CN110133262B

CN110133262B - 一种细菌检测试剂盒

Info

Publication number: CN110133262B
Application number: CN201910337253.0A
Authority: CN
Inventors: 李娟�; 庞博; 赵超; 徐坤; 王娟; 宋秀玲; 李金华
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2019-04-25
Filing date: 2019-04-25
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2039-04-25
Also published as: CN110133262A

Abstract

本发明公开了双标记金纳米棒探针，它是由脲酶溶液逐滴加入金纳米棒的混悬液中，混旋，逐滴加入抗金黄色葡萄球菌抗体溶液混旋；离心、弃上清得到的；该双标记探针通过脲酶的催化作用和IgY的特异性识别作用，将SA的数量信号转化为溶液pH值变化；同时提供了一种金黄色葡萄球菌检测试剂盒，它包括：双标记金纳米棒探针、非特异性磁珠、饱和尿素、酚酞试纸；所述的双标记金纳米棒探针用脲酶和抗金黄色葡萄球菌抗体标记；用酚酞试纸快速检测结果，由白色变为洋红色；本发明优势：该试剂盒操作简便；检测结果可在自然光下通过肉眼进行判读，无需借助任何仪器；且可与标准比色卡进行对比，获取半定量检测结果；检测快速，可在20分钟内完成。

Description

一种细菌检测试剂盒

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种细菌检测试剂盒。

背景技术

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是一种重要的人畜共患病致病菌，是与食源性疾病相关的五大病原体之一，可引起多种严重感染。金黄色葡萄球菌由于能耐受大范围的pH、温湿度，在自然界中分布广泛，食品受污染的机会很多，是引起食物中毒的主要致病菌之一。随着抗生素的广泛使用，出现了大量的耐药金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌所引起的疾病已成为全球性的公共卫生问题，严重危害人类安全与健康。研究表明，30%-50%的普通人群是SA的携带者。因此，在食品的制备和运输过程中，产品很容易受到污染。据报道，即使在食品供应最安全的美国，每年也有24万余人感染SA，从而造成的医疗费用高达167,597,860美元/年。同时，金黄色葡萄球菌也是引起奶牛患乳房炎的重要病原菌，给养殖业造成巨大的经济损失。目前我国对于金黄色葡萄球菌包括耐药金黄色葡萄球菌的检测方法以传统的微生物培养、生化鉴定等为主，有必要建立一种准确、快速、灵敏的检测方法。

传统的培养法是最常见、技术最成熟的SA检测方法。然而，它的过程耗时长，不适于应对突发食品安全事件。为了加快检测速度，研究者们开发了许多替代方法，如使用核酸扩增技术或先进的设备，检测时间可从2-4天减少到几个小时，甚至几十分钟。但是这些技术对专业人员和精密仪器的依赖仍然限制了它们的广泛应用。此外，复杂的材料加工大大提高了总检测成本。

纳米技术的出现为克服上述障碍提供了可能。近年来，利用纳米粒子获得更简单的操作和更低的成本成为人们关注的焦点。2016年，Bhaisare等人开发了一种非特异性磁珠(nMB)，即用碳点修饰的氧化铁纳米颗粒(Fe₃O₄NP)。由于磁性纳米颗粒表面附着有碳点，nMB可以有效地、非特异性地富集各种革兰氏阳性或阴性细菌。与传统的免疫磁分离探针相比，nMB合成后可直接使用，无需标记或修饰抗体。这意味着加工成本和检测成本大大降低。毫无疑问，在复杂的基质中，nMB是一种方便、经济、强大的细菌富集、检测工具。

纳米金粒子(AuNP)是金的微小颗粒，其直径在1~100nm，具有高电子密度、介电特性和催化作用，能与多种生物大分子结合，且不影响其生物活性。因为它也可以很容易地合成和功能化，在生物传感器方面，纳米金主要被设计为免疫传感器，是利用抗原-抗体特异性性结合而导致检测信号变化设计而成。为了使纳米颗粒不仅能够识别目标物，而且能够催化底物，多种双标记AuNP探针被开发出来。其中，大多数研究人员选择金纳米球（AuNS）作为载体。但有研究表明，在同等条件下，吸附在金纳米棒(AuNR)表面的蛋白质明显多于吸附在金纳米球（AuNS）表面的。Hinterwirth等人和Joshi等人也得到了类似的结果。因此，我们可以合理地推断AuNR能够同时结合更多的抗体和酶，而双标记AuNR探针的性能优于双标记AuNS探针。但据我们所知，双标记AuNR探针目前还没有被应用于SA的检测。

发明内容

本发明目的是为解决现有的细菌的检测方法耗时长、成本高的问题，而提供一种方便、经济的细菌检测试剂盒。

双标记金纳米棒探针，它是由下述方法制备：

1）将脲酶溶液逐滴加入金纳米棒的混悬液中，混旋孵育；

2）逐滴加入抗细菌抗体溶液混旋孵育；

3）离心、弃上清得双标记金纳米棒探针；

所述的步骤1）为将120µL浓度为8-12mg/mL的脲酶溶液逐滴加入1200µL金纳米棒的混悬液中，缓慢混旋5分钟；

所述的步骤2）为逐滴加入120µl浓度为0.25-1mg/mL 的抗细菌抗体溶液，缓慢混旋25分钟；

所述的金纳米棒是采用种子生长法制备的；

所述的抗细菌抗体为抗细菌卵黄抗体（IgY）。所述的细菌为金黄色葡萄球菌。

一种细菌检测试剂盒，它包括：双标记金纳米棒探针、非特异性磁珠、饱和尿素、酚酞试纸；所述的双标记金纳米棒探针是用脲酶和抗细菌抗体标记的；

所述的双标记金纳米棒探针浓度为：0.5-1.5 mg/mL；

所述的非特异性磁珠为浓度0.5-2mg/mL的含有非特异性磁珠的混悬液；

所述的细菌为金黄色葡萄球菌；

所述的双标记金纳米棒探针是由上述方法制备。

本发明提供了双标记金纳米棒探针，它是由下述方法制备：1）将脲酶溶液逐滴加入金纳米棒的混悬液中，混旋孵育；2）逐滴加入抗金黄色葡萄球菌抗体溶液混旋孵育；3）离心、弃上清得双标记金纳米棒探针；该双标记探针通过脲酶的催化作用和IgY的特异性识别作用，将SA的数量信号转化为溶液pH值的变化；同时提供了一种金黄色葡萄球菌检测试剂盒，它包括：双标记金纳米棒探针、非特异性磁珠、饱和尿素、酚酞试纸；所述的双标记金纳米棒探针是用脲酶和抗金黄色葡萄球菌抗体标记的；用酚酞试纸片快速可视化检测结果，由白色变为洋红色；本发明优势：（1）该试剂盒操作简便，适用于缺乏专业技术人员的基层食品监察部门使用；（2）检测结果可在自然光下通过肉眼进行判读，无需借助任何仪器；且可与标准比色卡进行对比，获取半定量检测结果；（3）检测快速，可在20分钟内完成。

附图说明

图1 金纳米棒的透射电镜图；

图2 非特异性磁珠的透射电镜图；

图3 检测流程图。

具体实施方式

实施例1 金纳米棒的制备

金纳米棒采用种子生长法制备，具体步骤如下：

1）配置种子液：96µl 浓度为25 mM的三水合四氯金酸水溶液加入到7.5mL 浓度为0.1M 的十六烷基三甲基溴化铵水溶液中；随后再加入0.5-2mL 浓度为0.02M 的硼氢化钠水溶液；当混合溶液变为深棕色后，在30℃下搅拌1-3小时，所得溶液即为种子液；

2）配置生长液：将100mL 浓度为0.1M 的十六烷基三甲基溴化铵水溶液，2mL 浓度为0.5M 的硫酸，1.96mL 浓度为25mM 的三水合四氯金酸水溶液，0.5-2mL 浓度为0.01M 的硝酸银水溶液和0.5-1mL 浓度为0.1M 的抗坏血酸水溶液充分混合，所得混合溶液即为生长液；

3）将0.1-1mL所述种子液加入50-100mL 所述生长液中，充分混合；30℃静置生长10-15小时；9000 rpm 离心15分钟，浓缩至20 mL；使用浓度为0.2M 的碳酸钾水溶液将溶液的pH 值调节至6.0-8.0，即得含有金纳米棒的混悬液，待用；

金纳米棒透射电镜图如图1所示；所述金纳米棒长约40-50nm，直径约10-15nm。

实施例2双标记金纳米棒探针的制备

将120µL浓度为8-12mg/mL的脲酶溶液逐滴加入1200µL实施例1中所述含有金纳米棒的混悬液中，缓慢混旋5分钟；随后，逐滴加入120µl浓度为0.25-1mg/mL 的抗金黄色葡萄球菌卵黄抗体溶液，缓慢混旋25分钟；8000 rpm 离心10分钟，弃上清，沉淀部分即为双标记金纳米棒探针；

用300-500µl超纯水重悬，即为含有双标记金纳米棒探针的混悬液；通过使用可见光-紫外分光光度计测量，双标记金纳米棒探针的吸收光谱较无标记金纳米棒的吸收光谱发生明显红移，证明双标记金纳米棒探针被成功制备。

实施例3非特异性磁珠的制备

非特异性磁珠为表面包裹有碳点的Fe₃O₄纳米粒子，采用两步法合成；

步骤一：制备Fe₃O₄纳米粒子核心：0.5-1g四水合氯化亚铁与1-2g六水合氯化铁充分溶解于30mL超纯水；逐滴加入35mL 28%（w/v）氨水；在氮气的保护下，80℃下搅拌5小时；用永磁体从反应溶液中分离出黑色的固体物质，用超纯水清洗，即为Fe₃O₄纳米粒子核心，晾干待用；

步骤二：于Fe₃O₄纳米粒子核心表面修饰碳点：添加0.05-0.2g上述Fe₃O₄纳米粒子核心和0.25-1g壳聚糖于30mL4%（w/v）冰醋酸中，充分混匀；将所得液体移至反应釜中，180℃反应6-24小时；用永磁体从反应溶液中分离出黑色的固体物质，用超纯水清洗，即为非特异性磁珠，晾干待用；

非特异性磁珠透射电镜图如图2所示；所述非特异性磁珠直径约为15-20nm。

实施例4 酚酞试纸的制备

将Fusion 5滤纸浸没在1%（w/v）酚酞溶液中，晾干后，裁剪成直径为5mm的圆形纸片，待用。

实施例5 金黄色葡萄球菌的检测

检测流程图如图3所示；将待测样品液200µL、含有双标记金纳米棒探针的混悬液200µL、浓度为0.5-2mg/mL的含有非特异性磁珠的混悬液（用超纯水重悬）200µL混合，于室温下反应10分钟；磁分离，取200µL上清液；在所取上清液中加入200µL饱和尿素，反应5分钟；将酚酞试纸浸入反应后溶液，观察酚酞试纸颜色变化，判读结果。

本发明方法检测稳定，检测限可低至1000CFU/mL，检测时间短，20分钟内可完成检测，检测结果可直接在自然光下通过肉眼判读。将结果颜色与标准比色卡进行比对，可获取半定量结果。对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157：H7、单核细胞增生性李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、副溶血性弧菌等菌进行检测，只有金黄色葡萄球菌的检测结果呈阳性，其余均为阴性。可见，该方法特异性强，未见假阳性和假阴性结果，结果如表1、表2所示。所有实验均重复三次，结果一致。

实施例6食品污染模拟样品（牛肉）的检测

称取5g牛肉，研磨成肉糜，平铺于平面上，置于紫外灯下照射2小时，以去除其中自然蓄积的病原菌；取1g灭菌后的肉糜，加入10mL灭菌生理盐水，充分混匀，制成食品样品基质；将不同浓度的金黄色葡萄球菌接种于该食品基质，用本发明检测试剂盒对其进行检测；检测结果如表3所示。所有实验均重复三次，结果一致。

实施例7食品污染模拟样品（白菜）的检测

称取5g白菜，研磨成菜糜，平铺于平面上，置于紫外灯下照射2小时，以去除其中自然蓄积的病原菌；取1g灭菌后的菜糜，加入10mL灭菌生理盐水，充分混匀，制成食品样品基质；将不同浓度的金黄色葡萄球菌接种于该食品基质，用本发明检测试剂盒对其进行检测；检测结果如表4所示；所有实验均重复三次，结果一致。

。

Claims

1.一种细菌检测试剂盒，它包括：双标记金纳米棒探针、非特异性磁珠、饱和尿素、酚酞试纸；

所述的双标记金纳米棒探针，它是由下述方法制备：

1）将脲酶溶液逐滴加入金纳米棒的混悬液中，混旋孵育；

2）逐滴加入抗细菌抗体溶液混旋孵育；

3）离心、弃上清得双标记金纳米棒探针。

2.根据权利要求1所述的一种细菌检测试剂盒，其特征在于：所述的抗细菌抗体为抗细菌卵黄抗体。

3.根据权利要求2所述的一种细菌检测试剂盒，其特征在于：所述的细菌为金黄色葡萄球菌。

4.根据权利要求1、2或3所述的一种细菌检测试剂盒，其特征在于：所述的步骤1）为将120µL浓度为8-12mg/mL的脲酶溶液逐滴加入1200µL金纳米棒的混悬液中，缓慢混旋5分钟。

5. 根据权利要求4所述的一种细菌检测试剂盒，其特征在于：所述的步骤2）为逐滴加入120µl浓度为0.25-1mg/mL 的抗金黄色葡萄球菌抗体溶液，缓慢混旋25分钟。

6.根据权利要求5所述的一种细菌检测试剂盒，其特征在于：所述的金纳米棒是采用种子生长法制备的。

7. 根据权利要求6所述的一种细菌检测试剂盒，其特征在于：所述的双标记金纳米棒探针浓度为：0.5-1.5 mg/mL。

8.根据权利要求7所述的一种细菌检测试剂盒，其特征在于：所述的非特异性磁珠为浓度0.5-2mg/mL的含有非特异性磁珠的混悬液。