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CN110072880B - 工程化肉毒杆菌神经毒素 - Google Patents

工程化肉毒杆菌神经毒素 Download PDF

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CN110072880B CN201780061528.1A CN201780061528A CN110072880B CN 110072880 B CN110072880 B CN 110072880B CN 201780061528 A CN201780061528 A CN 201780061528A CN 110072880 B CN110072880 B CN 110072880B
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Abstract

本文公开具备具有氨基酸突变的修饰的BoNT/B4受体结合结构域(B4‑HC)的肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽，所述氨基酸突变修饰所述BoNT与人SytII受体的结合。公开特定的突变和突变组合。还公开分离的修饰的HC、包含此类修饰的HC的多肽、嵌合分子、药物组合物以及制备和使用它们的方法。还公开鉴定额外的此类修饰的受体结合结构域的方法。

Description

工程化肉毒杆菌神经毒素
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年8月24日提交的美国临时申请号62/378,967的权益，其内容通过引用整体并入本文。
美国政府支持
本发明在美国政府支持下在美国国家健康协会授予的NIH 1R21NS082830下进行。美国政府享有本发明的某些权利。
序列表
本说明书参考序列表(2017年8月24日以电子方式作为名为“0342941_0602_SL.TXT”的.txt文件提交)。.txt文件是在2017年8月22日生成的，且大小为106,905字节。所述序列表的全部内容以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及修饰的神经毒素领域及其用于治疗医学和/或美学病症的用途。
背景技术
肉毒杆菌神经毒素属于细菌毒素家族，包括七种主要血清型(BoNT/A-G)(1)。这些毒素通过阻断从神经元释放神经递质起作用，从而使动物和人类麻痹。近年来，BoNT已被广泛用于治疗越来越多的医学病症：局部注射少量毒素可以减弱目标区域的神经元活动，这在许多医学病症和美容目的中可以是有益的(7-9)。
BoNT/A和BoNT/B是目前FDA批准用于人类的唯一两种BoNT(7-9)。这些是从细菌中纯化的毒素，而没有任何序列修饰(定义为野生型，WT)。随着BoNT的应用增长，已经报道了局限性和不良反应。主要局限性是在患者中产生中和抗体，这使得未来的治疗无效(11)。终止BoNT使用往往使患者没有其他有效的方法来治疗/缓解他们的病症。抗体应答的可能性与毒素剂量和注射频率两者直接相关(11)。因此，这种局限性主要发生在治疗肌肉痉挛方面，其涉及相对高剂量的毒素。
主要的不良反应通常与治疗肌肉痉挛相关，但与美容应用无关。这是因为不良反应主要是由于毒素扩散到身体的其他区域，并且毒素扩散的可能性与注射剂量直接相关。不良反应的范围从短暂的非严重事件如上睑下垂和复视到危及生命的事件，甚至死亡。在Sidney Wolfe博士于2008年向FDA提交的请愿书中，共记录了180起严重不良事件，其中包括16例死亡事件。因此，FDA现在要求对所有BoNT产品发出“黑匣子警告”，强调毒素传播的风险，遵循欧盟发布的类似警告。
因为中和抗体的产生和毒素扩散都与注射剂量直接相关，所以强烈常需要降低毒素剂量(同时维持相同水平的毒素活性)，这意味着必须增强单个毒素分子的功效。对神经元具有改善的特异性的这种修饰的BoNT还将减少由于非特异性进入其他细胞类型而导致的任何潜在的脱靶效应。
BoNT通过经由其受体结合结构域与其特异性受体结合而靶向并进入神经元，这在文献中有明确定义(BoNT-HC，图1A，B)1。受体结合决定BoNT识别神经元的功效和特异性。改善BoNT的受体结合能力将增强它们靶向神经元的功效和特异性。已经鉴定出用于大多数BoNT的受体(图1C)。BoNT/B、D-C和G共有两种同源突触囊泡蛋白，突触结合蛋白I和II(SytI/II)作为它们的受体13-18，而BoNT/A、E、D和F使用另一种突触囊泡蛋白SV2。除了蛋白质受体外，所有BoNT都需要脂质共受体神经节苷脂(图1D)，它们在神经元表面上丰富27。在两种Syt同种型中，Syt II对BoNT/B的结合亲和力比Syt I高约10倍，并且也是在运动神经末梢中表达的主要同种型，运动神经末梢是BoNT的靶向神经元(图2A)。因此，Syt II被认为是BoNT/B、D-C和G的主要毒素受体，而Syt I是运动神经末梢处的次要毒素受体。在啮齿动物中就是这样，并且可能在大多数哺乳动物中也是这样。
有人可能会说BoNT已经对神经元具有高度特异性，并且询问是否有可能进一步改善它们与神经元的结合？答案对人类来说是“是”，至少部分是因为最近发现人Syt II因自毒素结合位点内啮齿动物(大鼠/小鼠)Syt II的独特氨基酸变化而大大降低作为BoNT/B受体的结合和功能。这是位置54处的苯丙氨酸(F)至亮氨酸(L)的变化(小鼠Syt II序列)(如US 9,598,685，图2B中所示)。序列比对已经揭示，该位置的苯丙氨酸在包括鸭嘴兽、鱼类、啮齿动物和猴子的脊椎动物的Syt I和Syt II中都是高度保守的48。只有人和黑猩猩Syt II在这个位置含有亮氨酸。由于这种残基变化，人和黑猩猩Syt II大大降低了与BoNT/B、D-C和G的结合(如US 9,598,685，图2C所示)，并且与小鼠Syt II相比，在调节BoNT/B的进入方面效率显著降低(与US 9,598,685，图2D中所示)。由于人和黑猩猩Syt I在相同位置仍然含有苯丙氨酸并且可以结合BoNT/B、D-C和G(如US 9,598,685，图2E所示)，所以对于人类中的BoNT/B、D-C和G的高亲和力受体限于次要受体Syt I。这些发现为临床观察结果提供如下解释：需要比BoNT/A(其结合不同受体)高得多剂量的BoNT/B以在患者中实现相同水平的治疗效果。以前这些观察结果归因于其他原因，诸如所用制剂中活性神经毒素的百分比。相对于其他物种的Syt II，BoNT/B与人Syt II的这种结合差异的最近观察结果表明BoNT/B的不同残基可能参与与人Syt II的结合。因此，预期影响与啮齿动物SytII结合的BoNT/B的序列修饰可能对BoNT/B与人Syt II的结合具有不可预测的影响。
因此，需要改善BoNT/B与人类受体Syt II的结合，作为增加其靶向人类神经元的功效和特异性并减少治疗应用中需要的毒素剂量的方法。
发明内容
如上所述，肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)神经毒素已被发现在医学中用于治疗病理病症和用于美容目的。野生型肉毒梭状芽孢杆菌血清型B，菌株4多肽不以高亲和力结合人SytII受体或导致对不需要的神经元活性的有效抑制。本文描述的是血清型B，菌株4(BoNT/B4)受体结合结构域的定点突变，其显著增加修饰的受体结合结构域(BoNT/B4 Hc)结合人SytII受体的能力。修饰的BoNT/B4 Hc结构域与hSytII受体的结合增加增加了包括该结构域的BoNT多肽抑制神经元活性的能力，并使得包含这种结构域的BoNT多肽显著更有效并且不太可能激起对治疗以及化妆用途的不需要的免疫应答。
在一个方面，然后，本文描述的是肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽，其包含：a)蛋白酶结构域；b)蛋白酶裂解位点；c)易位结构域；和d)结合人SytII的肉毒梭状芽孢杆菌血清型B，菌株4的修饰的受体结合结构域(B4-Hc)。
在一个实施方案中，BoNT多肽的修饰的受体结合结构域包含取代突变V1113K、S1117P、S1196A和I1197P。
在另一个实施方案中，BoNT多肽的修饰的受体结合结构域还包含一个或多个取代突变，所述取代突变对应于选自由Q1191C、Q1191V、Q1191L、Q1191Y、Q1191M、Y1199W、Y1199E、Y1199H、W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P及其组合组成的组的血清型B，菌株4中的取代突变。在另一个实施方案中，修饰的(B4-Hc)包含对应于血清型B，菌株4中的取代突变的两个取代突变，所述取代突变选自由Q1191C、Q1191V、Q1191L、Q1191Y、Q1191M、Y1199W、Y1199E、Y1199H、W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C和Y1183P组成的组。
在另一个实施方案中，肉毒梭状芽孢杆菌血清型B，菌株4(B4-Hc)多肽的修饰的受体结合结构域还包含对应于血清型B，菌株4中的取代突变的两个或更多个取代突变，其中所述取代突变中的一个选自Q1191M、Q1191C、Q1191V、Q1191L和Q1191Y。
在另一个实施方案中，肉毒梭状芽孢杆菌血清型B，菌株4(B4-Hc)多肽的修饰的受体结合结构域还包含对应于血清型B，菌株4中的取代突变的两个或更多个取代突变，其中所述取代突变中的一个对应于血清型B，菌株4中的Y1199W、Y1199E、Y1199H、W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P、Y1199F或Y1199L。
在另一个实施方案中，肉毒梭状芽孢杆菌血清型B，菌株4(B4-Hc)多肽的修饰的受体结合结构域还包含两个取代突变，所述取代突变选自对应于血清型B，菌株4中的Q1191M和W1178Q、Q1191C和W1178Q、Q1191V和W1178Q、Q1191L和W1178Q、Q1191Y和W1178Q、Q1191M和Y1183P、Q1191M和Y1183C、Q1191C和Y1183P、Q1191C和Y1183C、Q1191V和Y1183P、Q1191V和Y1183C、Q1191L和Y1183P、Q1191L和Y1183C、Q1191Y和Y1183P、Q1191Y和Y1183C、W1178Q和Y1183P以及W1178Q和Y1183C的取代突变。在另一个实施方案中，肉毒梭状芽孢杆菌血清型B，菌株4(B4-Hc)多肽的修饰的受体结合结构域还包含两个取代突变，所述取代突变对应于血清型B，菌株4中的Q1191M和W1178Q。在另一个实施方案中，肉毒梭状芽孢杆菌血清型B，菌株4(B4-Hc)多肽的修饰的受体结合结构域还包含两个取代突变，所述取代突变对应于血清型B，菌株4中的Q1191M和W1183P。在另一个实施方案中，肉毒梭状芽孢杆菌血清型B，菌株4(B4-Hc)多肽的修饰的受体结合结构域还包含两个取代突变，所述取代突变对应于血清型B，菌株4中的Q1191M和W1183C。
在另一个实施方案中，肉毒梭状芽孢杆菌血清型B，菌株4(B4-Hc)多肽的修饰的受体结合结构域还包含三个取代突变。在另一个实施方案中，所述三个另外的取代突变在对应于血清型B，菌株4的Q1191、W1178和Y1183的位置。在另一个实施方案中，所述三个另外的取代突变对应于血清型B，菌株4的Q1191M、W1178Q和Y1183P。
在另一个实施方案中，修饰的受体结合结构域还包含对应于选自由：Q1191C；Q1191V；Q1191L；Q1191Y；Q1191M；Y1199W；Y1199E；和Y1199H组成的组的血清型B，菌株4中的取代突变的取代突变。
在另一个实施方案中，修饰的受体结合结构域还包含对应于血清型B，菌株4中的取代突变Q1191M的取代突变。
在另一个实施方案中，修饰的受体结合结构域还包含两个取代突变，所述取代突变对应于选自由：选自Q1191C；Q1191；Q1191L；Q1191Y；和Q1191M的第一突变；和选自：Y1199W；Y1199E；和Y1199H的第二突变组成的血清型B，菌株4中的取代突变。
在另一个实施方案中，修饰的受体结合结构域还包含对应于血清型B，菌株4中的取代突变的一个或多个取代突变，所述取代突变选自由：W1178Y；W1178Q；W1178A；W1178S；Y1183C；Y1183P及其组合组成的组。
在另一个实施方案中，修饰的受体结合结构域包含对应于血清型B，菌株4中的Q1191M和Y1199W、Q1191M和W1178Q、Q1191C和Y1199W、Q1191C和W1178Q、Q1191V和Y1199W或Q1191V和W1178Q的两个取代突变。
在另一个实施方案中，修饰的(B-Hc)包含对应于血清型B，菌株4的Q1191、W1178和Y1183的位置处的三个取代突变。在另一个实施方案中，所述三个取代突变对应于血清型B，菌株4的Q1191M、W1178Q和Y1183C。
本文还提供一种编码如本文任何方面或实施方案中所述的BoNT多肽的核酸，或可操作地连接到允许表达BoNT多肽的序列的包含此类核酸的核酸载体。本文还提供一种包含此类核酸或核酸载体的细胞，和/或一种表达此类BoNT多肽的细胞。
在另一个方面，本文描述一种肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽，其包含：a)蛋白酶结构域；b)蛋白酶裂解位点；c)易位结构域；和d)肉毒梭状芽孢杆菌血清型B，菌株4的修饰的受体结合结构域(B4-Hc)，其包含取代突变V1113K、S1117P、S1196A和I1197P，并且还包含在对应于血清型B，菌株4的S1201的位置处的取代突变。
在任何前述方面的一个实施方案中，BoNT多肽的蛋白酶结构域、易位结构域和蛋白酶裂解位点来自选自由A、B、C、D、E、F、G及其组合组成的组的血清型。
在任何前述方面的另一个实施方案中，蛋白酶结构域、易位结构域和蛋白酶裂解位点来自血清型B，菌株1。
在任何前述方面的另一个实施方案中，蛋白酶结构域、易位结构域和蛋白酶裂解位点来自血清型A，菌株1。
在另一个实施方案中，蛋白酶裂解位点来自血清型A、血清型B，或者是血清型A和B的嵌合裂解位点。
在另一个方面，本文描述一种包含结合人SytII的肉毒梭状芽孢杆菌血清型B，菌株4重链的修饰的受体结合结构域(B4-Hc)的多肽。
在一个实施方案中，修饰的受体结合结构域包含取代突变V1113K、S1117P、S1196A和I1197P。
在另一个实施方案中，修饰的受体结合结构域还包含对应于血清型B，菌株4中的取代突变的一个或多个取代突变，所述取代突变选自由：Q1191C、Q1191V、Q1191L、Q1191Y、Q1191M、Y1199W、Y1199E、Y1199H、W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P及其组合组成的组。
在另一个实施方案中，修饰的(B4-Hc)包含对应于血清型B，菌株4中的取代突变的两个取代突变，所述取代突变选自由：Q1191C、Q1191V、Q1191L、Q1191Y、Q1191M、Y1199W、Y1199E、Y1199H、W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C和Y1183P组成的组。
在另一个实施方案中，修饰的B4-Hc还包含对应于血清型B，菌株4中的取代突变的两个或更多个取代突变，其中所述取代突变中的一个选自由Q1191M、Q1191C、Q1191V、Q1191L和Q1191Y组成的组。
在另一个实施方案中，修饰的B4-Hc还包含对应于血清型B，菌株4中的取代突变的两个或更多个取代突变，其中所述取代突变中的一个对应于血清型B，菌株4中的Y1199W、Y1199E、Y1199H、W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P、Y1199F或Y1199L。
在另一个实施方案中，修饰的B4-Hc还包含两个取代突变，所述取代突变选自对应于血清型B，菌株4中的Q1191M和W1178Q、Q1191C和W1178Q、Q1191V和W1178Q、Q1191L和W1178Q、Q1191Y和W1178Q、Q1191M和Y1183P、Q1191M和Y1183C、Q1191C和Y1183P、Q1191C和Y1183C、Q1191V和Y1183P、Q1191V和Y1183C、Q1191L和Y1183P、Q1191L和Y1183C、Q1191Y和Y1183P、Q1191Y和Y1183C、W1178Q和Y1183P以及W1178Q和Y1183C的取代突变。
在另一个实施方案中，所述两个取代突变对应于血清型B，菌株4中的Q1191M和W1178Q。
在另一个实施方案中，所述两个取代突变对应于血清型B，菌株4中的Q1191M和W1183P。
在另一个实施方案中，所述两个取代突变对应于血清型B，菌株4中的Q1191M和W1183C。
在另一个实施方案中，修饰的(B4-Hc)还包含三个取代突变。在另一个实施方案中，所述三个另外的取代突变在对应于血清型B，菌株4的Q1191、W1178和Y1183的位置。在另一个实施方案中，所述三个另外的取代突变对应于血清型B，菌株4的Q1191M、W1178Q和Y1183P。
在另一个方面，本文描述一种嵌合分子，其包含第一部分，所述第一部分为连接到第二部分的肉毒梭状芽孢杆菌血清型B，菌株4的修饰的受体结合结构域(B4-Hc)，其中修饰的B4-Hc与人SytII结合。
在一个实施方案中，肉毒梭状芽孢杆菌血清型B，菌株4的修饰的受体结合结构域(B4-Hc)包含取代突变V1113K、S1117P、S1196A和I1197P。
在另一个实施方案中，肉毒梭状芽孢杆菌血清型B，菌株4的修饰的受体结合结构域(B4-Hc)还包含一个或多个选自由：Q1191M、Q1191C、Q1191V、Q1191L、Q1191Y、W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P及其组合组成的组的取代突变。
在另一个实施方案中，修饰的B4-Hc还包含两个选自由：Q1191M、Q1191C、Q1191V、Q1191L、Q1191Y、W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C和Y1183P组成的组的取代突变。
在另一个方面，本文描述一种嵌合分子，其包含第一部分，所述第一部分为连接到第二部分的肉毒梭状芽孢杆菌血清型B，菌株4的修饰的受体结合结构域(B4-Hc)，其中修饰的B4-Hc包含对应于血清型B，菌株4中的取代突变的两个或更多个取代突变并结合人SytII，其中所述取代突变中的一个选自由：Q1191M、Q1191C、Q1191V、Q1191L和Q1191Y组成的组。
在一个实施方案中，所述取代突变中的一个对应于血清型B，菌株4中的W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C或Y1183P。
在另一个实施方案中，两个取代突变对应于血清型B，菌株4中Q1191M和W1178Q、Q1191C和W1178Q、Q1191V和W1178Q、Q1191L和W1178Q、Q1191Y和W1178Q、Q1191M和Y1183P、Q1191M和Y1183C、Q1191C和Y1183P、Q1191C和Y1183C、Q1191V和Y1183P、Q1191V和Y1183C、Q1191L和Y1183P、Q1191L和Y1183C、Q1191Y和Y1183P、Q1191Y和Y1183C、W1178Q和Y1183P以及W1178Q和Y1183C。
在另一个实施方案中，修饰的(B-Hc)包含三个取代突变。在另一个实施方案中，所述三个取代突变在对应于血清型B，菌株4的Q1191、W1178和Y1183的位置。在另一个实施方案中，所述三个取代突变对应于血清型B，菌株4的Q1191M、W1178Q和Y1183P。
在另一个实施方案中，第一部分和第二部分共价连接。
在另一个实施方案中，第一部分和第二部分非共价连接。
在另一个实施方案中，第二部分选自由小分子、核酸、短多肽和蛋白质的组成的组。
在另一个实施方案中，第二部分是生物活性分子。
在另一个实施方案中，第二部分是治疗性多肽或非多肽药物。
在另一个方面，本文描述一种包含如本文所述的肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽或嵌合分子或包含编码如本文所述的BoNT多肽的核酸或核酸载体的药物组合物。
在一个实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂。
在另一个方面，本文描述一种包含如本文所述的药物组合物的药盒。所述药盒可以包括用于治疗性施用药物组合物的指导。
在另一个方面，本文描述一种生产肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽的方法，所述方法包括在一定条件下培养包含编码如本文所述的BoNT多肽或嵌合BoNT多肽的核酸或核酸载体的如本文所述的细胞的步骤，在所述条件下生产所述BoNT多肽或嵌合BoNT多肽。
在一个实施方案中，所述方法还包括以下步骤中的一个或多个：从培养物中回收BoNT多肽；纯化BoNT多肽；激活BoNT多肽；或配制BoNT多肽。
在另一个方面，本文描述一种用于治疗与不需要的神经元活性相关的病症的方法，其包括对受试者施用治疗有效量的如本文所述的BoNT多肽或嵌合BoNT多肽或包含这类多肽的药物组合物，从而接触表现出不需要的神经元活性的一种或多种神经元，从而治疗所述病症。
在一个实施方案中，所述病症选自由以下组成的组：痉挛性发声障碍、痉挛性斜颈、喉肌张力障碍、口下颌肌张力障碍、舌肌张力障碍、颈肌张力障碍、手局部肌张力障碍、眼睑痉挛、斜视、半面痉挛、眼睑病症、脑瘫、局部痉挛和其他语音障碍、痉挛性结肠炎、神经性膀胱、肛门痉挛、肢体痉挛、抽搐、震颤、磨牙症、肛裂、贲门失弛缓症、吞咽困难和其他肌张力障碍和其他以肌肉群不自主运动为特征的病症、流泪、多汗症、过度流涎、胃肠道分泌物过多、分泌性病症、肌肉痉挛引起的疼痛、头痛、偏头痛以及皮肤病学或美学/美容病症。
在另一个方面，本文描述如本文所述的肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽、如本文所述的嵌合BoNT多肽或用于医学中的包含此类BoNT多肽或嵌合多肽的药物组合物。
在另一个方面，本文描述如本文所述的肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽、如本文所述的嵌合BoNT多肽或用于治疗与不需要的神经元活性相关的病症的包含此类BoNT多肽或嵌合多肽的药物组合物。
定义
如本文所用，术语“结合亲和力”是指分子对特定受体系统的结合活性的强度。通常，高结合亲和力由结合结构域与其受体系统之间的较大分子间力产生，而低结合亲和力涉及配体与其受体之间的较小分子间力。与低结合亲和力的情况相比，高结合亲和力涉及结合结构域在其受体结合位点的停留时间更长。因此，具有高结合亲和力的分子意指需要较低浓度的该分子以最大限度地占据受体系统的结合位点并触发生理学应答。相反，低结合亲和力意指在受体系统的受体结合位点被最大限度地占据并且实现最大生理学应答之前需要相对高浓度的分子。因此，由于高结合亲和力而具有增加的结合活性的如本文所述的肉毒杆菌神经毒素将允许施用减少剂量的毒素，从而减少或防止与毒素分散到非靶向区域相关的不需要的副作用。
通常用于测量结合亲和力的一个参数定义为结合KD。因为KD定义为解离常数(K解离)和缔合常数(K缔合)之间的比率，KD值越低，结合亲和力越高。
作为本文所用的术语，当用于描述本文所述的肉毒梭状芽孢杆菌神经毒素分子或BoNT/B-Hc结构域或其受体结合片段对特异性受体(例如，人Syt II或人Syt I)的结合亲和力时，术语“显著增强的结合”是指对特异性受体的结合亲和力增加，与分子的非取代型式相比，其显著增加(例如，野生型分子的结合亲和力的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)。在一个实施方案中，取代的分子的增强的结合通过结合亲和力与未取代的分子(例如，具有天然存在的BoNT HC分子的神经毒素)的结合亲和力相比是一个数量级或更高来证实。换句话说，取代的分子的KD与未取代的分子的KD相比是一个数量级或更低。在一个实施方案中，增强的结合通过结合亲和力比未取代的分子的结合亲和力显著更高(例如，1.5X、2.0X、2.5X、3.0X等)来证实。换句话说，取代的分子的KD比未取代的分子的KD显著更低(例如，1.5X、2.0X、2.5X、3.0X等)。在一个实施方案中，证实的增强的结合在约0.59μM至5.82μM KD的范围内。在一个实施方案中，证实的增强的结合在约0.59μM至4.3μMKD的范围内。在一个实施方案中，增强的结合通过KD≤5.82μM证实。在一个实施方案中，增强的结合通过KD≤4.30μM证实。在一个实施方案中，增强的结合通过KD≤2.9μM证实。在一个实施方案中，增强的结合通过约0.59μM的KD证实。
在一个实施方案中，取代的分子对于人Syt II的KD≤10μM，优选≤9μM、8μM、7μM、6μM、5μM、4μM、3μM或2μM，更优选≤1μM或0.6μM。在一个实施方案中，取代的分子对于人Syt I的KD≤10μM，优选≤9μM、8μM、7μM、6μM、5μM、4μM，更优选≤3μM。在一个实施方案中，取代的分子对于人Syt II的KD≤7μM，且取代的分子对于人Syt I的KD≤6μM。在一个优选的实施方案中，取代的分子对于人Syt II的KD≤1μM，且取代的分子对于人Syt I的KD≤3μM。
在一个实施方案中，增强的结合在不存在共受体神经节苷脂的情况下产生可检测到的与人Syt I的结合，诸如由本文所述的实验举例说明。
当用于描述由本文所述的点突变产生的BoNT/B-HC结合片段的结合亲和力时，术语“显著增强的结合”或“显著降低的结合”分别指修饰的结合结构域(例如，表达为分离的片段或在较大的神经毒素多肽构建体的背景下)与特异性受体(例如，如上面直接讨论的人Syt II或人Syt I)的结合亲和力的增加或减小。
作为本文所用的术语，当用于描述本文所述的肉毒杆菌神经毒素分子或其结合片段(例如，BoNT/B-Hc)与特异性受体(例如，人Syt I或人Syt II)的结合亲和力时，术语“显著降低的结合”是指对特异性受体的结合亲和力减小，与分子的非取代型式相比，其显著减小(例如，野生型分子的结合亲和力的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)。在一个实施方案中，取代的分子的减小的结合产生与未取代的神经毒素(例如，具有天然存在的BoNT HC分子的神经毒素)的结合亲和力相比是一个数量级或更低的结合亲和力。换句话说，取代的分子的KD与未取代的神经毒素的KD相比是一个数量级或更高。在一个实施方案中，取代的分子的降低的结合产生比未取代的分子的结合亲和力显著更低(例如，1.5X、2.0X、2.5X、3.0X等)的结合亲和力。换句话说，取代的分子的KD比未取代的分子的KD显著更高(例如，1.5X、2.0X、2.5X、3.0X等)。在一个实施方案中，显著降低的结合导致在不存在共受体神经节苷脂的情况下与人Syt I的可检测结合损失。
如本文所用，术语“肉毒杆菌神经毒素”意指可以执行整体细胞机制的任何多肽，由此肉毒梭状芽孢杆菌毒素进入神经元并抑制神经递质释放。该机制涵盖肉毒梭状芽孢杆菌毒素与低或高亲和力受体复合物的结合、毒素的内化、毒素轻链易位到细胞质中以及肉毒梭状芽孢杆菌毒素底物的酶促修饰。提到肉毒梭状芽孢杆菌神经毒素分子及其片段时，术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用。
作为本文所用的术语，“修饰的受体结合结构域”或“修饰的HC”促进包含其的肉毒梭状芽孢杆菌神经毒素分子与位于靶细胞表面上的肉毒梭状芽孢杆菌神经毒素的受体的结合。此类分子通常通过遗传重组技术产生。修饰的HC对位于靶细胞表面的肉毒梭状芽孢杆菌神经毒素的受体具有结合活性。如本文所用，术语“结合活性”意指一个分子通过至少一种分子间或分子内力直接或间接接触另一分子，所述力包括而不限于共价键、离子键、金属键、氢键、疏水相互作用、范德华相互作用等或其任何组合。“结合的”和“结合”被认为是结合的术语。
如本文所用，术语“肉毒梭状芽孢杆菌毒素蛋白酶结构域”意指可以执行中毒过程的酶促靶标修饰步骤的肉毒梭状芽孢杆菌毒素结构域。因此，肉毒梭状芽孢杆菌毒素蛋白酶结构域特异性靶向肉毒梭状芽孢杆菌毒素底物并涵盖肉毒梭状芽孢杆菌毒素底物，例如SNARE蛋白如SNAP-25底物、VAMP底物和Syntaxin底物的蛋白水解裂解。
肉毒梭状芽孢杆菌毒素蛋白酶结构域的非限制性实例提供在表1中。
如本文所用，术语“肉毒梭状芽孢杆菌毒素易位结构域”或“HN”意指可以执行介导肉毒梭状芽孢杆菌毒素轻链易位的中毒过程的易位步骤的肉毒梭状芽孢杆菌毒性结构域。因此，HN促进肉毒梭状芽孢杆菌跨越膜的运动并涵盖肉毒梭状芽孢杆菌毒素轻链经细胞内囊泡膜运动进入细胞的细胞质。HN的非限制性实例包括BoNT/A HN、BoNT/B HN、BoNT/C1 HN、BoNT/D HN、BoNT/E HN、BoNT/F HN和BoNT/G HN，其氨基酸序列提供在表1和图8及图10至图16中。
如本文所用，术语“肉毒梭状芽孢杆菌受体结合结构域”与“HC域”同义并且意指任何自然存在的肉毒梭状芽孢杆菌受体结合结构域，其可以执行中毒过程的细胞结合步骤，包括例如肉毒梭状芽孢杆菌毒素与位于靶细胞的质膜表面上的肉毒梭状芽孢杆菌毒素-特异性受体系统的结合。设想结合活性的替换可以通过例如用修饰的(例如，增强的)HC结构域替换整个肉毒梭状芽孢杆菌HC结构域实现。
如本文所用，术语“肉毒梭状芽孢杆菌毒素靶细胞”意指作为天然存在的细胞的细胞，其中天然存在的肉毒梭状芽孢杆菌毒素能够中毒，包括而不限于运动神经元；感觉神经元；自主神经元；例如，交感神经元和副交感神经元；非肽能神经元，例如胆碱能神经元、肾上腺素能神经元、去甲肾上腺素能神经元、羟色胺能神经元、GABA能神经元；和肽能神经元，例如物质P神经元、降钙素基因相关的肽神经元、血管活性肠肽神经元、神经肽Y神经元和胆囊收缩素神经元。
“分离的”意指如在其天然状态下发现的通常伴随其的组分不同程度地自由的材料。“分离”表示自原始来源或周围环境，例如自侧翼氨基酸(例如，在分离的多肽片段的背景下)或自细胞或生物样品中的分离程度。
术语“纯化的”用以指相对于制剂的其他组分(例如，其他多肽)是“基本上纯的”的诸如多肽的物质。其可以指多肽相对于其他组分而言至少约50％、60％、70％或75％，优选至少约85％，更优选至少约90％，且最优选至少约95％纯。重新改动，关于多肽的术语“基本上纯的”或“基本上纯化的”是指制剂含有少于约20％，更优选少于约15％、10％、8％、7％，最优选少于约5％、4％、3％、2％、1％或少于1％的一种或多种其他组分(例如，其他多肽或细胞组分)。
如本文所用的术语“保守的”或“保守的取代突变”是指其中氨基酸被取代成具有类似性质的另一种氨基酸的突变，使得肽化学领域的技术人员将预期多肽的二次结构、化学性质和/或亲水性质基本上不变。以下氨基酸组在历史上作为保守变化相互取代：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、try、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；(5)phe、tyr、trp、his。其他普遍接受的保守取代如下：
残基 保守取代 残基 保守取代
Ala Ser Leu Ile；Val
Arg Lys Lys Arg；Gln
Asn Gln；His Met Leu；Ile
Asp Glu Phe Met；Leu；Tyr
Gln Asn Ser Thr；Gly
Cys Ser Thr Ser；Val
Glu Asp Trp Tyr
Gly Pro Tyr Trp；Phe
His Asn；Gln Val Ile；Leu
Ile Leu，Val
没有提及特定氨基酸的术语“取代突变”可以包括除了在该位置通常发现的野生型残基外的任何氨基酸。此类取代可以用非极性(疏水)氨基酸如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和脯氨酸替换。取代可以用极性(亲水)氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺替换。取代可以用带电荷的氨基酸，例如带负电荷的氨基酸如天冬氨酸和谷氨酸和带正电荷的氨基酸如赖氨酸、精氨酸和组氨酸替换。
本文所述的取代突变通常将用不同的天然存在的氨基酸残基替换，但在一些情况下，非天然存在的氨基酸残基也可被取代。作为如本文所用的术语，非天然氨基酸是非蛋白原性(即，非蛋白质编码)氨基酸，其是天然存在的或化学合成的。实例包括但不限于β-氨基酸(β3和β2)、同源氨基酸、脯氨酸和丙酮酸衍生物、3-取代的丙氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、环取代的苯丙氨酸和酪氨酸衍生物、线性核心氨基酸、二氨基酸、D-氨基酸和N-甲基氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸可以是取代的或未取代的。取代的氨基酸或取代基可以是卤代芳族或脂族氨基酸、疏水侧链上的卤代脂族或芳族改性、或脂族或芳族改性。
术语“治疗有效量”是指当施用到患有病症的典型受试者时足以实现所述病症的一种或多种症状的治疗显著降低的量。症状的治疗显著降低与对照或未治疗的受试者相比是例如约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％或更大。
术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”是指治疗性治疗，其中目的是消除或减轻症状。有益或期望的临床结果包括但不限于症状消除、症状缓解、病症程度减轻、病症状态稳定(即，不恶化)、病症进展延迟或减缓。
如本文所用，“受试者”是指人或动物。通常，所述动物是脊椎动物，诸如灵长类动物、啮齿动物、家畜或野生动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴如恒河猴。啮齿动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠、白鼬、兔子和仓鼠。家畜和野生动物包括奶牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫物种(例如，家猫)、犬物种(例如，狗、狐狸、狼)、鸟物种(例如，雏鸡、鸸鹋、鸵鸟)和鱼(例如，鳟鱼、鲶鱼和大麻哈鱼)。患者或受试者包括前述的任何子集，例如，以上所有，但排除一个或多个组或物种，诸如人、灵长类动物或啮齿动物。在本文所述方面的某些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人。术语“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。受试者可以是雄性或雌性的。受试者可以是完全发育的受试者(例如，成年人)或经历发育过程的受试者(例如，儿童、婴儿或胎儿)。
优选地，受试者是哺乳动物。所述哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或奶牛，但不限于这些实例。除人之外的哺乳动物可以有利地用作代表与不需要的神经元活性相关的病症的动物模型的受试者。此外，本文所述的方法和组合物可用于治疗驯养动物和/或宠物。
附图说明
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图1A至图1D.(公布的背景数据)显示BoNT如何靶向神经元的示意性模型(图1A)、其总蛋白质结构(图1B)、鉴定的受体的列表(图1C)以及BoNT/B与其受体Syt和神经节苷脂结合的结构模型(图1D)。(图1A)BoNT作用的示意图：BoNT通过与其特异性受体结合识别神经元(步骤1)，通过受体介导的内吞作用进入神经元(步骤2)，BoNT的轻链然后跨越内体膜易位到细胞溶质(步骤3)，其中这些轻链充当蛋白酶以裂解靶宿主蛋白(步骤4)。图1A改编自Arnon,S.等人，JAMA,285:1059,200124。(图1B)BoNT由通过二硫键连接的轻链和重链组成。重链可以进一步分成两个结构域：易位结构域(HN)和受体结合结构域(HC)。这些功能结构域可以在不同的BoNT之间切换。例如，BoNT/B-HC可以用来替换BoNT/A HC以产生嵌合毒素。(图1C)鉴定的毒素受体的列表。(图1D)显示BoNT/B与其蛋白受体Syt(I/II)以及其脂质共受体神经节苷脂在细胞表面上的结合的结构模型。图1D改编自Chai等人，Nature,444:1096,200631。
图2A至图2E.细菌双杂交(BACTH)筛选鉴定的点突变，其增强BoNT/B与h-Syt II的结合。(图2A)上图：人Syt II(h-Syt II，SEQ ID NO:6)中的BoNT/B结合位点与小鼠Syt II(m-Syt II，SEQ ID NO:5)的序列比对。下图：HCB和Syt II：用于诱变研究的BoNT/B中的靶向残基之间的界面的近距离视图用绿色标记(浅灰色)。Syt II残基标记为紫色(深灰色)，其中F54、F55和I58突出显示(在框内)。(图2B)HCB突变体文库的构造和BATCH测定的示意图。(图2C)产生蓝色菌落的BATCH测定中鉴定的阳性突变的列表。(图2D)图C中列出的HCB突变体通过β-半乳糖苷酶活性测定进一步分析，其反映重构的腺苷酸环化酶的水平。(n＝6，*p<0.05)。(图2E)E1191位点处的HCB突变在下拉分析中使用固定化的m-Syt II(残基1-87)或含有模拟h-Syt II序列的F54L突变的小鼠Syt II(1-87)检查。结合的HCB突变体通过检测与HCB融合的HA标签的免疫印迹分析检测。额外的HCB突变显示在图18和图21中。
图3A至图3C.HCB中的组合突变增强其与h-Syt II和Syt I的结合。(图3A)HCB双突变在下拉测定中对于其结合m-Syt II的能力相对其结合h-Syt II的能力检查。显示与h-Syt II稳固结合的三个双突变以红色标记(粗体)。(图3B)HCB与h-Syt II的结合通过BLI测定定量。显示WT HCB和三个HCB突变体：E1191M/S1199Y、E1191V/S1199W和E1191C/S1199W的代表性缔合和解离曲线。表4中列出所有12个双突变的结合参数，并且它们的代表性结合迹线显示在图19中。(图3C)WT HCB、HCB(E1191M)和HCB(E1191M/S1199Y)与固定化的GST标记的h-Syt I(残基1-80)的结合在下拉测定中在有(+)和没有(-)神经节苷脂(Gangl)的情况下检查。WT HCB与h-Syt I的结合需要存在共受体神经节苷脂，而HCB(E1191M)和HCB(E1191M/S1199Y)在不存在神经节苷脂的情况下与h-Syt I结合。
图4A至图4B.HCBMY显示与表达h-Syt II的人源化神经元的稳固结合。(图4A)人源化神经元由内源性Syt I的KD产生，并表达培养的大鼠皮层神经元中的全长h-Syt II。表达全长m-Syt II或m-Syt II的神经元(F54L)用作额外的对照。将这些神经元暴露于WT HCB，然后进行免疫染色分析。结合的HCB通过与HCB融合的HA标签检测。突触蛋白被标记为突触前末梢的标记物。WT HCB结合WT神经元的突触，但不结合Syt I KD神经元。通过慢病毒转导表达全长m-Syt II恢复HCB的结合，而全长m-Syt II(F54L)或全长h-Syt II的表达未能挽救结合。(图4B)Syt I KD废除HCBMY与神经元的结合。所述结合通过表达全长m-Syt II、m-SytII(F54L)或h-Syt II挽救。
图5A至图5C.BoNT/BMY展示对阻断人源化神经元中的神经传递的增强的功效。(图5A)人源化神经元如图4A中所述产生。将这些神经元暴露于全长WT BoNT/B或BoNT/BMY的浓度梯度24小时。收获细胞裂解物并对其进行免疫印迹分析。β-微管蛋白用作内部装载对照。BoNT/BMY在相同浓度下裂解比WT BoNT/B多的VAMP2，指示BoNT/BMY比WT BoNT/B更有效地进入神经元。(图5B至图5C)将人源化神经元暴露于WT BoNT/B或BoNT/BMY的浓度梯度24小时，然后通过全细胞膜片钳方法记录mIPSC活性。图B(图5B)显示30pM毒素的代表性mIPSC记录。图C(图5C)描绘mIPSC活性相对于毒素浓度的关系，标准化为未暴露于任何毒素的神经元。每个数据点记录的神经元数记在(括号)中。对于WT BoNT/B和BoNT/BMY记录相同数量的神经元。确定半最大抑制浓度(IC50)，对于WT BoNT/B，为89pM，且对于BoNT/BMY，为7.8pM，证实对人受体的增强结合增加毒素在神经元中在功能水平下功效。
图6A至图6D.BoNT/B亚型的序列变异影响其结合h-Syt II的能力。(图6A)BoNT/B亚型在BoNT/B中在残基E1191/S1199周围区域中的序列比对，包括BoNT/B1(SEQ ID NO:9)；BoNT/B2(SEQ ID NO:10)；BoNT/B3(SEQ ID NO:11)；BoNT/B4(SEQ ID NO:12)；BoNT/B5(SEQID NO:13)；BoNT/B6(SEQ ID NO:14)；BoNT/B7(SEQ ID NO:15)；BoNT/B8(SEQ ID NO:16)。(图6B)含有Q1191和Y1199的HCB4在下拉测定中不与h-Syt II结合。(图6C)在形成Syt I/II的结合口袋的19个关键残基内在HCB4和HCB之间存在六个不同的残基。用HCB中的相应残基替换HCB4中的所有六个残基产生可以与h-Syt II结合的突变体HCB4(称为“六个突变”：V1113K/S1117P/S1196A/I1197P/A1182T/N1185Y)。HCB1和HCB4之间的序列比对显示在图7中。(图6D)HcB和HcB4与固定化GST标记的h-Syt I的结合在下拉测定中检查。HcB与h-Syt I的结合需要存在神经节苷脂，而HcB4在下拉测定中能够在没有神经节苷脂的情况下与h-Syt I结合。
图7.BoNT/B1(SEQ ID NO:17)和BoNT/B4(SEQ ID NO:18)氨基酸序列的Hc结构域的比对。BoNT/B1和B4的Hc结构域多肽序列的比对突出B血清型的这两种菌株之间不同的那些氨基酸。B4氨基酸V1113、S1117、S1196和I1197在本文中被鉴定为调节B4 Hc结构域结合人SytII分子的能力的残基。图7还通过指示形成具有星号的Syt II结合口袋的19个关键残基来证实表5中已经显示的内容。
图8是BoNT/B-Hc(菌株1；BoNT/B1秋葵菌株)的氨基酸序列。BoNT/B，菌株1的残基857-1291，GenBank：AB232927.1(SEQ ID NO:19)。
图9是编码BoNT/B-Hc(菌株B1，秋葵菌株)的核酸序列(BoNT/B，菌株1的残基857-1291，基于GenBank：AB232927.1)，其已被优化用于在大肠杆菌中表达(SEQ ID NO:20)。
图10显示肉毒梭状芽孢杆菌血清型A(1296a.a.)的氨基酸序列(SEQ ID NO:21)。
图11显示肉毒梭状芽孢杆菌血清型B(1291a.a.)的氨基酸序列(SEQ ID NO:22)。
图12显示肉毒梭状芽孢杆菌血清型C1(1291a.a.)的氨基酸序列(SEQ ID NO:23)。
图13显示肉毒梭状芽孢杆菌血清型D(1276a.a.)的氨基酸序列(SEQ ID NO:24)。
图14显示肉毒梭状芽孢杆菌血清型E(1252a.a.)的氨基酸序列(SEQ ID NO:25)。
图15显示肉毒梭状芽孢杆菌血清型F(1274a.a.)的氨基酸序列(SEQ ID NO:26)。
图16显示肉毒梭状芽孢杆菌血清型G(1297a.a.)的氨基酸序列(SEQ ID NO:27)。
图17显示肉毒梭状芽孢杆菌血清型B，菌株Eklund 17B(BoNT/B4)的氨基酸序列Genbank Ref：EF051570.1(SEQ ID NO:28)。
图18显示13种不同的单取代突变对突变的BoNT/B1 HC结构域与小鼠和人SytII的结合的影响。
图19显示对于在一次突变E1191M/C/V/Q与相容的二次突变S1199W/Y和W1178Q以及三重突变E1191M/S1199W/W1178Q之间的所有12种组合而言关于与人SytII的结合的生物层干涉测量迹线。所有12种突变体对h-Syt II的结合亲和力(KD)使用生物层干涉测定法(BLI)测量，参数列于表4中。
图20显示前两种BoNT/B1 HC结构域突变体(E1191M/S1199Y和E1191V/S1199Y)对于h-Syt I的结合亲和力的BLI测定测量结果。含有E1191M/S1199Y(HCBMY)或E1191V/S1199Y(HCBVY)的HCB分别展示2.9μM和5.82μM的KD。
图21显示在下拉测定中检查的HcB突变体与m-Syt II和h-Syt II的结合，如图2E中所述。
图22显示突变体HcB4与m-Syt II和h-Syt II的结合。
图23A至图23B显示在大肠杆菌中生产的BoNT/BMY具有活性，并且可被BoNT/B抗体中和。图23A)全长BoNT/B和BoNT/BMY从大肠杆菌中纯化。这些毒素被内切蛋白酶Lys-C激活。SDS-PAGE分析揭示WT BoNT/B毒素纯度为约93％，其中约80％呈其双链形式，并且BoNT/BMY毒素纯度为约86％，其中约99％呈其双链形式。图23B)将培养的大鼠皮层神经元暴露于BoNT/BMY(在培养基中1nM，16小时)，BoNT/BMY用兔多克隆抗BoNT/B抗体(培养基中1:200稀释)或针对BoNT/A、B和E的三价马抗血清(在培养基中1:40稀释)预孵育。16小时后收获神经元裂解物。VAMP2的裂解通过免疫印迹测定分析。BoNT/BMY因为它在神经元中裂解VAMP2而具有活性。兔多克隆抗BoNT/B抗体和三价马抗血清均易于中和BoNT/BMY。肌动蛋白用作内部装载对照。这些结果证实E1191M/S1199Y突变不改变BoNT/B的免疫原性。
图24A至图24B显示在BoNT/B-结合界面处在Syt I和Syt II之间以及在人Syt I和小鼠Syt I之间的比较。图24A)在小鼠Syt I(SEQ ID NO:7)和Syt II(SEQ ID NO:8)之间的序列比对和结构比较。星号突出显示与BoNT/B相互作用的保守残基，这可以在与Syt I(底部，浅灰色)和Syt II(底部，深灰色)结合的BoNT/B(顶部)的模型结构中看到。基于可用的BoNT/B-Syt II晶体结构(PDB：4KBB)，对Syt I与BoNT/B的结合进行建模。图24B)在BoNT/B结合结构域内人Syt I(SEQ ID NO:4)相对小鼠/大鼠Syt I(SEQ ID NO:29)的序列比对。唯一的区别，人Syt I中的E45和小鼠/大鼠Syt I中的Q，是粗体。该模型显示残基45的侧链(由箭头指示)自结合位点指向外，并且不与BoNT/B相互作用。
具体实施方式
本发明的方面涉及多肽的产生以及编码此类多肽的核酸，其包含肉毒梭状芽孢杆菌的修饰的受体结合结构域(例如，血清型B(B-Hc))，且更特别地讲，肉毒梭状芽孢杆菌神经毒素(BoNT)多肽，其通过并入修饰的受体结合结构域而对其人受体具有改善的结合，以及编码此类多肽的核酸。根据这些发现，可以产生新一代的治疗性BoNT，其包括本文鉴定的修饰的受体结合结构域，相对于目前使用的WT BoNT，其对靶向人神经元具有改善的功效和特异性。
先前已经确定BoNT/B Hc多肽与人SytII受体分子的结合可以通过在对应于BoNT/B1 Hc残基E1191和S1199的残基处的突变显著增强。参见PCT/US2016/024211，其通过引用整体并入本文。特别地讲，相对于WT，在BoNT/B1 HC结构域在残基E1191处突变成Q、M、C、V、L或Y增强hSytII结合。突变E1191M提供最急剧的结合增加，但E1191Q也显著促进结合。参见，例如，图2D和图2E。BoNT/B1Hc E1191M突变与残基S1199至Y的突变的组合进一步增加BoNT/B1分子与hSytII受体的结合。双突变体显示与表达hSytII受体分子的人神经元的强结合，并且展示阻断神经传递的增强功效。参见图4和图5。
注意到BoNT血清型B4(BoNT/B4)WT Hc结构域包括在对应于血清型B1分子的E1191和S1199的位置处的谷氨酰胺和酪氨酸，因此对应于将预期促进强结合的血清型B1分子的E1191Q、S1199Y双突变体。有趣的是，尽管在血清型B1蛋白中的位置处具有促进血清型B1神经毒素的结合的谷氨酰胺和酪氨酸，但野生型B4分子不能有效地结合hSytII受体分子。因此，B4分子的除Q1191和Y1199外的氨基酸对于结合hSytII分子肯定是重要的。
如本文实施例中所述，发现在血清型B1和血清型B4之间不同的B4分子的Hc结构域的19个氨基酸中的4个突变赋予血清型B4分子上的强hSytII结合。具体地讲，发现B4氨基酸V1113、S1117、S1196和I1197对于B4与hSytII的结合是重要的。这些残基突变为血清型B1分子的相应残基赋予血清型B4分子上的强烈结合-即B4突变V1113K、S1117P、S1196A和I1197P赋予强hSytII结合。因此，包含除天然存在的Q1191和Y1199之外的这些突变的B4 Hc结构域突变体可以在用于治疗或美容应用的修饰的肉毒梭状芽孢杆菌神经毒素制剂中使用。还应理解，还将预期，进一步修饰包含V1113K、S1117P、S1196A和I1197P突变的B4 Hc突变体以包括例如发现单独或组合地促进血清型B1分子与hSytII的结合的突变，促进修饰的血清型B4Hc结构域的结合。因此，也可以预期，在包含V1113K、S1117P、S1196A和I1197P突变的B4突变体中，例如Q1191进一步突变成例如C、V、L、Y、M和/或Y1199进一步突变成例如W、E或H积极地影响结合。仅作为一个实例，有可能的是包含包含V1113K、S1117P、S1196A和I1197P突变加突变Q1191M的B4 Hc结构域突变体的BoNT神经毒素也将强烈结合并影响神经传递活性。
以下包括带来本文所述的发现的研究的进一步描述以及本领域技术人员将其应用于本文公开的方法和组合物的考虑因素。
实施方案
BoNT/B由于无法结合人Syt II而在人类中的特异性和效力较低的观察结果可以解释为什么与BoNT/A相比需要相对更高的剂量。较高的BoNT/B剂量对应于触发抗体应答和发生严重副作用的机会增加。因此，改善BoNT/B与人受体Syt II的结合以增加其靶向人神经元的功效和特异性将允许在治疗应用中使用的减少量的毒素剂量。
本发明的方面来自于修饰BoNT血清型B4-HC的蛋白质序列修饰含有受体结合结构域的片段与人Syt II受体的结合的发现。已经鉴定出增强结合的特异性修饰，从而产生以高亲和力结合人Syt II的结构域。修饰的BoNT/B4-HC在全长BoNT蛋白的背景下保留这些结合性质。将具有增强的结合的修饰的受体结合结构域并入包含其他BoNT结构域的分子中，从而产生具有类似增强的受体结合的全长BoNT分子。因此，产生具有与人Syt II的高亲和力结合的新型BoNT。具有显著增强的结合的BoNT可以用于类似的治疗，尽管其剂量低于目前可用的BoNT分子，因此提供更安全的治疗方法。
BoNT多肽，包括本文所述的全长BoNT多肽和BoNT多肽片段或结构域(例如，修饰的BoNT/HC)及编码其的核酸分子，明确涵盖在本发明中。这些多肽和核酸分子可以通过本领域已知的重组DNA工序产生。此类多肽通常被称为“重组多肽”或“重组核酸”。
肉毒杆菌神经毒素蛋白
本发明的一个方面涉及一种肉毒杆菌神经毒素(BoNT)蛋白质，其包含如本文所述的(例如，肉毒梭状芽孢杆菌血清型B4的)修饰的受体结合结构域。BoNT蛋白还包含蛋白酶结构域、易位结构域和蛋白酶裂解位点。通常，这些以蛋白酶结构域、蛋白酶裂解位点、易位结构域和修饰的受体结合结构域的线性氨基-羧基单多肽顺序排列。然而，预期各种结构域的不同排列充分地发挥作用。在一个实施方案中，修饰的受体结合结构域包含一个或多个取代突变，所述取代突变引起与人Syt I受体和/或人Syt II受体的结合显著增强。
BoNT蛋白还可以包含可用于纯化分子如六组氨酸标签(His6)(SEQ ID NO:1)或表位标签如血凝素(HA)标签(YPYDVPDYA)(SEQ ID NO:2)的结构域。已知各种此类结构域并且在本领域中用于此目的。
BoNT具有图1B中所示的整体结构。BoNT由三个结构域组成，每个结构域具有特定且独立的功能：蛋白酶结构域(也称为轻链)、易位结构域(HN)和受体结合结构域(HC)。已经显示肉毒梭状芽孢杆菌神经毒素的各种菌株的结构域在很大程度上是可以互换的(如由天然存在的嵌合毒素如BoNT/CD所证实，它由BoNT/C的轻链和HN以及BoNT/D(52)的HC组成，美国专利8,052,979，通过引用并入本文)。蛋白质可以呈单链形式或双链形式。双链形式由位于蛋白酶结构域和易位结构域之间的蛋白酶裂解位点的天然存在的蛋白酶加工产生。在蛋白酶加工后，通过二硫键的存在，蛋白质维持呈双链形式。
肉毒梭状芽孢杆菌的菌株生产七种抗原性不同类型的肉毒杆菌毒素，其已经通过研究人(BoNT/A、BoNT/B、BoNT/E和BoNT/F)、动物(BoNT/C1和BoNT/D)或从土壤中分离(BoNT/G)中的肉毒杆菌中毒暴发来鉴定。虽然所有七种BoNT血清型都具有类似的结构和药理学性质，但各自还展示异源的细菌学特征。肉毒梭状芽孢杆菌菌株的遗传多样性在Hill等人(Journal of Bacteriology，第189卷，第3期，第818至832页(2007))(53)，其内容通过引用并入本文中详细描述。在一个实施方案中，本发明的BoNT具有全部相同血清型(A、B、C、D、E、F或G)的结构域。在一个实施方案中，相同血清型的那些结构域中的一个或多个在其菌株和/或亚型方面不同。
来自各种肉毒梭状芽孢杆菌血清型/菌株的毒素共享相同的功能域组织和整体结构架构。肉毒梭状芽孢杆菌毒素各自翻译为约150kDa的单链多肽，其随后通过由天然存在的蛋白酶如内源性肉毒梭状芽孢杆菌毒素蛋白酶或环境中生产的天然存在的蛋白酶在二硫环内蛋白水解切断而裂解。这种翻译后加工产生双链分子，其包含约50kDa轻链(LC)和约100kDa重链(HC)，二者通过单个二硫键和非共价相互作用结合在一起。每个成熟的双链分子包含三个功能不同的结构域：1)位于LC中的蛋白水解结构域，其包括特异性靶向神经递质释放装置的核心组分的含有锌依赖性内肽酶活性的金属蛋白酶区；2)包含在HC(HN)的氨基末端半区内的易位结构域，其促进LC从细胞内囊泡释放到靶细胞的细胞质中；和3)在HC的羧基末端半区内发现的结合结构域，其确定毒素与位于靶细胞表面的受体复合物的结合活性和结合特异性。表1中提供各种血清型/菌株的毒素内特定结构域的位置：
表1
来自各种血清型/菌株的肉毒梭状芽孢杆菌毒素结构域
毒素的完整氨基酸序列提供在图10至16中。BoNT/B4神经毒素多肽(也称为Eklund菌株)的完整氨基酸序列提供在图17中。
这三个功能结构域的结合、易位和蛋白酶活性都是毒性所必需的。肉毒梭状芽孢杆菌毒素进入神经元并抑制神经递质释放的整体细胞中毒机制是类似的，而不管血清型或亚型如何。不希望受理论束缚，中毒机制涉及至少四个步骤：1)受体结合，2)复合物内化，3)轻链易位，和4)蛋白酶靶修饰。当肉毒梭状芽孢杆菌毒素的HC结构域与位于靶细胞的质膜表面上的毒素特异性受体结合时启动该过程。认为受体复合物的结合特异性部分地通过神经节苷脂和蛋白质受体的特定组合来实现。一旦结合，毒素/受体复合物就通过内吞作用内化且内化的囊泡被分选至特定细胞内途径。易位步骤由囊泡隔室的酸化触发。易位后，毒素的轻链内肽酶从细胞内囊泡释放到细胞溶质中，其中其特异性地靶向三种蛋白质中的一种，称为神经递质释放装置的核心组分(囊泡相关膜蛋白(VAMP)/突触小泡蛋白、25kDa的突触体相关蛋白(SNAP-25)和突触融合蛋白)。这些核心组分是神经末梢的突触囊泡对接和融合所必需的，并且构成可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子-附着蛋白-受体(SNARE)家族的成员。BoNT/A和BoNT/E在羧基末端区中裂解SNAP-25，分别释放含九或二十六个氨基酸的链段，且BoNT/C1也在羧基末端附近裂解SNAP-25。肉毒杆菌血清型BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G以及破伤风毒素作用于VAMP的保守中心部分，并将VAMP的氨基末端部分释放到细胞溶质中。BoNT/C1在胞浆质膜表面附近的单个位点裂解突触融合蛋白。突触SNARE的选择性蛋白水解解释了体内由肉毒梭状芽孢杆菌毒素引起的神经递质释放的阻滞。肉毒梭状芽孢杆菌毒素的SNARE蛋白靶标在各种非神经元类型中的胞吐作用常见；在这些细胞中，如在神经元中，轻链肽酶活性抑制胞吐作用，参见，例如，Yann Humeau等人，How Botulinum andTetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release,82(5)Biochimie.427-446(2000)；Kathryn Turton等人，Botulinum and Tetanus Neurotoxins:Structure,Function and Therapeutic Utility,27(11)Trends Biochem.Sci.552-558.(2002)；Giovanna Lalli等人，The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins inNeurons,11(9)Trends Microbiol.431-437,(2003)。
结构域和嵌合神经毒素
本文所述的肉毒杆菌神经毒素包含修饰的受体结合结构域(HC)。修饰的受体结合结构域表现出与通常由一种或多种肉毒梭状芽孢杆菌毒素菌株(例如，SytII、SytI)结合并利用的人受体的显著增强的结合。修饰的受体结合结构域将是修饰的血清型B4受体结合结构域(如本文所述)。这可以是与BoNT内的一个或多个其他结构域相同或不同的血清型、菌株/亚型。本文提供特异性修饰的受体结合结构域的实例。本发明还涵盖本文所述的分离的修饰的受体结合结构域多肽，同样涵盖由其编码的分离的核酸分子。
本发明的肉毒杆菌神经毒素还包含蛋白酶结构域，在本领域中也称为轻链变体。轻链变体可以是天然存在的轻链变体，例如肉毒梭状芽孢杆菌毒素轻链同种型和肉毒梭状芽孢杆菌毒素轻链亚型；或非天然存在的肉毒梭状芽孢杆菌毒素轻链变体，例如保守取代肉毒梭状芽孢杆菌毒素轻链变体。蛋白酶结构域可以是任何血清型(A、B、C、D、E、F或G)、菌株或亚型(如本文所述)。这可以是与BoNT内的一个或多个其他结构域相同或不同的血清型、菌株/亚型。在一个实施方案中，蛋白酶结构域是血清型B。在一个实施方案中，蛋白酶结构域是血清型A。
本发明的肉毒杆菌神经毒素还包含毒素易位结构域(HN)。毒素易位结构域可以是任何血清型(A、B、C、D、E、F或G)、菌株或亚型(如本文所述)。这可以是与BoNT内的一个或多个其他结构域相同或不同的血清型、菌株/亚型。在一个实施方案中，HN是血清型B。在一个实施方案中，HN是血清型A。
本文所述的各种结构域(例如，HN、HC或蛋白酶结构域)包括而不限于天然存在的变体，例如同种型和亚型；非天然存在的变体，例如保守的取代突变。非天然存在的变体是指具有自参考序列的相应区域的至少一个氨基酸变化的结构域(例如，来自表1或图8或10至17并且可以以与该参考序列的相应区域的百分比同一性描述。
虽然应当理解本文所述的肉毒杆菌神经毒素变体将涵盖修饰的血清型B4 HC结构域，但本领域技术人员认识到，在肉毒梭状芽孢杆菌毒素的每种血清型中，可以存在在其氨基酸序列方面以及在编码这些蛋白质的核酸方面有所不同的天然存在的肉毒梭状芽孢杆菌结构域变体。设想用于产生本发明的BoNT的天然存在的肉毒梭状芽孢杆菌毒素结构域(例如，轻链、HN或HC)可以以与天然存在的肉毒梭状芽孢杆菌结构域变体所基于的参考肉毒梭状芽孢杆菌毒素结构域基本相同的方式起作用，并且可以取代成参考肉毒梭状芽孢杆菌毒素结构域。
天然存在的肉毒梭状芽孢杆菌毒素结构域变体的一个非限制性实例是肉毒梭状芽孢杆菌毒素结构域同种型，诸如BoNT/A结构域同种型、BoNT/B结构域同种型、BoNT/C1结构域同种型、BoNT/D结构域同种型、BoNT/E结构域同种型、BoNT/F结构域同种型和BoNT/G结构域同种型。肉毒梭状芽孢杆菌毒素结构域同种型可以以与肉毒梭状芽孢杆菌毒素结构域同种型所基于的参考肉毒梭状芽孢杆菌毒素结构域基本相同的方式起作用，并且可以取代成参考肉毒梭状芽孢杆菌毒素结构域。
天然存在的肉毒梭状芽孢杆菌毒素结构域变体的另一个非限制性实例是肉毒梭状芽孢杆菌毒素结构域亚型，诸如来自亚型BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4、BoNT/A5的结构域；来自亚型BoNT/B1、BoNT/B2、BoNT/B3、BoNT/B4、BoNT/B5、BoNT/B6、BoNT/B7的结构域；来自亚型BoNT/C1-1、BoNT/C1-2、BoNT/D-C的结构域；来自亚型BoNT/E1、BoNT/E2、BoNT/E3、BoNT/E4、BoNT/E5、BoNT/E6、BoNT/E7、BoNT/E8的结构域；和来自亚型BoNT/F1、BoNT/F2、BoNT/F3、BoNT/F4、BoNT/F5、BoNT/F6、BoNT/F7的结构域。肉毒梭状芽孢杆菌毒素结构域亚型可以以与肉毒梭状芽孢杆菌毒素结构域亚型所基于的参考肉毒梭状芽孢杆菌毒素结构域基本相同的方式起作用，并且可以取代成参考肉毒梭状芽孢杆菌毒素结构域。
如本文所用，术语“非天然存在的变体”(例如，肉毒梭状芽孢杆菌毒素轻链变体、HC和HN)意指借助于人工操作生产的肉毒梭状芽孢杆菌结构域，包括而不限于通过使用随机诱变或合理设计的基因工程生产的结构域和通过化学合成生产的肉毒梭状芽孢杆菌结构域。非天然存在的肉毒梭状芽孢杆菌结构域变体的非限制性实例包括例如保守的肉毒梭状芽孢杆菌结构域变体。如本文所用，术语“保守的肉毒梭状芽孢杆菌结构域变体”意指肉毒梭状芽孢杆菌结构域具有至少一个被另一氨基酸或氨基酸类似物取代的氨基酸，所述另一氨基酸或氨基酸类似物具有至少一种与来自参考肉毒梭状芽孢杆菌结构域序列的原始氨基酸类似的性质(例如，表1和图8和10至17)。与参考结构域序列相比，变体可以具有一个、两个、三个、四个、五个或更多个保守氨基酸取代。性质的实例包括而不限于类似大小、拓扑学、电荷、疏水性、亲水性、亲脂性、共价键合能力、氢键合能力、物理化学性质等或其任何组合。保守的肉毒梭状芽孢杆菌结构域变体可以以与保守的肉毒梭状芽孢杆菌毒素结构域变体所基于的参考肉毒梭状芽孢杆菌毒素结构域基本相同的方式起作用，并且在本发明的任何方面，可以取代成参考肉毒梭状芽孢杆菌毒素结构域。
非天然存在的肉毒梭状芽孢杆菌毒素结构域变体可以取代来自天然存在的肉毒梭状芽孢杆菌毒素结构域所基于的参考肉毒梭状芽孢杆菌毒素结构域的一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个)氨基酸。非天然存在的肉毒梭状芽孢杆菌毒素结构域变体还可以与天然存在的肉毒梭状芽孢杆菌结构域变体所基于的参考肉毒梭状芽孢杆菌毒素结构域具有95％或更大(例如，96％、97％、98％或99％)的氨基酸同一性。
各种非天然存在的肉毒梭状芽孢杆菌神经毒素或其特定结构域描述于国际专利公开WO95/32738、WO96/33273、WO98/07864和WO99/17806中，其各自通过引用并入本文。本文所述的肉毒梭状芽孢杆菌神经毒素或其特定结构域通常将含有天然存在的氨基酸残基，但在一些情况下，也可存在非天然存在的氨基酸残基。因此，可以在本发明的上下文中使用所谓的“肽模拟物”和“肽类似物”，其可以包括模拟特定氨基酸或肽的结构的非氨基酸化学结构。此类模拟物或类似物的特征通常在于表现出类似的物理特征如大小、电荷或疏水性，以及在其天然肽对应物中发现的适当的空间取向。肽模拟化合物的具体实例是其中在一个或多个氨基酸之间的酰胺键被例如碳-碳键或其他非酰胺键替换的化合物，如本领域所熟知(参见，例如Sawyer，在Sawyer，在Peptide Based Drug Design,第378至422页,ACS,Washington D.C.1995中)。
本文所述的修饰的肉毒杆菌神经毒素包含肉毒梭状芽孢杆菌血清型B4的修饰的受体结合结构域(BoNT/B-HC)，所述修饰的受体结合结构域包含相对于野生型或Eklund菌株的HC结构域的四个取代突变：V1113K、S1117P、S1196A和I1197P。这些取代变体引起与人Syt II受体的结合显著增强。用作本发明中的参考模板的BoNT/B4-HC Eklund菌株的氨基酸序列示于图17中(还参见NCBI参考序列：YP_001893661.1,Genbank Ref:EF051570.1)。本文特别预期产生并入修饰的B4-Hc如完整的BoNT或包含修饰的B-HC的多肽的较长分子。
毒素扩散和中和抗体的产生是与但不限于BoNT/B相关的问题，这在BoNT/A的情况下同样观察到。BoNT/A与其受体SV2的结合亲和力的改善将缓解这些问题。因为BoNT/B与Syt I/II结合的亲和力比BoNT/A与SV2结合的亲和力高得多，所述可以使用具有结合人SytII的能力的修饰的BoNT/B受体结合结构域(BoNT/B-HC)替换BoNT/A-HC以产生修饰的嵌合BoNT/A，其对人神经元的功效和特异性可能比WT BoNT/A更高。(49-51)。
进一步设想可以利用如上所述的修饰的B4 HC替换所有其他BoNT血清型/菌株的HC。因此，本发明的另一个方面是BoNT多肽，其包含与不同血清型(A、C、D、E、F或G)、菌株或亚型的一个或多个结构域连接从而产生嵌合神经毒素的修饰的血清型B4受体结合结构域(HC)。每个BoNT的HC区域是明确定义的且各自的HC区域可以在BoNT分子中交换(例如，通过基因工程)。这类操作常规上由熟练的从业者通过用其他BoNT的轻链(LC)和易位结构域(HN)或HN-LC编码BoNT/B-HC的DNA的标准PCR融合执行，其在本领域中已经很好地确立。另外，也可以使用BoNT/B-HC的C-末端部分(指定为HCC)执行替换，所述C-末端部分是每个BoNT中含有蛋白质受体和神经节苷脂的结合位点的区域。所得嵌合毒素将具有通过与人Syt I/II结合而靶向人神经元的能力。作为非限制性实例，修饰的BoNT/B4-HC(或BoNT/B4-HCC)可以用来替换BoNT/A的HC(或HCC)。所得多肽涵盖在本发明中。这些嵌合毒素可具有比WTBoNT/A高的靶向人神经元的功效和特异性。这类嵌合BoNT/A毒素可用于人类的治疗应用，并且提供相对于WT BoNT/A的显著改善。
一方面涉及一种如本文所述的分离的纯化的修饰的受体结合结构域多肽。在一个实施方案中，修饰的受体结合结构域是修饰的BoNT/B4-HC。在一个实施方案中，B4-Hc通过取代对应于本文所述B4中的指定位置的氨基酸由BoNT的不同菌株和/或亚型产生。在一个实施方案中，HC是亚型B1、B2、B3、B5、B6或B7。在一个实施方案中，修饰的B-Hc不属于菌株3、7或8。
本发明涵盖用于人类的治疗应用的含有具有如本文所述的氨基酸取代的修饰的HC(例如，B4-HC)的突变体全长BoNT。在一个实施方案中，全长BoNT含有具有氨基酸取代V1113K、S1117P、S1196A和I1197P的修饰的HC(例如，B4-HC)，并且还包括在对应于B4的位置Q1191、Y1199、Y1183和W1178的氨基酸残基(例如，选自表2中列出的那些)的一个或多个组合处的氨基酸取代。在一个实施方案中，BoNT含有具有氨基酸取代V1113K、S1117P、S1196A和I1197P以及单个如本文所述的额外氨基酸取代的修饰的B4 HC。在一个实施方案中，BoNT含有具有氨基酸取代V1113K、S1117P、S1196A和I1197P以及两个如本文所述的额外氨基酸取代的修饰的B4 HC。在一个实施方案中，BoNT含有具有氨基酸取代V1113K、S1117P、S1196A和I1197P以及三个如本文所述的额外氨基酸取代的修饰的B4 HC。在一个实施方案中，修饰的B-Hc不属于菌株3、7或8。
所得BoNT毒素可以具有显著增强的与人Syt II的结合，因此，与WT BoNT相比，将对靶向人神经元实现更高的功效和特异性。所得突变体还可以维持与人SytI的类似结合，具有显著增强的对人SytI的结合，或具有显著降低的与人SytI的结合。
多肽和嵌合多肽
本发明的另一方面涉及一种包含修饰的BoNT/B4受体结合结构域的多肽。在一个实施方案中，与在Hc中修饰的特定位置处具有WT氨基酸的类似多肽(血清型B4野生型对应物)相比，在多肽的背景下，修饰的Hc具有显著增强的与人Syt II和/或Syt I的结合。在一个实施方案中，修饰的血清型B4 Hc通过取代对应于本文所述的B4中的指定位置的氨基酸由BoNT的不同血清型、菌株和/或亚型产生。在一个实施方案中，修饰的B-Hc不属于菌株3、7或8。在一个实施方案中，所得多肽具有通过与人SytI/II结合而靶向人神经元的能力。
包含修饰的受体结合结构域的多肽可以是受体结合结构域和另一种功能多肽(例如，用于2-杂交系统的功能多肽(诱饵或猎物，诸如T18或T25，或谷胱甘肽S转移酶)(GST))的融合蛋白。这也可以被称为嵌合多肽分子。或者，它可以是修饰的受体结合结构域和多肽标签的融合体，用于鉴定目的和/或纯化目的(例如，六组氨酸标签(His6)(SEQ ID NO:1)或表位标签如血凝素(HA)标签(YPYDVPDYA)(SEQ ID NO:2)或GST)，其中的许多是本领域已知且常用的。融合可以在各自的功能结构域之间具有一段氨基酸，其促进连接，用作裂解位点，或保持独立的构象和/或功能。在一个实施方案中，所述连接保留修饰的受体结合结构域的功能。在一个实施方案中，所述连接掩盖修饰的受体结合结构域的功能。本发明的另一个方面涉及一种编码这类多肽中的任一种的核酸分子。
修饰的BoNT/B4 HC可以与其他试剂(例如，蛋白质、小分子、短多肽、核酸)共价连接(例如，作为融合蛋白)或非共价连接。因此，本发明的另一个方面涉及一种嵌合分子，其包含第一部分，所述第一部分为连接到第二部分的如本文所述的肉毒梭状芽孢杆菌(例如，血清型B4)的修饰的受体结合结构域。所述分子的第二部分可以是生物活性(或“生物学活性”)分子，诸如治疗剂(例如，多肽或非多肽药物，诸如小分子或核酸)。所述分子的第一部分和第二部分的连接可以是共价的(例如，以融合蛋白的形式)或非共价的。此类连接的方法在本领域中是已知的，并且可以由熟练的从业者容易地应用。本发明的嵌合分子的一种这样的用途是作为靶向人神经元的递送工具。例如，修饰的BoNT/HC可以与其他治疗剂连接，以用作靶向媒介物，从而通过与人Syt I和/或Syt II结合将治疗剂递送至人神经元。
受体结合结构域(Hc)的修饰
如本文所讨论，本发明涉及一种修饰的Hc和包含所述修饰的Hc的多肽(例如，BoNT或融合或嵌合多肽)。用于产生本发明的这些多种多肽的HC氨基酸序列的修饰可以通过熟练的从业者已知的各种方法执行。实例包括而不限于已知结合Syt I/II的区域内的每个氨基酸残基的靶向诱变(定点诱变)或随机诱变。这些Syt结合区域通过先前关于小鼠或大鼠Syt受体的研究明确定义，但尚未明确确定BoNT/B-Hc和人Syt受体之间的相互作用。可以使用BoNT/B的不同亚型或与Syt I/II(D-C或G)结合的其他血清型作为模板，以通过产生本文对于B4-HC所述的相应突变来产生相同或类似的突变。通过与B4亚型的序列比对，可以容易地鉴定待突变的所选残基的相应位置。本发明涵盖所得多肽产物，同样涵盖包含所述产物的多肽和编码所述多肽和产物的核酸分子。
氨基酸序列修饰HC以生产修饰的受体结合结构域可以是单个残基突变成不同的氨基酸(单位点取代)，多个残基同时突变(多位点取代)，缺失一个或多个残基(缺失)，以及插入一个或多个残基(插入)，以及它们的组合。用于使蛋白质突变的方法是本领域公知的(例如，编码BoNT/HC序列的DNA上的靶向单位点和多位点取代)。
在一个实施方案中，基于先前关于BoNT/B受体结合结构域(29)_ENREF_29和报道的BoNT/B-Syt II结构(PDB ID：2NM1)的文献，修饰HC中的一个或多个残基，所述残基接触啮齿动物Syt II或周围区域。这些包括而不限于对应于BoNT/B4的位置Y1181、I1197、S1196、F1204、F1194、S1117、W1178、Y1183、V1118、S1116、V1113、K1192、Y1199、S1201、Q1191、E1245、Y1256、D1115和E1203的位置。在一个实施方案中，除了V1113K、S1117P、S1196A和I1197P取代之外，这些残基中的一个或多个被其他氨基酸系统地替换。还设想了各种修饰的组合，包括而不限于两个或更多个所述位置突变成任何种类的氨基酸，诸如本文所述的那些。
通过组合这些鉴定的关键残基中的突变，可以产生多位点取代(例如，2或3)。此类多位点置换突变体甚至可以具有进一步增强的与h-Syt II的结合，并且可以进一步维持或具有增强的与人Syt I的结合。在一个实施方案中，修饰的B4 HC相对于B4野生型序列具有四个氨基酸取代：V1113K、S1117P、S1196A和I1197P，并且还包含对应于血清型B，菌株4中的取代突变的一个或多个取代突变，所述取代突变选自Q1191C、Q1191V、Q1191L、Q1191Y、Q1191M、Y1199W、Y1199E、Y1199H、W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P及其组合。
还设想具有取代突变V1113K、S1117P、S1196A和I1197P以及下表2中所示的单个氨基酸取代突变的修饰的B4 HC，以及其并入本文所述的各种多肽中。
表2
Q1191M Y1183C Y1199H S1117Y
Q1191E Y1183P Y1199S V1118M
Q1191C Y1183M Y1199W S1196Y
Q1191V W1178Q Y1199F Y1181M
Q1191L W1178Y Y1199L
Q1191Y W1178A S1201V
Q1191T W1178S S1117P
Q1191I Y1199E S1117M
在一个实施方案中，与在特定位置具有WT氨基酸的类似多肽(在本文中也称为野生型对应物)相比，修饰的B4 HC具有增强的与hSyt II的结合。在一个实施方案中，与野生型对应物相比，产生的突变体还维持或具有显著增强的与人Syt I的结合。
在一个实施方案中，HC具有两个取代突变，所述取代突变对应于表3中对于血清型B，菌株4所示的那些：
表3
Q1191M和Y1199W Q1191V和Y1199H
Q1191M和Y1199E Q1191L和Y1199W
Q1191M和Y1199H Q1191L和Y1199E
Q1191C和Y1199W Q1191L和Y1199H
Q1191C和Y1199E Q1191Y和Y1199W
Q1191C和Y1199H Q1191Y和Y1199E
Q1191V和Y1199W Q1191Y和Y1199H
Q1191V和Y199E
核酸分子
本发明的另一个方面涉及一种分离的核酸分子，其包含编码本文所述的多肽的核苷酸序列(例如，修饰的受体结合结构域，或包含修饰的受体结合结构域的多肽，或包含本文所述的修饰的受体结合结构域的肉毒杆菌神经毒素)。在一个实施方案中，核酸分子包含图9中所示的核酸序列。此类核酸分子可由熟练的从业者例如通过重组DNA技术生制造。所需的氨基酸取代突变例如通过修饰编码DNA进行。例如，编码本文所述的多肽的核酸序列通过使用如下所示的遗传密码将编码指定氨基酸的核酸密码子突变成所需氨基酸来产生：
TTT Phe TCT Ser TAT Tyr TGT Cys
TTC Phe TCC Ser TAC Tyr TGC Cys
TTA Leu TCA Ser TGA
TTG Leu TCG Ser TGG Trp
CTT Leu CCT Pro CAT His CGT Arg
CTC Leu CCC Pro CAC His CGC Arg
CTA Leu CCA Pro CAA Gln CGA Arg
CTG Leu CCG Pro CAG Gln CGG Arg
ATT Ile ACT Thr AAT Asn AGT Ser
ATC Ile ACC Thr AAC Asn AGC Ser
ATA Ile ACA Thr AAA Lys AGA Arg
ATG Met* ACG Thr AAG Lys AGG Arg
GTT Val GCT Ala GAT Asp GGT Gly
GTC Val GCC Ala GAC Asp GGC Gly
GTA Val GCA Ala GAA Glu GGA Gly
GTG Val GCG Ala GAG Glu GGG Gly
在一个实施方案中，优化核酸序列以在大肠杆菌中表达(例如，基于GenBankAB232927.1的核酸序列，其相关部分显示在图9中)。
本发明的另一个方面涉及一种包含本文所述核酸分子的核酸载体。在一个实施方案中，所述载体是表达载体。此类表达载体在本文中称为表达构建体，并且包含可操作地连接到可用于表达细胞或无细胞提取物中的核酸分子的表达载体的本文公开的核酸分子。可以采用多种表达载体来表达编码本发明的肉毒梭状芽孢杆菌神经毒素的核酸分子，所述表达载体包括而不限于病毒表达载体；原核表达载体；真核表达载体，例如酵母表达载体、昆虫表达载体和哺乳动物表达载体；和无细胞提取物表达载体。还应理解，可用于实践这些方法的方面的表达载体可以包括在组成型、组织特异性、细胞特异性或诱导型启动子元件、增强子元件或两者的控制下表达肉毒梭状芽孢杆菌神经毒素的那些表达载体。表达载体以及用于制备和使用来自此类表达载体的表达构建体的充分确立的试剂和条件的非限制性实例自包括而不限于以下的商业供应商容易地购得：BD Biosciences-Clontech,Palo Alto,Calif.；BD Biosciences Pharmingen,San Diego,Calif.；Invitrogen,Inc,Carlsbad,Calif.；EMD Biosciences-Novagen,Madison,Wis.；QIAGEN,Inc.,Valencia,Calif.；和Stratagene,La Jolla,Calif.。适当表达载体的选择、制备和使用为完全在本领域的技术人员的技能范围内且自本文的教示获得的常规工序。
细胞
本发明的另一个方面涉及一种包含本文所述的核酸分子或表达构建体的细胞。所述细胞可以用于核酸的繁殖或用于核酸的表达或两者。此类细胞包括而不限于原核细胞，包括而不限于好氧、微需氧、嗜酸性、兼性、厌氧、革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌细胞的菌株，诸如来源于例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、脆弱拟杆菌、产气荚梭菌、艰难梭菌、新月形杆菌、乳酸乳球菌、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)、脑膜炎奈瑟球菌、脑膜炎奈瑟菌、荧光假单胞菌和鼠伤寒沙门氏菌的那些；和真核细胞，包括而不限于酵母菌株，例如来源于巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、毕赤酵母、粟酒裂殖酵母、酿酒酵母和解脂耶氏酵母的那些；昆虫细胞和来源于昆虫的细胞系，例如来源于自草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)和烟草天蛾(Manduca sexta)的那些；和哺乳动物细胞和来源于哺乳动物细胞的细胞系，例如来源于小鼠、大鼠、仓鼠、猪、牛、马、灵长类动物和人的那些。细胞系可以从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)、欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Cultures)和德国微生物与细胞培养物保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)获得。用于选择、制备和使用适当细胞系的特定方案的非限制性实例描述于例如INSECT CELL CULTURE ENGINEERING(Mattheus F.A.Goosen等人编，Marcel Dekker,1993)；INSECT CELL CULTURES:FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS(J.M.Vlak等人编，Kluwer Academic Publishers,1996)；Maureen A.Harrison和Ian F.Rae,GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE(Cambridge University Press,1997)；CELL AND TISSUE CULTURE:LABORATORYPROCEDURES(Alan Doyle等人编，John Wiley and Sons,1998)；R.Ian Freshney,CULTUREOF ANIMAL CELLS:A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE(Wiley-Liss,第四增刊，2000)；ANIMALCELL CULTURE:A PRACTICAL APPROACH(John R.W.Masters编，Oxford University Press,第三增刊，2000)；MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL，前述，(2001)；BASIC CELLCULTURE:A PRACTICAL APPROACH(John M.Davis,Oxford Press，第二增刊，2002)；和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，前述，(2004)。这些方案是本领域技术人员的技能范围内且自本文教示获得的常规工序。
细胞可以用于表达核酸，从而产生编码的多肽。因此，本发明的另一个方面是一种用于生产肉毒杆菌神经毒素蛋白的方法、一种分离的HC或者一种包含本文所述的修饰的HC的多肽。此类多肽通过在表达构建体的背景下培养其中具有编码多肽的核酸的宿主细胞而生产。在适于生产BoNT多肽的条件下执行培养。表达的多肽可以从培养物中回收，通过本领域已知的方法纯化并配制。表达的多肽也可以根据需要通过本领域已知的方法激活。一种激活表达的多肽的方法是通过蛋白酶裂解(或切口)成活性的双链形式。此类方法可以改编自本领域已知的方法，例如如Peter F.Bonventre和Lloyd L.Klempe(J.Bacteriol1960,79(1):23以及Michaeal L.Dekleva和Bibhuti R.DasGupta(Biochemical and BiophysicalResearch Communicaitons 1989,162:767-772)所公开。
药物组合物
本发明的另一个方面涉及一种包含本文所述的肉毒梭状芽孢杆菌神经毒素或嵌合分子的药物组合物。在一个实施方案中，本文所述的多肽是包含药学上可接受的载剂的组合物(在本文中称为药物组合物)中的活性成分。“药学上可接受的载剂”意指将靶向递送组合物混合和/或递送至受试者的任何药学上可接受的手段。本文所用的术语“药学上可接受的载剂”意指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料，其有助于维持或确立BoNT多肽以递送到受试者的形式。在与组合物的其他成分相容的意义上，每种载剂必须是“可接受的”，并且与对受试者如人的施用相容。此类组合物可以特别配制成通过多种途径中的一种或多种如本文所述的施用途径施用。补充的活性成分也可以并入组合物中。当将本文所述的药剂、制剂或药物组合物施用到受试者时，优选施用治疗有效量。如本文所用，术语“治疗有效量”是指引起病症改善或治愈的量。在一个实施方案中，配制药物组合物用于通过注射施用。在一个实施方案中，药物组合物包括封装在微球中的肉毒杆菌神经毒素。在一个实施方案中，药物组合物包含配制成经上皮递送的肉毒杆菌神经毒素。在一个实施方案中，药物组合物包含配制成缓慢释放的肉毒杆菌神经毒素。
在一个实施方案中，本发明的肉毒杆菌神经毒素、多肽或嵌合分子是以控释制剂的形式。此类组合物和施用方法在美国专利公开号2007/0020295中提供，其内容通过引用并入本文。
肉毒杆菌神经毒素可以通过在发酵罐中建立并生长肉毒梭状芽孢杆菌的培养物，然后根据已知工序收获并纯化发酵的混合物而获得。所有肉毒杆菌毒素血清型最初合成为无活性的单链蛋白，其必须被蛋白酶裂解或切口以变成神经活性的。制备肉毒杆菌毒素血清型A和G的细菌菌株具有内源性蛋白酶，因此血清型A和G可以主要以其活性形式从细菌培养物中回收。相反，肉毒杆菌毒素血清型C1，D和E由非蛋白水解菌株合成，因此当从培养物中回收时通常是未激活的。血清型B和F由蛋白水解菌株和非蛋白水解菌株生产，因此可以以活性形式或非活性形式回收。生产例如肉毒杆菌毒素B型血清型的蛋白水解菌株可能仅裂解生产的毒素的一部分。切口分子与无切口分子的确切比例取决于孵育的长度和培养物的温度。因此，一定比例的例如肉毒杆菌毒素B型毒素的制剂可能是无活性的。在一个实施方案中，本发明的神经毒素处于活性状态。在一个实施方案中，所述神经毒素处于无活性状态。在一个实施方案中，设想活性神经毒素和非活性神经毒素的组合。
药盒
本发明中还涵盖一种药盒，其包含本文公开的BoNT或多肽(例如，以药物组合物的形式)。所述药盒可以包含包装在小瓶中的本文所述的组合物中的一种或多种。所述药盒还可以包括用于组合物的治疗性施用的递送工具或装置和/或用于治疗性施用的说明书。所述药盒可以在其中具有包装到成形容器中的所有组分。
本发明的另一个方面涉及一种用于施用本文所述的药物组合物的递送工具或装置，其预先装有药物组合物(例如，用于单次使用)。此类装置可以是用于递送组合物的注射器或微针装置。所述注射器可以是预先装有有效量的组合物的一次性注射器。所述微针装置可以包括涂有本文所述的组合物的一个或多个微针，诸如美国专利公开2010/0196445中所述，其内容整体并入本文中。
治疗方法
本发明还包括用于治疗通常用神经毒素治疗的病症(例如，骨骼肌病症、平滑肌病症、腺体病症、神经肌肉病症、自主神经病症、疼痛或美学/美容病症)的方法。如由熟练的从业者所确定，此类病症与不需要的神经元活性相关。所述方法包括将治疗有效量的本文所述的BoNT或多肽/嵌合分子(例如，作为药物组合物)施用到哺乳动物中的适当位置以降低不需要的神经元活性，从而治疗所述病症的步骤。通过使有效量的组合物与表现出不需要的活性的神经元接触的途径施用。
设想通过本文讨论的方法治疗的特定病况包括而不限于痉挛性发声障碍、痉挛性斜颈、喉肌张力障碍、口下颌肌张力障碍、舌肌张力障碍、颈肌张力障碍、手局部肌张力障碍、眼睑痉挛、斜视、半面痉挛、眼睑病症、脑瘫、局部痉挛和其他语音障碍、痉挛性结肠炎、神经性膀胱(即，所有涉及尿失禁的疾病，例如神经源性逼尿肌过度活动或特发性膀胱过度活动症)、前列腺癌和其他癌症形式、肛门痉挛、肢体痉挛、抽搐、震颤、磨牙症、肛裂、贲门失弛缓症、吞咽困难和其他肌张力障碍及其他以肌肉群不自主运动为特征的病症、流泪、多汗症、过度流涎、胃肠道分泌物过多以及其他分泌性疾病、肌肉痉挛引起的疼痛、神经性疼痛、炎性疼痛、头痛如偏头痛、瘙痒(瘙痒症)、痤疮。此外，本发明可以用于治疗皮肤病学或美学/美容病症，例如减少眉毛沟、减少皮肤皱纹。本发明还可以用于治疗运动损伤。其他应用包括治疗诸如流涎和多汗症的病症。此外，需要BoNT/B作为替代毒素，用于治疗已经产生针对BoNT/A的中和抗体的患者。
此外，可以施用修饰的神经毒素以使用通常用肉毒杆菌A型执行的熟知技术治疗其他神经肌肉病症。例如，本发明可以用于治疗疼痛，例如头痛、由肌肉痉挛引起的疼痛和各种形式的炎性疼痛。例如，Aoki美国专利号5,721,215和Aoki美国专利号6,113,915公开使用A型肉毒杆菌毒素治疗疼痛的方法。这两个专利的公开内容通过引用整体并入本文。
自主神经系统病症也可以用修饰的神经毒素治疗。例如，腺体功能障碍是一种自主神经系统病症。腺体功能障碍包括过度出汗和过度流涎。呼吸功能障碍是自主神经系统病症的另一实例。呼吸功能障碍包括慢性阻塞性肺病和哮喘。Sanders等人在美国专利号5,766,605中公开使用天然存在的肉毒杆菌毒素治疗自主神经系统；例如治疗自主神经系统病症如过度出汗、过度流涎、哮喘等的方法。Sander等人的公开内容通过引用整体并入本文。在一个实施方案中，可以采用与Sanders等人的方法基本类似的方法，但是使用修饰的神经毒素，以治疗自主神经系统病症，诸如上面讨论的病症。例如，修饰的神经毒素可以以足以使自主神经系统的胆碱能神经元退化的量局部施用到哺乳动物的鼻腔，从而控制鼻腔中的粘液分泌。
可以通过修饰的神经毒素治疗的疼痛包括由肌肉张力或痉挛引起的疼痛或与肌肉痉挛无关的疼痛。例如，Binder在美国专利号5,714,468中公开由血管紊乱、肌张力、神经痛和神经病引起的头痛可以用天然存在的肉毒杆菌毒素如A型肉毒杆菌治疗。Binder的公开内容通过引用整体并入本文。在一个实施方案中，可以采用与Binder的方法基本类似的方法，但是使用修饰的神经毒素，以治疗头痛，特别是由血管紊乱、肌张力、神经痛和神经病引起的头痛。由肌肉痉挛引起的疼痛也可以通过施用修饰的神经毒素来治疗。例如，WO2006001676(Kang Ahn)公开使用肉毒杆菌神经毒素用于治疗由隐神经卡压引起的膝关节疼痛的方法，WO2008059126(Christine Favre等人)公开使用肉毒杆菌神经毒素用于治疗由化学疗法诱导的疼痛的方法，WO2008090287(Christine Favre等人)公开使用肉毒杆菌神经毒素用于治疗由抗HIV治疗诱导的疼痛的方法，WO2009130600(Christine Favre等人)公开使用肉毒杆菌神经毒素用于治疗与糖尿病性神经病相关的疼痛的方法，并且WO2007144493(Michel Auguet等人)公开使用肉毒杆菌神经毒素与阿片衍生物组合用于治疗疼痛的方法。WO2006001676、WO2008059126、WO2008090287、WO2009130600、WO2007144493的公开内容通过引用整体并入本文。此外，可以将修饰的神经毒素施用到哺乳动物以治疗与肌肉病症如痉挛无关的疼痛。在一个广泛的实施方案中，本发明治疗非痉挛相关疼痛的方法包括修饰的神经毒素的中枢施用或外周施用。
与肌肉痉挛无关的急性或慢性疼痛也可以通过将修饰的神经毒素局部外周施用到哺乳动物的实际或感知疼痛的位置来减轻。在一个实施方案中，修饰的神经毒素在疼痛位置处或其附近，例如在切口处或其附近皮下施用。在一些实施方案中，修饰的神经毒素在疼痛位置处或其附近，例如在哺乳动物的瘀伤位置处或附近肌内施用。在一些实施方案中，将修饰的神经毒素直接注射到哺乳动物的关节中，用于治疗或减轻由关节炎病症引起的疼痛。并且，将修饰的神经毒素频繁地重复注射或输注到外周疼痛位置也在本发明的范围内
此类方法的施用途径是本领域已知的，并且由熟练的从业者容易地调适成本文所述的方法(例如，参见例如Harrison's Principles of Internal Medicine(1998)，Anthony Fauci等人编，第14版，由McGraw Hill出版)。作为非限制性实例，神经肌肉病症的治疗可以包括向肌肉或肌肉群局部施用有效量的分子的步骤，自主神经病症的治疗可以包括向一种或多种腺体局部施用有效的分子的步骤，并且疼痛的治疗可以包括向疼痛部位施用有效量的分子的步骤。另外，疼痛的治疗可以包括向脊髓施用有效量的修饰的神经毒素的步骤。
还设想可以利用本文所述的修饰的B4 HC作为递送工具以靶向在人中表达人突触结合蛋白II的神经元和其他细胞类型。例如，共价或非共价连接到另一种生物活性分子(例如，治疗剂)从而形成本文所述的嵌合分子的修饰的HC可以用作靶向媒介物以将生物活性分子递送至通过与人Syt I和/或Syt II结合而表达人突触结合蛋白II的神经元和其他细胞类型。因此，本发明的另一个方面涉及本文所述的嵌合多肽分子用于将生物活性分子递送至人受试者中的神经元的用途。所述分子的第二部分可以是生物活性分子，诸如治疗剂(例如，多肽或药物)。所述分子的第一部分和第二部分的连接可以是共价的(例如，以融合蛋白的形式)或非共价的。此类连接的方法在本领域中是已知的，并且可以由熟练的从业者容易地应用。嵌合多肽分子将通过导致多肽与表达受体的神经元接触的途径施用，如本文所述，修饰的B-HC与所述神经元(靶神经元)结合。
鉴定受体结合活性
本发明的另一个方面涉及一种鉴定修饰的BoNT受体结合结构域的结合受体(例如人Syt I或人Syt II，或人SV2)的能力的方法。所述方法利用2-杂交测定系统，并利用由分别融合(表达为融合蛋白)到在2-杂交测定中使用的各自的“诱饵”和“猎物”亚基的受体和修饰的Hc制成的融合蛋白(例如，利用激活结构域和DNA结合结构域的Gal4转录激活系统)。2-杂交测定通常在酵母(酿酒酵母)中执行，但是已经开发了在其他单细胞生物体如大肠杆菌中使用的类似的测定系统。那些系统具有同等可比性。在一个实施方案中，使用细菌腺苷酸环化酶2-杂交测定(Karimova等人，Proc Natl Acad Sci U S A.1998年5月12日；95(10):5752-5756，其内容通过引用并入本文)。所述系统使用T18和T25作为诱饵和猎物，并且可以利用大肠杆菌BTH101细胞。
修饰的Hc在2-杂交测定的大肠杆菌中表达为与T18的融合蛋白(称为第一融合蛋白)。在所述方法中，受体(或其结合片段如h-Syt II a.a.1-87)在2-杂交测定的大肠杆菌中共表达为与T25的融合蛋白(称为第二融合蛋白)。所述测定通过它们各自的融合利用相应分子之间的相互作用的阳性指示。一种可能的阳性指示是显色。表达第一融合蛋白和第二融合蛋白的克隆大肠杆菌菌落在含有适当选择性和报告性的培养基(例如，氨苄青霉素、卡那霉素、X-gal和IPTG)的固体培养基上生长一段时间以允许自阳性菌落产生阳性指示(例如，颜色产生)。修饰的结合结构域与受体片段的结合将产生阳性指示(例如，LacZ基因的表达并导致在X-gal平板上生长的菌落中产生蓝色)。
当与适当的对照(阳性和阴性)比较时，分析菌落的此类阳性指示(例如，显色)。分析可以在视觉上或通过非人机器进行。使用不能生产明显的阳性指示(例如，LacZ表达)的适当阴性对照(例如，缺乏测定系统的关键组分的克隆菌落，诸如具有在没有融合的情况下表达的诱饵和猎物)。也可以使用适当的强阳性对照。在所述测定中对人Syt II受体的强阳性对照的一个实例是在E1191处具有取代突变(M/C/V或Q)的B1-Hc。也可以使用弱阳性对照来鉴定结合的强度。在所述测定中对人Syt II受体的弱阳性对照的一个实例是在W1178处具有取代突变(Q/Y/A或S)的B1-Hc。鉴定阳性指示(例如，显色)指示修饰的Hc结合受体。鉴定强阳性指示如强烈显色(例如，强于弱阳性对照)指示Hc以高亲和力结合受体。
所述测定中使用的修饰的Hc可以是本文公开的任何修饰的Hc。作为非限制性实例，修饰的Hc可以含有一个、两个或三个取代突变，诸如本文公开的那些。修饰的Hc可以是如本文公开的任何血清型/菌株或亚型。
这里和以下实施例中描述的实施方案仅用于说明目的，并且对本领域技术人员显而易见的各种修改或改变都包括在本发明的范围内。
除非本文另有定义，否则结合本申请使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。另外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。
应理解本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂等，且因此可变化。本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制本发明的范畴，所述范围仅由权利要求限定。
除了在操作实施例中之外或除非另外指出，本文所用的表示成分的量或反应条件的所有数字均应理解为在所有情况下都由术语“约”修饰。术语“约”在结合百分数用于描述本发明时意指±1％。
在一个方面，本发明涉及本文所述的组合物、方法和其各自的一种或多种组分，它们对于本发明是必需的，但仍然包括必需或并非必需的未指明元素(“包含”)。在一些实施方案中，包括在组合物、方法或其各自的组分的描述中的其他元素限于那些不会实质上影响本发明的一种或多种基本且新颖的特征的那些元素(“基本上由......组成”)。这同样适用于所述方法内的步骤以及其中的组合物和组分。在其他实施方案中，本文所述的发明、组合物、方法及其各自的组分旨在排除不被认为是组分、组合物或方法的必需元素(“由......组成”)的任何元素。
所有鉴定的专利、专利申请和出版物都通过引用明确地并入本文，用于描述和公开例如可以与本发明结合使用的此类出版物中描述的方法。这些出版物仅提供本申请的申请日之前的公开内容。就此而言，决不应解释为承认发明人因现有发明或任何其他原因而无权将此公开提前。所有关于日期的陈述或关于这些文件内容的说明均基于申请人可获得的信息，并且不应构成有关这些文件日期或内容的修正的任何许可。
通过以下实施例进一步说明本发明，不应当将以下实施例视为进一步的限制。
实施例
实施例1.增强BoNT/B与h-Syt II的结合的单突变的鉴定
已经解析出与大鼠Syt II结合的BoNT/B的共晶结构(19、20)。这为选择在BoNT/B-Syt II界面处总共19个残基进行诱变研究提供良好的基础(图2A，表5)。我们的策略是用所有20种可能的氨基酸使这19个位置中的每一个饱和，旨在鉴定所有增加与h-Syt II结合的单残基突变。为此，我们利用细菌腺苷酸环化酶双杂交方法(BACTH)(**33)。简而言之，将BoNT/B的HC(HCB)亚克隆到具有细菌腺苷酸环化酶的分裂片段(指定为T18)的载体中。该T18-HCB融合构建体通过PCR使用在所选位置带有随机三核苷酸(NNN)的引物扩增，产生编码在所选位点的所有20种可能氨基酸的构建体池(图2B)。然后将该构建体池与组成型表达含有与分裂的细菌腺苷酸环化酶的另一半(指定为T25)融合的毒素结合位点(残基1-87)的h-Syt II片段的构建体一起共转变成细菌(大肠杆菌菌株BTH101)。HCB与h-Syt II结合使T18和T25在一起并恢复腺苷酸环化酶的活性，其引起表达lacZ基因并在X-Gal平板上产生蓝色菌落(图2B)。
四个位置显示蓝色菌落E1191(菌落总数的22.7％)、W11178(菌落总数的7.8％)、Y1183(菌落总数的4.0％)和S1199(菌落总数的5.1％)(表6)。质粒从这些蓝色菌落中提取并测序，揭示每个位点处的突变E1191M/C/V/Q/L/Y、Y1183/C/P、S1199W/E/Y/H、W1178Y/Q/A/S(图2C)。这些突变通过测量细菌中β-半乳糖苷酶的水平进一步验证，其反映重构的腺苷酸环化酶活性。E1191位点处的4个突变E1191M/C/V/Q在所有突变之中显示最强的β-半乳糖苷酶活性(图2D)。我们用下拉分析进一步检查E1191处的突变。GST标记的野生型(WT)小鼠Syt II片段(m-Syt II，残基1-87)用作阳性对照。人Syt II片段通过将小鼠Syt II(1-87)中的F54突变为L产生，从而模拟人序列(指定为h-Syt II)。将GST标记的Syt II片段固定在珠粒上并用于下拉HCB。结合的HCB通过免疫印迹分析通过融合的HA标签检测。E1191M/C/V/Q产生与h-Syt II的显著结合水平(图2E)。E1191以及其他位点处的其他突变不会引起与h-Syt II的显著结合(图18)。确认先前在图18中显示的内容，图21还显示其他突变不会引起与h-Syt II的显著结合。总之，这些数据证实含有E1191M/C/V/Q突变的HCB获得改善的结合h-Syt II的能力。
实施例2.HCB中的组合突变进一步增强其与h-Syt II的结合
我们接下来探讨HCB(E1191M/C/V/Q)与h-Syt II的结合是否可以通过在不同位置包括二次突变而进一步增强。双重突变通过在1183、1199和1178位点组合E1191M与在BACTH筛选中鉴定的残基改变而产生(图2C)。在下拉分析中分析这10种双突变体结合h-Syt II的能力(图3A)。其中三种：E1191M/S1199W、E1191M/S1199Y和E1191M/W1178Q展示出与h-SytII的稳固结合，而将E1191M与Y1183C/P组合降低与h-Syt II的结合(图3A)。考虑到E1191在空间上接近Y1183(图2A)，这表明在突变E1191和Y1183两者时的潜在结构性冲突。
我们接下来产生在一次突变E1191M/C/V/Q与相容的二次突变S1199W/Y和W1178Q以及三重突变E1191M/S1199W/W1178Q之间的所有12种组合。所有12种突变体对于h-Syt II的结合亲和力(KD)使用生物层干涉测定(BLI)测量，其中参数列于表4中并且代表性迹线示于图19中。简而言之，将GST标记的Syt片段固定到探针上，然后将其暴露于不同浓度的纯化的HCB(缔合阶段，图3B)，然后是洗涤步骤(解离阶段，图3B)。WT HCB与m-Syt II的结合用作阳性对照，其显示KD为0.13μM(表4)。WT HCB与h-Syt II的结合太弱而不能可靠地确定超过检测极限，估计的KD>20μM(图3B，表4)。E1191M突变体产生6.7μM的与h-Syt II的结合KD。大多数双突变体进一步改善结合亲和力，KD值在0.59μM和4.3μM之间(图19，表4)。前两种双突变体，E1191M/S1199Y(KD＝0.72μM)和E1191V/S1199Y(KD＝0.59μM)，提供与E1191M突变体相比是一个数量级的亲和力(图3B，表4)。E1191Q/W1178Q双突变体是唯一一种不与h-Syt II结合的突变体。三重突变体E1191M/S1199W/W1178Q显示与双突变体E1191M/S1199W类似的结合亲和力，指示增加第三突变位点没有提供进一步的改善(表4)。
实施例3.HCB突变体显示增强的与h-Syt I的结合
接下来检查HCB突变体是否仍然与h-Syt I结合。图24描绘在本文所述的BoNT/B-结合界面处在Syt I和Syt II之间以及在人Syt I和小鼠Syt I之间的比较。WT HCB与Syt I的结合仅可以在下拉分析中在存在共受体神经节苷脂的情况下检测。这是因为与Syt II相比，Syt I对BoNT/B展示出更低的结合亲和力(15，28)。我们发现E1191M突变体和E1191M/S1199Y突变体在下拉分析中在不存在神经节苷脂的情况下都与h-Syt I结合(图3C)，表明这些突变体可能具有与h-Syt I的增强的结合。我们使用BLI测定测量我们的前两种突变体(E1191M/S1199Y和E1191V/S1199Y)对h-Syt I的结合亲和力。含有E1191M/S1199Y(HCBMY)或E1191V/S1199Y(HCBVY)的HCB分别展示2.9μM和5.82μM的KD。考虑到WT HCB与h-Syt I的结合太弱而无法可靠地确定(表4，图20)，HCB突变体不仅增强与h-Syt II的结合，而且还增强与h-Syt I的结合。因为与HCBVY相比，HCBMY对于Sy-I显示更高的结合亲和力且对Syt I和h-SytII两者显示出更低的解离常数，我们选择这种突变体进行进一步表征。
实施例4.HCBMY在神经元表面上与h-Syt II结合
接下来检查HCBMY突变体是否可以在生理学相关的神经元表面上与h-Syt II结合。为此，使用表达Syt I但不表达Syt II的培养的大鼠皮层神经元(13)。因此，Syt I的敲除(KD)产生没有内源性受体的神经元。在这些Syt I KD神经元中表达全长h-Syt II产生仅具有h-Syt II作为毒素受体的“人源化”神经元(18)。正如预期的那样，WT HCB与大鼠神经元强烈结合，并且在敲除内源性Syt I后结合被废除。表达全长m-Syt II，但不是全长h-SytII，也不是含有F54L突变的m-Syt II，恢复WT HCB的结合(图4A)。相反，HCBMY显示与表达m-Syt II、h-Syt II或m-Syt II(F54L)的神经元的稳固结合，证实HCBMY具有增强的结合在神经元表面上的h-Syt II的能力(图4B)。
实施例5.BoNT/B突变体展示出增强的阻断在人源化神经元中的神经传递的功效
为了解决增强的与h-Syt II的结合在神经元中在功能水平下是否转化成改善的功效的关键问题，全长WT BoNT/B和E1191M/S1199Y双突变体毒素(BoNT/BMY)在大肠杆菌中重组生产(图23)。将人源化神经元暴露于WT BoNT/B或BoNT/BMY毒素的梯度。VAMP2的裂解通过免疫印迹分析检查。如图5A中所示，在每种测试的毒素浓度下，与暴露于WT BoNT/B的神经元相比较，更多的VAMP2在暴露于BoNT/BMY的神经元中裂解，指示BoNT/BMY比WT毒素更有效地靶向并进入神经元。
接下来通过使用全细胞膜片钳记录来记录微型抑制性突触后电流(mIPSC)来监测神经递质释放。mIPSC的频率反映神经元群体中神经递质释放的活性。BoNT/B进入突触前末梢阻断神经递质的释放，从而降低mIPSC的频率(图5B)。将人源化神经元暴露于WT BoNT/B或BoNT/BMY的梯度。如图5C中所示，BoNT/BMY显示大大增强的效能，具有比WT毒素低约11倍的半最大抑制浓度(IC50)。这些数据证实增强的与人受体的结合引起毒素在神经元中在功能水平上的功效增加。
实施例6.BoNT/B4亚型含有Q1191/Y1199，但不与h-Syt II结合
最后，探讨是否存在可能影响与h-Syt II结合的BoNT/B亚型中的任何天然存在的序列变异。迄今已知BoNT/B有八种亚型(BoNT/B1-B8，其中BoNT/B1称为原型BoNT/B)，序列变异高达7％(34)。序列比对揭示在E1191和S1199两者处的变异(图6A)。有趣的是，存在E1191Q(BoNT/B4、BoNT/B8)和S1199Y(BoNT/B2、BoNT/B3、BoNT/B4、BoNT/B7)的情况。甚至是在B4中的E1191Q和S1199Y的组合-BoNT/B1中的这种双突变体产生与h-Syt II的稳固结合(表4)。但是，HCB4在下拉分析中不与h-Syt II结合(图6B)。这可能是由于HCB4自BoNT/B1的其他残基变化。在BoNT/B-Syt界面处的19个关键残基之中，在BoNT/B1和BoNT/B4之间存在四个不同的其他残基(图7)。实际上，将HCB4中的所有四个残基替换成BoNT/B1中的相应残基增加其与h-syt II的结合(图6C)。确认先前显示在图6C、图22中的内容还显示用BoNT/B1中的相应残基替换HCB4中的所有四个残基产生可以与h-Syt II结合的突变体HcB4。有趣的是，在缺乏神经节苷脂的情况下，HCB4显示与h-Syt I的稳固结合，表明所述亚型对Syt I的结合亲和力优于BoNT/B1(图6D)。
论述
通过将基于BoNT/B-Syt II复合物的可用共晶结构的合理设计与BACTH方法组合，所述BACTH方法使每个选定的靶残基上的所有可能的单点突变饱和，鉴定出改善与h-SytII的结合的BoNT/B1中的一系列点突变。这些点突变以不同的组合进一步检查，揭示双突变体对h-Syt II展示出高亲和力。此外，含有这些突变中的两个的全长BoNT/B1在人源化神经元上显示比WT BoNT/B1高约11倍的效能，证实增强的与毒素受体的结合在神经元中在功能水平下转化为更高的效能。
发现BoNT/B1的残基E1191是结合h-Syt I和h-Syt II两者的关键位置。所述残基位于BoNT/B·Syt II界面的外围，其中通过放置M/C/V/Q，可能的是这些残基可以与Syt II形成新/额外的键，以及移除潜在不利的负电荷，从而增强整体结合亲和力。除h-Syt II外，E1191M突变还增加与Syt I的结合亲和力。先前已显示E1191L增加BoNT/B与Syt I的结合(35)。本文还发现，用L或Y替换E1191显示增加的与h-Syt II的结合，但增加程度远低于M/C/V/Q。因此，这些结果表明1191位于调节BoNT/B和Syt I/II之间的结合亲和力的关键位置，而不破坏整体结合界面。
BACTH筛选鉴定BoNT/B中的其他突变，这些突变仅引起与h-Syt II的结合的轻微增加，它们包括W1178Y/Q/A/S、Y1183C/P和S1199W/E/Y/H。先前报道S1199Y增加BoNT/B与Syt II的结合，这可能是由于在S1199Y和Synt II的F47之间的π-堆积作用(19)。有趣的是，BoNT/B亚型的序列分析揭示这些位点中的一些的残基变异。例如，1199位点可以是S、Y或H，且1191位点可以是E、K或Q。预期此类残基变化会改变对Syt I或Syt II的结合亲和力。例如，BoNT/B4与h-Syt I的结合比BoNT/B1更强，可能是因为它在1191位点含有Q且在1199位点含有Y。看起来大自然已经对于在我们的BACTH筛选中鉴定的这两个关键位置改变毒素-受体相互作用的能力对一系列残基进行取样。随着揭示出越来越多的亚型毒素，毒素的HC结构域中的天然存在的序列变异为挖掘可能调节毒素-受体相互作用的残基提供丰富的资源。
BoNT/DC和BoNT/G识别与BoNT/B相同的在Syt I/II上的表面残基，并且两者均显示减弱的与h-Syt II的结合(18)。已经解析出与Syt I/II复合的BoNT/DC的共晶结构(36)；因此，靶向结合界面中的关键残基的类似方法可以鉴定BoNT/DC中增加其对h-Syt II的亲和力的特定突变。
值得注意的是，已知人类对BoNT/D的敏感性较低，这是由于在人VAMP1底物中从小鼠中的M48(小鼠VAMP1序列号)到人类中在人类中I48的单残基变化。在所述位置具有残基I的情况下，BoNT/D显示显著降低的裂解效率(37-39)。考虑到BoNT/DC与BoNT/D共有相同的蛋白酶结构域，人类对BoNT/DC的敏感性较低，这是由于其受体中的单残基变化和其底物中的单残基变化。虽然不能排除这两种变化是随机事件的可能性，但可能的是BoNT可能是人类进化的一种选择性力量(37)。
BoNT的医学用途是将致命毒素转化为有效治疗剂的一个显著实例。随着医疗应用的迅速扩展，越来越多地关注工程BoNT，以改善其治疗功效并减少其不良反应(40-44)。先前的研究显示，用BoNT/B的HC替换BoNT/A的HC产生在小鼠组织中具有增加的效能的嵌合BoNT/AB(45、46)。这些发现表明可以利用HCB产生潜在地进一步改善BoNT/A在人类中的效能的嵌合BoNT/AB的可能性。因此，这里鉴定的BoNT/B突变体允许发展具有在人类中具有改善的功效的新一代治疗性毒素。此外，这类修饰的BoNT/B及其HC也将是用于靶向人类神经元的有价值的科学工具和递送媒介物。
材料和方法
材料和构建体。
以下抗体购自指示的供应商：Synapsin I(克隆46.1，Synaptic Systems)、VAMP2(克隆69.1，Synaptic Systems)、HA(16B12，Covance)和β-微管蛋白III(ab18207，Abcam)。牛混合脑神经节苷脂购自Matreya LLC(Pleasant Gap,PA)并如前所述在Tris缓冲盐水(TBS：20mM Tris，150mM NaCl)中重构(14)。编码HCB(残基857-1291，Genbank：ACA46990.1)和HCB4(Genbank：EF051570)的cDNA经过密码子优化以便大肠杆菌表达并由GenscriptInc.(New Brunswick,NJ)合成。以下cDNA通过指示的组慷慨地提供：大鼠Syt I(T.C.Sudhof,Palo Alto,CA)、小鼠Syt II(M.Fukuda,Ibaraki,Japan)、人Syt I(R.B.Sutton,Lubbock,TX)。编码HCB的DNA亚克隆到pET28a载体中，其中His6标签(SEQ IDNO:1)和HA标签(YPYDVPDYA)(SEQ ID NO:2)都与其N-末端融合。HCB中的突变使用定点诱变药盒(Agilent Technologies,CA)通过PCR产生。先前描述GST标记的Syt I/II片段和SytII F54L突变体(15、18、23)。
生产和激活全长BoNT/B和BoNT/BMY 。
编码全长无活性BoNT/BR370A、Y373F(登录号B1INP5)的cDNA经密码子优化以在大肠杆菌中表达。其通过NdeI/BamHI克隆到pET32a中，以将六组氨酸亲和标签(SEQ ID NO:1)添加到C-末端。构建体通过标准定点诱变(Agilent)恢复回到其活性WT形式。引入E1191M/S1199Y突变以生产BoNT/BMY双突变体。构建体转化为大肠杆菌(菌株BL21 DE3)，在mTB+100μg/mL氨苄青霉素中生长，并用1mM IPTG在16℃下诱导20小时。收获细菌并通过每克团块在50mL Tris pH 8中的5mL 0.5M NaCl和0.5μL全能核酸酶(Benzonase)中超声处理裂解。通过以4000×g离心1小时使粗裂解物澄清，并在HisTrap HP柱(GE)上捕获BoNT/B，并通过FPLC(Ge)用在50mM Tris pH 8中的0.5M NaCl中的0.1M咪唑洗脱。使用HiPrep 26/10脱盐柱(GE)使洗脱液脱盐到50mM Tris pH 8中的125mM NaCl中，然后使用10kDa MWCO旋转过滤器浓缩至0.6mg/mL。将浓缩物用0.1μg/mL内蛋白酶Lys-C在37℃下处理2小时，然后调节至1M(NH)4)2SO4，然后通过疏水相互作用色谱法用苯基琼脂糖凝胶HP(GE)进行最终纯化。用在50mM Tris pH 8中的1M至0M(NH4)2SO4线性梯度洗脱蛋白质。将含有双链BoNT/B的级分汇集，脱盐，浓缩，并在-80℃下储存。
BACTH(细菌腺苷酸环化酶双杂交测定)。
根据制造商的说明书(Euromedex)执行BACTH测定。选择两种相容的质粒pUT18C和pKT25用于筛选。将H-Syt II腔结构域(残基1-80)克隆到pKT25中以产生pKT25-h-Syt II。将HCB克隆到pUT18C中以生产T18-HCB。HCB突变体文库用在指定位置含有随机核苷酸三联体(NNN)的引物产生。每个文库通过电穿孔用pKT25-h-Syt II质粒共转化到大肠杆菌指示菌株BTH101中并含有100μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml卡那霉素、0.5mM IPTG和40μg/ml X-Gal的LB琼脂平板上筛选。将平板在30℃下孵育64小时。从蓝色菌落中提取质粒并测序。总菌落数确定覆盖所选突变位点处的所有20个氨基酸的可能性。这通过Clark-Carbon方程：P＝1-(1-f)N计算，其中f反映可能残基的数量(这里f＝1/20，因为有20种不同的氨基酸)，并且N是总菌落数。在我们的测定中，使用最少数量的380个菌落，覆盖在每个位置处的所有20个氨基酸的概率>99.8％。
β-半乳糖苷酶活性测定。
测定如前所述执行(47)。简单地说，将具有关注的质粒的大肠杆菌BTH101细胞接种到含有抗生素和IPTG(0.5mM)的LB培养基中。培养物在37℃下生长过夜以达到稳定期。在收获前记录培养物的OD600。离心培养物，且将细胞团块用PBS洗涤两次，并在Z缓冲液(60mMNa2HPO4、40mM Na2HPO4、10mM KCl、1mM MgSO4和20mM DTT)中重悬浮。然后，添加1:10(v/v)氯仿和1:20(v/v)0.1％SDS并充分混合以使细胞透过。然后将混合物与邻硝基苯基-p-半乳糖苷(4mg/ml，在Z缓冲液中)以5:1比率混合，并在28℃下孵育10分钟。反应通过添加80μl的1M Na2CO3停止。β-半乳糖苷酶活性计算为A420/OD600。
GST下拉测定。
进行两种类型的下拉测定。第一系列用于快速筛选突变体HCB与GST标记的m-SytII(残基1-87)和模拟人Syt II(指定为h-Syt II)的突变体m-Syt II(F54L)的结合。简而言之，将6ml的表达HCB的大肠杆菌旋转减慢，在800μl TBS中重悬浮，超声处理，然后在4℃下用2％ Triton X-100孵育1小时。然后将样品在微量离心机中在4℃下旋转减慢15分钟。收集上清液，且通过用固定在谷胱甘肽-琼脂糖珠(GE bioscience，Piscataway，NJ)上的10μg的GST-Syt蛋白在4℃下孵育1小时而用于下拉测定。将样品在洗涤缓冲液(具有0.5％Triton X-100的TBS)中洗涤三次，并使用抗HA抗体通过免疫印迹分析进行分析。对于显示增强的与h-Syt II的结合的突变体，通过纯化这些HCB突变体作为His6标记的蛋白质(“His6”公开为SEQ ID NO:1)进行进一步的表征下拉测定然后使用纯化的HCB(100nM)和固定的GST-Syt II在100μl TBS缓冲液加0.5％ Triton X-100中在有或没有神经节苷脂(60μg/ml)的情况下在4℃下进行1小时。使用TBS缓冲液加0.5％Triton X-100洗涤珠粒三次。在免疫印迹分析后，对10％的结合材料进行SDS-PAGE。
生物层干涉测定。
HCB变体和Syt I/Syt II之间的结合亲和力用Blitz系统(ForteBio)通过BLI测定测量。简而言之，将GST标记的Syt I或Syt II(20μg/ml)固定到Dip和ReadTM抗GST生物传感器(ForteBio)上并用PBS缓冲液平衡。然后将生物传感器暴露于系列浓度的HCB，然后用PBS洗涤。结合亲和力(KD)使用Blitz系统软件按照制造商的说明书(ForteBio)计算。
神经元培养物、慢病毒和毒素结合/进入测定。
如前所述，由E18-19胚胎制备大鼠皮层神经元(14)。先前描述神经元中用于Syt IKD、m-Syt II和h-Syt II表达的构建体(18)。在DIV5(体外天数)将慢病毒添加到神经元培养物中，并在DIV12-14进行毒素结合/进入实验。毒素在高K+缓冲液(87mM NaCl、56mM Kcl、1.5mM KH2PO4、8mM Na2HPO4、0.5mM MgCl2和1mM CaCl)中稀释并预热至37℃。将神经元在37℃下暴露于上述含有毒素的缓冲液5分钟，然后用PBS洗涤。对这些神经元进行免疫染色分析，或在无毒的培养基中再孵育24小时，然后进行免疫印迹分析。
mIPSC记录。
全细胞膜片钳记录由DIV 14-18培养的皮层神经元得到(DIV 14-18)。移液管溶液含有(以mM计)：135CsCl，10HEPES，1EGTA，1Na-GTP，4Mg-ATP和10QX-314(pH 7.4，用CsOH调节)。填充有细胞内溶液的移液管的电阻在4MΩ到5MΩ之间变化。在形成全细胞构造和平衡细胞内移液管溶液之后，将串联电阻调节至10MΩ。用EPC-10/2放大器(HEKA)在-70mV保持电位下监测突触电流。浴溶液含有(以mM计)：140NaCl，5KCl，2CaCl，1MgCl2，10HEPES，10葡萄糖(pH 7.4，用NaOH调节)。通过将AMPA和NMDA受体阻断剂CNQX和APV添加至细胞外浴液，药理学抑制自发的抑制性突触后电流(sIPSC)和诱发的抑制性突触后电流(eIPSC)。在河豚毒素(TTX)存在下监测自发的微型抑制性突触后电流(mIPSC)以阻断动作电位。数据使用Clampfit 10(Molecular Devices)、Origin8软件(Mocrocal Inc.)、MiniAnalysis软件(Synaptosoft)和Igor(Wavemetrics)分析。统计学分析用学生t-检验执行(*P<0.01)。显示的所有数据均为平均值±S.E.M.。
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表4：通过BLI测量的在GST-Syt II/Syt I和HCB之间的相互作用。
表5：基于与Syt II复合的BoNT/B的可用共晶结构选择的形成Syt I/II的结合口袋的在BoNT/B中的19个关键残基的列表(19、20)。
表6：来自BACTH筛选的在每个诱变位点处的菌落数的汇总。
序列表
<110> PRESIDENT AND FELLOWS OF HARVARD COLLEGE
<120> 工程化肉毒杆菌神经毒素
<130> 0342941-0602
<140>
<141>
<150> 62/378,967
<151> 2016-08-24
<160> 29
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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<400> 1
His His His His His His
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /note = “人工序列的描述：合成肽”
<400> 2
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 3
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<212> PRT
<213> 鼠属
<400> 3
Gly Glu Gly Lys Glu Asp Ala Phe Ser Lys Leu Lys Gln Lys Phe Met
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Asn Glu Leu His Lys Ile
20
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<212> PRT
<213> 智人
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Gly Glu Gly Lys Glu Asp Ala Phe Ser Lys Leu Lys Glu Lys Phe Met
1 5 10 15
Asn Glu Leu His Lys Ile
20
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<211> 22
<212> PRT
<213> 鼠属
<400> 5
Gly Glu Ser Gln Glu Asp Met Phe Ala Lys Leu Lys Glu Lys Phe Phe
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20
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<211> 22
<212> PRT
<213> 智人
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Gly Glu Ser Gln Glu Asp Met Phe Ala Lys Leu Lys Glu Lys Leu Phe
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20
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<212> PRT
<213> 鼠属
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<211> 14
<212> PRT
<213> 鼠属
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<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌
<400> 9
Lys Tyr Phe Lys Lys Glu Glu Glu Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Ser
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20 25
<210> 10
<211> 26
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌
<400> 10
Lys Asp Phe Lys Glu Glu Glu Lys Lys Leu Phe Leu Ala Asn Ile Tyr
1 5 10 15
Asp Ser Asn Glu Phe Tyr Lys Thr Ile Gln
20 25
<210> 11
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<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌
<400> 11
Lys Asp Phe Lys Lys Lys Glu Glu Lys Leu Phe Leu Ala Asn Ile Tyr
1 5 10 15
Asp Ser Asn Glu Phe Tyr Asn Thr Ile Gln
20 25
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<211> 26
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌
<400> 12
Lys Asn Phe Lys Glu Gln Glu Gln Lys Leu Phe Leu Ser Ile Ile Tyr
1 5 10 15
Asp Ser Asn Glu Phe Tyr Lys Thr Ile Gln
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<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌
<400> 13
Lys Tyr Phe Lys Lys Glu Glu Glu Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Ser
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌
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Lys Asn Phe Lys Lys Lys Glu Glu Lys Leu Phe Leu Ala Pro Ile Ser
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Asp Ser Asp Glu Phe Tyr Asn Thr Ile Gln
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<210> 15
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<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌
<400> 15
Lys Asn Phe Lys Gly Gln Glu Glu Lys Leu Phe Leu Ala Asn Ile Tyr
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Asp Ser Asn Glu Phe Tyr Lys Thr Ile Gln
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<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌
<400> 16
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<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌
<400> 17
Ser Glu Ile Leu Asn Asn Ile Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Lys Asp Asn
1 5 10 15
Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly Tyr Gly Ala Lys Val Glu Val Tyr Asp
20 25 30
Gly Val Glu Leu Asn Asp Lys Asn Gln Phe Lys Leu Thr Ser Ser Ala
35 40 45
Asn Ser Lys Ile Arg Val Thr Gln Asn Gln Asn Ile Ile Phe Asn Ser
50 55 60
Val Phe Leu Asp Phe Ser Val Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr
65 70 75 80
Lys Asn Asp Gly Ile Gln Asn Tyr Ile His Asn Glu Tyr Thr Ile Ile
85 90 95
Asn Cys Met Lys Asn Asn Ser Gly Trp Lys Ile Ser Ile Arg Gly Asn
100 105 110
Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile Asp Ile Asn Gly Lys Thr Lys Ser Val
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Phe Phe Glu Tyr Asn Ile Arg Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Ile Asn Arg
130 135 140
Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Leu Asn Asn Ala Lys Ile Tyr
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Ile Asn Gly Lys Leu Glu Ser Asn Thr Asp Ile Lys Asp Ile Arg Glu
165 170 175
Val Ile Ala Asn Gly Glu Ile Ile Phe Lys Leu Asp Gly Asp Ile Asp
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Arg Thr Gln Phe Ile Trp Met Lys Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr Glu
195 200 205
Leu Ser Gln Ser Asn Ile Glu Glu Arg Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr Ser
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Glu Tyr Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys Glu
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Tyr Tyr Met Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Lys
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Lys Asp Ser Pro Val Gly Glu Ile Leu Thr Arg Ser Lys Tyr Asn Gln
260 265 270
Asn Ser Lys Tyr Ile Asn Tyr Arg Asp Leu Tyr Ile Gly Glu Lys Phe
275 280 285
Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp Asp Ile Val
290 295 300
Arg Lys Glu Asp Tyr Ile Tyr Leu Asp Phe Phe Asn Leu Asn Gln Glu
305 310 315 320
Trp Arg Val Tyr Thr Tyr Lys Tyr Phe Lys Lys Glu Glu Glu Lys Leu
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Phe Leu Ala Pro Ile Ser Asp Ser Asp Glu Phe Tyr Asn Thr Ile Gln
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Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr Tyr Ser Cys Gln Leu Leu Phe
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Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp Glu Ile Gly Leu Ile Gly Ile His
370 375 380
Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Ile Val Phe Glu Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe
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Cys Ile Ser Lys Trp Tyr Leu Lys Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Asn
405 410 415
Leu Lys Leu Gly Cys Asn Trp Gln Phe Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp
420 425 430
Thr Glu
<210> 18
<211> 434
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌
<400> 18
Ser Glu Ile Leu Asn Asn Ile Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Arg Asp Asn
1 5 10 15
Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly Tyr Gly Ala Lys Val Glu Val Tyr Asp
20 25 30
Gly Val Lys Leu Asn Asp Lys Asn Gln Phe Lys Leu Thr Ser Ser Ala
35 40 45
Asp Ser Lys Ile Arg Val Thr Gln Asn Gln Asn Ile Ile Phe Asn Ser
50 55 60
Met Phe Leu Asp Phe Ser Val Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr
65 70 75 80
Arg Asn Asp Asp Ile Gln Asn Tyr Ile His Asn Glu Tyr Thr Ile Ile
85 90 95
Asn Cys Met Lys Asn Asn Ser Gly Trp Lys Ile Ser Ile Arg Gly Asn
100 105 110
Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile Asp Ile Asn Gly Lys Thr Lys Ser Val
115 120 125
Phe Phe Glu Tyr Asn Ile Arg Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Ile Asn Arg
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Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Leu Asp Asn Ala Lys Ile Tyr
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Ile Asn Gly Thr Leu Glu Ser Asn Met Asp Ile Lys Asp Ile Gly Glu
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Val Ile Val Asn Gly Glu Ile Thr Phe Lys Leu Asp Gly Asp Val Asp
180 185 190
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195 200 205
Leu Asn Gln Ser Asn Ile Lys Glu Ile Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr Ser
210 215 220
Glu Tyr Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys Glu
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Tyr Tyr Met Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Val
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Lys Asp Ser Ser Val Gly Glu Ile Leu Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Gln
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Asn Ser Asn Tyr Ile Asn Tyr Arg Asn Leu Tyr Ile Gly Glu Lys Phe
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Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp Asp Ile Val
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Arg Lys Glu Asp Tyr Ile His Leu Asp Phe Val Asn Ser Asn Glu Glu
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Cys Ile Ser Lys Trp Tyr Leu Lys Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Lys
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<213> 肉毒梭状芽孢杆菌
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Asn Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly Tyr Gly Ala Lys Val Glu Val Tyr
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Gln Asn Ser Lys Tyr Ile Asn Tyr Arg Asp Leu Tyr Ile Gly Glu Lys
275 280 285
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325 330 335
Leu Phe Leu Ala Pro Ile Ser Asp Ser Asp Glu Phe Tyr Asn Thr Ile
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355 360 365
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370 375 380
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435
<210> 20
<211> 1308
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /note = “人工序列的描述：合成多肽”
<400> 20
aacagcgaaa tcctgaacaa cattattctg aacctgcgct ataaagataa caacctgatt 60
gatctgagcg gctatggcgc gaaagtggaa gtgtatgatg gcgtggaact gaacgataaa 120
aaccagttca aactgaccag ctctgcgaac agcaaaattc gtgtgaccca gaaccagaac 180
attatcttca acagcgtgtt tctggatttt agcgtgagct tttggattcg catcccgaaa 240
tataaaaacg atggcatcca gaactatatc cacaacgaat acaccattat caactgcatg 300
aaaaacaaca gcggctggaa aattagcatt cgtggcaacc gtattatttg gaccctgatc 360
gatattaacg gcaaaaccaa aagcgtgttc ttcgaataca acatccgcga agatatcagc 420
gaatacatta accgctggtt ctttgtgacc attaccaaca acctgaacaa cgcgaaaatt 480
tatatcaacg gtaaactgga aagcaacacc gatatcaaag atatccgcga agtgattgcg 540
aacggcgaaa tcatctttaa actggatggc gatattgatc gtacccagtt catctggatg 600
aaatacttca gcatcttcaa caccgaactg agccagagca acattgaaga acgctacaaa 660
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gagtattaca tgttcaacgc gggtaacaaa aacagctata tcaaactgaa aaaagatagc 780
ccggtgggcg aaattctgac ccgtagcaaa tataaccaga acagcaaata catcaactat 840
cgcgatctgt atatcggcga aaaatttatc attcgccgca aaagcaacag ccagagcatt 900
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ccgacctata gctgccagct gctgtttaaa aaagatgaag aaagcaccga tgaaattggc 1140
ctgattggca tccatcgttt ctatgaaagc ggcatcgtgt tcgaagaata taaagattat 1200
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ggctgcaact ggcagtttat tccgaaagat gaaggctgga ccgaataa 1308
<210> 21
<211> 1296
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌
<400> 21
Met Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly
1 5 10 15
Val Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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130 135 140
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Gly Ser Pro Phe Met Gly Asp Ser Ser Thr Pro Glu Asp Thr Phe Asp
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Phe Thr Arg His Thr Thr Asn Ile Ala Val Glu Lys Phe Glu Asn Gly
130 135 140
Ser Trp Lys Val Thr Asn Ile Ile Thr Pro Ser Val Leu Ile Phe Gly
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Pro Leu Pro Asn Ile Leu Asp Tyr Thr Ala Ser Leu Thr Leu Gln Gly
165 170 175
Gln Gln Ser Asn Pro Ser Phe Glu Gly Phe Gly Thr Leu Ser Ile Leu
180 185 190
Lys Val Ala Pro Glu Phe Leu Leu Thr Phe Ser Asp Val Thr Ser Asn
195 200 205
Gln Ser Ser Ala Val Leu Gly Lys Ser Ile Phe Cys Met Asp Pro Val
210 215 220
Ile Ala Leu Met His Glu Leu Thr His Ser Leu His Gln Leu Tyr Gly
225 230 235 240
Ile Asn Ile Pro Ser Asp Lys Arg Ile Arg Pro Gln Val Ser Glu Gly
245 250 255
Phe Phe Ser Gln Asp Gly Pro Asn Val Gln Phe Glu Glu Leu Tyr Thr
260 265 270
Phe Gly Gly Leu Asp Val Glu Ile Ile Pro Gln Ile Glu Arg Ser Gln
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Asn Asn Ile Asn Lys Thr Ile Pro Ser Ser Trp Ile Ser Asn Ile Asp
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Lys Tyr Lys Lys Ile Phe Ser Glu Lys Tyr Asn Phe Asp Lys Asp Asn
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Thr Gly Asn Phe Val Val Asn Ile Asp Lys Phe Asn Ser Leu Tyr Ser
340 345 350
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355 360 365
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Thr Cys Ile Lys Val Lys Asn Asn Arg Leu Pro Tyr Val Ala Asp Lys
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Thr Asn Val Gln Asn Tyr Ser Asp Lys Phe Ser Leu Asp Glu Ser Ile
485 490 495
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
Phe Leu Pro Ser Leu Ala Glu Lys Val Asn Lys Gly Val Gln Ala Gly
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595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
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<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌
<400> 25
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885 890 895
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915 920 925
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1235 1240 1245
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<210> 26
<211> 1274
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌
<400> 26
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355 360 365
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1160 1165 1170
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1190 1195 1200
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1205 1210 1215
Asn Cys Thr Met Asn Phe Gln Asn Asn Asn Gly Ser Asn Ile Gly
1220 1225 1230
Leu Leu Gly Phe His Ser Asn Asn Leu Val Ala Ser Ser Trp Tyr
1235 1240 1245
Tyr Asn Asn Ile Arg Arg Asn Thr Ser Ser Asn Gly Cys Phe Trp
1250 1255 1260
Ser Ser Ile Ser Lys Glu Asn Gly Trp Lys Glu
1265 1270
<210> 27
<211> 1297
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌
<400> 27
Met Pro Val Asn Ile Lys Asn Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Asn Asn
1 5 10 15
Asp Asp Ile Ile Met Met Glu Pro Phe Asn Asp Pro Gly Pro Gly Thr
20 25 30
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Phe Ala Ala Asn Val Ala Asn Val Ser Ile Asn Lys Lys Ile Ile Gln
130 135 140
Pro Gly Ala Glu Asp Gln Ile Lys Gly Leu Met Thr Asn Leu Ile Ile
145 150 155 160
Phe Gly Pro Gly Pro Val Leu Ser Asp Asn Phe Thr Asp Ser Met Ile
165 170 175
Met Asn Gly His Ser Pro Ile Ser Glu Gly Phe Gly Ala Arg Met Met
180 185 190
Ile Arg Phe Cys Pro Ser Cys Leu Asn Val Phe Asn Asn Val Gln Glu
195 200 205
Asn Lys Asp Thr Ser Ile Phe Ser Arg Arg Ala Tyr Phe Ala Asp Pro
210 215 220
Ala Leu Thr Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly Leu Tyr
225 230 235 240
Gly Ile Lys Ile Ser Asn Leu Pro Ile Thr Pro Asn Thr Lys Glu Phe
245 250 255
Phe Met Gln His Ser Asp Pro Val Gln Ala Glu Glu Leu Tyr Thr Phe
260 265 270
Gly Gly His Asp Pro Ser Val Ile Ser Pro Ser Thr Asp Met Asn Ile
275 280 285
Tyr Asn Lys Ala Leu Gln Asn Phe Gln Asp Ile Ala Asn Arg Leu Asn
290 295 300
Ile Val Ser Ser Ala Gln Gly Ser Gly Ile Asp Ile Ser Leu Tyr Lys
305 310 315 320
Gln Ile Tyr Lys Asn Lys Tyr Asp Phe Val Glu Asp Pro Asn Gly Lys
325 330 335
Tyr Ser Val Asp Lys Asp Lys Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Ala Leu Met
340 345 350
Phe Gly Phe Thr Glu Thr Asn Leu Ala Gly Glu Tyr Gly Ile Lys Thr
355 360 365
Arg Tyr Ser Tyr Phe Ser Glu Tyr Leu Pro Pro Ile Lys Thr Glu Lys
370 375 380
Leu Leu Asp Asn Thr Ile Tyr Thr Gln Asn Glu Gly Phe Asn Ile Ala
385 390 395 400
Ser Lys Asn Leu Lys Thr Glu Phe Asn Gly Gln Asn Lys Ala Val Asn
405 410 415
Lys Glu Ala Tyr Glu Glu Ile Ser Leu Glu His Leu Val Ile Tyr Arg
420 425 430
Ile Ala Met Cys Lys Pro Val Met Tyr Lys Asn Thr Gly Lys Ser Glu
435 440 445
Gln Cys Ile Ile Val Asn Asn Glu Asp Leu Phe Phe Ile Ala Asn Lys
450 455 460
Asp Ser Phe Ser Lys Asp Leu Ala Lys Ala Glu Thr Ile Ala Tyr Asn
465 470 475 480
Thr Gln Asn Asn Thr Ile Glu Asn Asn Phe Ser Ile Asp Gln Leu Ile
485 490 495
Leu Asp Asn Asp Leu Ser Ser Gly Ile Asp Leu Pro Asn Glu Asn Thr
500 505 510
Glu Pro Phe Thr Asn Phe Asp Asp Ile Asp Ile Pro Val Tyr Ile Lys
515 520 525
Gln Ser Ala Leu Lys Lys Ile Phe Val Asp Gly Asp Ser Leu Phe Glu
530 535 540
Tyr Leu His Ala Gln Thr Phe Pro Ser Asn Ile Glu Asn Leu Gln Leu
545 550 555 560
Thr Asn Ser Leu Asn Asp Ala Leu Arg Asn Asn Asn Lys Val Tyr Thr
565 570 575
Phe Phe Ser Thr Asn Leu Val Glu Lys Ala Asn Thr Val Val Gly Ala
580 585 590
Ser Leu Phe Val Asn Trp Val Lys Gly Val Ile Asp Asp Phe Thr Ser
595 600 605
Glu Ser Thr Gln Lys Ser Thr Ile Asp Lys Val Ser Asp Val Ser Ile
610 615 620
Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Val Gly Asn Glu Thr Ala
625 630 635 640
Lys Glu Asn Phe Lys Asn Ala Phe Glu Ile Gly Gly Ala Ala Ile Leu
645 650 655
Met Glu Phe Ile Pro Glu Leu Ile Val Pro Ile Val Gly Phe Phe Thr
660 665 670
Leu Glu Ser Tyr Val Gly Asn Lys Gly His Ile Ile Met Thr Ile Ser
675 680 685
Asn Ala Leu Lys Lys Arg Asp Gln Lys Trp Thr Asp Met Tyr Gly Leu
690 695 700
Ile Val Ser Gln Trp Leu Ser Thr Val Asn Thr Gln Phe Tyr Thr Ile
705 710 715 720
Lys Glu Arg Met Tyr Asn Ala Leu Asn Asn Gln Ser Gln Ala Ile Glu
725 730 735
Lys Ile Ile Glu Asp Gln Tyr Asn Arg Tyr Ser Glu Glu Asp Lys Met
740 745 750
Asn Ile Asn Ile Asp Phe Asn Asp Ile Asp Phe Lys Leu Asn Gln Ser
755 760 765
Ile Asn Leu Ala Ile Asn Asn Ile Asp Asp Phe Ile Asn Gln Cys Ser
770 775 780
Ile Ser Tyr Leu Met Asn Arg Met Ile Pro Leu Ala Val Lys Lys Leu
785 790 795 800
Lys Asp Phe Asp Asp Asn Leu Lys Arg Asp Leu Leu Glu Tyr Ile Asp
805 810 815
Thr Asn Glu Leu Tyr Leu Leu Asp Glu Val Asn Ile Leu Lys Ser Lys
820 825 830
Val Asn Arg His Leu Lys Asp Ser Ile Pro Phe Asp Leu Ser Leu Tyr
835 840 845
Thr Lys Asp Thr Ile Leu Ile Gln Val Phe Asn Asn Tyr Ile Ser Asn
850 855 860
Ile Ser Ser Asn Ala Ile Leu Ser Leu Ser Tyr Arg Gly Gly Arg Leu
865 870 875 880
Ile Asp Ser Ser Gly Tyr Gly Ala Thr Met Asn Val Gly Ser Asp Val
885 890 895
Ile Phe Asn Asp Ile Gly Asn Gly Gln Phe Lys Leu Asn Asn Ser Glu
900 905 910
Asn Ser Asn Ile Thr Ala His Gln Ser Lys Phe Val Val Tyr Asp Ser
915 920 925
Met Phe Asp Asn Phe Ser Ile Asn Phe Trp Val Arg Thr Pro Lys Tyr
930 935 940
Asn Asn Asn Asp Ile Gln Thr Tyr Leu Gln Asn Glu Tyr Thr Ile Ile
945 950 955 960
Ser Cys Ile Lys Asn Asp Ser Gly Trp Lys Val Ser Ile Lys Gly Asn
965 970 975
Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile Asp Val Asn Ala Lys Ser Lys Ser Ile
980 985 990
Phe Phe Glu Tyr Ser Ile Lys Asp Asn Ile Ser Asp Tyr Ile Asn Lys
995 1000 1005
Trp Phe Ser Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg Leu Gly Asn Ala Asn
1010 1015 1020
Ile Tyr Ile Asn Gly Ser Leu Lys Lys Ser Glu Lys Ile Leu Asn
1025 1030 1035
Leu Asp Arg Ile Asn Ser Ser Asn Asp Ile Asp Phe Lys Leu Ile
1040 1045 1050
Asn Cys Thr Asp Thr Thr Lys Phe Val Trp Ile Lys Asp Phe Asn
1055 1060 1065
Ile Phe Gly Arg Glu Leu Asn Ala Thr Glu Val Ser Ser Leu Tyr
1070 1075 1080
Trp Ile Gln Ser Ser Thr Asn Thr Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn
1085 1090 1095
Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Gln Tyr Tyr Leu Phe Asn Gln Gly Met
1100 1105 1110
Gln Asn Ile Tyr Ile Lys Tyr Phe Ser Lys Ala Ser Met Gly Glu
1115 1120 1125
Thr Ala Pro Arg Thr Asn Phe Asn Asn Ala Ala Ile Asn Tyr Gln
1130 1135 1140
Asn Leu Tyr Leu Gly Leu Arg Phe Ile Ile Lys Lys Ala Ser Asn
1145 1150 1155
Ser Arg Asn Ile Asn Asn Asp Asn Ile Val Arg Glu Gly Asp Tyr
1160 1165 1170
Ile Tyr Leu Asn Ile Asp Asn Ile Ser Asp Glu Ser Tyr Arg Val
1175 1180 1185
Tyr Val Leu Val Asn Ser Lys Glu Ile Gln Thr Gln Leu Phe Leu
1190 1195 1200
Ala Pro Ile Asn Asp Asp Pro Thr Phe Tyr Asp Val Leu Gln Ile
1205 1210 1215
Lys Lys Tyr Tyr Glu Lys Thr Thr Tyr Asn Cys Gln Ile Leu Cys
1220 1225 1230
Glu Lys Asp Thr Lys Thr Phe Gly Leu Phe Gly Ile Gly Lys Phe
1235 1240 1245
Val Lys Asp Tyr Gly Tyr Val Trp Asp Thr Tyr Asp Asn Tyr Phe
1250 1255 1260
Cys Ile Ser Gln Trp Tyr Leu Arg Arg Ile Ser Glu Asn Ile Asn
1265 1270 1275
Lys Leu Arg Leu Gly Cys Asn Trp Gln Phe Ile Pro Val Asp Glu
1280 1285 1290
Gly Trp Thr Glu
1295
<210> 28
<211> 1291
<212> PRT
<213> 肉毒梭状芽孢杆菌
<400> 28
Met Pro Val Thr Ile Asn Asn Phe Asn Tyr Asn Asp Pro Ile Asp Asn
1 5 10 15
Asp Asn Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Phe Ala Arg Gly Thr Gly Arg
20 25 30
Tyr Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Ile Pro Glu
35 40 45
Arg Tyr Thr Phe Gly Tyr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Lys Ser Ser Gly
50 55 60
Ile Phe Asn Arg Asp Val Cys Glu Tyr Tyr Asp Pro Asp Tyr Leu Asn
65 70 75 80
Thr Asn Asp Lys Lys Asn Ile Phe Leu Gln Thr Met Ile Lys Leu Phe
85 90 95
Asn Arg Ile Lys Ser Lys Pro Leu Gly Glu Lys Leu Leu Glu Met Ile
100 105 110
Ile Asn Gly Ile Pro Tyr Leu Gly Asp Arg Arg Val Pro Leu Glu Glu
115 120 125
Phe Asn Thr Asn Ile Ala Ser Val Thr Val Asn Lys Leu Ile Ser Asn
130 135 140
Pro Gly Glu Val Glu Gln Lys Lys Gly Ile Phe Ala Asn Leu Ile Ile
145 150 155 160
Phe Gly Pro Gly Pro Val Leu Asn Glu Asn Glu Thr Ile Asp Ile Gly
165 170 175
Ile Gln Asn His Phe Ala Ser Arg Glu Gly Phe Gly Gly Ile Met Gln
180 185 190
Met Lys Phe Cys Pro Glu Tyr Val Ser Val Phe Asn Asn Val Gln Glu
195 200 205
Asn Lys Gly Ala Ser Ile Phe Asn Arg Arg Gly Tyr Phe Ser Asp Pro
210 215 220
Ala Leu Ile Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His Gly Leu Tyr
225 230 235 240
Gly Ile Lys Val Asp Asp Leu Pro Ile Val Pro Asn Glu Lys Lys Phe
245 250 255
Phe Met Gln Ser Thr Asp Thr Ile Gln Ala Glu Glu Leu Tyr Thr Phe
260 265 270
Gly Gly Gln Asp Pro Ser Ile Ile Ser Pro Ser Thr Asp Lys Ser Ile
275 280 285
Tyr Asp Lys Val Leu Gln Asn Phe Arg Gly Ile Val Asp Arg Leu Asn
290 295 300
Lys Val Leu Val Cys Ile Ser Asp Pro Asn Ile Asn Ile Asn Ile Tyr
305 310 315 320
Lys Asn Lys Phe Lys Asp Lys Tyr Lys Phe Val Glu Asp Ser Glu Gly
325 330 335
Lys Tyr Ser Ile Asp Val Glu Ser Phe Asn Lys Leu Tyr Lys Ser Leu
340 345 350
Met Phe Gly Phe Thr Glu Ile Asn Ile Ala Glu Asn Tyr Lys Ile Lys
355 360 365
Thr Arg Ala Ser Tyr Phe Ser Asp Ser Leu Pro Pro Val Lys Ile Lys
370 375 380
Asn Leu Leu Asp Asn Glu Ile Tyr Thr Ile Glu Glu Gly Phe Asn Ile
385 390 395 400
Ser Asp Lys Asn Met Gly Lys Glu Tyr Arg Gly Gln Asn Lys Ala Ile
405 410 415
Asn Lys Gln Ala Tyr Glu Glu Ile Ser Lys Glu His Leu Ala Val Tyr
420 425 430
Lys Ile Gln Met Cys Lys Ser Val Lys Val Pro Gly Ile Cys Ile Asp
435 440 445
Val Asp Asn Glu Asn Leu Phe Phe Ile Ala Asp Lys Asn Ser Phe Ser
450 455 460
Asp Asp Leu Ser Lys Asn Glu Arg Val Glu Tyr Asn Thr Gln Asn Asn
465 470 475 480
Tyr Ile Gly Asn Asp Phe Pro Ile Asn Glu Leu Ile Leu Asp Thr Asp
485 490 495
Leu Ile Ser Lys Ile Glu Leu Pro Ser Glu Asn Thr Glu Ser Leu Thr
500 505 510
Asp Phe Asn Val Asp Val Pro Val Tyr Glu Lys Gln Pro Ala Ile Lys
515 520 525
Lys Val Phe Thr Asp Glu Asn Thr Ile Phe Gln Tyr Leu Tyr Ser Gln
530 535 540
Thr Phe Pro Leu Asn Ile Arg Asp Ile Ser Leu Thr Ser Ser Phe Asp
545 550 555 560
Asp Ala Leu Leu Val Ser Ser Lys Val Tyr Ser Phe Phe Ser Met Asp
565 570 575
Tyr Ile Lys Thr Ala Asn Lys Val Val Glu Ala Gly Leu Phe Ala Gly
580 585 590
Trp Val Lys Gln Ile Val Asp Asp Phe Val Ile Glu Ala Asn Lys Ser
595 600 605
Ser Thr Met Asp Lys Ile Ala Asp Ile Ser Leu Ile Val Pro Tyr Ile
610 615 620
Gly Leu Ala Leu Asn Val Gly Asp Glu Thr Ala Lys Gly Asn Phe Glu
625 630 635 640
Ser Ala Phe Glu Ile Ala Gly Ser Ser Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro
645 650 655
Glu Leu Leu Ile Pro Val Val Gly Val Phe Leu Leu Glu Ser Tyr Ile
660 665 670
Asp Asn Lys Asn Lys Ile Ile Lys Thr Ile Asp Asn Ala Leu Thr Lys
675 680 685
Arg Val Glu Lys Trp Ile Asp Met Tyr Gly Leu Ile Val Ala Gln Trp
690 695 700
Leu Ser Thr Val Asn Thr Gln Phe Tyr Thr Ile Lys Glu Gly Met Tyr
705 710 715 720
Lys Ala Leu Asn Tyr Gln Ala Gln Ala Leu Glu Glu Ile Ile Lys Tyr
725 730 735
Lys Tyr Asn Ile Tyr Ser Glu Glu Glu Lys Ser Asn Ile Asn Ile Asn
740 745 750
Phe Asn Asp Ile Asn Ser Lys Leu Asn Asp Gly Ile Asn Gln Ala Met
755 760 765
Asp Asn Ile Asn Asp Phe Ile Asn Glu Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met
770 775 780
Lys Lys Met Ile Pro Leu Ala Val Lys Lys Leu Leu Asp Phe Asp Asn
785 790 795 800
Thr Leu Lys Lys Asn Leu Leu Asn Tyr Ile Asp Glu Asn Lys Leu Tyr
805 810 815
Leu Ile Gly Ser Val Glu Asp Glu Lys Ser Lys Val Asp Lys Tyr Leu
820 825 830
Lys Thr Ile Ile Pro Phe Asp Leu Ser Thr Tyr Thr Asn Asn Glu Ile
835 840 845
Leu Ile Lys Ile Phe Asn Lys Tyr Asn Ser Glu Ile Leu Asn Asn Ile
850 855 860
Ile Leu Asn Leu Arg Tyr Arg Asp Asn Asn Leu Ile Asp Leu Ser Gly
865 870 875 880
Tyr Gly Ala Lys Val Glu Val Tyr Asp Gly Val Lys Leu Asn Asp Lys
885 890 895
Asn Gln Phe Lys Leu Thr Ser Ser Ala Asp Ser Lys Ile Arg Val Thr
900 905 910
Gln Asn Gln Asn Ile Ile Phe Asn Ser Met Phe Leu Asp Phe Ser Val
915 920 925
Ser Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Arg Asn Asp Asp Ile Gln Asn
930 935 940
Tyr Ile His Asn Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Lys Asn Asn Ser
945 950 955 960
Gly Trp Lys Ile Ser Ile Arg Gly Asn Arg Ile Ile Trp Thr Leu Ile
965 970 975
Asp Ile Asn Gly Lys Thr Lys Ser Val Phe Phe Glu Tyr Asn Ile Arg
980 985 990
Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Ile Asn Arg Trp Phe Phe Val Thr Ile Thr
995 1000 1005
Asn Asn Leu Asp Asn Ala Lys Ile Tyr Ile Asn Gly Thr Leu Glu
1010 1015 1020
Ser Asn Met Asp Ile Lys Asp Ile Gly Glu Val Ile Val Asn Gly
1025 1030 1035
Glu Ile Thr Phe Lys Leu Asp Gly Asp Val Asp Arg Thr Gln Phe
1040 1045 1050
Ile Trp Met Lys Tyr Phe Ser Ile Phe Asn Thr Gln Leu Asn Gln
1055 1060 1065
Ser Asn Ile Lys Glu Ile Tyr Lys Ile Gln Ser Tyr Ser Glu Tyr
1070 1075 1080
Leu Lys Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Met Tyr Asn Lys Glu Tyr
1085 1090 1095
Tyr Met Phe Asn Ala Gly Asn Lys Asn Ser Tyr Ile Lys Leu Val
1100 1105 1110
Lys Asp Ser Ser Val Gly Glu Ile Leu Ile Arg Ser Lys Tyr Asn
1115 1120 1125
Gln Asn Ser Asn Tyr Ile Asn Tyr Arg Asn Leu Tyr Ile Gly Glu
1130 1135 1140
Lys Phe Ile Ile Arg Arg Lys Ser Asn Ser Gln Ser Ile Asn Asp
1145 1150 1155
Asp Ile Val Arg Lys Glu Asp Tyr Ile His Leu Asp Phe Val Asn
1160 1165 1170
Ser Asn Glu Glu Trp Arg Val Tyr Ala Tyr Lys Asn Phe Lys Glu
1175 1180 1185
Gln Glu Gln Lys Leu Phe Leu Ser Ile Ile Tyr Asp Ser Asn Glu
1190 1195 1200
Phe Tyr Lys Thr Ile Gln Ile Lys Glu Tyr Asp Glu Gln Pro Thr
1205 1210 1215
Tyr Ser Cys Gln Leu Leu Phe Lys Lys Asp Glu Glu Ser Thr Asp
1220 1225 1230
Asp Ile Gly Leu Ile Gly Ile His Arg Phe Tyr Glu Ser Gly Val
1235 1240 1245
Leu Arg Lys Lys Tyr Lys Asp Tyr Phe Cys Ile Ser Lys Trp Tyr
1250 1255 1260
Leu Lys Glu Val Lys Arg Lys Pro Tyr Lys Ser Asn Leu Gly Cys
1265 1270 1275
Asn Trp Gln Phe Ile Pro Lys Asp Glu Gly Trp Thr Glu
1280 1285 1290
<210> 29
<211> 22
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<221> 来源
<223> /note = “未知的描述：小鼠/大鼠Syt I序列”
<400> 29
Gly Glu Gly Lys Glu Asp Ala Phe Ser Lys Leu Lys Gln Lys Phe Met
1 5 10 15
Asn Glu Leu His Lys Ile
20

Claims (28)

1.一种多肽，其包含肉毒梭状芽孢杆菌血清型B，菌株4重链的修饰的受体结合结构域(B4-Hc)，所述修饰的受体结合结构域基于与由根据SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列组成的参考B4-Hc相同的氨基酸序列，其中，相对于由根据SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列组成的所述参考B4-Hc，所述修饰的受体结合结构域的氨基酸序列修饰为取代突变V1113K、S1117P、S1196A和I1197P，并且其中相对于所述参考B4-Hc，所述修饰使得所述修饰的B4-Hc与人SytII的结合增强。
2.一种肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽，其包含：
a)蛋白酶结构域；
b)蛋白酶裂解位点；
c)易位结构域；和
d)肉毒梭状芽孢杆菌血清型B，菌株4重链的修饰的受体结合结构域(B4-Hc)，所述修饰的受体结合结构域基于与由根据SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列组成的参考B4-Hc相同的氨基酸序列，其中，相对于由根据SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列组成的所述参考B4-Hc，所述修饰的受体结合结构域的氨基酸序列修饰为取代突变V1113K、S1117P、S1196A和I1197P，并且其中相对于所述参考B4-Hc，所述修饰使得所述修饰的B4-Hc与人SytII的结合增强。
3.一种嵌合分子，其包含第一部分，所述第一部分为连接到第二部分的肉毒梭状芽孢杆菌血清型B，菌株4重链的修饰的受体结合结构域(B4-Hc)，所述修饰的受体结合结构域基于与由根据SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列组成的参考B4-Hc相同的氨基酸序列，其中，相对于由根据SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列组成的所述参考B4-Hc，所述修饰的受体结合结构域的氨基酸序列修饰为取代突变V1113K、S1117P、S1196A和I1197P，其中相对于所述参考B4-Hc，所述修饰使得所述修饰的B4-Hc与人SytII的结合增强，
其中，所述第二部分选自由小分子和生物活性分子组成的组。
4.如权利要求3所述的嵌合分子，其中所述第二部分选自核酸和蛋白质。
5.如权利要求3所述的嵌合分子，其中所述第二部分为多肽。
6.如权利要求3所述的嵌合分子，其中所述生物活性分子是治疗性多肽或非多肽药物。
7.如权利要求1-6中任一项所述的多肽、BoNT多肽或嵌合分子，其中，
所述修饰还包含一个或多个取代突变，所述取代突变选自由以下组成的组：
Q1191C、Q1191V、Q1191L、Q1191Y、Q1191M、Y1199W、Y1199E、Y1199H、W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P及其组合。
8.如权利要求1-6中任一项所述的多肽、BoNT多肽或嵌合分子，其中，
所述修饰还包含两个取代突变，所述取代突变选自由以下组成的组：
Q1191C、Q1191V、Q1191L、Q1191Y、Q1191M、Y1199W、Y1199E、Y1199H、W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C和Y1183P。
9.如权利要求1-6中任一项所述的多肽、BoNT多肽或嵌合分子，其中所述修饰还包含：
两个或更多个取代突变，所述取代突变选自由Q1191M、Q1191C、Q1191V、Q1191L、Q1191Y、Y1199W、Y1199E、Y1199H、W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C、Y1183P、Y1199F和Y1199L组成的组。
10.如权利要求1-6中任一项所述的多肽、BoNT多肽或嵌合分子，其中所述修饰还包含：
两个取代突变，所述两个取代突变对应于Q1191M和W1178Q；Q1191C和W1178Q；Q1191V和W1178Q；Q1191L和W1178Q；Q1191Y和W1178Q；Q1191M和Y1183P；Q1191M和Y1183C；Q1191C和Y1183P；Q1191C和Y1183C；Q1191V和Y1183P；Q1191V和Y1183C；Q1191L和Y1183P；Q1191L和Y1183C；Q1191Y和Y1183P；Q1191Y和Y1183C；W1178Q和Y1183P；以及W1178Q和Y1183C。
11.如权利要求10所述的多肽、BoNT多肽或嵌合分子，其中所述两个取代突变对应于：
i)Q1191M和W1178Q；或
ii)Q1191M和Y1183P；或
iii)Q1191M和Y1183C。
12.如权利要求1-6中任一项所述的多肽、BoNT多肽或嵌合分子，其中，
所述修饰还包含三个取代突变，并且所述三个取代突变选自由Q1191C、Q1191V、Q1191L、Q1191Y、Q1191M、W1178Y、W1178Q、W1178A、W1178S、Y1183C和Y1183P组成的组。
13.如权利要求1-6中任一项所述的多肽、BoNT多肽或嵌合分子，其中，
所述修饰还包含三个取代突变，并且所述三个取代突变对应于Q1191M、W1178Q和Y1183P。
14.如权利要求1-6中任一项所述的多肽、BoNT多肽或嵌合分子，还包含对应于S1201V的取代突变。
15.如权利要求2所述的BoNT多肽，其中，
i)所述蛋白酶结构域、易位结构域和蛋白酶裂解位点来自选自由A、B、C、D、E、F、G及其组合组成的组的血清型；或
ii)所述蛋白酶结构域、易位结构域和蛋白酶裂解位点来自选自由A、B、C、D、E、F、G及其组合组成的组的血清型，其中所述蛋白酶结构域、易位结构域和蛋白酶裂解位点来自血清型B，菌株1；或
iii)所述蛋白酶结构域、易位结构域和蛋白酶裂解位点来自选自由A、B、C、D、E、F、G及其组合组成的组的血清型，其中所述蛋白酶结构域、易位结构域和蛋白酶裂解位点来自血清型A，菌株1；或
iv)所述蛋白酶结构域、易位结构域和蛋白酶裂解位点来自选自由A、B、C、D、E、F、G及其组合组成的组的血清型，其中所述蛋白酶裂解位点来自血清型A、血清型B，或者是血清型A和血清型B的嵌合裂解位点。
16.如权利要求3-6中任一项所述的嵌合分子，其中，
所述第一部分和所述第二部分共价连接。
17.如权利要求3-6中任一项所述的嵌合分子，其中，
所述第一部分和所述第二部分非共价连接。
18.一种核酸，其编码如权利要求1或7-13中任一项所述的多肽、如权利要求2或7-13中任一项所述的BoNT多肽或如权利要求3-10或12-13中任一项所述的嵌合分子。
19.一种核酸载体，其包含如权利要求18所述的核酸。
20.一种细胞，其包含如权利要求18所述的核酸或如权利要求19所述的核酸载体。
21.一种细胞，其表达如权利要求1或7-13中任一项所述的多肽、如权利要求2或7-13中任一项所述的BoNT多肽或如权利要求3-10或12-13中任一项所述的嵌合分子。
22.一种药物组合物，其包含如权利要求1或7-13中任一项所述的多肽，或如权利要求2或7-15中任一项所述的肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽，或如权利要求3-10、12-13或16-17中任一项所述的嵌合分子，或如权利要求19所述的核酸载体。
23.如权利要求22所述的药物组合物，其还包含药学上可接受的赋形剂。
24.一种药盒，其包括如权利要求22或23所述的药物组合物和用于所述药物组合物的治疗性施用的指导。
25.一种生产肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽的方法，所述方法包括在生产所述BoNT多肽的条件下培养如权利要求21所述的细胞的步骤。
26.如权利要求25所述的方法，其还包括以下步骤中的一个或多个：
i)-从培养步骤中所培养的培养物中回收所述BoNT多肽；
ii)-纯化所述BoNT多肽；
iii)-激活所述BoNT多肽；和/或
iv)-配制所述BoNT多肽。
27.如权利要求1或7-13中任一项所述的多肽，或如权利要求2或7-15中任一项所述的肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽，如权利要求22或23所述的药物组合物，或如权利要求3-10、12-13或16-17中任一项所述的嵌合分子在制备用于治疗与不需要的神经元活性相关的病症的药物中的用途，其中，所述病症选自由以下组成的组：眼睑病症、局部痉挛和其他语音障碍以及分泌性病症。
28.如权利要求1或7-13中任一项所述的多肽，或如权利要求2或7-15中任一项所述的肉毒杆菌神经毒素(BoNT)多肽，如权利要求22或23所述的药物组合物，或如权利要求3-10、12-13或16-17中任一项所述的嵌合分子在制备用于治疗与不需要的神经元活性相关的病症的药物中的用途，其中所述病症选自由以下组成的组：痉挛性发声障碍、痉挛性斜颈、喉肌张力障碍、口下颌肌张力障碍、舌肌张力障碍、颈肌张力障碍、手局部肌张力障碍、眼睑痉挛、斜视、半面痉挛、脑瘫、痉挛性结肠炎、神经性膀胱、肛门痉挛、肢体痉挛、抽搐、震颤、磨牙症、肛裂、贲门失弛缓症、吞咽困难和其他肌张力障碍和其他以肌肉群不自主运动为特征的病症、流泪、多汗症、过度流涎、胃肠道分泌物过多、肌肉痉挛引起的疼痛、头痛、偏头痛以及皮肤病学或美学/美容病症。
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