CN110114674A

CN110114674A - 确定肿瘤样品中存在靶抗原的方法

Info

Publication number: CN110114674A
Application number: CN201780076410.6A
Authority: CN
Inventors: M·盖格尔; C·克莱因
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2016-12-13
Filing date: 2017-12-11
Publication date: 2019-08-09
Anticipated expiration: 2037-12-11
Also published as: CN110114674B; JP7141407B2; JP2020504829A; US20200116727A1; WO2018108759A1; EP3555620A1

Abstract

本发明涉及基于细胞的确定原发肿瘤样品中抗原表达的新测定法。该方法进一步涉及确定原发肿瘤样品中的抗原和蛋白酶表达。该方法允许稳健确定抗原和/或蛋白酶表达，无需消化肿瘤样品。该方法进一步允许为治疗肿瘤选择抗体和选择蛋白酶可切割接头。

Description

确定肿瘤样品中存在靶抗原的方法

技术领域

本发明涉及基于细胞的确定原发肿瘤样品中抗原表达的新测定法。该方法进一步涉及确定原发肿瘤样品中的抗原和蛋白酶表达。该方法允许稳健确定抗原和/或蛋白酶表达，无需消化肿瘤样品。该方法进一步允许为治疗肿瘤选择抗体及选择蛋白酶可切割接头。

背景技术

直至现在，化疗仍是一个最常使用的癌症疗法。另外，基于抗体的疗法已经历最近15年演进并且现在代表肿瘤治疗方面有价值的组合或化疗方案替代。不同于化疗，抗体疗法靶向癌细胞上的特定抗原，因此允许定向性更强的治疗，因而减少对健康组织的副作用。在基于抗体的治疗用药剂开发中，需要多种测定法以鉴定最佳候选物来投入临床试验并最终投入市场。在最早期临床前阶段，必须生成抗体并分析它们的靶特异性，以及它们对靶的亲和力和功能。可以使用各种蛋白质-蛋白质相互作用测定法，如基于FRET的方法、表面等离子体共振(SPR)、荧光激活细胞分选法(FACS)或Alpha Screen^TM，分析结合特性。通常在多种基于细胞的测定法中检验功能，所述测定法设计成尽可能逼真模仿生理情景，以鉴定在动物模型中待测试的最佳候选物，之后进入临床试验。通常使用原代细胞、肿瘤细胞系或设计成特定途径激活时表达报道分子的报道细胞，实施这些功能测定法。

但是，培养的细胞系或原代细胞可能不是肿瘤组织的全面模型，所述肿瘤组织通常是更复杂的细胞三维组合体。在另一方面，功能测定法对于培养的细胞稳健和直观，因为可以对单一细胞测量试验参数，如抗体结合或功能，例如，靶细胞杀伤作用。因为数个障碍，直接评估肿瘤样品难得多。除肿瘤细胞之外，肿瘤还含有复杂的胞外基质环境，其部分地或完全由肿瘤中的细胞分泌胞外基质组分产生。胞外基质可以限制抗体渗入肿瘤组织，而且还可能干扰肿瘤细胞上细胞表面靶的可及性。但是，胞外组分也可以含有可能对靶向的免疫疗法有价值的额外抗原元件或功能元件。

总之，需要更全面和稳健的在肿瘤样品、尤其衍生自肿瘤活组织检查的肿瘤样品上直接确定抗体结合作用和功能的测定法。

最近，靶向的免疫疗法(激活免疫系统自身元件以攻击肿瘤细胞)正变成克服肿瘤免疫耐受性的战斗中的利剑。包含能够识别肿瘤细胞的结合部分和活化免疫细胞的效应子部分的双特异性构建体已经显示有前景的结果。但是，在一些情况下，可能需要遮蔽效应子部分直至递送双特异性分子至肿瘤为止，以减少非特异性全身性副作用。一个实现这个目的的方案是用抗独特型结合部分遮蔽效应子部分，所述抗独特型结合部分能够可逆结合效应子部分并使用蛋白酶可切割接头，将起到遮蔽作用的部分与双特异性免疫治疗抗体连接。熟知肿瘤，尤其恶性肿瘤，包含在健康成年组织中不表达或不以其活性形式存在的蛋白酶。具有蛋白酶可切割接头的构建体因此能用来导引新类别的双特异性抗体的活性至肿瘤组织。

随着免疫疗法用构建体的复杂性增加，对于全面环境下测量抗体结合作用和功能的测定法的要求也增加。在培养的细胞上的结合测定法可能不足以模拟肿瘤组织中的复杂环境。

本发明的发明人开发了一种在肿瘤样品(例如，肿瘤活组织检查样品)上将抗体和抗体样构建体的结合作用和功能评估直接组合的新测定法。这种新测定法可用于例如新抗体构建体早期开发中的筛选或表征目的以及用于选择合适的抗体治疗癌症。

这种新测定法代表了在肿瘤样品中筛选结合和靶向功能性的有价值工具，所述工具将允许在候选药物开发早期鉴定最好的构建体并且为患者确定合适的治疗。

发明概述

提供了一种确定肿瘤样品中存在靶抗原的体外方法，所述体外方法包括步骤：

i)提供肿瘤样品；

ii)提供报道细胞，所述报道细胞包含信号转导性细胞表面受体控制下的报道基因；

iii)向肿瘤样品添加双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：

a)能够与靶抗原特异性结合的第一抗原结合部分；和

b)能够与信号转导性细胞表面受体特异性结合的第二抗原结合部分；

iv)向肿瘤样品添加报道细胞；和

v)通过确定报道基因的表达，确定靶抗原的存在。

在一个实施方案中，靶抗原由肿瘤细胞表达。

在一个实施方案中，报道基因表达提示第一抗原结合部分与靶抗原结合。

在一个实施方案中，步骤iii)的双特异性抗体额外地包含c)通过蛋白酶可切割接头与第二抗原结合部分共价连接的掩蔽部分，其中掩蔽部分能够与第二抗原结合部分的独特型特异性结合，由此可逆地遮蔽第二抗原结合部分。

在一个实施方案中，蛋白酶切割蛋白酶可切割接头，其中第二抗原结合部分去遮盖。

在一个实施方案中，蛋白酶由肿瘤细胞表达。

在一个实施方案中，报道基因表达提示肿瘤样品中蛋白酶表达。

在一个实施方案中，肿瘤样品是肿瘤组织样品，尤其来自患者的活组织检查样品。

在一个实施方案中，肿瘤样品未消化。

在一个实施方案中，肿瘤样品经消化，尤其经胶原酶或透明质酸酶消化。

在一个实施方案中，肿瘤样品含有死细胞，尤其多于10％的死细胞。

在一个实施方案中，蛋白酶表达提示恶性肿瘤。

在一个实施方案中，信号转导性细胞表面受体与反应元件功能性连接。

在一个实施方案中，反应元件控制报道基因的表达。

在一个实施方案中，反应元件是NF-κB途径的部分。

在一个实施方案中，反应元件包含具有SEQ ID NO：68、69、70、71或72的DNA序列的至少一个DNA重复序列。

在一个实施方案中，反应元件包含SEQ ID NO：73、74、75或76的DNA序列。

在一个实施方案中，报道基因编码荧光蛋白或发光蛋白。

在一个实施方案中，报道基因编码绿色荧光蛋白(GFP)或萤光素酶。

在一个实施方案中，报道细胞包含编码反应元件控制下的报道基因的DNA序列和编码信号转导性细胞表面受体的DNA序列。

在一个实施方案中，报道细胞包含具有SEQ ID NO：68、69、70、71或72的DNA序列的至少一个DNA重复序列，其中所述DNA重复序列与报道基因有效连接并且其中一旦第二抗原结合部分与信号转导性细胞表面受体结合，则报道基因表达。

在一个实施方案中，第二抗原结合部分能够与CD3特异性结合。

在一个实施方案中，蛋白酶可切割接头包含蛋白酶识别序列。

在一个实施方案中，蛋白酶识别序列选自：

a)RQARVVNG(SEQ ID NO：45)；

b)VHMPLGFLGPGRSRGSFP(SEQ ID NO：46)；

c)RQARVVNGXXXXXVPLSLYSG(SEQ ID NO：47)；

d)RQARVVNGVPLSLYSG(SEQ ID NO：48)；

e)PLGLWSQ(SEQ ID NO：49)；

f)VHMPLGFLGPRQARVVNG(SEQ ID NO：50)；

g)FVGGTG(SEQ ID NO：51)；

h)KKAAPVNG(SEQ ID NO：52)；

i)PMAKKVNG(SEQ ID NO：53)；

j)QARAKVNG(SEQ ID NO：54)；

k)VHMPLGFLGP(SEQ ID NO：55)；

l)QARAK(SEQ ID NO：56)；

m)VHMPLGFLGPPMAKK(SEQ ID NO：57)；

n)KKAAP(SEQ ID NO：58)；和

o)PMAKK(SEQ ID NO：59)，其中X是任何氨基酸。

在一个实施方案中，蛋白酶选自金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、和组织蛋白酶。

在一个实施方案中，金属蛋白酶是基质金属蛋白酶(MMP)，尤其MMP9或MMP2。

在一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶是Matriptase。

在一个实施方案中，掩蔽部分与第二抗原结合部分的重链可变区共价连接。

在一个实施方案中，掩蔽部分与第二抗原结合部分的轻链可变区共价连接。

在一个实施方案中，掩蔽部分是抗独特型scFv。

在一个实施方案中，第一和第二抗原结合部分彼此融合，任选地通过肽接头彼此融合。

在一个实施方案中，第一和第二抗原结合部分是包含共同轻链的常规Fab分子。

在一个实施方案中，第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，任选地通过肽接头融合。

在一个实施方案中，第一抗原结合部分的Fab轻链和第二抗原结合部分的Fab轻链彼此融合，任选地通过肽接头彼此融合。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含能够特异性结合肿瘤抗原的第三抗原结合部分。

在一个实施方案中，第三抗原结合部分是常规Fab分子，或交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换。

在一个实施方案中，第三抗原结合部分与第一抗原结合部分相同。

在一个实施方案中，双特异性抗体额外地包含由能够稳定缔合的第一和第二亚基组成的Fc结构域。

在一个实施方案中，Fc结构域是IgG、特别地IgG1或IgG4的Fc结构域。

在一个实施方案中，Fc结构域是人Fc结构域。

在一个实施方案中，靶抗原是细胞表面受体。

在一个实施方案中，靶抗原是FolR1。

在一个实施方案中，靶抗原是与人主要组织相容性复合体(MHC)的分子结合的肽。

在一个实施方案中，肽具有8个和100个之间、优选地8和30个之间和更优选8个和16个氨基酸之间的总长度。

在一个实施方案中，在相同小瓶中确定与靶抗原的结合和蛋白酶的表达。

在一个实施方案中，提供了选择双特异性抗体以治疗肿瘤的体外方法，其中双特异性抗体包含：

a.能够与靶抗原特异性结合的第一抗原结合部分；和

b.能够与信号转导性细胞表面受体特异性结合的第二抗原结合部分；

其中所述方法包括根据如本文所述的方法确定肿瘤样品中靶抗原的存在并且其中如果检测到报道基因表达，则选择双特异性抗体用于治疗肿瘤。

在其他实施方案中，提供基本上如本文所述的方法。

附图简述

图1描述了测定法原理。图1A：Jurkat-NFAT报道细胞系(Promega)是表达人CD3ε的具有NFAT启动子的人急性淋巴性白血病报道细胞系。如果TCB的CD3结合物结合肿瘤靶并且CD3(交联为必需)结合CD3ε，则添加One-Glo底物(Promega)后，可以以发光测量萤光素酶表达。图1B：如果肿瘤表达的蛋白酶可以切割蛋白酶可切割接头，则用该接头掩蔽CD3结合物仅诱导Jurkat-NFAT报道基因激活。

图2描述了带有和没有掩蔽部分的不同双特异性CD3结合物的示意图。图2A：ID8364.16D5TCB，经典样式，抗ID CH2527scFv 4.32.63MMP9-MK062Matriptase位点，N端融合于CD3。图2B：ID 8363.16D5TCB，经典样式，抗ID CH2527scFv 4.32.63组织蛋白酶S/B位点，N端融合于CD3。图2C：ID 8409，抗ID CH2527scFv 4.32.63不可切割接头CD316D5Fc。图2D：ID 6298。具有共同轻链的FolR1 16D5经典2+1TCB。图2E：ID 6182和7235。DP47GS TCB sfCHO W(9a)。DP47倒转型2+1TCB。图2F：ID 8408。抗ID CH2527scFv4.15.64MK062Matriptase位点CD316D5Fc。

图3描述了不同双特异性CD3结合物的CE-SDS分析。图3A：图2A中所述TCB 8364的CE-SDS分析(纯化的最终制品)：泳道A＝蛋白质标准，泳道B＝储存在4℃的蛋白质，泳道C＝用rhMatriptase/ST14(R&D Systems)预处理的蛋白质，泳道D＝在37℃温育72小时的蛋白质并且泳道E＝不可切割接头构建体。图3B：图2B中所述TCB 8363的CE-SDS分析(纯化的最终制品)：泳道A＝蛋白质标准，泳道B＝储存在4℃的蛋白质，泳道C＝用rhCathepsin B(R&DSystems)预处理的蛋白质，泳道D＝用rhCathepsin S(R&D Systems)预处理的蛋白质，泳道E＝在37℃温育72小时的蛋白质并且泳道F＝不可切割接头构建体。

图4描述了根据图1的使用HeLa(4A)细胞和Skov-3(4B)细胞作为靶细胞的JurkatNFAT激活测定法。每个点表示三次重复的均值。标准偏差由误差线表示。将FolR1 TCB(向下的黑三角形)和具有N端融合的抗ID CD34.32.63scFv和MMP9-Matriptase MK062位点的rhMatriptase/ST14预处理的蛋白酶激活的TCB(8364，灰色实心正方形)比较。纳入掩蔽的TCB(含有GS不可切割接头，向上灰三角形)和非靶向TCB对照(向下空心三角形)作为阴性对照。点线显示无任何TCB情况下靶细胞和效应细胞的发光。

图5描述了采用良性原发肿瘤样品和FolR1 TCB的Jurkat-NFAT激活测定法。在具有细胞培养插件的24孔平板中与FolR1 TCB(6298)共温育后，Jurkat NFAT报道细胞活化。蛋白酶激活的FolR1 TCB(8363、8364、8408)和对照TCB(8409、7235)不诱导萤光素酶表达。点线表示与肿瘤共温育的Jurkat NFAT细胞的基线发光。

图6描述了采用恶性原发肿瘤样品和FolR1 TCB的Jurkat-NFAT激活测定法。在具有Matrigel的96孔平板中与FolR1 TCB(6298)和蛋白酶激活的含有MMP9-Matriptase切割位点的FolR1 TCB(8364)共温育后，Jurkat NFAT报道细胞活化。蛋白酶激活的FolR1 TCB(8363、8408)和对照TCB(8409、7235)不诱导萤光素酶表达。点线表示与肿瘤共温育的Jurkat NFAT细胞的基线发光。

图7描述了采用患者衍生的异种移植物的Jurkat-NFAT激活测定法。图7A描述了p95Her2-TCB(SEQ ID NOs：77、78、79、80)的示意图。图7B描述了患者衍生的异种移植物(PDX)或人乳腺癌样品的p95Her2表达的定量分析。图7C描述了PDX对于HER2或p95HER2的免疫组织学染色。图7D描述了基于IHC的定量分析和采用相应样品的Jurkat-NFAT激活的相关分析。在使用Jurkat NFAT激活测定法所测量的活化和基于IHC的定量测定法所测定的p95HER2水平之间观察到正相关。

本发明实施方案的详细描述

I.定义

出于本文目的，“接纳体人类构架”是这样的构架，它包含源自人免疫球蛋白构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架或如下文定义的人共有序列构架的氨基酸序列。“衍生自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的接纳体人类构架可以包含其相同的氨基酸序列，或它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小、或2或更小。在一些实施方案中，VL接纳体人类构架在序列上与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列同一。

“亲和力”指分子(例如，抗体或配体)的单一结合位点及其结合配偶体(例如，抗原或受体)之间非共价相互作用的总计强度。除非另外指出，否则如本文所用，“结合亲和力”指反映结合对子的成员(例如，抗体和抗原)之间1∶1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶物Y的亲和力可以通常由解离常数(Kd)代表。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量，包括本文所述的那些方法。在下文中描述了用于测量结合亲和力的具体示意性和示例性实施方案。

如本申请中使用，术语”氨基酸”指一组天然存在的羧基α-氨基酸，包括丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)和缬氨酸(val，V)。

如本文所用的术语“氨基酸突变”意在涵盖氨基酸置换、缺失、插入和修饰。可以作出置换、缺失、插入和修饰的任何组合以获得最终构建体，条件是最终构建体拥有所需的特征，例如，与Fc受体结合减少或与另一种肽的缔合增加。氨基酸序列缺失和插入包括氨基端和/或羧基端缺失和插入氨基酸。特定的氨基酸突变是氨基酸置换。出于改变例如Fc区结合特征的目的，特别优选非保守性氨基酸置换，即将一个氨基酸替换为另一个具有不同结构特性和/或化学特性的氨基酸。氨基酸置换包括用非天然存在的氨基酸替换或用二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟赖氨酸)替换。可以使用本领域熟知的遗传方法或化学方法产生氨基酸突变。遗传方法可以包括位点定向诱变、PCR、基因合成等。构思了也可以使用通过除基因工程之外的方法(如化学修饰法)改变氨基酸侧链基团的方法。多种名称可以在本文中用来指示相同的氨基酸突变。例如，从Fc结构域第329位置处的脯氨酸置换成甘氨酸可以显示为329G、G329、G₃₂₉、P329G或Pro329Gly。

“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中存在一个或多个改变的抗体，其中与不拥有这些改变的亲本抗体相比，这类改变导致抗体对抗原的亲和力改善。

本文中术语“抗体”以最广意义用来指特异性结合抗原决定簇的分子并且涵盖多种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。

抗体特异性指抗体对抗原特定表位的选择性识别作用。例如，天然抗体是单特异性。

术语“抗原结合结构域”指抗体的部分，所述部分包含与抗原的部分或完整抗原特异性结合并且与之互补的区域。在抗原是大抗原的情况下，抗体可以仅与抗原的特定部分结合，所述部分称作表位。抗原结合结构域可以由例如一个或多个抗体可变结构域(也称作抗体可变区)提供。优选地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。

如本文所用，术语“抗原结合部分”指与抗原决定簇特异性结合的多肽分子。在一个实施方案中，一个抗原结合部分能够将与之连接的实体(例如，第二抗原结合部分)引向靶部位，例如引向携带抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞或肿瘤基质。在另一个实施方案中，抗原结合部分能够经其靶抗原(例如T细胞受体复合物抗原)激活信号传导。抗原结合部分包括如本文进一步限定的抗体及其片段。特定抗原结合部分包含抗体的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区。在某些实施方案中，抗原结合部分可以包含如本文进一步限定和本领域已知的抗体恒定区。可用的重链恒定区包括以下五个同种型的任一种：α、δ、ε、γ或μ。可用轻链恒定区包括以下两个同种型的任一种：κ和λ。

一个“抗原结合位点”指抗体中提供与抗原相互作用的位点，即一个或多个氨基酸残基。例如，抗体的抗原结合位点包含来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基。一个天然免疫球蛋白分子一般具有两个抗原结合位点，一个Fab分子一般具有单个抗原结合位点。

在本文中使用时，术语“抗体的抗原结合位点”指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分包含来自CDR的氨基酸残基。“构架”区或“FR”区是除如本文中定义的高变区残基之外的那些可变结构域区域。因此，抗体的轻链可变结构域和重链可变结构域从N端至C末端包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。特别地，重链的CDR3是对抗原结合作用贡献最大并限定抗体特性的区域。根据Kabat等人，Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(1991)的标准定义和/或来自“高变环”的那些残基确定CDR区和FR区。

“抗体片段”指除完整抗体之外包含完整抗体的一部分的分子，所述部分结合与完整抗体结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab’-SH、F(ab′)₂；双体抗体、交换-Fab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和从抗体片段形成的多特异性抗体。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun，引自Pharmacology of MonoclonalAntibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编著，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)；还参见WO 93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。关于包含救援受体(salvage receptor)结合表位残基和具有增加的体内半寿期的Fab和F(ab′)₂片段的讨论，见美国专利号5,869,046。双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述两个抗原结合位点可以是双价或双特异性的。参见例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，NatMed 9，129-134(2003)；和Hollinger等人，Proc Natl Acad Sci USA 90，6444-6448(1993)。三体抗体和四体抗体还在Hudson等人，Nat Med 9，129-134(2003)中描述。单结构域抗体是包含抗体的全部或一部分重链可变结构域或全部或一部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利号6,248,516 B1)。可以通过多种技术产生抗体片段，所述多种技术包括但不限于蛋白酶解消化完整抗体以及由重组宿主细胞产生(例如，大肠杆菌或噬菌体)。

如本文所用，术语“抗原决定簇”同义于“抗原”和“表位”并且指多肽大分子上与抗原结合部分结合，形成抗体抗原结合部分-抗原复合物的位点(例如，一段连续氨基酸或由不同区域的不连续氨基酸构成的构象构型)。可用的抗原决定簇可以例如在肿瘤细胞的表面上、病毒感染的细胞的表面上、其他患病细胞的表面上存在、免疫细胞的表面上、游离于血清中存在，和/或在胞外基质(ECM)中存在。除非另外说明，否则本文中称作抗原的蛋白质(例如FolR1和CD3)可以是来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物如灵长类(例如，人类)和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)的任何天然形式的蛋白质。在一个具体实施方案中，抗原是人蛋白质。在提到本文中具体蛋白质的情况下，该术语涵盖“全长”、未加工的蛋白质以及因细胞中加工产生的任何形式的蛋白质。本术语还涵盖天然存在的蛋白质，例如，剪接变体或等位变体。可用作抗原的示例性人蛋白质包括但不限于：FolR1和CD3，尤其CD3的ε亚基(对于人序列，参见UniProt编号P07766(版本130)，NCBI参考编号NP_000724.1，SEQ ID NO：60；或对于食蟹猴，UniProt编号Q95LI5(版本49)，NCBI GenBank编号BAB71849.1[食蟹猴(Macacafascicularis)]序列)。在某些实施方案中，本发明的双特异性分子与CD3或靶细胞抗原的表位结合，所述表位在来自不同物种的CD3或靶抗原当中保守。在某些实施方案中，本发明的双特异性分子与CD3和FolR1结合。

如本文所用，术语“双特异性”抗体指具有至少两个结合位点的抗体，所述位点的每一个与相同抗原或不同抗原的不同表位结合。用于产生多特异性抗体的技术包括但不限于重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对(参见Milstein和Cuello，Nature 305：537(1983))、WO 93/08829和Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))和“结入扣”工程化(例如，参见美国专利号5,731,168)。也可以通过以下方式产生多特异性抗体：工程化静电转向效应用于产生抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004)；交联两个或更多个抗体或片段(例如，参见美国专利号4,676,980，和Brennan等人，Science，229：81(1985))；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(例如，参见J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992))；使用“双体抗体(diabody)”技术以产生双特异性抗体片段(例如，参见Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(例如，参见Gruber等人，J.Immunol.，152：5368(1994))；以及制备三特异性抗体，如在例如Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)中所述那样。双特异性抗体能够与至少两个不同的抗原决定簇特异性结合。一般，双特异性抗体包含两个各自对不同抗原决定簇特异的抗原结合位点。在某些实施方案中，双特异性抗体能够同时结合两个抗原决定簇，尤其两个不同细胞上表达的两个抗原决定簇。

如本文所用，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”互换使用并且全部这类名称包括后代。因而，词语“转化体”和“转染的细胞”包括原代主题细胞和从中衍生的培养物，而无论转移次数是多少。还应当理解，全部后代可以在DNA含量方面不是精确地相同，原因在于有意或不经意突变。包括具有与最初转化细胞中所筛选的相同功能或生物学活性的变体后代。

术语“嵌合抗体”指一种抗体，其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分源自不同的来源或物种，通常借助重组DNA技术制备。优选包含兔可变区和人恒定区的嵌合抗体。由本发明涵盖的其他优选形式的“嵌合抗体”是这样的抗体，其中恒定区已经从原始抗体的恒定区被修饰或改变以产生本发明的特性，尤其在C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合方面。这类嵌合抗体也称作“类别转换抗体”。嵌合抗体是表达的免疫球蛋白基因的产物，所述免疫球蛋白基因包含编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段。用于产生嵌合抗体的方法涉及常规重组DNA并且基因转染技术是本领域熟知的。参见，例如Morrison，S.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855；美国专利号5,202,238和5,204,244。

“交换”Fab分子(还称作“Crossfab”)意指这样的Fab分子，其中Fab重链和轻链的可变区或恒定区交换，即交换Fab分子包含由轻链可变区和重链恒定区组成的肽链，和由重链可变区和轻链恒定区组成的肽链。为了清晰，在其中Fab轻链和Fab重链的可变区交换的交换Fab分子中，包含重链恒定区的肽链在本文中称作交换Fab分子的“重链”。相反，在其中Fab轻链和Fab重链的恒定区交换的交换Fab分子中，包含重链可变区的肽链在本文中称作交换Fab分子的“重链”。

与之相反，“常规”Fab分子意指处于其天然形式的Fab分子，即包含由重链可变区和恒定区(VH-CH1)组成的重链和由轻链可变区和恒定区(VL-CL)组成的轻链。

药剂(例如，药物制剂)的“有效量”指有效实现所需治疗性或预防性结果的量、以实现前述结果的剂量和持续实现前述结果所需要的时间段。

“效应子功能”指随抗体同种型变动的归因于抗体Fc区的那些生物学活性。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合作用；抗体依赖的细胞介导细胞毒性(ADCC)；抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)；细胞因子分泌；免疫复合物介导的抗原呈递细胞摄取抗原；下调细胞表面受体(例如B细胞受体)和B细胞活化。

如本文所用，术语“工程、工程化的、工程化”视为包含对肽主链的任何操作或对天然存在的或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程化包括修饰氨基酸序列、糖基化模式或个别氨基酸的侧链基团，以及这些方案的组合。如本文所用，术语“工程、工程化的、工程化”，尤其附带前缀“糖-”时，以及术语“糖基化工程化”，视为包含对天然存在或重组的多肽或其片段的糖基化模式的任何操作。糖基化工程化包括细胞的糖基化装置的代谢工程化，包括对低聚糖合成途径的遗传操作，以实现改变细胞中表达的糖蛋白的糖基化。另外，糖基化工程化包括突变和细胞环境对糖基化的影响。在一个实施方案中，糖基化工程化是糖基转移酶活性的改变。在一个具体实施方案中，该工程化导致葡糖胺基转移酶活性和/或岩藻糖基转移酶活性改变。

术语“表位”包括能够与抗体特异性结合的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括化学活跃的分子表面基团，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构性特征，和/或特定的电荷特征。抗原的表位是抗原的由抗体结合的区域。

如本文所用，“Fab片段”指这样的抗体片段，其包含含有轻链VL结构域和(CL)恒定结构域的轻链片段以及重链VH结构域和第一恒定结构域(CH1)。

术语“Fc结构域”或“Fc区”在本文中用来限定免疫球蛋白重链的含有至少一部分恒定区的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然IgG重链的Fc区的界限可能略微变动，但是通常将人IgG重链Fc区限定为从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文中另外说明，否则Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据如Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991中所述的EU编号体系，也称作EU index。如本文所用，Fc结构域的“亚基”指形成二聚体Fc结构域的两个多肽之一，即包含兔疫球蛋白重链C末端恒定区的能够稳定自我缔合的多肽。例如，IgG Fc结构域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定结构域。

如本文所用，当存在多于一个每种类型的部分时，相对于抗原结合部分等而言，使用术语“第一和第二”便利区分。除非明确地如此陈述，否则使用这些术语不意在赋予双特异性抗体的特定顺序或取向。

“Fab分子”指由免疫球蛋白重链(“Fab重链”)的VH结构域和CH1结构域及其轻链(“Fab轻链”)的VL结构域和CL结构域的组成的蛋白质。

“构架”或“FR”指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR序列和FR序列通常按以下序列出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

术语“全长抗体”、“完全抗体”和“完整抗体”在本文中可互换地用来指一种抗体，所述抗体具有基本上与天然抗体结构相似的结构或具有含有如本文定义的Fc区的重链。

如本文所用，术语“抗体或配体的功能”指抗体或配体的生物学活性，例如抗体或配体激发细胞应答的能力。例如通过与靶抗原结合，抗体激活或阻抑细胞信号传导途径，即激活或抑制靶抗原的功能。例如，待测试的抗体与激活NF-κB途径的受体结合并且通过这种结合，细胞核中的反应元件激活。当这种反应元件与报道基因连接时，可以在本发明的测定法中轻易地监测激活过程。术语“功能”还包括抗体的效应子功能，例如C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合作用、抗体依赖的细胞介导细胞毒性(ADCC)、抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞摄取抗原、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)和B细胞活化；以及活化T细胞。

“融合”意指各组分(例如，Fab分子和Fc结构域亚基)直接或借助一个或多个肽接头由肽键连接。

如本文所用的“高通量筛选”应当理解成意指，可以用本文所述的新测定法对数目相对巨大的不同抗体或配体候选物分析结合和功能。一般，这类高通量筛选在多孔微量滴定板中(例如，在96孔平板或384孔平板或具有1536孔或3456孔的平板中)进行。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”互换使用并且指已经向其中引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化细胞和从其衍生的后代，而无论传代次数是多少。后代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括突变子代，所述突变子代具有与最初转化的细胞中所筛选或选择的子代相同的功能或生物学活性。

“人抗体”是这样一种抗体，其拥有对应于人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列或从利用人抗体库或其他编码人抗体的序列的非人来源衍生。人抗体的这种定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。还如针对本发明的嵌合抗体和人源化抗体提到，如本文所用的术语“人抗体”还包含这类抗体，其中在恒定区修饰所述抗体，以产生本发明的特性，特别地就C1q结合和/或FcR结合而言，例如通过“类别转换”，即改变或突变Fc部分(例如从IgG1至IgG4和/或IgG1/IgG4突变)。

“人共有构架”是这样的构架，它代表在人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选项中最常出现的氨基酸残基。通常，人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选项来自可变结构域序列的亚组。通常，序列亚组是如Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第五版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，第1-3卷中描述的亚组。在一个实施方案中，对于VL，该亚组是如上文Kabat等人中描述的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，该亚组是如上文Kabat等人中描述的亚组III。

“人源化”抗体指包含来自非人类HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个和一般两个可变结构域，其中全部或基本上全部的HVR(例如，CDR)与非人抗体的那些HVR对应并且全部或基本上全部的FR区与人抗体的那些FR对应。人源化抗体任选地可以包含从人抗体衍生的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经进行了人源化的抗体。由本发明涵盖的其他形式的“人源化抗体”是这些抗体，其中恒定区已经从原始抗体的恒定区被额外地修饰或改变以产生本发明的特性，尤其在C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合方面。

如本文所用，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变结构域的下述区域的每一个，所述区域在序列上高变和/或形成结构上确定的环(“高变环”)。通常，天然的四链抗体包含六个HVR；VH中三个(H1、H2、H3)和VL中三个(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高序列变异性和/或参与抗原识别。示例性高变环存在于第26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)位氨基酸残基处。(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、和CDR-H3)存在于L1的第24-34位氨基酸残基、L2的第50-56位氨基酸残基、L3的第89-97位氨基酸残基、H1的第31-35B位氨基酸残基、H2的第50-65位氨基酸残基和H3的第95-102位氨基酸残基处。(Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(1991).)。高变区(HVRs)也称作互补决定区(CDR)，并且提到形成抗原结合区的可变区部分时，这些术语在本文中可互换地使用。这种特定区域已经由描述Kabat等人，美国卫生和公众服务部(U.S.Dept.of Health and Human Services)，″Sequencesof Proteins of Immunological Interest″(1983)并且由Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)描述，其中所述定义包括彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，谈及抗体或其变体的CDR的任一个定义的应用意在处于如本文中定义和使用的术语范围内。作为比较，下文在表A中描述了构成如上文所引用每篇参考文献所定义的CDR的适宜氨基酸残基。构成特定CDR的确切残基数目将根据该CDR的序列和大小变动。根据抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规地确定哪些残基构成特定CDR。

表A.CDR定义¹

CDR	Kabat	Chothia	AbM<sup>2</sup>
				V<sub>H</sub> CDR1	31-35	26-32	26-35
V<sub>H</sub> CDR2	50-65	52-58	50-58
				V<sub>H</sub> CDR3	95-102	95-102	95-102
V<sub>L</sub> CDR1	24-34	26-32	24-34
				V<sub>L</sub> CDR2	50-56	50-52	50-56
V<sub>L</sub> CDR3	89-97	91-96	89-97

¹根据Kabat等人(见下文)所述的编号惯例对表A中全部CDR定义编号。

²如表A中使用的具有小写体“b”的“AbM”指如Oxford Molecular“AbM”抗体建模软件所定义的CDR。

Kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变区序列编号体系。本领域普通技术人员可以毫无疑义地将这种Kabat编号体系应用至任何可变区序列，不依赖于除序列本身之外的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”指Kabat等人，美国卫生和公众服务部(U.S.Dept.of Health and Human Services)，″Sequence of Proteins ofImmunological Interest″(1983)所述的编号体系。除非另外说明，否则根据Kabat编号体系提及抗体可变区中特定氨基酸残基位置的编号。

除了VH中的CDR1外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”，它们是接触抗原的残基。SDR含于称作缩写-CDR或a-CDR的CDR区域内部。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和a-CDR-H3)存在于L1的第31-34位氨基酸残基、L2的第50-55位氨基酸残基、L3的第89-96位氨基酸残基、H1的第31-35B位氨基酸残基、H2的第50-58位氨基酸残基和H3的第95-102位氨基酸残基处。(参见Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008))。除非另外说明，否则本文中HVR残基和可变结构域中的其他残基(例如，FR残基)根据上文Kabat等人编号。

如本文所用的“独特型特异性多肽”指识别抗原结合部分(例如，对CD3特异的抗原结合部分)的独特型的多肽。独特型特异性多肽能够与抗原结合部分的可变区特异性结合并且因而减少或防止抗原结合部分与其相关抗原特异性结合。与包含抗原结合部分的分子缔合时，独特型特异性多肽可以作为分子的掩蔽部分发挥作用。本文具体公开了对于抗CD3结合分子的独特型特异的抗独特型抗体或结合抗独特型的抗体片段。

“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。

术语“免疫球蛋白分子”指具有天然存在抗体的结构的蛋白质。例如，IgG类免疫球蛋白是由二硫键结合的两条轻链和两条重链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。从N端至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，也称作可变重链域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，也称作重链恒定区。类似地，从N端至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，也称作可变轻链域或轻链可变结构域，随后一个恒定轻链(CL)结构域，也称作轻链恒定区。免疫球蛋白的重链可以归属至五个类型之一，称作α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，其中某些类型可以进一步划分成亚型，例如γ₁(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。免疫球蛋白的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列而划分成两种类型之一，称作κ(κ)和λ(λ)。免疫球蛋白基本上由借助免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和一个Fc结构域组成。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。

“分离的”抗体是已经与其自然环境的组分分离的一种抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳法)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)所确定。关于评估抗体纯度的方法的综述，例如参见Flatman等人，J.Chromatogr.B848：79-87(2007)。

“分离的”核酸指已经与其自然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括包含在通常包含该核酸分子的细胞中的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置处。

如本文所用，术语“配体”指能够与另一个分子结合的任何分子。配体分子的例子包括但不限于肽、蛋白质、糖、脂质或核酸。用本文所述的测定法待分析的优选配体是能够与靶抗原结合的肽或蛋白质。通常，这种靶抗原是细胞表面受体。

“促进Fc结构域的第一和第二亚基缔合的修饰”是对肽主链的操作或对Fc结构域亚基的翻译后修饰，其减少或防止包含Fc结构域亚基的多肽与相同多肽缔合以形成同型二聚体。如本文所用的促进缔合的修饰特别包括对需要缔合的两个Fc结构域亚基(即Fc结构域的第一和第二亚基)各自所做的独立分离，其中所述修饰彼此互补，从而促进两个Fc结构域亚基的缔合。例如，促进缔合的修饰可以改变一个或两个Fc结构域亚基的结构或电荷，从而使得它们的缔合分别在空间上或静电上有利。因此，(异)二聚化在包含第一Fc结构域亚基的多肽和包含第二Fc结构域亚基的多肽之间发生，所述多肽可能在与每种亚基融合的其他组分(例如抗原结合部分)并非相同的含义上是不同的。在一些实施方案中，促进缔合的修饰包括Fc结构域中的氨基酸突变，特别是氨基酸置换。在一个具体实施方案中，促进缔合的修饰包含在Fc结构域的两个亚基的各自亚基中的独立氨基酸突变，特别地是氨基酸置换。

如本文所用，术语“单克隆抗体”指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即，构成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，例外在于例如含有天然存在突变或在产生单克隆抗体制备物期间出现的可能变体抗体，这类变体通常以微量存在。另外，与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆的”指示该抗体的特征为从基本上均一的抗体群体获得，并且不得解释为要求通过任何特定方法产生该抗体。例如，可以通过多种技术产生根据本发明待使用的单克隆抗体，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于产生单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。

如本文所用，术语“单特异性”抗体指具有一个或多个结合位点的抗体，所述位点的每一个与相同抗原的相同表位结合。

“裸抗体”指不与异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。

“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是由二硫键结合的两条相同轻链和两条相同重链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。从N端至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，也称作可变重结构域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，也称作可变轻链域或轻链可变结构域，随后一个恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链可以基于其恒定域的氨基酸序列而划分成两种类型之一，称作κ(κ)和λ(λ)。

如本文所用，“NF-κB”指“活化B细胞的核因子κ轻链增强物”并且是一种转录因子，其涉及调节许多编码凋亡、病毒复制、肿瘤形成、多种自身免疫性疾病和炎症反应的中介物的基因。NFκB存在于几乎全部真核细胞中。通常，它以无活性状态位于细胞溶胶中，因为它与抑制性κB(IκB)蛋白形成复合物。通过配体与整合型膜受体(也称作“NF-κB途径受体”)结合，激活IκB激酶(IKK)。IKK是由两种激酶和一个调节亚基组成的酶复合体。这种复合体使IκB蛋白磷酸化，导致遍在蛋白化及因此这些蛋白质被蛋白酶体降解。最后，游离的NFκB处于活跃状态，转位至胞核和与κB DNA元件结合并诱导靶基因转录。

如本文所用，“NF-κB途径”指导致调节NF-κB活性的刺激。例如，通过配体或抗体的结合作用激活toll样受体信号传导、TNF受体信号转导、T细胞受体和B细胞受体信号传导，导致NF-κB激活。随后，磷酸化的NF-κB二聚体与κB DNA元件结合并诱导靶基因转录。本文中有用的示例性κB DNA元件称作“NF-κB途径的反应元件”。因此，“NF-κB途径的受体”指可以触发对NF-κB活性调节的受体：“NF-κB途径受体”的例子是Toll样受体、TNF受体、T细胞受体和B细胞受体。与其靶结合时导致对NF-κB活性调节的抗体的非限制性例子是抗CD3抗体、抗CD40抗体、抗DR5抗体、抗DR4抗体、抗41BB抗体、抗Ox40抗体和抗GITR抗体。与其靶结合时导致对NF-κB活性调节的配体的例子是OX40配体、4-1BB配体或CD40配体。

“没有实质交叉反应性”意指分子(例如，抗体)不识别或不特异性结合与该分子的实际靶抗原不同的抗原(例如与靶抗原密切相关的抗原)，特别地与该靶抗原相比时不同。例如，抗体可以结合小于约10％至小于约5％的与实际靶抗原不同的抗原，或可以按照由小于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％、或0.1％组成的量结合与实际靶抗原不同的所述抗原，优选地按小于约2％、1％或0.5％并且最优选地小于约0.2％或0.1％的量结合与实际靶抗原不同的抗原。

本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼抗体(Octopus antibody)”(参见，例如US 2006/0025576A1)。

本文的抗体或片段还包括“双重作用FAb”或“DAF”(例如参见，US 2008/0069820)。

术语“包装插页”用来指治疗产品的商业包装中习惯性包括的说明书，所述说明书含有关于适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或涉及此类治疗产品用途之警告的信息。

相对于参比多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在将所述序列进行比对(并在必要时导入空位)以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守取代视为序列同一性的部分之后，候选序列中的氨基酸残基与参比多肽序列中的相同氨基酸残基的百分比。为了确定氨基酸序列同一性百分数的比对可以按本领域能力范围内的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内最大比对所需要的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.授权，并且源代码已经随用户文档提交至华盛顿特区20559的美国版权局，在那里它以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程序从Genentech，Inc.，加利福尼亚州South San Francisco可公开获得或可以从源代码汇编。应当汇编ALIGN-2程序以在UNIX操作系统(包括数字式UNIXV4.0D)上使用。全部序列比较参数由ALIGN-2程序设定并且不变动。

在使用ALIGN-2比较氨基酸序列的情况下，如下计算给定氨基酸序列A相对、与或针对给定氨基酸序列B(这可以备选地描述为相对、与或针对给定氨基酸序列B具有或包含某个氨基酸序列同一性％的给定氨基酸序列A)的氨基酸序列同一性％：

100乘以分数X/Y

其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对结果中评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。将可以理解在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的氨基酸序列同一性％将不等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别声明，否则本文所用的全部氨基酸序列同一性值％如紧接前段中所述那样使用ALIGN-2计算机程序获得。

术语“药物制剂”指一种制备物，所述制备物处于这类形式从而允许其中所含的有效成分的生物活性有效，并且不含有对于将会施用该制剂的受试者不可接受地有毒的额外组分。

“可药用载体”指药物制剂中除有效成分之外的对受试者无毒的成分。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

如本文所用的“蛋白酶”或“蛋白水解酶”指在识别位点切割接头并且由靶细胞(例如由肿瘤细胞)表达的任何蛋白水解酶。这类蛋白酶可能由靶细胞分泌或保持与靶细胞结合，例如，在靶细胞表面上。蛋白酶的例子包括但不限于金属蛋白酶，例如，基质金属蛋白酶1-28和A解整联蛋白和金属蛋白酶(ADAM)2、7-12、15、17-23、28-30和33、丝氨酸蛋白酶，例如，尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活物和Matriptase、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、和组织蛋白酶家族的成员。

关于T细胞活化性双特异性分子而言，如本文所用的“蛋白酶可活化的”指因掩蔽部分而具有减少或消除的T细胞活化能力的T细胞活化性双特异性分子，所述掩蔽部分减少或消除T细胞活化性双特异性分子与CD3结合的能力。一旦借助蛋白酶切割作用解离掩蔽部分，例如，通过蛋白酶切割将掩蔽部分与T细胞活化性双特异性分子连接的接头，与CD3的结合作用恢复并且T细胞活化性双特异性分子因而激活。

术语“具有固有荧光的蛋白质”指通过内部氨基酸在蛋白质内部环化和氧化或借助酶促添加荧光辅因子，能够形成高度发荧光的固有发色团的蛋白质。术语“具有固有荧光的蛋白质”包括野生型荧光蛋白和显示光谱特性或物理特性改变的突变体。该术语不包括仅因蛋白质内部未修饰的酪氨酸、色氨酸、组氨酸和苯丙氨酸基团的荧光贡献而显示微弱荧光的蛋白质。具有固有荧光的蛋白质是本领域已知的，例如绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、蓝色荧光蛋白(BFP，Heim等人，1994、1996)、青绿色荧光(cyan fluorescent)变体，称作CFP(Heim等人，1996；Tsien 1998)；黄色荧光变体，称作YFP(Ormo等人1996；Wachter等人，1998)；紫外可激发的绿色荧光变体，称作Sapphire(Tsien 1998；Zapata-Hommer等人，2003)；和青绿色可激发的绿色荧光变体，称作增强型绿色荧光蛋白或EGFP(Yang等人，1996)并且可以例如通过活细胞成像(例如Incucyte)或荧光分光光度测定法测量。

如本文所用，术语“重组人抗体”意在包括通过重组手段所制备、表达、产生或分离的全部人抗体，如从宿主细胞如NS0或CHO细胞或从相对于人免疫球蛋白基因为转基因的动物(例如小鼠)中分离的抗体或使用转染至宿主细胞中的重组表达载体所表达的抗体。此类重组人抗体具有重排形式的可变区和恒定区。本发明的重组人抗体已经经历体内体细胞超变。因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是尽管源自人种系VH和VL序列并且与之相关，但可以不天然存在于体内人抗体种系库内部的序列。

如本文所用，“报道基因”意指可以测定其表达的基因。在一个优选的实施方案中，“报道基因”是编码蛋白质的基因，其中使用所述蛋白质的产生和检测作为代用品间接检测待测试抗体或配体的活性。报道蛋白是报道基因编码的蛋白质。优选地，报道基因编码可以通过简单测定方法检测其催化活性的酶或具有某种特性如固有荧光或发光的蛋白质，从而可以在需要最小样品制备的简单和快速测定法检测报道基因的表达。可以检测其催化活性的酶的非限制性例子是萤光素酶、β半乳糖苷酶、碱性磷酸酶。萤光素酶是分子量(MW)为61kDa的单体酶。它充当催化剂并且能够将D-萤光素在三磷酸腺苷(ATP)和Mg²⁺存在下转化成萤光素化腺苷酸。此外，生成焦磷酸(PPi)和腺苷单磷酸(AMP)作为副产物。中间体萤光素化腺苷酸随后氧化为氧基萤光素、二氧化碳(CO₂)和光。氧基萤光素是可以在光度计中，依据从反应释放的光定量测量的生物发光产物。萤光素酶报道分子测定法是市售和本领域已知的，例如Luciferase 1000 Assay System和ONE-Glo^TM Luciferase Assay System。

如本文所用的“可逆遮蔽”指掩蔽部分或独特型特异性多肽与抗原结合部分或分子结合，从而将抗原结合部分或分子与其抗原(例如，CD3)阻隔。这种遮蔽作用是可逆的，在于独特型特异性多肽可以从抗原结合部分或分子释放，例如，借助蛋白酶切割作用，和因而释放抗原结合部分或分子以结合其抗原。

如本文所用，术语“单链”指包含由肽键线性连接的氨基酸单体的分子。在某些实施方案中，抗原结合部分之一是单链Fab分子，即其中Fab轻链和Fab重链由肽接头连接以形成单个肽链的Fab分子。在一个这样的特定实施方案中，单链Fab分子中的Fab轻链的C末端与Fab重链的N末端连接。

如本文所用，“T细胞活化”指T淋巴细胞、特别地细胞毒T淋巴细胞的一种或多种细胞反应，所述细胞反应选自：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒效应分子释放、细胞毒活性和活化标志物表达。如本文所述的某些双特异性抗体分子能够诱导T细胞活化。测量T细胞活化的合适测定法是本领域已知的并在本文中描述。

如本文所用，“靶细胞抗原”指呈递在靶细胞(例如肿瘤中的细胞，如癌细胞或肿瘤基质的细胞)表面上的抗原决定簇。

如本文所用，“靶抗原”指可以由抗体或其片段靶向的任何细胞表面抗原。它还指可以由配体靶向的受体。

“反应元件”指在结合某些转录因子时可以激活或沉默的特定转录因子结合元件或顺式作用元件。在一个实施方案中，反应元件是位于转录因子结合时驱动报道基因表达的最小启动子(例如，TATA框启动子)上游的顺式作用增强子元件。

如本文所用的“信号转导性细胞表面受体”是位于如本文所述的报道细胞的表面上的细胞表面受体，所述受体能够转导胞外信号(例如，抗原结合部分与信号转导性细胞表面受体结合)至胞内信号传导级联，导致报道基因表达。信号转导性细胞表面受体的非限制性例子是Toll样受体、TNF受体、T细胞受体和B细胞受体或其重组形式或片段。

如本文所用，名词“治疗”(和其语法变型如动词“治疗”或分词“治疗”)指意欲改变正在接受治疗的个体的天然过程的临床介入，并且可以旨在预防或在临床病理学过程期间实施。想要的治疗效果包括，但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或预后改善。

如本文所用的术语“价态”指抗体分子中存在指定数目的结合位点。就这一点而论，术语“双价”、“四价”和“六价”指抗体分子中分别存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。本发明的双特异性抗体至少是“双价的”并且可以是“三价”或“多价的”(例如“四价”或“六价”)。

术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的参与抗体结合抗原的结构域。天然抗体重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL)通常具有相似的结构，每种结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见，例如，Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007))。单个VH结构域或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。另外，结合特定抗原的抗体可以利用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域进行分离以分别筛选互补性VL结构域或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)。

如本文所用，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸表达。此类载体在本文中称作“表达载体”。

本发明中所用的抗体具有两个或更多个结合位点并且是双特异性的。即，这些抗体可以是双特异性的，甚至在存在多于两个结合位点的情况下(即该抗体是三价或多价的)也是如此。本发明的双特异性抗体例如包括，多价单链抗体、双体抗体和三体抗体，以及具有全长抗体的恒定结构域结构的抗体，其中所述恒定结构域结构通过一个或多个肽接头与其他抗原结合位点(例如，单链Fv、VH域和/或VL域、Fab或(Fab)₂)连接。抗体可以是来自单一物种的全长抗体或经嵌合化或人源化。

II.新颖测定法

发明人开发了一种适于高通量样式的稳健测定法，所述测定法能够实现确定肿瘤中的抗原表达和/或双特异性抗体在肿瘤细胞中、尤其在原发肿瘤样品中的功能活性。通过使用激活反应元件时使得报道基因表达的报道细胞系，评价抗体的功能(例如，抗体的生物学活性，如抗体激发细胞应答的能力)。在某些实施方案中，所述报道基因选自编码荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白，GFP)的基因和/或编码可以检测其催化活性的酶(例如萤光素酶)的基因。本文中还提供用于确定肿瘤样品中存在靶抗原和/或蛋白酶表达的方法以及用于选择双特异性抗体和选择蛋白酶可切割接头以治疗增生性疾病、尤其癌症的方法。

在一个实施方案中，提供了一种确定肿瘤样品中存在靶抗原的体外方法，所述体外方法包括步骤：

i)提供肿瘤样品；

iii)向肿瘤样品添加双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：

a)能够与靶抗原特异性结合的第一抗原结合部分；和

iv)向肿瘤样品添加报道细胞；和

v)通过确定报道基因的表达，确定靶抗原的存在。

靶抗原可以是由肿瘤细胞表达并通常位于肿瘤细胞的细胞表面上的抗原。在一个实施方案中，靶抗原由肿瘤细胞表达。在一个实施方案中，肿瘤细胞天然地表达靶抗原。在一个实施方案中，靶抗原位于肿瘤细胞的表面上。在一个实施方案中，靶抗原是细胞表面受体。因此，双特异性抗体与肿瘤细胞的细胞表面上的靶抗原结合。在一个实施方案中，靶抗原选自CEA、Her2、TYRP、EGFR、MCSP、STEAP1、WT1和FolR1。在一个实施方案中，靶抗原是FolR1。

但是，靶抗原不限于位于细胞表面上的蛋白质，反而还可以源自暂时或永久位于胞内的多肽或蛋白质。在这种情况下，源自胞内多肽或蛋白质的靶抗原呈递在细胞表面上，尤其在肿瘤细胞的细胞表面上。在一个实施方案中，靶抗原是与主要组织相容性复合体(MHC)的分子结合的肽。在一个实施方案中，MHC是人MHC。在一个实施方案中，与MHC分子结合的肽具有8个和100个之间、优选地8和30个之间和更优选8个和16个氨基酸之间的总长度。在一个实施方案中，靶抗原源自排他性或主要在肿瘤组织中表达的蛋白质。在一个实施方案中，蛋白质是胞内蛋白，并且肽是由MHC-I或MHC-II途径产生并由MHC I类或MHC II类复合体呈递。在一个实施方案中，肽由MHC-I途径产生并由MHC I类复合体呈递。

在一个实施方案中，肿瘤细胞是哺乳动物细胞、优选地人细胞或灵长类细胞。在一个实施方案中，肿瘤细胞源自肿瘤样品，尤其源自患者活组织检查样品。在一个实施方案中，肿瘤样品是来自人类患者的活组织检查样品。在一个实施方案中，肿瘤细胞携带靶抗原决定簇。在一个实施方案中，肿瘤细胞源自患有增生性疾病、尤其癌症的患者。癌症的非限制性例子包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食管癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌和肾癌。在一个实施方案中，肿瘤细胞源自人类患者的活组织检查样品。在一个实施方案中，肿瘤样品是人类患者的活组织检查样品。可以在不将肿瘤样品或肿瘤组织解离成单个细胞的情况下评估肿瘤样品。在一个实施方案中，在根据本发明的方法确定靶抗原存在之前，不消化肿瘤样品。在一个实施方案中，将肿瘤样品切割，尤其使用剃须刀片切割。在另一个实施方案中，在根据本发明的方法确定靶抗原存在之前消化肿瘤样品。在一个实施方案中，将肿瘤样品消化，尤其经胶原酶或透明质酸酶消化。

一旦第一抗原结合部分与靶抗原结合或之后，双特异性抗体与报道细胞上的信号转导性细胞表面受体结合，其中反应元件激活报道基因表达。因此，当第一抗原结合部分与靶抗原结合并且信号转导性细胞表面受体与报道细胞结合时，报道细胞中的报道基因表达。在一个实施方案中，报道基因表达提示第一抗原结合部分与靶抗原结合。令人惊讶地，在第一抗原结合部分与肿瘤细胞上的靶抗原不结合的情况下，无报道基因的表达或仅其很低表达。可以定性地，即依据存在或不存在报道基因表达，确定双特异性抗体与靶抗原的结合；缺失任何荧光或发光表示无结合。通常，缺少报道基因表达依据某个阈值限定，即扣除任何背景信号后。通常通过用全部试剂但无待测试抗体情况下或在肿瘤细胞不存在的情况下实施测定法，测定背景信号。在其他实施方案中，可以定量确定抗体或配体与靶抗原的结合，即可以用本发明的方法确定结合水平或强度。为此目的，抗体按不同浓度测试并且确定半数最大有效浓度(EC₅₀)。EC₅₀指在指定的暴露时间后抗体在基线和最大值之间一半处结合的抗体或配体浓度。剂量反应曲线的EC₅₀因此代表其中观察到50％其最大结合作用的抗体浓度。KD(解离常数)可以从剂量反应曲线通过本领域已知的方法计算。

在一个实施方案中，双特异性抗体与信号转导性细胞表面受体结合。抗体与信号转导性细胞表面受体的结合激发了直接或借助细胞信号级联导致对反应元件活性调节的细胞应答。反应元件是可以被转录因子等沉默或激活的DNA元件。反应元件是本领域已知和市售的，例如在报道分子载体中市售。通常，反应元件包含DNA重复元件并且是位于转录因子结合时驱动报道基因表达的最小启动子上游的顺式作用增强子元件。下表中提到用于本文中的反应元件及其转录因子的例子：

双特异性抗体与信号转导性细胞表面受体的结合激活反应元件。在一个实施方案中，反应元件是位于细胞的胞核的胞核反应元件。在另一个实施方案中，所述反应元件位于报道细胞中的质粒上。在一个实施方案中，该测定法包括初始步骤：用表达载体转染报道细胞，所述表达载体包含编码反应元件控制下的报道基因的DNA序列。另外，可以用表达载体转染报道细胞，所述表达载体包含编码信号转导性细胞表面受体的DNA序列。可以用包含信号传导级联的全部要素的表达载体或用各自表达不同组分的不同载体转染报道细胞。在一个实施方案中，报道细胞包含编码反应元件控制下的报道基因的DNA序列和编码信号转导性细胞表面受体的DNA序列。

在一个实施方案中，报道基因选自编码荧光蛋白的基因或编码可以检测其催化活性的酶的基因。在一个实施方案中，报道基因编码荧光蛋白或发光蛋白。在一个实施方案中，报道基因编码绿色荧光蛋白(GFP)或萤光素酶。在其他实施方案中，荧光蛋白选自例如绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP)、蓝色荧光蛋白(BFP，Heim等人，1994、1996)、青绿色荧光变体，称作CFP(Heim等人，1996；Tsien 1998)；黄色荧光变体，称作YFP(Ormo等人，1996；Wachter等人，1998)；紫外可激发的绿色荧光变体，称作Sapphire(Tsien 1998；Zapata-Hommer等人，2003)；和青绿色可激发的绿色荧光变体，称作增强型绿色荧光蛋白或EGFP(Yang等人1996)增强型绿色荧光蛋白(EGFP)并且可以例如通过活细胞成像(例如Incucyte)或荧光分光光度测定法测量。在一个实施方案中，可以检测其催化活性的酶选自萤光素酶、β半乳糖苷酶、碱性磷酸酶。在一个实施方案中，报道基因编码GFP。在一个实施方案中，报道基因编码萤光素酶。可以通过市售测定法，例如通过Luciferase1000Assay System(或ONE-Glo^TM Luciferase Assay System(均来自Promega)，检测萤光素酶的活性。Luciferase 1000Assay System含有辅酶A(CoA)，此外萤光素作为底物，导致持久至少一分钟的强烈光强度。为了分析胞内萤光素酶，需要在检测前裂解细胞。因此，单独向Luciferase 1000Assay System提供细胞裂解缓冲液。相比之下，ONE-Glo^TMLuciferaseAssay System将萤光素酶底物与细胞裂解试剂组合并且还显示更稳定的信号。作为反应副产物产生的光由光度计从整个可见光谱收集。在本文的例子中，信号与产生的萤光素酶的量成正比并且因此与激活NFκB启动子的强度成正比。在另一个实施方案中，使用其中萤光素酶分泌自细胞的萤光素酶测定法。因此，该测定法可以在不裂解细胞的情况下进行。

因此，如本文所述，信号转导性细胞表面受体与反应元件功能性连接。在一个实施方案中，反应元件控制报道基因的表达。在一个实施方案中，信号转导性细胞表面受体和反应元件是NF-κB途径的部分。在一个实施方案中，信号转导性细胞表面受体选自Toll样受体、TNF受体、T细胞受体和B细胞受体；以及其重组形式及片段。与其靶结合时导致对NF-κB活性调节的抗体的非限制性例子是抗CD3抗体、抗CD40抗体、抗DR5抗体、抗DR4抗体、抗41BB抗体、抗Ox40抗体和抗GITR抗体。

在一个实施方案中，反应元件是NF-κB反应元件。在一个实施方案中，所述反应元件包含以下一个或多个以下DNA重复序列：GGGAATTTCC(SEQ ID NO：68)、GGGGACTT TCC(SEQID NO：69)、GGGACTTTCC(SEQ ID NO：70)、GGGACTTCC(SEQ ID NO：71)、ATTGTAGCGTA(SEQ IDNO：72)。在一个实施方案中，所述反应元件包含3至6个、3个或6个上文提到的DNA重复序列。在一个实施方案中，所述反应元件包含3至6个、3个或6个上文提到的DNA重复序列和1、2、3或4个额外的核苷酸。

在一个实施方案中，所述反应元件包含以下DNA序列

GGGAATTT CCGGGGACTT TCCGGGAATTTCCGGGGACT TTCCGGGAATTTCC(SEQ ID NO：73)、GGGAATTTCCGGGAATTTCCGGGAATTTCCGGGAATTTCCGGGAATTTCCGGGAATTTCC(SEQ ID NO：74)、GGGACTTCCGGGACTTTCCGGGACTTTCCGGGACTTTCCGGGACTTTCCGGGACTTTCC(SEQ ID NO：75)或

GGGACTTTCCATTGTAGCGTAGGGACTTTCCATTGTAGCGTAGGGCTTTCCATTGTAGCGTAGGGCTTTCC(SEQ ID NO：76)。

在一个实施方案中，步骤iii)和iv)连续或同时地进行。

如本文所述的，报道基因的表达可以直接与待测试抗体的功能相关。例如，当使用编码荧光蛋白的基因或编码萤光素酶的基因作为报道基因时，从细胞检测到的光量与待测试抗体的靶抗原结合作用直接相关。在一个实施方案中，抗体按不同浓度测试并且确定报道基因激活或抑制的半数最大有效浓度(EC₅₀)。EC₅₀指在指定的暴露时间后抗体或配体在基线和最大值之间激活或抑制报道基因一半的抗体或配体浓度。剂量反应曲线的EC₅₀因此代表其中观察到50％其对靶抗原的最大激活或抑制作用的抗体浓度。

如本文所述的新测定法是稳健的，适用以高通量模式使用和就完成该测定法所需要的人工操作时间而言高效。另外，本发明的测定法容忍待分析的样品中存在死细胞。这与其中通过测量细胞活力或细胞死亡而确定抗体结合作用和功能的细胞测定法(例如杀伤测定法)相反。

在一个实施方案中，待测定的样品含有死细胞。在一个实施方案中，待测定的样品是肿瘤样品，尤其肿瘤的活组织检查样品。在一个实施方案中，肿瘤样品含有死细胞，尤其多于10％的死细胞。在进一步的实施方案中，肿瘤样品含有多于20％、多于30％、多于40％或多于50％的死细胞。确定确定细胞培养物或组织中死细胞数目的方法是本领域熟知的，例如碘化丙啶染色法。

本文所述的新测定法的又一个优点是无需洗涤步骤。可以将待测试的抗体和报道细胞以任何顺序或同时添加至肿瘤样品。在一个实施方案中，将抗体稀释于细胞培养基中并将肿瘤样品以合适的细胞培养样式(例如，在24孔平板的孔中或在96孔平板的孔中)添加至含有稀释的抗体的细胞培养基。优选地，测试用培养基是为细胞保持活力直至48小时提供条件的培养基。合适的培养基例如是Jurkat培养基，如实施例中所概述。在一个实施方案中，该测定法在微量滴定板中进行。在一个实施方案中，微量滴定板适于高通量筛选。本发明的测定法可以按允许快速制备、处理和分析多个反应的任何样式进行。这可以例如是在多孔分析平板(例如，24孔、96孔或386孔)中。可以手工或自动地产生多种试剂的母液，并且可以使用能够检测荧光信号和/或发光信号的市售分析软件、机器人和检测仪器，自动进行后续全部抽吸、稀释、混合、分配、洗涤、温育、样品读出、数据采集和分析。

在一个实施方案中，步骤ii)中提供24孔平板每孔约100000至约1000000个报道细胞。在一个优选实施方案中，提供24孔平板每孔约300000至约700000个细胞或约400000至约600000个报道细胞。在一个实施方案中，步骤ii)中提供24孔平板每孔约500000个报道细胞。在一个实施方案中，步骤ii)中提供96孔平板每孔约10000至约100000个报道细胞。在一个优选实施方案中，提供96孔平板每孔约30000至约70000个细胞或约40000至约60000个细胞。在一个实施方案中，步骤ii)中提供96孔平板每孔约50000个报道细胞。在一个实施方案中，步骤ii)中提供每ml细胞培养基约200000至约2000000个细胞。在一个优选实施方案中，提供每ml细胞培养基约600000至约1400000个细胞或约800000至约1200000个细胞。在一个实施方案中，步骤ii)中提供每ml细胞培养基约1000000个细胞。

在一个实施方案中，步骤iii)中提供抗体以实现约0.001μg/ml至10μg/ml的终浓度。在其他实施方案中，步骤iii)中提供抗体以实现约0.05μg/ml至约2μg/ml或约0.1μg/ml至约1μg/ml的终浓度。在其他实施方案中，步骤iii)中提供抗体以实现约0.5μg/ml的终浓度。在一个实施方案中，步骤iii)中提供抗体以实现约1nM至约1000nM的终浓度。在其他实施方案中，步骤iii)中提供抗体以实现约5nM至约200nM或约10nM至约100nM的终浓度。在其他实施方案中，步骤iii)中提供抗体以实现约50nM的终浓度。抗体可以稀释于细胞培养基中，例如，如实施例部分所述的Jurkat培养基中。将稀释至如本文所述终浓度的抗体在添加报道细胞之前或之后添加至肿瘤样品。在一个实施方案中，将稀释至如本文所述终浓度的抗体在添加报道细胞之前添加至肿瘤样品。在一个实施方案中，在细胞培养插件中提供肿瘤样品。在一个实施方案中，肿瘤样品包埋在Matrigel中。

在某些实施方案中，本发明的双特异性分子与CD3结合。在一个具体实施方案中，双特异性抗体包含

(a)第一抗原结合部分，其是能够与靶细胞抗原特异性结合的Fab分子；

(b)第二抗原结合部分，其是能够与CD3特异性结合的Fab分子。

在一个具体实施方案中，双特异性抗体包含

(b)第二抗原结合部分，其是能够与CD3特异性结合的Fab分子并且包含选自SEQID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的至少一个重链互补决定区(CDR)和选自SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19的至少一个轻链CDR。

在一个实施方案中，靶抗原是细胞表面受体。在一个实施方案中，靶抗原选自CEA、Her2、TYRP、EGFR、MCSP、STEAP1、WT1和FolR1。在一个实施方案中，靶抗原是FolR1。在一个实施方案中，双特异性抗体包含

(a)第一抗原结合部分，其是能够与FolR1特异性结合的Fab分子，所述Fab分子包含选自SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16的至少一个重链互补决定区(CDR)和选自SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19的至少一个轻链CDR；

在一个实施方案中，双特异性抗体包含

(a)第二抗原结合部分，其是能够与FolR1特异性结合的Fab分子，所述Fab分子包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：27的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ IDNO：28的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列；和

(b)第一抗原结合部分，其是能够与CD3特异性结合的Fab分子，所述Fab分子包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：26的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ IDNO：28的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。

在几个实施方案中，双特异性抗体包含由能够稳定缔合的第一和第二亚基组成的Fc结构域。在一些实施方案中，第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的N末端融合。

在一个这样的实施方案中，第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。在一个这样的具体实施方案中，双特异性抗体基本上由第一和第二抗原结合部分、以第一和第二亚基组成的Fc结构域和任选地一个或多个肽接头组成，其中第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的N末端融合。在一个实施方案中，第二抗原结合部分的Fab轻链和第一抗原结合部分的Fab轻链可以额外地彼此融合，任选地通过肽接头融合。

在另一个实施方案中，第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的N末端融合。在一个这样的具体实施方案中，双特异性抗体基本上由第一和第二抗原结合部分、以第一和第二亚基组成的Fc结构域和任选地一个或多个肽接头组成，其中第一和第二抗原结合部分各自在Fab重链的C末端与Fc结构域的亚基之一的N末端融合。

在其他实施方案中，第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的N末端融合。在一个这样的特定实施方案中，第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合。在一个这样的具体实施方案中，双特异性抗体基本上由第一和第二抗原结合部分、以第一和第二亚基组成的Fc结构域和任选地一个或多个肽接头组成，其中第一抗原结合部分在Fab重链的C末端与第二抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，并且第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与Fc结构域的第一或第二亚基的N末端融合。任选地，第二抗原结合部分的Fab轻链和第一抗原结合部分的Fab轻链可以额外地彼此融合。

在一个实施方案中，第一和第二抗原结合部分是包含共同轻链的常规Fab分子。在一个实施方案中，第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，任选地通过肽接头融合。在一个实施方案中，第一抗原结合部分的Fab轻链和第二抗原结合部分的Fab轻链彼此融合，任选地通过肽接头彼此融合。

抗原结合部分可以与Fc结构域融合或彼此直接融合或通过包含一个或多个氨基酸、一般约2-20个氨基酸的肽接头融合。本领域已知并且本文中描述了肽接头。合适地，无免疫原性肽接头例如包括(G₄S)_n、(SG₄)_n、(G₄S)_n或G₄(SG₄)_n肽接头，“n”通常是在1和10之间、一般在2和4之间的数字。使第一和第二抗原结合部分的Fab轻链彼此融合的特别合适的肽接头是(G₄S)₂。另外，接头可以包含(一部分的)免疫球蛋白铰链区。特别地当抗原结合部分与Fc结构域亚基的N末端融合情况下，它可以在具有或没有额外的肽接头的情况下通过免疫球蛋白铰链区或其部分融合。

具有能够与靶细胞抗原特异性结合的单个抗原结合部分的双特异性抗体是有用的，尤其在高亲和力抗原结合部分结合之后应期望靶细胞抗原内化的情况下有用。在这种情况下，多于一个对靶细胞抗原特异的抗原结合部分的存在可以增强靶细胞抗原的内化，因而减少其可获得性。

然而，在许多其他情况下，将有利的是具有包含两个或更多个对靶细胞抗原特异的抗原结合部分的双特异性抗体，例如以优化靶向靶位点。

因此，在某些实施方案中，根据本发明使用的双特异性抗体还包含能够与靶细胞抗原特异性结合的第三抗原结合部分。在其他实施方案中，第三抗原结合部分是常规Fab分子，或交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换。在一个实施方案中，第三抗原结合部分能够特异性结合与第一抗原结合部分相同的靶细胞抗原。在一个具体实施方案中，第二抗原结合部分能够与CD3特异性结合，并且第一和第三抗原结合部分能够与靶细胞抗原特异性结合。在一个具体实施方案中，第一和第三抗原结合部分是相同的(即它们包含相同的氨基酸序列)。

在一个具体实施方案中，第二抗原结合部分能够与CD3特异性结合，并且第一和第三抗原结合部分能够与FolR1特异性结合，其中第一和第三抗原结合部分包含选自SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16的至少一个重链互补决定区(CDR)和选自SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19的至少一个轻链CDR。

在一个具体实施方案中，第二抗原结合部分能够与CD3特异性结合，并且包含选自SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13的至少一个重链互补决定区(CDR)和选自SEQID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19的至少一个轻链CDR；并且第一和第三抗原结合部分能够与FolR1特异性结合，其中第一和第三抗原结合部分包含选自SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：15和SEQ ID NO：16的至少一个重链互补决定区(CDR)和选自SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19的至少一个轻链CDR。

在一个具体实施方案中，第二抗原结合部分是Fab分子，所述Fab分子能够与CD3特异性结合，包含SEQ ID NO：11的重链互补决定区(CDR)1、SEQ ID NO：12的重链CDR 2、SEQID NO：13的重链CDR 3、SEQ ID NO：17的轻链CDR 1、SEQ ID NO：18的轻链CDR 2和SEQ IDNO：19的轻链CDR 3，其中第一抗原结合部分是交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区，特别地它们的恒定区交换；并且第一和第三抗原结合部分各自是能够与FolR1特异性结合的Fab分子，所述Fab分子包含SEQ ID NO：14的重链CDR 1、SEQ ID NO：15的重链CDR 2、SEQ ID NO：16的重链CDR 3、SEQ ID NO：17的轻链CDR 1、SEQ ID NO：18的轻链CDR 2和SEQ ID NO：19的轻链CDR 3。

在一个具体实施方案中，第二抗原结合部分能够与CD3特异性结合，并且包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：26的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：28的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列，并且第一和第三抗原结合部分能够与FolR1特异性结合，其中第二和第三抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO：27的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO：28的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。

根据本发明使用的双特异性抗体的Fc结构域由一对包含免疫球蛋白分子重链结构域的多肽链组成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc结构域是二聚体，其每个亚基包含CH2和CH3IgG重链恒定结构域。Fc结构域的两个亚基能够彼此稳定缔合。在一个实施方案中，根据本发明使用的双特异性抗体包含不多于一个Fc结构域。

在一个实施方案中，双特异性抗体的Fc结构域是IgG Fc结构域。在一个实施方案中，Fc结构域是IgG1或IgG4Fc结构域。在一个具体实施方案中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域。在另一个实施方案中，Fc结构域是IgG4Fc结构域。在一个更具体的实施方案中，Fc结构域是在位置S228(Kabat编号)包含氨基酸置换、尤其包含氨基酸置换S228P的IgG4Fc结构域。这个氨基酸置换减少IgG₄抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch等人，Drug Metabolismand Disposition 38，84-91(2010))。在又一个实施方案中，Fc结构域是人Fc结构域。

根据本发明使用的双特异性抗体包含与Fc结构域的两个亚基中一者或另一者融合的不同抗原结合部分，因此Fc结构域的两个亚基一般包含于两条不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和后续二聚化导致两种多肽的几种可能组合为了改善重组生产时双特异性抗体的产率和纯度，将因此有利的是在双特异性抗体的Fc结构域中引入促进所需多肽缔合的修饰。

因此，在具体的实施方案中，根据本发明使用的双特异性抗体包含促进Fc结构域的第一和第二亚基缔合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间蛋白质-蛋白质相互作用最广泛的位点处于Fc结构域的CH3结构域中。因此，在一个实施方案中，所述修饰在Fc结构域的CH3结构域中。

在一个具体实施方案中，所述修饰是所谓的“结入扣”修饰，包括在Fc结构域的两个亚基的一者中的“结修饰”和在Fc结构域的两个亚基的另一者中的“扣修饰”。结入扣技术例如在US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng 9，617-621(1996)和Carter，J Immunol Meth 248，7-15(2001)中描述。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入突出部分(“结”)并在第二多肽的界面中引入相应空穴(“扣”)，从而可以将突出部分安置在空穴中，从而促进异二聚体形成并阻碍同型二聚体形成。通过将源自第一多肽界面小氨基酸侧链替换为较大侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)，构建突出部分。通过将大氨基酸侧链替换为较小侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)、在第二多肽的界面中产生与突出部分具有相同或相似尺寸的补偿空穴。

因此，在一个具体实施方案中，双特异性抗体的Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸残基由具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，因而在第一亚基的CH3结构域内部产生可布置在第二亚基的CH3结构域内部空穴中的突出部分，并且Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸残基由具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，因而在第二亚基的CH3结构域内部产生空穴，在空穴内部可布置第一亚基的CH3结构域内部的突出部分。

突出部分和空穴可以通过改变编码多肽的核酸产生，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成产生。在一个具体实施方案中，Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中位置366处的苏氨酸残基由色氨酸残基替换(T366W)，并且Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中位置407处的酪氨酸残基由缬氨酸残基替换(Y407V)。在一个实施方案中，Fc结构域的第二亚基中位置366处的苏氨酸残基额外地由丝氨酸残基替换(T366S)并且位置368处的亮氨酸残基由丙氨酸残基替换(L368A)。在又一个实施方案中，Fc结构域的第一亚基中位置354处的丝氨酸残基额外地由半胱氨酸残基替换(S354C)并且Fc结构域的第二亚基中位置349处的酪氨酸残基额外地由半胱氨酸残基替换(Y349C)。这两个半胱氨酸残基的引入导致二硫键在Fc结构域的两个亚基之间形成，进一步稳定二聚体(Carter，J Immunol Methods 248，7-15(2001))。

在一个具体实施方案中，能够与CD3结合的抗原结合部分融合(任选地通过能够与靶细胞抗原结合的抗原结合部分)于Fc结构域的第一亚基(包含“结修饰”)。

在一个备选实施方案中，促进Fc结构域的第一和第二亚基缔合的修饰包括介导静电转向效应的修饰，例如，如PCT公开WO 2009/089004中所述。通常，这种方法涉及将两个Fc结构域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基替换为带电荷的氨基酸残基，从而同型二聚体形成在静电上变得不利，而异二聚化在静电上有利。

在一个实施方案中，步骤iii)的双特异性抗体额外地包含c)通过蛋白酶可切割接头与第二抗原结合部分共价连接的掩蔽部分，其中掩蔽部分能够与第二抗原结合部分的独特型特异性结合，由此可逆地遮蔽第二抗原结合部分。这类构建体称作“蛋白酶可活化”，因为第二抗原结合部分将仅在蛋白酶可切割接头由蛋白酶切割时才去遮盖。在一个实施方案中，蛋白酶由肿瘤样品表达。在一个实施方案中，能够切割蛋白酶可切割接头的蛋白酶选自金属蛋白酶，例如，基质金属蛋白酶(MMP)1-28和A解整联蛋白和金属蛋白酶(ADAM)2、7-12、15、17-23、28-30和33、丝氨酸蛋白酶，例如，尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活物和Matriptase、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和组织蛋白酶。在一个具体实施方案中，蛋白酶是MMP9或MMP2。在又一个具体实施方案中，蛋白酶是Matriptase。本领域已知蛋白酶表达提示恶性肿瘤。因此，在一个实施方案中，蛋白酶表达提示恶性肿瘤。在一个实施方案中，当第一抗原结合部分与肿瘤样品中肿瘤细胞上的靶抗原结合并且蛋白酶可切割接头被肿瘤细胞表达的蛋白酶切割及随后第二抗原结合部分与信号转导性细胞表面受体结合时，报道基因由报道细胞表达。一旦切割接头，则第二抗原结合部分露出并与信号转导性细胞表面受体结合，其中报道基因的表达启动。因此，报道基因的表达提示肿瘤中的靶抗原和蛋白酶表达，其中蛋白酶表达提示恶性肿瘤。

在一个实施方案中，抗独特型掩蔽部分与第二抗原结合部分的独特型结合。在一个实施方案中，抗独特型掩蔽部分具有约1nM至约8nM的KD，尤其如通过表面等离子体共振(SPR)测定。在一个实施方案中，抗独特型掩蔽部分在37℃具有约2nM的KD，如通过SPR测定。在一个具体实施方案中，掩蔽部分识别能够与CD3(例如，人CD3)特异性结合的第二抗原结合部分的独特型。在一个具体实施方案中，掩蔽部分识别能够与靶细胞抗原结合的第二抗原结合部分的独特型。

在一个实施方案中，第二抗原结合部分能够与CD3特异性结合。能够与CD3特异性结合的第二抗原结合部分包含独特型。在一个实施方案中，蛋白酶可活化的T细胞活化性双特异性分子的掩蔽部分与第二抗原结合部分共价连接。在一个实施方案中，掩蔽部分与第二抗原结合部分的重链可变区共价连接。在一个实施方案中，掩蔽部分与第二抗原结合部分的轻链可变区共价连接。这个共价键区别于掩蔽部分与独特型第一抗原结合位点的特异性结合(其优选地是非共价的)。第二抗原结合部分的独特型包含其可变区。在一个实施方案中，当第二抗原结合部分与CD3结合时，掩蔽部分与接触于CD3的氨基酸残基结合。在一个优选实施方案中，掩蔽部分不是第二抗原结合部分的相关抗原或其片段，即，掩蔽部分不是CD3或其片段。在一个实施方案中，掩蔽部分是抗独特型抗体或其片段。在一个实施方案中，掩蔽部分是抗独特型scFv。实施例中详述掩蔽部分的示例性实施方案，其为抗独特型scFv和包含这类掩蔽部分的蛋白酶可活化T细胞活化性分子。

在一个实施方案中，掩蔽部分掩蔽CD3结合部分并且包含SEQ ID NO：20的重链CDR1、SEQ ID NO：21的重链CDR 2、SEQ ID NO：22的重链CDR 3、SEQ ID NO：23的轻链CDR 1、SEQID NO：24的轻链CDR 2，和SEQ ID NO：25的轻链CDR 3中至少之一。在一个实施方案中，掩蔽部分包含SEQ ID NO：20的重链CDR 1、SEQ ID NO：21的重链CDR 2、SEQ ID NO：22的重链CDR3、SEQ ID NO：23的轻链CDR 1、SEQ ID NO：24的轻链CDR 2，和SEQ ID NO：25的轻链CDR 3。

在一个实施方案中，独特型特异性多肽是抗独特型scFv。在一个实施方案中，独特型特异性多肽通过接头与分子共价连接。在一个实施方案中，独特型特异性多肽通过多于一个接头与分子共价连接。在一个实施方案中，独特型特异性多肽通过两个接头与分子共价连接。在一个实施方案中，接头是肽接头。在一个实施方案中，接头是蛋白酶可切割接头。在一个实施方案中，蛋白酶可切割接头包含SEQ ID NO：30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44的序列。在一个实施方案中，蛋白酶可切割接头包含至少一个蛋白酶识别位点。

在一个实施方案中，蛋白酶识别位点包含SEQ ID NO：45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59的多肽序列。

在一个实施方案中，蛋白酶可切割接包含蛋白酶识别序列。在一个实施方案中，蛋白酶识别序列选自：

(a)RQARVVNG(SEQ ID NO：45)；

(b)VHMPLGFLGPGRSRGSFP(SEQ ID NO：46)；

(c)RQARVVNGXXXXXVPLSLYSG(SEQ ID NO：47)；

(d)RQARVVNGVPLSLYSG(SEQ ID NO：48)；

(e)PLGLWSQ(SEQ ID NO：49)；

(f)VHMPLGFLGPRQARVVNG(SEQ ID NO：50)；

(g)FVGGTG(SEQ ID NO：51)；

(h)KKAAPVNG(SEQ ID NO：52)；

(i)PMAKKVNG(SEQ ID NO：53)；

(j)QARAKVNG(SEQ ID NO：54)；

(k)VHMPLGFLGP(SEQ ID NO：55)；

(l)QARAK(SEQ ID NO：56)；

(m)VHMPLGFLGPPMAKK(SEQ ID NO：57)；

(n)KKAAP(SEQ ID NO：58)；和

(o)PMAKK(SEQ ID NO：59)，其中X是任何氨基酸。

在一个实施方案中，蛋白酶选自金属蛋白酶，例如，基质金属蛋白酶(MMP)1-28和A解整联蛋白和金属蛋白酶(ADAM)2、7-12、15、17-23、28-30和33、丝氨酸蛋白酶，例如，尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活物和Matriptase、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和组织蛋白酶。在一个实施方案中，蛋白酶选自金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、和组织蛋白酶。在一个实施方案中，蛋白酶是金属蛋白酶。在一个实施方案中金属蛋白酶是基质金属蛋白酶(MMP)、尤其MMP9或MMP2。在一个实施方案中，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。在一个实施方案中，丝氨酸蛋白酶是Matriptase。因此，在一个实施方案中，蛋白酶切割蛋白酶可切割接头，其中第二抗原结合部分去遮盖。在一个实施方案中，如本文所述的蛋白酶由肿瘤细胞表达。在一个实施方案中，蛋白酶在肿瘤样品中表达，尤其在如本文所述的活组织检查样品中表达。在一个实施方案中，蛋白酶在肿瘤组织样品、尤其来自患者的活组织检查样品中表达。在一个实施方案中，报道基因表达提示肿瘤样品中蛋白酶表达。

根据如本文所述的方法，包含通过蛋白酶可切割接头与第二抗原结合部分连接的掩蔽部分的抗体用来检测肿瘤样品中的蛋白酶表达。在一个实施方案中，蛋白酶可活化的双特异性抗体的靶抗原是细胞表面受体。在一个实施方案中，靶抗原选自CEA、Her2、TYRP、EGFR、MCSP、STEAP1、WT1和FolR1。在一个实施方案中，靶抗原是FolR1。

在一个实施方案中，根据本发明使用的蛋白酶可活化的双特异性抗体包含至少一个对FolR1特异的抗原结合部分，还包含抗独特型CD3scFv，其包含SEQ ID NO：20的重链CDR1、SEQ ID NO：21的重链CDR 2、SEQ ID NO：22的重链CDR 3、SEQ ID NO：23的轻链CDR 1、SEQID NO：24的轻链CDR 2，和SEQ ID NO：25的轻链CDR 3中至少之一。在一个实施方案中，抗独特型scFv包含SEQ ID NO：20的重链CDR 1、SEQ ID NO：21的重链CDR 2、SEQ ID NO：22的重链CDR 3、SEQ ID NO：23的轻链CDR 1、SEQ ID NO：24的轻链CDR 2，和SEQ ID NO：25的轻链CDR 3。

在一个实施方案中，根据本发明使用的蛋白酶可活化的双特异性抗体包含至少一个对FolR1特异的抗原结合部分，还包含抗独特型CD3scFv，其包含与SEQ ID NO：29至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列。在一个实施方案中，抗独特型scFv包含SEQ ID NO：29的多肽序列。

因此，本发明的测定法是能够评估与如本文所述的靶抗原的结合和如本文所述的蛋白酶的表达。在一个实施方案中，在相同小瓶中确定与靶抗原的结合和蛋白酶的表达。在一个实施方案中，本发明的测定法用于选择适于治疗肿瘤的蛋白酶可切割接头。

在一个实施方案中，根据本发明使用的蛋白酶可活化的双特异性抗体包含与SEQID NO：5至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列、与SEQ ID NO：6至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列和与SEQ ID NO：7至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列。

在一个实施方案中，根据本发明使用的蛋白酶可活化的双特异性抗体包含SEQ IDNO：5的多肽序列、SEQ ID NO：6的多肽序列和SEQ ID NO：7的多肽序列。

在一个实施方案中，根据本发明使用的蛋白酶可活化的双特异性抗体包含与SEQID NO：5至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列、与SEQ ID NO：7至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列和与SEQ ID NO：10至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列。

在一个实施方案中，根据本发明使用的蛋白酶可活化的双特异性抗体包含SEQ IDNO：5的多肽序列、SEQ ID NO：7的多肽序列和SEQ ID NO：10的多肽序列。(8363)

在一个实施方案中，根据本发明使用的蛋白酶可活化的双特异性抗体包含与SEQID NO：5至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列、与SEQ ID NO：7至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列和与SEQ ID NO：8至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列。

在一个实施方案中，根据本发明使用的蛋白酶可活化的双特异性抗体包含SEQ IDNO：5的多肽序列、SEQ ID NO：7的多肽序列和SEQ ID NO：8的多肽序列。

在一个实施方案中，根据本发明使用的蛋白酶可活化的双特异性抗体包含与SEQID NO：3至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列、与SEQ ID NO：4至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列和与SEQ ID NO：5至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的多肽序列。

在一个实施方案中，根据本发明使用的蛋白酶可活化的双特异性抗体包含SEQ IDNO：3的多肽序列、SEQ ID NO：4的多肽序列和SEQ ID NO：5的多肽序列。

在其他实施方案中，提供了一种选择双特异性抗体以治疗肿瘤的方法，其中双特异性抗体包含：

a.能够与靶抗原特异性结合的第一抗原结合部分；和

其中该方法包括根据如本文所述的方法确定肿瘤样品中存在靶抗原并且其中如果检测到报道基因表达，则选择双特异性抗体用于治疗肿瘤。

在一个实施方案中，双特异性抗体额外地包含c)通过蛋白酶可切割接头与第二抗原结合部分共价连接的掩蔽部分，其中掩蔽部分能够与第二抗原结合部分的独特型特异性结合，由此可逆地遮蔽如本文所述的第二抗原结合部分。这类构建体在本文中描述为蛋白酶可活化的。

考虑了靶向相同或甚至不同细胞上不同抗原的双特异性抗体以克服癌疗法中的某些当前难题。这些构建体中某些结合至不同细胞上的抗原，例如，结合至癌细胞上的靶抗原和效应细胞上、尤其T细胞上的免疫刺激性抗原。靶抗原应该指引双特异性抗体至肿瘤组织，在那里，免疫刺激性抗原活化效应细胞，这导致肿瘤细胞遭效应细胞(例如，T细胞)高效破坏。此外，可能需要遮蔽免疫刺激性抗原直至抗体抵达其肿瘤靶，以避免因全身性应用抗体所致的不良作用。一些构建体包含与肿瘤结合时去遮盖的可活化免疫调节部分。这可以通过用掩蔽部分遮蔽免疫调节部分，如本文所述那样进行，其中所述掩蔽部分借助蛋白酶可切割接头与所述免疫调节部分连接。这些构建体在本文中描述为蛋白酶可活化。

为了高效溶解肿瘤，肿瘤细胞必须以合适的量表达针对抗体的靶抗原，以与肿瘤细胞高效结合。另外，对于具有被遮蔽部分的蛋白酶可活化构建体，肿瘤细胞必须还以合适的量表达肿瘤组织特异性蛋白酶，以高效切割掩蔽部分和被掩蔽部分之间的蛋白酶可切割接头。本发明的方法提供通过评估肿瘤样品(例如，肿瘤活组织检查样品)的靶抗原结合情况和/或蛋白酶表达，评估双特异性抗体是否适于治疗肿瘤的测定法。因此，在本发明方法中测量的报道基因表达提示了适合治疗肿瘤的双特异性抗体，其中肿瘤样品是来自患者的肿瘤活组织检查样品并且其中双特异性抗体是治疗肿瘤的候选抗体。在一个实施方案中，本发明的测定法用于选择适于治疗肿瘤的蛋白酶可切割接头。评估可以按照如本文所述的高通量样式进行，即可以平行评估多种治疗肿瘤的候选抗体。该测定法稳健并容忍肿瘤样品中存在死细胞。为治疗肿瘤所选择的双特异性抗体可以用于如本文所述的治疗方法中。适于使用本发明测定法治疗选定肿瘤的蛋白酶可切割接头可以包含于新的或已知的治疗癌症的双特异性抗体中。

为如本文所述那样治疗肿瘤所选择的任何双特异性抗体可以用于治疗方法中。为治疗肿瘤所选择的双特异性抗体可以用作免疫治疗剂，例如用于治疗癌症。为了用于治疗方法中，根据本发明选择的双特异性抗体将以符合良好医学实践的方式配制、投予和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的具体病症、正在治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症原因、送递药物的部位、施用方法，施用计划和医疗执业者已知的其他因素。

在一个方面，提供了根据本发明的方法选择用于治疗肿瘤的双特异性抗体。在一个方面，提供了选择的双特异性抗体用作药物。在其他方面，提供选择的本发明双特异性抗体用于治疗疾病。在某些实施方案中，提供选择的本发明双特异性抗体用于治疗方法中。在一个实施方案中，本发明提供如本文所述那样选择的双特异性抗体用于治疗有需求的个体中的疾病。在某些实施方案中，本发明提供双特异性抗体用于治疗患有疾病的个体的方法中，所述方法包括向该个体施用治疗有效量的选定双特异性抗体。在某些实施方案中，待治疗的疾病是增殖性病症。在一个具体实施方案中，疾病是癌症。在某些实施方案中，该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种额外的治疗药，例如，如果待治疗的疾病是癌症，施用抗癌药。在其他实施方案中，本发明提供如本文所述那样选择的双特异性抗体用于诱导靶细胞裂解、尤其肿瘤细胞裂解。在某些实施方案中，本发明提供双特异性抗体用于诱导个体中靶细胞裂解、尤其肿瘤细胞裂解的方法，所述方法包括向该个体施用有效量的选定双特异性抗体以诱导靶细胞裂解。根据以上任一个实施方案的“个体”是哺乳动物，优选地是人类。

在又一个方面，本发明提供为如本文所述那样治疗肿瘤所选择的双特异性抗体在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗有需求的个体中的疾病。在又一个实施方案中，该药物用于治疗疾病的方法中，所述方法包括向患有该疾病的个体施用治疗有效量的药物。在某些实施方案中，待治疗的疾病是增殖性病症。在一个具体实施方案中，疾病是癌症。在一个实施方案中，该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种额外的治疗药，例如，如果待治疗的疾病是癌症，则施用抗癌药。在又一个实施方案中，药物用于诱导靶细胞裂解、尤其肿瘤细胞裂解。在仍然又一个实施方案中，该药物用于诱导个体中靶细胞裂解、尤其肿瘤细胞裂解的方法中，所述方法包括向该个体施用有效量的药物以诱导靶细胞裂解。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。在一个具体实施方案中，使用本发明的方法评估个体的肿瘤样品，例如，肿瘤活组织检查样品，以找到治疗肿瘤的合适双特异性抗体。

在又一个方面，本发明提供一种用于治疗疾病的方法。在一个实施方案中，该方法包括根据如本文所述的方法选择治疗疾病的双特异性抗体并且向患有这种疾病的个体施用治疗有效量的选定双特异性抗体。在一个实施方案中，将组合物施用至所述个体，所述组合物包含处于可药用形式的选定双特异性抗体。在某些实施方案中，待治疗的疾病是增殖性病症。在一个具体实施方案中，疾病是癌症。在某些实施方案中，该方法还包括向个体施用治疗有效量的至少一种额外的治疗药，例如，如果待治疗的疾病是癌症，施用抗癌药。根据以上实施方案中任一个实施方案的“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。

在又一个方面，本发明提供一种用于诱导靶细胞裂解、尤其肿瘤细胞裂解的方法。在一个实施方案中，该方法包括使靶细胞与根据本发明选择的双特异性抗体在T细胞、尤其细胞毒T细胞存在下接触。在又一个方面，提供一种用于诱导个体中靶细胞裂解、尤其肿瘤细胞裂解的方法。在这样一个实施方案中，该方法包括向个体施用有效量的双特异性抗体以诱导靶细胞裂解。在一个实施方案中，“个体”是人。

在某些实施方案中，待治疗的疾病是增殖性病症，尤其癌症。癌症的非限制性例子包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食管癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌和肾癌。可以使用双特异性抗体治疗的其他细胞增殖病症包括但不限于位于以下部位的肿瘤：腹部、骨、乳腺、消化系统、肝、胰、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头部和颈部、(中枢和外周)神经系统、淋巴系统、盆腔、皮肤、软组织、脾、胸部和泌尿生殖系统。还包括癌前病状或损害和癌症转移灶。在某些实施方案中，癌症选自肾细胞癌、皮肤癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌。技术人员轻易地认识到，在许多情况下双特异性抗体可能不提供治愈，而仅可以提供部分益处。在一些实施方案中，具有某些益处的生理变化也视为治疗性有益的。因此，在一些实施方案中，将提供生理变化的双特异性抗体的量视为“有效量”或“治疗有效量”。需要治疗的受试者、患者或个体一般是哺乳动物、更具体地是人。

在一些实施方案中，将有效量的本发明所选双特异性抗体施用至细胞。在其他实施方案中，将治疗有效量的双特异性抗体施用至个体以治疗疾病。对于预防或治疗疾病，双特异性抗体的适宜剂量(当单独或与一种或多种其他额外治疗药组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、施用途径、患者体重、T细胞活化性双特异性抗体的类型、疾病的严重性和过程、T细胞活化性双特异性抗体是否出于预防或治疗目的施用、既往或伴同治疗性介入、患者的临床史和对抗体的反应以及主治医师的决定。在任何情况下，负责施用的执业者将决定用于单个受试者的组合物中的有效成分浓度及适宜剂量。本文中构思了多种给药方案，包括但不限于单次或在多个时间点多次施用、推注施用(bolus administration)和脉冲输注。

将选择的双特异性抗体适当地按一次或经过一系列治疗施用至患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)双特异性抗体可以是向患者施用的起始候选剂量，无论是否例如通过一个或多个单独施用或通过连续输注来施用。取决于上文提到的因素，一个常见的每日剂量可能是从约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于在几日或更长时间范围内重复施用，取决于病状，治疗通常将持续直至对疾病症状的所需抑制作用出现。T细胞活化性双特异性抗体的一个示例性剂量将处于约0.005mg/kg至约10mg/kg范围内。在其他非限制性例子中，剂量还可以包含每次施用约1微克/kg体重、约5微克/kg体重、约10微克/kg体重、约50微克/kg体重、约100微克/kg体重、约200微克/kg体重、约350微克/kg体重、约500微克/kg体重、约1毫克/kg体重、约5毫克/kg体重、约10毫克/kg体重、约50毫克/kg体重、约100毫克/kg体重、约200毫克/kg体重、约350毫克/kg体重、约500毫克/kg体重至约1000mg/kg体重或或更多，和其中可推导的任何范围。在来自本文所列数值的可推导范围的非限制性例子中，基于上文描述的数值，可以施用约5mg/kg体重至约100mg/kg体重、约5微克/kg体重至约500毫克/kg体重等的范围。因此，可以向患者施用一剂或多剂的约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)。这类剂量可以间歇地施用，例如每周或每三周施用(例如从而该患者接受约二剂至约二十剂或例如约六剂双特异性抗体)。可以施用较高的初始负荷剂量，随后是一个或多个较低剂量。然而，可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定法容易地监测这种疗法的进程。

根据本发明选择的双特异性抗体通常将按有效实现预期目的量使用。为了用来治疗或预防疾病状态，以治疗有效量施用或施加选择的双特异性抗体或其药物组合物。确定治疗有效量完全处于本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文所提供的详细公开内容。对于全身性施用，可以从体外测定法初步估计治疗有效剂量，如细胞培养测定法。可以在动物模型中配制某个剂量以实现包括IC₅₀的循环浓度范围，如细胞培养物中所测定。这种信息可以用来更准确地确定人体中的有用剂量。也可以使用本领域熟知的技术，从体内数据(如动物模型)估计初始剂量。本领域普通技术人员可以基于动物数据轻易地优化对人类施用。可以逐一调整剂量和间隔时间以提供足以维持治疗效果的双特异性抗体血浆水平。通过注射施用的患者常规剂量是约0.1至50mg/kg/日，一般约0.5至1mg/kg/日。可以通过每日施用多个剂量实现治疗有效的血浆水平。可以测量血浆中的水平，例如，通过HPLC测量。

本文所述的所选双特异性抗体的治疗有效剂量通常将在不造成明显毒性的情况下提供治疗益处。可以通过标准药学流程在细胞培养物或实验动物中确定双特异性抗体的毒性和治疗功效。细胞培养测定法和动物研究可以用来测定LD₅₀(对50％群体致死的剂量)和ED₅₀(50％群体中治疗有效的剂量)。毒性作用和治疗作用之间的剂量比是治疗指数，它可以表述为LD₅₀/ED₅₀比。优选显示出大治疗指数的双特异性抗体。在一个实施方案中，根据本发明选择的双特异性抗体显示高治疗指数。从细胞培养物测定法和动物研究中获得的数据可以在配制适用于人类中的剂量范围时使用。该剂量优选地处于低毒性或无毒性情况下包括ED₅₀的一系列循环浓度范围内。剂量可以在这个范围内部变动，这取决于多种因素，例如，所用的剂型、所用的施用途径、受试者状况等。确切配方、施用途径和剂量可以由各位医师根据患者的状况选择(参见，例如Fingl等人，1975，引自：The Pharmacological Basis ofTherapeutics，第1章，第1页，所述文献通过引用方式完整并入本文作为参考)。

用根据本发明选择的双特异性抗体治疗的患者的主治医生将知道如何和何时因毒性、器官功能障碍等而终止、中断或调节施用。反过来，如果临床反应不充分(不包括毒性)，主治医师也会知道将治疗调整到更高的水平。治疗目的病状时所施用剂量的大小将随待治疗病状的严重程度、随施用途径等变动。可以例如部分地通过标准预后评价方法，评价病状的严重程度。另外，剂量和或许给药频率也将根据各位患者的年龄、体重和反应而变动。

示例性实施方案

1.确定肿瘤样品中存在靶抗原的体外方法，包括步骤：

i)提供肿瘤样品；

iii)向肿瘤样品添加双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：

a)能够与靶抗原特异性结合的第一抗原结合部分；和

iv)向肿瘤样品添加报道细胞；和

v)通过确定报道基因的表达，确定靶抗原的存在。

2.根据实施方案1的方法，其中靶抗原由肿瘤细胞表达。

3.根据实施方案1或2中任一者的方法，其中报道基因表达提示第一抗原结合部分与靶抗原结合。

4.根据实施方案1至3中任一者的方法，其中双特异性抗体额外地包含：

c)通过蛋白酶可切割接头与第二抗原结合部分共价连接的掩蔽部分，其中掩蔽部分能够与第二抗原结合部分的独特型特异性结合，由此可逆地遮蔽第二抗原结合部分；

5.根据实施方案1至4中任一者的方法，其中蛋白酶切割蛋白酶可切割接头，其中第二抗原结合部分去遮盖。

6.根据实施方案1至5中任一者的方法，其中蛋白酶由肿瘤细胞表达。

7.根据实施方案4至6中任一者的方法，其中报道基因表达提示肿瘤样品中蛋白酶表达。

8.根据实施方案1至7中任一者的方法，其中肿瘤样品是肿瘤组织样品，尤其来自患者的活组织检查样品。

9.根据实施方案1至8中任一者的方法，其中肿瘤样品未消化。

10.根据实施方案1至9中任一者的方法，其中肿瘤样品经消化，尤其经胶原酶或透明质酸酶消化。

11.根据实施方案1至10中任一者的方法，其中肿瘤样品含有死细胞，尤其多于10％的死细胞。

12.根据实施方案6至11中任一者的方法，其中蛋白酶表达提示恶性肿瘤。

13.根据实施方案1至12中任一者的方法，其中信号转导性细胞表面受体与反应元件功能性连接。

14.根据实施方案1至13中任一者的方法，其中反应元件控制报道基因的表达。

15.根据实施方案1至14中任一者的方法，其中反应元件是NF-κB途径的部分。

16.根据实施方案15的方法，其中反应元件包含具有SEQ ID NO：68、69、70、71或72的DNA序列的至少一个DNA重复序列。

17.根据实施方案15或16中任一者的方法，其中反应元件包含SEQ ID NO：73、74、75或76的DNA序列。

18.根据实施方案1至17中任一者的方法，其中报道基因编码荧光蛋白或发光蛋白。

19.根据实施方案1至18中任一者的方法，其中报道基因编码绿色荧光蛋白(GFP)或萤光素酶。

20.根据实施方案1至19中任一者的方法，其中报道细胞包含编码反应元件控制下的报道基因的DNA序列和编码信号转导性细胞表面受体的DNA序列。

21.根据实施方案1至20中任一者的方法，其中报道细胞包含具有SEQ ID NO：68、69、70、71或72的DNA序列的至少一个DNA重复序列，其中所述DNA重复序列与报道基因有效连接并且其中一旦第二抗原结合部分与信号转导性细胞表面受体结合，则报道基因表达。

22.根据实施方案1至21中任一者的方法，其中第二抗原结合部分能够与CD3ε特异性结合。

23.根据实施方案4至22中任一者的方法，其中蛋白酶可切割接头包含蛋白酶识别序列。

24.根据实施方案23的方法，其中蛋白酶识别序列选自：

a)RQARVVNG(SEQ ID NO：45)；

b)VHMPLGFLGPGRSRGSFP(SEQ ID NO：46)；

c)RQARVVNGXXXXXVPLSLYSG(SEQ ID NO：47)；

d)RQARVVNGVPLSLYSG(SEQ ID NO：48)；

e)PLGLWSQ(SEQ ID NO：49)；

f)VHMPLGFLGPRQARVVNG(SEQ ID NO：50)；

g)FVGGTG(SEQ ID NO：51)；

h)KKAAPVNG(SEQ ID NO：52)；

i)PMAKKVNG(SEQ ID NO：53)；

j)QARAKVNG(SEQ ID NO：54)；

k)VHMPLGFLGP(SEQ ID NO：55)；

l)QARAK(SEQ ID NO：56)；

m)VHMPLGFLGPPMAKK(SEQ ID NO：57)；

n)KKAAP(SEQ ID NO：58)；和

o)PMAKK(SEQ ID NO：59)，其中X是任何氨基酸。

25.根据实施方案4至24中任一者的方法，其中蛋白酶选自金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和组织蛋白酶。

26.根据实施方案25的方法，其中金属蛋白酶是基质金属蛋白酶(MMP)，尤其MMP9或MMP2。

27.根据实施方案26的方法，其中丝氨酸蛋白酶是Matriptase。

28.根据实施方案4至27中任一者的方法，其中掩蔽部分与第二抗原结合部分的重链可变区共价连接。

29.根据实施方案4至28中任一者的方法，其中掩蔽部分与第二抗原结合部分的轻链可变区共价连接。

30.根据实施方案4至29中任一者的方法，其中掩蔽部分是抗独特型scFv。

31.根据实施方案1至30中任一者的方法，其中第一和第二抗原结合部分彼此融合，任选地通过肽接头彼此融合。

32.根据实施方案1至31中任一者的方法，其中第一和第二抗原结合部分是包含共同轻链的常规Fab分子。

33.根据实施方案32的方法，其中第二抗原结合部分在Fab重链的C末端与第一抗原结合部分的Fab重链的N末端融合，任选地通过肽接头融合。

34.根据实施方案32或33的方法，其中第一抗原结合部分的Fab轻链和第二抗原结合部分的Fab轻链彼此融合，任选地通过肽接头彼此融合。

35.根据实施方案1至34中任一者的方法，其中双特异性抗体包含能够特异性结合肿瘤抗原的第三抗原结合部分。

36.根据实施方案35的方法，其中第三抗原结合部分是常规Fab分子，或交换Fab分子，其中Fab轻链和Fab重链的可变区或恒定区交换。

37.根据实施方案36中任一者的方法，其中第三抗原结合部分与第一抗原结合部分相同。

38.根据实施方案1至37中任一者的方法，其中双特异性抗体额外地包含由能够稳定缔合的第一和第二亚基组成的Fc结构域。

39.根据实施方案38的方法，其中Fc结构域是IgG、特别地IgG1或IgG4的Fc结构域。

40.根据实施方案38或39中任一者的方法，其中Fc结构域是人Fc结构域。

41.根据实施方案1至40中任一者的方法，其中靶抗原是细胞表面受体。

42.根据实施方案1至41中任一者的方法，其中靶抗原是FolR1。

43.根据实施方案1至42中任一者的方法，其中靶抗原是与人主要组织相容性复合体(MHC)的分子结合的肽。

44.根据实施方案43的肽，其中肽具有8个和100个之间、优选地8和30个之间和更优选8个和16个氨基酸之间的总长度。

45.根据实施方案4至44中任一者的方法，其中在相同小瓶中确定与靶抗原的结合和蛋白酶的表达。

46.选择双特异性抗体以治疗肿瘤的体外方法，其中双特异性抗体包含：

a.能够与靶抗原特异性结合的第一抗原结合部分；和

其中所述方法包括根据实施方案1至45中任一者的方法，确定肿瘤样品中靶抗原的存在并且其中如果检测到报道基因表达，则选择双特异性抗体用于治疗肿瘤。

47.基本上如前文所述的方法。

以下是本发明方法和组合物的实施例。应当理解，鉴于上文提供的一般性描述，可以实施多种其他实施方案。虽然已经出于清晰理解的目的，以说明和举例方式某种程度地详细描述前述发明，但是这些说明和例子不应当解释为限制本发明的范围。本文中援引的全部专利和科学文献的公开内容通过引用方式明确地完整并入本文作为参考。

III.实施例

实施例1

制备具有抗CD3 scFv的抗FolR1/抗CD3T细胞双特异性(TCB)分子这个实施例中制备以下分子；其示意图在图2A-F中显示：

ID 8364：“FolR1 2+1 IgG，经典样式(抗独特型scFv 4.32.63-MMP9-MK062Matriptase位点-CD3-N末端融合于FolR1 VH-惰性Fc)，具有N末端融合的抗CD3 scFv4.32.63和MMP9-MK062蛋白酶接头”(图2A，SEQ ID NO：5、6、7)

ID 8363：“FolR1 2+1 IgG，经典样式(抗独特型scFv 4.32.63-组织蛋白酶S/B位点-CD3-N末端融合于FolR1 VH-惰性Fc)，具有N末端融合的抗CD3 scFv 4.32.63和组织蛋白酶S/B蛋白酶接头”(图2B，SEQ ID NO：5、7、10)

ID 8409：“FolR1 2+1 IgG，经典样式(抗独特型scFv4.32.63-不可切割接头-CD3-N端融合于FolR1 VH-惰性Fc)，具有N端融合的抗CD3 scFv 4.32.63和不可切割的GS接头”(图2C)

ID 6298：“FolR1 2+1 IgG，经典样式”(图2D，SEQ ID NO：3、4、5)。

ID 7235/6182：“DP47GS 2+1 IgG，倒转样式”(图2E)

ID 8408：“FolR1 2+1 IgG，经典样式(抗独特型scFv 4.32.63-Matriptase位点-CD3-N末端融合于FolR1 VH-惰性Fc)，具有N末端融合的抗CD3 scFv 4.32.63和Matriptase蛋白酶接头”(图2F，SEQ ID NO：5、7、8)

将可变结构域按照符合预插入的结构域之可读框方式亚克隆入相应的接受者哺乳动物表达载体。蛋白质表达受MPSV启动子驱动并且合成性聚腺苷酸化信号序列存在于CDS的3′末端。此外，每个载体含有EBV OriP序列。

使用聚乙烯亚胺(PEI)，用哺乳动物表达载体共转染悬浮生长的HEK293-EBNA细胞，产生分子。为了转染，在含有6mM L-谷氨酰胺和250mg/l G418的无血清ExCell培养基中培养HEK293 EBNA细胞。为了在600ml离心管瓶(最大工作容积400ml)中生产，在转染之前24小时无G418情况下接种八亿个HEK293 EBNA细胞。为了转染，将八亿个细胞以210x g离心5分钟，并且将上清液更换为40ml含有6mM L-谷氨酰胺的预温CD CHO培养基。将表达载体与40ml含有6mM L-谷氨酰胺的CD CHO培养基混合至总量400μg DNA。在添加1080μl PEI溶液(2.7μg/ml)后，将混合物涡旋混合15秒并随后在室温温育10分钟。此后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移至600ml离心管瓶并在37℃在具有5％CO₂气氛的培养箱中温育3小时。在温育后，添加320ml ExCell+6mM L-谷氨酰胺+5g/L Pepsoy+1.0mM VPA+3g/l葡萄糖培养基并且将细胞培育24小时，之后输入7％补料7。在6-7天后，收集培养上清液以便通过在210xg离心20-30分钟纯化(Sigma 8K离心机)。将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，并且以终浓度0.01％w/v添加叠氮钠。保持溶液在4℃直至纯化。

通过使用蛋白A亲和层析的亲和层析，随后使用一至两个大小排阻层析步骤，从细胞培养上清液纯化分泌的蛋白。

对于亲和层析，将上清液加载于用20mM柠檬酸钠，20mM磷酸钠，pH 7.5平衡的蛋白A MabSelectSure(CV＝5mL，GE Healthcare)上。通过用至少10个柱体积的20mM柠檬酸钠、20mM磷酸钠，pH 7.5洗涤，移除未结合的蛋白质，并且在20个柱体积(从0％-100％的梯度)的20mM柠檬酸钠，100mM氯化钠，100mM甘氨酸，pH 3.0中洗脱靶蛋白。通过添加1/10的0.5MNa₂HPO₄pH 8.0中和蛋白溶液。将靶蛋白用Ultra-15 Ultracel 30K(MerckMillipore Ltd.)浓缩至最多4ml体积，之后加载于用20mM组氨酸，140mM NaCl，0.01％Tween pH 6.0平衡的HiLoad Superdex 200柱(GE Healthcare)上。

通过测量以基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数相除的280nm处光密度(OD)，确定纯化蛋白质样品的蛋白质浓度。

在还原剂存在和不存在下，通过CE-SDS分析法分析最终纯化步骤后的分子的纯度和分子量。根据制造商的说明书使用Caliper LabChip GXII系统(Caliper Lifescience)。

在25℃使用TSKgel G3000 SW XL分析性大小排阻柱(Tosoh)在25mM K₂HPO₄、125mMNaCl、200 mM L-精氨酸单盐酸盐、0.02％(w/v)NaN₃，pH 6.7运行缓冲液中分析所述分子的聚集物含量。

全部分子的最终质量均良好，具有≥95％的单体含量。

表1.蛋白酶激活的TCB分子的产生和纯化总结。

分子	滴度[mg/l]	产率[mg/l]	分析性SEC(HMW/单体/LMW)[％]
				1(8364)	34.55	1.72	0.68/99.32/0
2(8363)	33.75	1.59	4.02/95.98/0

实施例2

质量控制和稳定性

不同TCB分子的毛细管电泳SDS分析。在还原剂存在和不存在下，通过CE-SDS分析法分析最终纯化步骤后的分子的纯度和分子量。根据制造商的说明书使用CaliperLabChip GXII系统(Caliper Lifescience)。比较未处理的分子(储存在4℃)和处理的分子(用适宜的重组蛋白酶(R&D Systems)在37℃处理24小时和在37℃温育72小时的分子)。

比较未处理的和处理的分子，显示在rhMatriptase/ST14处理含有MMP9-MK062Matriptase接头的分子后，切割抗ID scFv(图3A)。采用rhCathepsin B和rhCathepsin S处理的切割不彻底。针对已纯化酶的条件尚未最佳(图3B)。

相比纯分子，在37℃温育72小时的分子在相同的高度前进，这显示分子在37℃在体外测定法持续的时间是稳定的。预染蛋白质标志物Mark 12(Invitrogen)用于估计正确的分子重量。

实施例3

比较蛋白酶激活的FolR1 TCB的不同接头和样式

Jurkat NFAT激活测定法。Jurkat NFAT激活测定法用于比较蛋白酶激活的TCB的不同样式和接头。Jurkat-NFAT报道细胞系(Promega)是表达人CD3ε的具有NFAT启动子的人急性淋巴性白血病报道细胞系。如果TCB结合肿瘤靶并且CD3结合物(交联)结合CD3ε，则添加One-Glo底物(Promega)后，可以以发光测量萤光素酶表达。在96孔白色壁透明底平板(Greiner BioOne)中，将20000个靶细胞接种于无潮霉素的50ul/孔Jurkat培养基(RPMI1640、2g/l葡萄糖、2g/l NaHCO₃、10％FCS、25mM HEPES、2mM L-Glutamin、1x NEAA、1x丙酮酸钠)。将平板在37℃温育约20小时。收获Jurkat-NFAT报道细胞，并且使用ViCell评估活力。将细胞重悬于无潮霉素的Jurkat培养基中并且每孔添加50μl(50000个细胞/孔)。E∶T比率是2.5∶1(基于接种的细胞数目)。将抗体稀释于无潮霉素的Jurkat培养基中并且添加50μl/孔。细胞在增湿培养箱中在37℃温育6小时，之后，将它们从培养箱取出保持约10分钟，以在发光读取之前适应室温。将50μl/孔ONE-Glo溶液添加至各孔并在黑暗下室温温育10分钟。使用WALLAC Victor3 ELISA读数仪(Perkin Elmer 2030)检测发光，1秒/孔作为检测时间。作为阳性对照，将(预处理的)蛋白酶激活的TCB用rhMatriptase/ST14(R&DSystems)在37℃处理约20小时。对预处理的蛋白酶激活的TCB(8364，灰色实心正方形)和FolR1 TCB(黑三角形向下)的比较显示，切割后的效价彻底恢复。在这个浓度范围内对于两个细胞系，均不可检出与掩蔽的TCB(含有GS不可切割接头，向上灰三角形)和非靶向TCB对照(向下空心三角形)温育的细胞发光。点线显示无任何TCB情况下靶细胞和效应细胞的发光(图4A-B)。

实施例4

监测原发肿瘤样品中靶表达(FOLR1 TCB)和蛋白酶活性(蛋白酶激活的FOLR1TCB)的Jurkat-NFAT报道分子测定法

这个测定法的意图是显示人肿瘤样品中肿瘤靶抗原(FolR1)表达和肿瘤特异性蛋白酶如MMP9、Matriptase或组织蛋白酶的活性。

Jurkat-NFAT报道细胞系(Promega)是表达人CD3ε的具有NFAT启动子的人急性淋巴性白血病报道细胞系。如果T细胞双特异性分子结合肿瘤靶和CD3ε(交联)，则可以测量萤光素酶表达。在添加One-Glo底物(Promega)后测量发光。

原发肿瘤样品接收自Indivumed GmbH，德国。样品在转运介质中过夜运送。术后约24小时，将样品以小片切割。

第一方法(图5)：

通过每个孔中插入一个Millicell Cell Culture Insert，12mm，亲水PTFE，0.4μm(PICM01250，MerckMillipore)，准备24孔平板。将抗体稀释于无潮霉素但含1.5X青霉素/链霉素溶液的Jurkat培养基中。在孔内添加400ul和在滤器外侧添加600ul。将人肿瘤的两至三个小片添加至每个孔并在37℃，5％CO₂温育48小时。

收获Jurkat-NFAT报道细胞，并且使用ViCell评估活力。将细胞以350xg离心7分钟，之后将它们重悬于无潮霉素的Jurkat培养基中并且每孔添加500μl(500,000个细胞/孔)。将平板在增湿培养箱中37℃温育5小时，之后取出供读取发光。将500μl/孔ONE-Glo溶液添加至每个孔并在黑暗下室温温育10分钟。使用WALLAC Victor3 ELISA读数仪(PerkinElmer 2030)检测发光，1秒/孔作为检测时间。

第二方法(图6)：

通过添加18ul冷的Matrigel(Matrigel(734-1101，Corning/VWR)，准备96孔白色壁、(透明)平底平板。将平板在37℃温育2分钟，之后添加肿瘤小片(一式三份)。每孔添加33ul冷的Matrigel并将平板在37℃再次温育2分钟。每孔添加(无潮霉素但含有2X青霉素/链霉素的Jurkat培养基中的)50ul抗体稀释物并且将平板在37℃，5％CO₂温育约48小时。

收获Jurkat-NFAT报道细胞，并且使用ViCell评估活力。将细胞以350x g离心7分钟，之后将它们重悬于无潮霉素的Jurkat培养基中并且每孔添加50μl(50,000个细胞/孔)。将平板在增湿培养箱中37℃温育5小时，之后取出供读取发光。将每个孔的80ul转移入白色壁的96孔板。将27μl/孔ONE-Glo溶液添加至每个孔并在黑暗下室温温育10分钟。使用WALLAC Victor3 ELISA读数仪(Perkin Elmer 2030)检测发光，1秒/孔作为检测时间。

与FolR1 TCB(6298)和肿瘤样品温育后，Jurkat NFAT报道细胞活化。蛋白酶激活的FolR1 TCB(8363、8408)和对照TCB(8409、7235)不诱导萤光素酶表达。点线表示与肿瘤共温育的Jurkat NFAT细胞的基线发光(图5和图6)。

可以检测到与恶性肿瘤样品(图6)和蛋白酶激活的FolR1 TCB(MMP9-Matriptase，8364)温育的Jurkat NFAT细胞的发光增加。但是，对良性肿瘤样品(图5)和蛋白酶激活的FolR1 TCB(MMP9-Matriptase，8364)未能测量到Jurkat NFAT激活。

实施例5

监测患者衍生的异种移植物中靶表达(p95HER2)的Jurkat-NFAT报道分子测定法

为了在免疫缺陷性小鼠中扩充的来自患者衍生的不同异种移植物(PDX)的细胞存在下，对p95HER2-TCB(图7A)诱导的T细胞活化定量，我们使用与萤光素酶偶联的表达NFAT驱动的TCR激活报道分子的Jurkat细胞。将患者样品的小片植入NOD.CB17-Prkdcscid(NOD/SCID)(#SM-NOD-5S-F，Janiver)或NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1WjI/SzJ(NSG)(CharlesRiver Laboratories)小鼠的脂肪垫中，并且将17β-雌二醇(1μM)(#E8875-1G，Sigma)添加至饮用水。

将患者衍生的异种移植物或人乳腺癌样品组织在缓冲至pH＝7的4％甲醛(用甲醇稳定化)中固定24小时并且随后石蜡包埋(FFPE)。将4μm厚度的组织切片置于带正电荷的玻璃载片上并且用所示的抗体免疫染色。认证的病理学家依据H评分和细胞角蛋白和CD8阳性细胞百分数(图7B和图7C)，评价p95HER2表达。

切除衍生自PDXs的肿瘤并且切割成可能的最小小片，与200U/ml胶原酶1A(Sigma)温育1小时，洗涤，经100μm滤网(Corning)过滤并且计数。在96孔V底平板中在p95HER2-TCB存在下，将单一靶细胞与效应细胞按5∶1效应物：靶(E：T)比率共培养。将平板在增湿培养箱中37℃温育16小时，之后取出如之前描述那样供读取发光。在p95HER2-TCB诱导的T细胞反应活化(图7D)和通过基于IHC的定量测定法及通过免疫组织化学所测定的p95HER2水平之间观察到正相关。

示例性序列

Claims

1.确定肿瘤样品中存在靶抗原的体外方法，包括步骤：

i)提供肿瘤样品；

iii)向肿瘤样品添加双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：

a)能够与靶抗原特异性结合的第一抗原结合部分；和

iv)向肿瘤样品添加报道细胞；和

v)通过确定报道基因的表达，确定靶抗原的存在。

2.根据权利要求1所述的方法，其中报道基因表达提示第一抗原结合部分与靶抗原结合。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述双特异性抗体额外地包含：

c)通过蛋白酶可切割接头与第二抗原结合部分共价连接的掩蔽部分，其中掩蔽部分能够与第二抗原结合部分的独特型特异性结合，由此可逆地遮蔽第二抗原结合部分。

4.根据权利要求3所述的方法，其中报道基因表达提示肿瘤样品中的蛋白酶表达。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中肿瘤样品是肿瘤组织样品，尤其是来自患者的活组织检查样品。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其中蛋白酶表达提示恶性肿瘤。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中报道细胞包含编码反应元件控制下的报道基因的DNA序列和编码信号转导性细胞表面受体的DNA序列。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中第二抗原结合部分能够与CD3ε特异性结合。

9.根据权利要求3至8中任一项所述的方法，其中掩蔽部分是抗独特型scFv。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中第一和第二抗原结合部分是包含共同轻链的常规Fab分子。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中靶抗原是细胞表面受体。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中靶抗原是FolR1。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中靶抗原是与人主要组织相容性复合体(MHC)的分子结合的肽。

14.选择用于治疗肿瘤的双特异性抗体的体外方法，其中双特异性抗体包含：

a.能够与靶抗原特异性结合的第一抗原结合部分；和

其中所述方法包括根据权利要求1至13中任一项所述的方法，确定肿瘤样品中靶抗原的存在并且其中如果检测到报道基因表达，则选择双特异性抗体用于治疗肿瘤。

15.基本上如前文所述的方法。