CN110079500B - 角膜缘干细胞及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高活性角膜缘干细胞及其制备方法，其制备方法包含以下步骤：获取角膜组织，将待用角膜组织预处理；向预处理后的角膜组织中加入含有细胞诱导剂的细胞冻存液；冷冻加有细胞冻存液的角膜组织；所述的细胞诱导剂是可诱导角膜组织中的细胞局部发生炎症或应激反应，但不直接引起细胞死亡的试剂。该方法在细胞培养前通过简单的低温冷冻操作即可在角膜组织中实现角膜缘干细胞与成熟分化的各类角膜细胞的筛选，同时可实现高活性角膜缘干细胞的长期冷冻保存，该方法无需特定的仪器设备，操作简便，筛选效率高，筛选细胞纯度高，可提高角膜缘干细胞的比例和活性。

Description

角膜缘干细胞及其制备方法

技术领域

本发明涉及组织工程领域，特别是涉及一种角膜缘干细胞的制备方法。

背景技术

角膜缘是角膜和巩膜的移行区，由于透明的角膜嵌入不透明的巩膜内，并逐渐过渡到巩膜，在眼球表面和组织学上没有一条明确的分界线。角膜缘是天然储藏负责角膜上皮再生修复的成体干细胞位置，角膜缘干细胞在角膜缘组织中成栅栏状排列在上皮层基底部，是用于眼表角膜上皮溃疡及组织工程板层角膜重建的优质细胞来源，角膜缘干细胞移植被认为是目前针对眼表疾病最有前景的治疗方法之一。

角膜缘干细胞在角膜眼表重建中起重要作用，但由于角膜缘干细胞在体外培养时易分化，难以大量扩增，为此需要使用更温和的手段获取原代角膜缘干细胞，并寻找更佳的方法维持细胞在体外的干细胞活性。为了从角膜组织中获得角膜缘干细胞，现有的角膜缘干细胞的取材方法主要有：酶消化法和组织块贴壁法等。酶消化法的做法主要是利用胰蛋白酶、胶原酶或中性蛋白酶等在33℃下处理消化角膜组织，将角膜上皮层消化下来后接种于培养皿上培养；组织块贴壁法的步骤为剪取一定大小的角膜缘组织块贴在培养皿皿底，加入培养液使其迁出细胞进而培养。酶消化法虽然能获得较多细胞，但是角膜缘干细胞的纯度较低；组织块贴壁法获得的细胞较纯，但是组织块贴壁时间和细胞迁出时间较长。

虽然上述方法都能分离得到角膜缘干细胞，但是在后续体外培养中仍存在角膜缘干细胞活性较低、易分化等问题。为了维持角膜缘干细胞的干性，常使用细胞共培养、载体培养和培养基添加生长因子等的方法体外扩增细胞。细胞共培养方法是将角膜缘干细胞直接培养在饲养层细胞上，饲养层细胞分泌的生长因子和细胞因子能保持角膜缘干细胞的干性，但使用细胞饲养层容易导致细胞交叉污染，后续细胞分离难度较大。羊膜是角膜缘干细胞培养的良好载体，许多研究表明在羊膜上培养的角膜缘干细胞干性保持良好，存活率高，生长迅速，但是从羊膜上分离的角膜缘干细胞也存在细胞交叉污染的问题。在培养基中添加细胞生长因子也能促进角膜缘干细胞的生长，如表皮生长因子、肝细胞生长因子、碱性纤维母细胞生长因子和角质细胞生长因子等都能促进细胞有丝分裂、细胞移行和干细胞的增殖，但是目前添加生长因子的种类和比例未有确定说法。

尽管在培养中使用了多种方法维持角膜缘干细胞的活性，但是不可避免地仍有部分细胞发生了分化，为了在实际应用中如角膜缘干细胞移植手术、组织工程板层角膜构建、角膜病机制研究等获得更佳的效果，需要对角膜缘干细胞进行筛选获得其中高活性的干细胞，目前的筛选方法有:流式分选法、免疫磁珠法和胶原吸附分选法等。流式分选法是通过流式细胞仪对标记的细胞进行筛选的方法，免疫磁珠筛选是根据免疫学原理，利用包被有抗体的磁珠与干细胞表面的特殊标志特异性结合，再通过一定强度的磁场，将细胞滞留而分选的方法，流式分选法和免疫磁珠法是常用的细胞筛选方法，它们的优点是得到的细胞纯度高，其缺点是细胞被标定且和介质结合，需要从介质上洗脱下来，容易丢失一部分角膜缘干细胞，这两种方法还需要特定的仪器设备和抗体试剂，成本较高。胶原吸附分选法是根据上皮干细胞具有对细胞外基质快速吸附的能力，通过细胞对细胞外基质如胶原等的吸附时长，筛选出干细胞活性较高的角膜缘干细胞的方法，该方法分选速度快，避免了因时间长或者特殊物质的毒性而影响细胞活性，然而该法是一种比较粗略的筛选方法，无法准确筛选到角膜缘干细胞。

对于暂时不使用的角膜缘干细胞，常将其保存起来，目前广泛应用的角膜缘干细胞的保存方法是低温冷冻保存法，大致流程如下：细胞消化分散后，用冷冻保护剂(含10％血清的培养基加10％甘油或3.5％～10％二甲亚砜细胞保护剂)冷却，同时将细胞悬液稀释成(2～5)×10⁶/ml，按1ml/安瓿的量分装细胞悬液，将封口的安瓿放入慢冻机或程序降温仪内，按每分钟下降1℃的速度缓慢冷冻，加保护剂的细胞悬液经缓慢冷冻，温度降至-25℃，将冻结的安瓿放入低温冰柜或液氮罐中。现有的细胞保存液，营养成分简单，没有固定配比，保存方法单一，导致干细胞的细胞存活率低，细胞稳定性差，不能很好保持干细胞的活性。而对于短期不使用的角膜组织，常将其放入角膜保存液中置于2～2℃条件下进行保存，保存时间为2周，当保存时间超过2周时采用的方法有器官培养保存法和深低温保存法，两种方法均需要特殊的保存液和保存设备，因随着保存时间的增长，角膜凋亡细胞数量不断增加，结构逐渐紊乱，故在实际应用中较少将角膜进行长期保存。

上述角膜缘干细胞的培养、筛选及保存方法，共同特点在于从新鲜角膜组织取材细胞后再进行角膜缘干细胞的培养、筛选和保存，必须经过传统地细胞筛选的步骤，操作过程较繁琐，每个步骤都有可能造成角膜缘干细胞的损失，难以成功获得数量较多的高活性角膜缘干细胞。

发明内容

基于此，本申请的目的在于提供一种角膜缘干细胞的制备方法，该方法通过在角膜组织中加入细胞诱导剂，在细胞培养前通过简单的低温冷冻操作即可在角膜组织中实现角膜缘干细胞与成熟分化的各类角膜细胞的筛选，同时可实现高活性角膜缘干细胞的长期冷冻保存，该方法无需特定的仪器设备，操作简便，筛选效率高，筛选细胞纯度高，可较大程度的提高角膜缘干细胞的比例和活性。

实现上述技术目的的具体技术方案如下：

一种高活性角膜缘干细胞的制备方法，包含以下步骤：

获取角膜组织，将待用角膜组织预处理；

向预处理后的角膜组织中加入含有细胞诱导剂的细胞冻存液；

冷冻加有细胞冻存液的角膜组织；

所述的细胞诱导剂是可诱导角膜组织中的细胞局部发生炎症或应激反应，但不直接引起细胞死亡的试剂。

在其中一些实施例中，所述细胞诱导剂选自炎症因子、激素、胞内信号分子调节剂和细胞周期调节剂中的一种或多种。

在其中一些实施例中，所述炎症因子选自白介素、干扰素和肿瘤坏死因子中的一种或多种；所述激素选自糖皮质激素、盐皮质激素和性激素中的一种或多种；所述胞内信号分子调节剂选自放线菌、蛋白激酶C激活剂、蛋白激酶C抑制剂和DNA拓扑异构酶抑制剂中的一种或多种；所述细胞周期调节剂选自细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、周期素、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子、G1特异性细胞周期蛋白、G2/有丝分裂特异性细胞周期蛋白及其转录或降解因子中的一种或多种。

在其中一些实施例中，所述细胞诱导剂选自糖皮质激素、蛋白激酶C抑制剂和肿瘤坏死因子中的一种或多种。

在其中一些实施例中，所述细胞诱导剂选自醋酸泼尼松龙、星状孢菌素和肿瘤坏死因子α中的一种或多种。

在其中一些实施例中，所述细胞冻存液为含有所述细胞诱导剂的细胞培养液和冷冻保护剂的混合液；所述冷冻保护剂和含有所述细胞诱导剂的细胞培养液的体积比为1：2-20。

在其中一些实施例中，所述冷冻保护剂和含有所述细胞诱导剂的细胞培养液的体积比为1：2-10。

在其中一些实施例中，所述冷冻保护剂选自二甲基亚砜、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇、聚乙烯吡咯烷酮、果糖、蔗糖、葡聚糖、白蛋白、聚乙二醇、乙基淀粉和卵黄中的一种或多种。

在其中一些实施例中，所述细胞诱导剂在所述细胞培养液中的浓度为1ng/ml-100μg/ml。

在其中一些实施例中，所述细胞诱导剂在所述细胞培养液中的浓度为1ng/ml-10μg/ml。

在其中一些实施例中，所述细胞诱导剂在所述细胞培养液中的浓度为10ng/ml-5μg/ml。

在其中一些实施例中，所述细胞诱导剂在所述细胞培养液中的浓度为4-4.5μg/ml。

在其中一些实施例中，所述细胞培养液是添加有如下组分的高糖型DMEM：0-50wt％胎牛血清、0-20wt％谷氨酰胺、0-20wt％非必需氨基酸、0-20wt％青霉素-链霉素溶液、0-1000ng/ml表皮生长因子、0-1000μg/ml转铁蛋白、0-1000μg/ml胰岛素、1ng/ml-10μg/ml所述细胞诱导剂。

在其中一些实施例中，所述细胞培养液是添加有如下组分的高糖型DMEM：2-12wt％胎牛血清、0.2-1.2wt％谷氨酰胺、0.2-1.2wt％非必需氨基酸、0.2-1.2wt％青霉素-链霉素溶液、2-12ng/ml表皮生长因子、4-6μg/ml转铁蛋白、4-6μg/ml胰岛素、10ng/ml-5μg/ml所述细胞诱导剂。

在其中一些实施例中，所述细胞培养液是添加有如下组分的高糖型DMEM：10wt％胎牛血清、1wt％谷氨酰胺、1wt％非必需氨基酸、1wt％青霉素-链霉素溶液、10ng/ml表皮生长因子、5μg/ml转铁蛋白、5μg/ml胰岛素、4-4.5μg/ml所述细胞诱导剂。

在其中一些实施例中，所述冷冻的温度为0℃～-200℃。

在其中一些实施例中，所述冷冻的温度为-20℃～-196℃。

在其中一些实施例中，所述冷冻的时间为1-120个月。

在其中一些实施例中，所述冷冻的时间为1-24个月。

在其中一些实施例中，所述冷冻的时间为3-6个月。

在其中一些实施例中，所述角膜缘干细胞的制备方法还包含以下步骤：分离培养冷冻后的角膜组织，即得所述角膜缘干细胞。

在其中一些实施例中，用于所述培养的细胞培养液中添加有1ng/ml-100μg/ml所述细胞诱导剂。

在其中一些实施例中，用于所述培养的细胞培养液中添加有1ng/ml-10μg/ml所述细胞诱导剂。

在其中一些实施例中，用于所述培养的细胞培养液中添加有1ng/ml-5μg/ml所述细胞诱导剂。

在其中一些实施例中，用于所述培养的细胞培养液中添加有4-4.5μg/ml所述细胞诱导剂。

在其中一些实施例中，用于所述培养的细胞培养液是添加有如下组分的高糖型DMEM：0-50wt％胎牛血清、0-20wt％谷氨酰胺、0-20wt％非必需氨基酸、0-20wt％青霉素-链霉素溶液、0-1000ng/ml表皮生长因子、0-1000μg/ml转铁蛋白、0-1000μg/ml胰岛素、1ng/ml-10μg/ml所述细胞诱导剂。

在其中一些实施例中，所述细胞培养液是添加有如下组分的高糖型DMEM：2-12wt％胎牛血清、0.2-1.2wt％谷氨酰胺、0.2-1.2wt％非必需氨基酸、0.2-1.2wt％青霉素-链霉素溶液、2-12ng/ml表皮生长因子、4-6μg/ml转铁蛋白、4-6μg/ml胰岛素、10ng/ml-5μg/ml所述细胞诱导剂。

在其中一些实施例中，用于所述培养的细胞培养液是添加有如下组分的高糖型DMEM：10wt％胎牛血清、1wt％谷氨酰胺、1wt％非必需氨基酸、1wt％青霉素-链霉素溶液、10ng/ml表皮生长因子、5μg/ml转铁蛋白、5μg/ml胰岛素、4-4.5μg/ml所述细胞诱导剂。

在其中一些实施例中，所述分离培养的方法选自组织贴壁法和消化法中的一种或多种。

在其中一些实施例中，所述组织贴壁法包括如下步骤：从角膜组织中将角膜缘组织分离后，将角膜缘组织上皮层帖附在培养容器中培养，使角膜缘干细胞从角膜缘组织中迁出，获得角膜缘干细胞。优选地，分离的角膜缘组织的大小为0.1mm～20mm，厚度为0.01mm～3mm。

在其中一些实施例中，所述消化法包括如下步骤：利用消化酶将包含角膜缘干细胞的角膜上皮层从角膜组织中消化分离，然后将角膜上皮层接种于培养容器中培养，获得角膜缘干细胞。优选地，所述消化酶为胶原酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶中的任何一种或多种。

在其中一些实施例中，所述预处理包括：使用包含或不包含抗生素的生理缓冲液对待用角膜组织进行常规清洗、消毒、分离。

在其中一些实施例中，所述角膜组织选自人、啮齿类动物和其他哺乳动物的角膜组织中的任意一种或多种。

在其中一些实施例中，所述角膜组织是新鲜角膜组织或者经过短期保存的角膜组织中的任何一种，其中所述短期保存的时间为1天～20天。

本发明的另一目的在于提供一种高活性角膜缘干细胞。

具体技术方案如下：

由上述角膜缘干细胞的制备方法制备得到的角膜缘干细胞。

本发明提供的角膜缘干细胞的制备方法通过向角膜组织中加入含有细胞诱导剂的冻存液后进行低温冷冻以对细胞进行筛选和保存，所加入的细胞诱导剂可诱导角膜组织中细胞局部发生炎症或细胞凋亡，且低温冷冻条件可诱导角膜组织中的成体细胞发生细胞凋亡或细胞坏死，同时维持和保存角膜组织中的角膜缘干细胞的活性，以此可达到角膜缘干细胞的筛选和长期保存的目的，因此，该方法可获得高活性的角膜缘干细胞；再对冷冻后的角膜组织进行分离培养，即可进一步获得高比例的角膜缘干细胞。

本发明的高活性的角膜缘干细胞的制备方法的原理以及有益效果如下：

(1)在角膜组织中有效实现角膜缘干细胞与成熟分化的各类角膜细胞的筛选：在细胞诱导剂的作用下，配合低温冷冻条件处理，角膜组织会产生炎症应激。由于角膜组织中的内皮细胞、基质细胞和上皮细胞均为成熟分化细胞，不具备抵抗这种炎症应激的能力，因此会在低温冷冻的条件下逐渐发生凋亡或坏死。而因为角膜缘干细胞具备核质比大，更新周期慢等特点，可以抵抗这些刺激，不发生凋亡，组织中的角膜缘干细胞得到维持和保存。因此，经过简单的冷冻处理，即可在角膜组织中实现去除其他成熟分化细胞，保留角膜缘干细胞的目的，并且筛选效率高，筛选细胞纯度高。

(2)借助天然干细胞壁龛优势，维持和保存角膜缘干细胞及其干细胞活性：角膜缘中的栅栏组织是角膜缘干细胞的储存壁龛。在角膜缘的天然壁龛中，存在着丰富的胞外基质、生长因子、特殊的三维基质结构等有利因素，可以保护角膜缘干细胞在炎症或应激情况下维持干细胞特性。因此，借助这些优势，角膜组织中的角膜缘干细胞在低温冷冻的条件下可以保持其干细胞活性，同时达到角膜缘干细胞长期储存的目的。

(3)在进行筛选过程中，模拟体内炎症应激状态，可以加快角膜缘干细胞在培养过程的激活：角膜缘干细胞在体内负责着角膜上皮层的更新和修复。当角膜上皮、基质中的成熟分化细胞逐渐发生细胞凋亡或坏死时，这些信号会传递到角膜缘位置。角膜缘干细胞接收损伤信号后，在适合的条件下会开始进行修复。因此，将角膜组织从低温冷冻条件取出进行原代细胞培养时，角膜缘干细胞可以快速地被激活并从组织中增殖迁出。

(4)本发明的方法操作简便，生产成本低廉：与流式分选法、免疫磁珠法和胶原吸附分选法等筛选法相比，本发明方法只需加入细胞诱导剂和进行低温冷冻处理即可对角膜组织中的细胞进行筛选，无需特定的仪器设备，大大降低了试剂耗材、仪器使用和人力资源等方面的成本。

(5)本发明的方法可较大程度的提高角膜缘干细胞的比例和活性，通过本发明的方法可获得活性较高的角膜缘干细胞，可用于基础研究如角膜病的机制研究中细胞模型的构建，也可为组织工程领域提供优质的种子细胞来源，或可推动角膜缘干细胞移植治疗眼表疾病的发展。

附图说明

图1为实施例1中的新鲜角膜与经细胞诱导剂与低温冷冻处理角膜的半胱天冬酶1(Caspase 1)染色结果图；

图2为实施例1中的新鲜角膜与处理组角膜组织原代培养角膜缘干细胞流式细胞术检测结果图；

图3为实施例1中的三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)免疫荧光染色和western blot结果图；

图4为实施例2中的通过RT-qPCR法检测角膜的肿瘤坏死因子α、白介素6和白介素1β的相对表达量结果图；

图5为实施例2中的角膜组织切片K3，P63染色结果图；

图6为实施例2中的新鲜角膜与处理组角膜组织原代培养角膜缘干细胞流式细胞术检测结果图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明一实施方案中提供了一种角膜缘干细胞的制备方法，包含以下步骤：

获取角膜组织，将待用角膜组织预处理；

向预处理后的角膜组织中加入含有细胞诱导剂的细胞冻存液；

冷冻加有细胞冻存液的角膜组织；

所述的细胞诱导剂是可诱导角膜组织中的细胞局部发生炎症或应激反应，但不直接引起细胞死亡的试剂。

上述方法通过向角膜组织中加入含有细胞诱导剂的冻存液后进行低温冷冻以对细胞进行筛选和保存，所加入的细胞诱导剂可诱导角膜组织中细胞局部发生炎症或细胞凋亡，且低温冷冻条件可诱导角膜组织中的成体细胞发生细胞凋亡或细胞坏死，同时维持和保存角膜组织中的角膜缘干细胞的活性，以此可达到角膜缘干细胞的筛选和长期保存的目的，因此，该方法可获得高活性的角膜缘干细胞。

在其中一些实施方案中，细胞诱导剂优选为可诱导角膜组织中的细胞局部发生炎症或应激反应，但不直接引起细胞死亡的炎症因子、激素、胞内信号分子调节剂和细胞周期调节剂中的一种或多种。

其中，可行的炎症因子包括但不限于白介素、干扰素、肿瘤坏死因子、转化生长因子、趋化因子等；可行的激素包括但不限于皮质激素、性激素、生长激素、甲状腺素、胰岛素、肾上腺激素等；可行的胞内信号分子调节剂包括但不限于放线菌、蛋白激酶C激活剂、蛋白激酶C抑制剂、DNA拓扑异构酶抑制剂、胞质酪氨酸激酶抑制剂、磷脂酰肌醇激酶抑制剂、凋亡信号调节激酶抑制剂等；可行的细胞周期调节剂包括但不限于细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、周期素、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子、G1特异性细胞周期蛋白、G2/有丝分裂特异性细胞周期蛋白及其转录或降解因子、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、Janus激酶抑制剂等。

进一步优选地，所述炎症因子选自白介素、干扰素和肿瘤坏死因子中的一种或多种；所述激素选自糖皮质激素、盐皮质激素和性激素中的一种或多种；所述胞内信号分子调节剂选自放线菌、蛋白激酶C激活剂、蛋白激酶C抑制剂和DNA拓扑异构酶抑制剂中的一种或多种；所述细胞周期调节剂选自细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、周期素、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子、G1特异性细胞周期蛋白、G2/有丝分裂特异性细胞周期蛋白及其转录或降解因子中的一种或多种。

进一步优选地，所述细胞诱导剂选自糖皮质激素(例如可以是醋酸泼尼松龙)、蛋白激酶C抑制剂(例如可以是星状孢菌素)和肿瘤坏死因子(例如可以是肿瘤坏死因子α(TNF-α))中的一种或多种。

在其中一些实施方案中，所述细胞诱导剂是通过添加到细胞冻存液中起作用的，该细胞冻存液可以是现有的常规冻存液，优选为含有所述细胞诱导剂的细胞培养液和冷冻保护剂的混合液；所述冷冻保护剂和含有所述细胞诱导剂的细胞培养液的优选地体积比为1：2-20，更优选的体积比为1：2-10。其中所述冷冻保护剂选自二甲基亚砜、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇、聚乙烯吡咯烷酮、果糖、蔗糖、葡聚糖、白蛋白、聚乙二醇、乙基淀粉和卵黄中的一种或多种；优选为二甲基亚砜。

冻存液中的细胞培养液可以是培养角膜缘干细胞的常规培养液。优选为添加有所述细胞诱导剂和如下组分的高糖型DMEM：0-50wt％胎牛血清、0-20wt％谷氨酰胺、0-20wt％非必需氨基酸、0-20wt％青霉素-链霉素溶液、0-1000ng/ml表皮生长因子(EGF)、40-1000μg/ml转铁蛋白、0-1000μg/ml胰岛素。更优选为添加有所述细胞诱导剂和如下组分的高糖型DMEM：2-12wt％胎牛血清、0.2-1.2wt％谷氨酰胺、0.2-1.2wt％非必需氨基酸、0.2-1.2wt％青霉素-链霉素溶液、2-12ng/ml表皮生长因子、4-6μg/ml转铁蛋白、4-6μg/ml胰岛素。最优选为添加有所述细胞诱导剂和如下组分的高糖型DMEM：10wt％胎牛血清、1wt％谷氨酰胺、1wt％非必需氨基酸、1wt％青霉素-链霉素溶液、10ng/ml表皮生长因子、5μg/ml转铁蛋白、5μg/ml胰岛素。其中所述细胞诱导剂优选地添加量为1ng/ml-100μg/ml，细胞诱导剂的添加量在该范围内时，可以使角膜组织中的细胞局部发生的炎症或应激反应比较适中，以使角膜组织中的内皮细胞、基质细胞和上皮细胞等成熟分化细胞在后续的低温冷冻的条件下最大程度的发生凋亡或坏死，同时使角膜缘干细胞最大程度的抵抗住细胞诱导剂的刺激而不发生凋亡，以最大程度的维持和保存角膜缘干细胞的比例和活性。更优选的添加量为10ng/ml-10μg/ml，更优选的添加量为10ng/ml-5μg/ml，更优选地添加量为4-4.5μg/ml。

在其中一些实施方案中，所述冷冻的温度为0℃～-200℃。优选为-20℃～-196℃，在该温度条件下可以更好的诱导角膜组织中的成体细胞发生细胞凋亡或细胞坏死，同时更好的维持和保存角膜组织中的角膜缘干细胞的活性，从而进一步提高所获得的角膜缘干细胞的比例和活性。

在其中一些实施方案中，所述冷冻的时间为1-120个月。在该时间范围内，可以充分诱导角膜组织中的成体细胞发生细胞凋亡或细胞坏死，同时可以使角膜缘干细胞的活性得到较高程度的保存。该时间进一步优选为1-24个月，更优选为3-6个月。

进一步地，本发明的角膜缘干细胞的制备方法还包括分离培养冷冻后的角膜组织的步骤。通过常规的方法对冷冻后的角膜组织进行分离培养，即可进一步获得高比例和高活性的角膜缘干细胞。

本发明的方法中培养角膜缘干细胞的细胞培养液可以是现有的常规培养液，优选为添加有所述细胞诱导剂和如下组分的高糖型DMEM：0-50wt％胎牛血清、0-20wt％谷氨酰胺、0-20wt％非必需氨基酸、0-20wt％青霉素-链霉素溶液、0-1000ng/ml表皮生长因子、0-1000μg/ml转铁蛋白、0-1000μg/ml胰岛素。更优选为添加有所述细胞诱导剂和如下组分的高糖型DMEM：2-12wt％胎牛血清、0.2-1.2wt％谷氨酰胺、0.2-1.2wt％非必需氨基酸、0.2-1.2wt％青霉素-链霉素溶液、2-12ng/ml表皮生长因子、4-6μg/ml转铁蛋白、4-6μg/ml胰岛素。最更优选为添加有所述细胞诱导剂和如下组分的高糖型DMEM：10wt％胎牛血清、1wt％谷氨酰胺、1wt％非必需氨基酸、1wt％青霉素-链霉素溶液、10ng/ml表皮生长因子、5μg/ml转铁蛋白、5μg/ml胰岛素。其中所述细胞诱导剂优选地添加量为1ng/ml-100μg/ml，更优选的添加量为10ng/ml-10μg/ml，更优选的添加量为10ng/ml-5μg/ml，更优选地添加量为4-4.5μg/ml。

本发明提供的方法中，所述分离培养的方法可以是常规的细胞培养方法，例如可以是组织贴壁法和消化法中的一种或多种。所述组织贴壁法包括如下步骤：从角膜组织中将角膜缘组织分离后，将角膜缘组织上皮层帖附在培养容器中培养，使角膜缘干细胞从角膜缘组织中迁出，获得角膜缘干细胞。优选地，分离的角膜缘组织的大小为0.1mm～20mm，厚度为0.01mm～3mm。所述消化法包括如下步骤：利用消化酶将包含角膜缘干细胞的角膜上皮层从角膜组织中消化分离，然后将角膜上皮层接种于培养容器中培养，获得角膜缘干细胞。优选地，所述消化酶为胶原酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶中的任何一种或多种。

在其中一些实施方案中，所述预处理包括：使用包含或不包含抗生素的生理缓冲液对待用角膜组织进行常规清洗、消毒、分离。

本发明的方法中所用的角膜组织可以是人、啮齿类动物和其他哺乳动物的角膜组织中的任意一种或多种。角膜组织优选为新鲜角膜组织或者经过短期保存的角膜组织中的任何一种，其中所述短期保存的时间为1天～20天。满足该条件的角膜组织中的角膜缘干细胞具有更高的活性，有利于后续的筛选、保存及培养。

本发明还提供了由上述角膜缘干细胞的制备方法制备得到的高活性角膜缘干细胞，可用于基础研究如角膜病的机制研究中细胞模型的构建，也可为组织工程领域提供优质的种子细胞来源，或可推动角膜缘干细胞移植治疗眼表疾病的发展。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

以下实施例中没有特别说明的百分比均指质量百分比。

实施例1：兔角膜缘干细胞的制备

(1)获取角膜组织，将待用角膜组织预处理：

将从新西兰兔取下的眼球用添加1％青霉素-链霉素溶液的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次后，用组织剪将眼球外部周围多余组织去除干净，沿着角膜缘保留1～5mm巩膜并将其余部分剪去，同时去除内容物，并将虹膜等部分刮除干净，再用PBS清洗3次。

(2)向预处理后的角膜组织中加入含有细胞诱导剂的细胞冻存液：

首先配制体外培养角膜缘干细胞的细胞培养液KCM：高糖DMEM+10％胎牛血清+1％谷氨酰胺+1％非必需氨基酸+1％青霉素-链霉素溶液+10ng/ml表皮生长因子(EGF)+5μg/ml转铁蛋白+5μg/ml胰岛素，并添加4μg/ml醋酸泼尼松龙和20ng/ml星状孢菌素(STS)，其中醋酸泼尼松龙为糖皮质激素，星状孢菌素为蛋白激酶C抑制剂，两者共同作用作为细胞诱导剂，再配制细胞冻存液：10％DMSO加90％KCM培养液(体积百分比)。将步骤(1)预处理后的角膜组织放入1.5ml冻存管中，加入1ml配制好的细胞冻存液。

(3)将加有细胞冻存液的角膜组织进行低温冷冻以对角膜缘干细胞进行筛选与保存：

将步骤(2)中的冻存管放入程序降温盒中并置于-20℃冰箱，冷冻后将冻存管转移至液氮罐中。

(4)从步骤(3)冷冻后的角膜组织中分离培养得到角膜缘干细胞：

六个月后从液氮罐中取出冻存的角膜组织，在33℃水浴锅中1分钟内快速解冻，用PBS清洗3次。将整个角膜(含有少量巩膜)上皮层朝上放在干净的大皿中铺开，用3mm环钻以角膜缘为中心线钻取组织块(要包含透明部分和不透明部分)，获得角膜缘组织块。角膜缘组织块先在0.1％IV型胶原酶中消化15分钟后取出，上皮层蘸取少量胎牛血清后朝下贴在六孔板中，之后放入培养箱中干燥30分钟，然后每孔分别添加1.5ml KCM培养液静置培养，细胞在2～4天后迁出，即可得到冻存筛选后的高活性角膜缘干细胞。

对加入细胞诱导剂和低温冷冻处理后的角膜(处理组角膜)和新鲜角膜分别进行石蜡包埋、切片及免疫荧光染色处理，结果如图1所示。结果显示，两组角膜组织上皮结构完整保存，基质层排列不紧密，内皮层出现脱落现象。在新鲜角膜中，中央角膜与角膜缘位置未见Caspase 1表达。处理组中，中央角膜全层表达Caspase 1，而角膜缘表层可见少量Caspase 1表达，基底部位置未见Caspase 1表达(图1中白色箭头指示表达位置)。在角膜组织中，中央角膜位置为成熟分化的角膜上皮细胞，角膜缘基底部为角膜缘干细胞。在细胞处于应激状态时，细胞会表达Caspase 1并引起细胞炎症与凋亡。因此，上述检测结果说明经细胞诱导剂与低温冷冻处理后，处理组角膜组织中成熟分化的角膜上皮细胞发生炎症凋亡，而组织中的角膜缘干细胞未受影响。

对加入细胞诱导剂和低温冷冻处理后的角膜(处理组角膜)和新鲜角膜的原代培养角膜缘干细胞分别进行流式细胞检测，观察P63阳性细胞比例，结果如图2所示。结果显示，处理组细胞P63的比例为95％，远高于未经处理的新鲜角膜组的32％。P63是角膜缘干细胞标志物之一，其表达与干细胞的增殖活性密切相关。检测结果说明经过细胞诱导剂和低温冷冻处理的角膜组织可获得更多增殖活性更好的角膜缘干细胞。

对加入细胞诱导剂和低温冷冻处理后的角膜(处理组角膜)和新鲜角膜原代培养角膜缘干细胞进行免疫荧光染色及western blot检测，观察干细胞ABCG2(三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2)的表达情况，结果如图3所示。结果显示，处理组中ABCG2阳性表达的细胞数量远多于新鲜角膜组，western blot半定量检测结果显示处理组细胞ABCG2表达量较新鲜角膜组更高。ABCG2是角膜缘干细胞的标志物之一，检测结果说明经过细胞诱导剂和低温冷冻处理的角膜组织可获得更多活性更好的角膜缘干细胞。

以上结果表明本发明提供的角膜缘干细胞筛选、保存及培养方法获得的角膜缘干细胞比例高，能保持良好的干细胞活性。

实施例2：人角膜缘干细胞的制备

(1)获取角膜组织，将待用角膜组织预处理：

将人眼用可乐必妥滴眼液清洗5～6次，之后分别用Ⅲ型安尔碘和添加庆大霉素的生理盐水冲洗，取下眼球用组织剪将眼球外部周围多余组织去除干净，沿着角膜缘保留1～5mm巩膜并将其余部分剪去，同时去除内容物，并将虹膜等部分刮除干净，之后角膜用添加1％青霉素-链霉素溶液的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次。

(2)向预处理后的角膜组织中加入含有细胞诱导剂的细胞冻存液：

首先配制体外培养角膜缘干细胞的细胞培养液KCM：高糖DMEM+10％胎牛血清+1％谷氨酰胺+1％非必需氨基酸+1％青霉素-链霉素溶液+10ng/ml表皮生长因子(EGF)+5μg/ml转铁蛋白+5μg/ml胰岛素，并添加4μg/ml醋酸泼尼松龙和10ng/ml肿瘤坏死因子α(TNF-α)，醋酸泼尼松龙为糖皮质激素，肿瘤坏死因子α为炎症因子，两者共同作用作为细胞诱导剂，再配制细胞冻存液：10％二甲基亚砜加90％KCM培养液。将步骤(1)预处理后的角膜组织放入1.5ml冻存管中，加入1ml配制好的细胞冻存液。

(3)将加有细胞冻存液的角膜组织进行低温冷冻以对角膜缘干细胞进行筛选与保存：

将步骤(2)中的冻存管放入程序降温盒中并置于-20℃冰箱，过夜冷冻后将冻存管转移至液氮罐中。

(4)从步骤(3)冷冻后的角膜组织中分离培养得到角膜缘干细胞：

三个月后从液氮罐中取出冻存的角膜组织，在33℃水浴锅中1分钟内快速解冻，用PBS清洗3次。将整个角膜(含有少量巩膜)上皮层朝上放在干净的大皿中铺开，用剪刀剪取5mm大小的角膜缘组织块。角膜缘组织块先在0.1％IV型胶原酶中消化15分钟后取出，上皮层蘸取少量胎牛血清后朝下贴在六孔板中，之后放入培养箱中干燥30分钟，然后每孔分别添加1.5ml KCM培养液静置培养，细胞在2～4天后迁出，即可得到冻存筛选后的高活性角膜缘干细胞。

通过RT-qPCR法检测角膜的肿瘤坏死因子α、白介素6和白介素1β的相对表达量，结果如图4所示：与新鲜角膜相比，加入细胞诱导剂与低温冷冻处理后，处理组的角膜组织肿瘤坏死因子α、白介素6和白介素1β三种炎症因子的转录水平显著上调。在角膜组织体内损伤后，肿瘤坏死因子α、白介素6和白介素1β表达会上调。检测结果说明经细胞诱导剂与低温冷冻处理后，可引起处理组角膜组织的炎症应激反应，从而达到模拟体内角膜损伤信号，实现角膜缘干细胞的激活。

对新鲜角膜与处理组角膜分别进行石蜡包埋、切片及免疫荧光染色处理，结果如图5所示。结果显示，两组角膜组织上皮结构完整保存，在新鲜角膜中与处理组角膜组织中，角膜缘位置基底部均可见P63阳性表达，K3阴性表达的角膜缘干细胞。结果表明经细胞诱导剂与低温冷冻处理不会对组织中的角膜缘干细胞的干细胞活性产生影响。

对两组原代培养角膜缘干细胞进行流式细胞检测，流式细胞仪检测结果如图6所示。结果显示新鲜角膜组原代培养角膜缘干细胞的干细胞标志物P63的阳性细胞率为62％，角膜上皮细胞分化标志物K3阳性细胞率为32％。处理组中，P63的阳性细胞率提高到91％，K3阳性细胞率降低到20％。检测结果表明，经过细胞诱导剂和低温冷冻处理的角膜组织可获得更多增殖活性更好，分化程度更低的角膜缘干细胞。

以上结果表明本发明提供的角膜缘干细胞筛选、保存及培养方法获得的角膜缘干细胞比例高，干细胞活性良好。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种角膜缘干细胞的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

获取角膜组织，将待用角膜组织预处理；

向预处理后的角膜组织中加入含有细胞诱导剂的细胞冻存液；

冷冻加有细胞冻存液的角膜组织；

所述的细胞诱导剂是可诱导角膜组织中的细胞局部发生炎症或应激反应，但不直接引起细胞死亡的试剂；

所述细胞冻存液为含有所述细胞诱导剂的细胞培养液和冷冻保护剂的混合液；

所述细胞诱导剂为醋酸泼尼松龙和星状孢菌素，所述醋酸泼尼松龙在所述细胞培养液中的浓度为4μg/ml，所述星状孢菌素在所述细胞培养液中的浓度为20ng/ml；或者，所述细胞诱导剂为醋酸泼尼松龙和肿瘤坏死因子α，所述醋酸泼尼松龙在所述细胞培养液中的浓度为4μg/ml，所述肿瘤坏死因子α在所述细胞培养液中的浓度为10ng/ml；

所述冷冻采用液氮冰冻；

所述冷冻的时间为3个月或者6个月。

2.根据权利要求1所述的角膜缘干细胞的制备方法，其特征在于，所述冷冻保护剂和含有所述细胞诱导剂的细胞培养液的体积比为1：2～20。

3.根据权利要求2所述的角膜缘干细胞的制备方法，其特征在于，所述冷冻保护剂和含有所述细胞诱导剂的细胞培养液的体积比为1：2～10。

4.根据权利要求1所述的角膜缘干细胞的制备方法，其特征在于，所述冷冻保护剂选自二甲基亚砜、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇、聚乙烯吡咯烷酮、果糖、蔗糖、葡聚糖、白蛋白、聚乙二醇、乙基淀粉和卵黄中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的角膜缘干细胞的制备方法，其特征在于，所述预处理包括：使用包含或不包含抗生素的生理缓冲液对待用角膜组织进行常规清洗、消毒、分离；及/或，

所述角膜组织选自人、啮齿类动物和其他哺乳动物的角膜组织中的任意一种或多种，所述角膜组织是新鲜角膜组织或者经过短期保存的角膜组织中的任何一种，其中所述短期保存的时间为1天～20天。

6.根据权利要求5所述的角膜缘干细胞的制备方法，其特征在于，所述分离培养的方法选自组织贴壁法和消化法中的一种或多种。

7.根据权利要求6所述的角膜缘干细胞的制备方法，其特征在于，所述组织贴壁法包括如下步骤：从角膜组织中将角膜缘组织分离后，将角膜缘组织上皮层帖附在培养容器中培养，使角膜缘干细胞从角膜缘组织中迁出，获得角膜缘干细胞。

8.根据权利要求6所述的角膜缘干细胞的制备方法，其特征在于，所述消化法包括如下步骤：利用消化酶将包含角膜缘干细胞的角膜上皮层从角膜组织中消化分离，然后将角膜上皮层接种于培养容器中培养，获得角膜缘干细胞。

9.根据权利要求1所述的角膜缘干细胞的制备方法，其特征在于，还包含以下步骤：分离培养冷冻后的角膜组织，即得所述角膜缘干细胞。

10.根据权利要求9所述的角膜缘干细胞的制备方法，其特征在于，用于所述培养的细胞培养液中添加有1ng/ml～100μg/ml所述细胞诱导剂。

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