了一种化妆品组合物，所述化妆品组合物中包括本发明第一方面所述的视黄醇视黄酸酯纳米制剂。

在另一优选例中，所述化妆品组合物中，所述视黄醇视黄酸酯纳米制剂的含量为0.01％-10％。

在另一优选例中，所述化妆品组合物中，所述视黄醇视黄酸酯纳米制剂的含量为0.05％-5％。

在另一优选例中，所述化妆品组合物中，所述视黄醇视黄酸酯纳米制剂的含量为0.5％-3％。

在另一优选例中，所述化妆品的剂型为固体剂型、半固体剂型、或液体剂型，如溶液、凝胶、膏霜、乳液、膏剂、霜剂、糊剂、饼、粉剂、贴剂等。

本发明的第三方面，提供了一种视黄醇视黄酸酯纳米制剂的制备方法，所述方法包括步骤：

(1)取视黄醇视黄酸酯、抗坏血酸棕榈酸酯和α-生育酚溶于乙醇中，得混合液一；

(2)取膜材溶于混合液一中，加热至约40℃，1330Pa下除去溶液中的乙醇得混合液二；

(3)将混合液二加入至PBS缓冲液中，得混合液三；

(4)将混合液三转移至高压均质机中均质后,通过0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制得纳米脂质体即为所述视黄醇视黄酸酯纳米制剂。

在另一优选例中，所述步骤(1)的混合液一包括：

视黄醇视黄酸酯 2-10重量份；

抗坏血酸棕榈酸酯 0.1-1重量份；和

α-生育酚 0.1-1重量份。

在另一优选例中，所述步骤(1)的混合液一包括：

视黄醇视黄酸酯 4-6重量份；

抗坏血酸棕榈酸酯 0.2-0.5重量份；和

α-生育酚 0.2-0.5重量份。

本发明的第四方面，提供了本发明第一方面所述的视黄醇视黄酸酯纳米制剂的用途，用于制备化妆品、保健品或药物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了制得的脂质体纳米制剂的电镜照片。

图2显示了纳米制剂粒径分布。

图3为小鼠组织切片结果。

图4为受试者眼周肌肤照片。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种视黄醇视黄酸酯纳米制剂及其制备方法，本发明制备的纳米制剂含有黄醇视黄酸酯、抗坏血酸棕榈酸酯和α-生育酚作为活性成分，表现出了显著得协同效果，能够显著的提高皮肤内透明质酸水平。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

本发明提供了一种稳定的含有黄醇视黄酸酯、抗坏血酸棕榈酸酯和α-生育酚作为活性成分得纳米脂质体制剂。

脂质体(Liposomes)是由磷脂、胆固醇等为膜材包合而成。磷脂分散在水中时能形成多层微囊，且每层均为脂质双分子层，各层之间被水相隔开，这种微囊就是脂质体。脂质体可分为单室脂质体、多室脂质体。由于生物体质膜的基本结构也是磷脂双分子层膜，脂质体具有与生物体细胞相类似的结构，因此有很好的生物相容性。

磷脂是构成脂质体的主要化学成分，其中最具有代表性的是卵磷脂。卵磷脂主要来自蛋黄和大豆，制备成本低，性质稳定，属于中性磷脂。磷脂酰胆碱是形成许多细胞膜的主要成分，也是制备脂质体的主要原料。

本发明提供的纳米脂质体选用的膜材可以为磷脂和胆固醇，其中磷脂包括但不限于大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂。

胆固醇也是脂质体另一个重要组成成分，它是许多天然生物膜的重要成分，本身并不形成膜结构，但是能够插入磷脂膜中。加入胆固醇可以改变脂膜的相变温度，从而影响膜的通透性和流动性。因此胆固醇具有稳定磷脂双分子膜的作用。

本发明的主要优点在于：

1)本发明制备的纳米制剂含有黄醇视黄酸酯、抗坏血酸棕榈酸酯和α-生育酚作为活性成分，表现出了显著得协同效果，能够显著的提高皮肤内透明质酸水平。

2)本发明制备的纳米制剂，对皮肤无刺激，并且表现出了明显的抗衰老效果。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1制备纳米制剂

参考专利文献CN1411368A中的方法制备纳米制剂。将视黄醇视黄酸酯5g、抗坏血酸棕榈酸酯0.3g和α-生育酚0.3g溶于乙醇中，总计100mL混合溶液。将蛋黄卵磷脂50g溶于混合溶液中，加热至40℃，在1330Pa下除去溶液中的乙醇溶剂。剩余液体加入到500ml PBS缓冲液中，搅拌分散。

使用高压乳化机将上述分散溶液乳化，乳化后的分散液通过0.22μm微孔滤膜过滤除菌。将15g滤液灌装于冻干瓶中，然后将冻干瓶放入冻干机中，在4000Pa下室温运行进行气体脱气。脱气后在40℃，1330Pa条件下进行浓缩获得浓缩液。将浓缩液冷却至-40℃，然后在高真空条件(1.33Pa)下将溶液温度升高至40℃使溶液起泡。在30℃，13.3Pa条件下真空干燥该鼓泡溶液，真空干燥后用氮气增压至大气压后将冻干瓶密封，获得的脂质体纳米制剂命名为纳米制剂A。

图1显示了制得的脂质体纳米制剂的电镜照片；

图2显示了纳米制剂粒径分布。

通过上述方法分别制备仅包含视黄醇视黄酸酯的脂质体纳米制剂(命名为纳米制剂B)；仅包含抗坏血酸棕榈酸酯的脂质体纳米制剂(命名为纳米制剂C)；仅包含α-生育酚的脂质体纳米制剂(命名为纳米制剂D)；包含视黄醇视黄酸酯和抗坏血酸棕榈酸酯的脂质体纳米制剂(命名为纳米制剂E)；以及,包含视黄醇视黄酸酯和α-生育酚的脂质体纳米制剂(命名为纳米制剂F)；其中，各活性物质的用量同上。

实施例2促进体内粘多糖(透明质酸)的表达测试

1.实验动物

健康雄性6～8周龄SPF级小鼠，体重为(23±2)g。在温度(25±2)℃、湿度(40±10)％的环境下饲养。

2.动物模型的建立、分组及给药

随机将小鼠分为空白组、模型组、基质组、阳性对照组、实验组I、实验组II、实验组III、实验组IV、实验组V，每组6只小鼠。

小鼠适应性饲养l周后，用6％硫化钠进行脱毛处理，裸露出3cm×3cm的皮肤。除空白组外，其余各组参照文献[ZHONG W，LIU N，XIE Y，et a1.Antioxidant and antiageingactivities of mycelial polysaceharides from Lepista sordid[J].Int J BiolMacromol，2013，60(6)：355—359]建立皮肤衰老模型，每天皮下注射D-半乳糖1.09/(kg.d)。

空白组每天皮下注射与D-半乳糖等体积的生理盐水，共10天；

造模后基质组涂抹常规护肤乳液基质10mg/cm²；

实验组I涂抹含1％纳米制剂A的护肤乳液基质10mg/cm²；

实验组II涂抹含1％纳米制剂B的护肤乳液基质10mg/cm²；

实验组III涂抹含1％纳米制剂C的护肤乳液基质10mg/cm²；

实验组IV涂抹含1％纳米制剂D的护肤乳液基质10mg/cm²；

实验组V涂抹含1％纳米制剂E的护肤乳液基质10mg/cm²；

实验组VI涂抹含1％纳米制剂F的护肤乳液基质10mg/cm²。

模型组和空白组不予处理。连续涂抹28天后禁食24h，将小鼠皮肤清洁后，采用颈椎脱臼法处死小鼠，迅速将皮肤剪下并冷冻保存。另设皮肤刺激组小鼠7只用于皮肤刺激性实验。

护肤乳液基质组分如下：柠檬酸单甘脂1.5％、霍霍巴油2％、棕榈酸异丙酯3％、吐温-60 3％、蜂蜡3％、液体石蜡3％、卡波姆941 0.1％、甘油3％、羟乙基纤维素0.1％、EDTA二钠0.01％、三乙醇胺0.01％，余量为蒸馏水，上述各组分合计为100％。

急性多次皮肤刺激性实验

将皮肤刺激组剃毛并清洁后的小鼠背侧划分为两个区域(2.5cm×2.5cm)，左侧涂抹各组的护肤乳0.5g，右侧为空白对照，用纱布覆盖后再用胶布固定，24h后清洁皮肤，观察1h、24h、48h后涂抹部位的皮肤反应。

连续涂抹14天，观察并记录涂抹部位的皮肤反应。参照《化妆品安全性评价程序和方法》对皮肤进行刺激反应评价和刺激强度评价。

结果显示，除实验组III、实验组V外，其余各实验组的皮肤与未涂护肤乳皮肤相比，未出现水肿和红斑的现象，证明本发明护肤乳对皮肤无刺激性。经长时间多次给小鼠背部皮肤涂抹本发明护肤乳后，与空白皮肤相比，涂抹后的皮肤未见红斑和水肿的现象，证明长时间涂抹本发明护肤乳对肌肤无刺激性。实验组III的皮肤表现出了明显的红斑，连续涂抹14天后出现了严重的水肿。实验组V的副作用较弱，但是还是能够观察到轻微的皮肤红斑。该结果表明，抗坏血酸棕榈酸酯纳米制剂对皮肤有较严重的刺激性，而视黄醇视黄酸酯的存在，能够显著降低抗坏血酸棕榈酸酯的副作用，在视黄醇视黄酸酯和α-生育酚同时存在的情况下，可以完全消除抗坏血酸棕榈酸酯的副作用。

小鼠皮肤的表观特征观察

观察各组小鼠背部裸露皮肤的色泽、光滑程度、皱纹等外观的形态。

观察小鼠皮肤的外观，发现空白组皮肤光滑，肤色润泽，无皱纹产生。模型组小鼠皮肤干燥、松弛，色泽暗沉并有皱纹形成。基质组与模型组相比，改善效果不明显。除实验组III的副作用显著，在第14天停止实验外，其余各实验组小鼠的皮肤状态与模型组相比均有改善，其中，实验组I的皮肤状态较其它各组的状态更好，干燥缓解，皮肤色泽改善，皱纹明显减轻。

小鼠皮肤透明质酸(HA)含量测定

取0.5g的小鼠皮肤组织，用PBS缓冲溶液制备10％的匀浆液，离心，取上清液，按照小鼠透明质酸(HA)检测试剂盒(购自上海研生生化试剂有限公司)说明书进行操作，测定小鼠皮肤中HA的含量。实验结果如下表所示：

组别	HA含量(mg/g)	组别	HA含量(mg/g)
				空白组	2.64	实验组II	2.56
模型组	1.86	实验组IV	2.28
				基质组	2.24	实验组V	2.63
实验组I	2.82	实验组VI	2.47

结果表明，实验组I能够显著促进小鼠体内透明质酸的表达，连续使用后，皮肤中透明质酸的含量比空白组要高出6.8％，显示出视黄醇视黄酸酯、抗坏血酸棕榈酸酯和α-生育酚三者的组合制备的纳米制剂具有显著的协同效果。

显微观察小鼠组织切片中的表皮层和真皮层，透明质酸与蛋白(HABP)结合会有染色反应，部分结果如图3所示，从图中可以明显的观察到，实验组I的切片中透明质酸含量明显高于空白组组织切片中透明质酸的含量。而模型组中，透明质酸含量显著降低。

实施例3对UV引起的衰老的修复测试

选取60名志愿者参与试验，年龄25-45岁，随机分为3组：A组、B组、C组。

其中A组使用含1％纳米制剂A的护肤乳液基质；

B组使用含1％纳米制剂B的护肤乳液基质；

C组使用含1％纳米制剂E的护肤乳液基质。

每天早晚各一次，分别在测试的第4、8、12周对受试者进行回访。使用VisiometerSV 600(CK,Germany)记录受试者在不同测试阶段眼周皮肤状况。

测试结果：

A组受试者的肌肤均得到了明显改善,100％的的A组受试者表示她们眼周肌肤的弹性得到了改善，60％(12/20)的B组受试者表示眼周肌肤弹性得到改善,70％(14/20)的C组受试者表示眼周肌肤弹性得到改善。

典型的结果如图4所示。

第12周，A组受试者可见皱纹改善为1.28％，高于B组的0.61％和C组的0.72％。

对光损伤的修复表现，A组提升了8.61％，B组提升了4.43％，C组提升了4.68％。

除此之外，A组的“边际效应递减”(产品用的久了，效果渐渐看不到了)较弱，A组坚持使用产品在一年时间内都可以看到皮肤的改变。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种视黄醇视黄酸酯纳米制剂，其特征在于，所述视黄醇视黄酸酯纳米制剂为脂质体纳米制剂，并且包括：

视黄醇视黄酸酯、抗坏血酸棕榈酸酯和α-生育酚。

2.如权利要求1所述的视黄醇视黄酸酯纳米制剂，其特征在于，所述视黄醇视黄酸酯纳米制剂的平均粒径为10-50nm。

3.如权利要求1所述的视黄醇视黄酸酯纳米制剂，其特征在于，所述视黄醇视黄酸酯纳米制剂包括：

视黄醇视黄酸酯 2-10重量份；

抗坏血酸棕榈酸酯 0.1-1重量份；和

α-生育酚 0.1-1重量份。

4.如权利要求1所述的视黄醇视黄酸酯纳米制剂，其特征在于，所述视黄醇视黄酸酯纳米制剂包括：

视黄醇视黄酸酯 4-6重量份；

抗坏血酸棕榈酸酯 0.2-0.5重量份；和

α-生育酚 0.2-0.5重量份。

5.一种化妆品组合物，其特征在于，所述化妆品组合物中包括权利要求1所述的视黄醇视黄酸酯纳米制剂。

6.如权利要求5所述的化妆品组合物，其特征在于，所述化妆品组合物中，所述视黄醇视黄酸酯纳米制剂的含量为0.01％-10％。

7.如权利要求5所述的化妆品组合物，其特征在于，所述化妆品的剂型为固体剂型、半固体剂型、或液体剂型。

8.如权利要求5所述的化妆品组合物，其特征在于，所述化妆品的剂型为溶液、凝胶、膏霜、乳液、膏剂、霜剂、糊剂、饼、粉剂、贴剂等。

9.如权利要求1所述的视黄醇视黄酸酯纳米制剂的用途，其特征在于，用于制备化妆品、保健品或药物。

10.一种视黄醇视黄酸酯纳米制剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)取视黄醇视黄酸酯、抗坏血酸棕榈酸酯和α-生育酚溶于乙醇中，得混合液一；

(2)取膜材溶于混合液一中，加热至约40℃，1330Pa下除去溶液中的乙醇得混合液二；

(3)将混合液二加入至PBS缓冲液中，得混合液三；

(4)将混合液三转移至高压均质机中均质后,通过0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制得纳米脂质体即为所述视黄醇视黄酸酯纳米制剂。