CN110035766B

CN110035766B - 用于抑制皮肤炎症和确定癌症易感性的方法和组合物

Info

Publication number: CN110035766B
Application number: CN201780071726.6A
Authority: CN
Inventors: B·勒韦萨德; 钟雷; O·马迈
Original assignee: Laboratory Of Cytogenetics Molecular Genetics And Human Reproduction; Agency for Science Technology and Research Singapore
Current assignee: Laboratory Of Cytogenetics Molecular Genetics And Human Reproduction; Agency for Science Technology and Research Singapore
Priority date: 2016-09-21
Filing date: 2017-09-21
Publication date: 2023-10-24
Anticipated expiration: 2037-09-21
Also published as: CN110035766A; WO2018056907A1; EP3515470B1; US20200030411A1; EP3515470A1; EP3515470A4; CN110035766B9

Abstract

本文公开了在有需要的受试者中治疗或预防自身免疫性皮肤病症和/或炎症性皮肤病症、皮肤肿瘤以及肥胖的方法，所述方法是通过施用能够抑制炎性体NLRP1激活的抑制剂、NLRP1突变体、防止皮肤中应激响应性分泌因子、已知的促炎性细胞因子、角质形成细胞分化标志物、炎性体依赖性细胞因子以及生长因子分泌的制剂以及降低炎性体依赖性细胞因子的作用的制剂来实现的。本发明涵盖了NLRP1激活剂，如塔拉博斯塔特的用途，特别是用于治疗皮肤肿瘤的用途。本文还包括确定受试者患自身免疫性皮肤病症和/或炎症性皮肤病症的可能性的方法，所述方法包括在从所述受试者获得的样品中检测NLRP1突变。还公开了炎性体感受蛋白NLRP1突变体和用于治疗的组合物。

Description

用于抑制皮肤炎症和确定癌症易感性的方法和组合物

对相关申请的交叉引用

本申请要求2016年9月21日提交的新加坡临时申请号10201607886X的优先权权益，该新加坡临时申请的内容在此以引用的方式整体并入本文用于所有目的。

技术领域

本发明一般性涉及分子生物学领域。具体来说，本发明涉及使用生物标志物检测和诊断癌症。

背景技术

先天免疫应答的及时激活和消退对于宿主防御、组织稳态以及肿瘤免疫监视来说是必要的。一个关键的先天免疫途径依赖于炎性体复合物，其由一系列例如配体感受性含核苷酸结合结构域、富含亮氨酸重复序列(NLR)蛋白、衔接蛋白ASC以及胱天蛋白酶-1组成。NLR蛋白巡视胞质并且在配体结合后引发炎性体组装、焦亡性细胞死亡以及促炎性细胞因子释放。虽然炎性体复合物在生理条件下对于病原体清除来说是必要的，但是它们的异常激活可能是有害的。这例如在由炎性体感受蛋白中的种系激活突变所引起的一组自身炎症性病症中是明显的，包括隐热蛋白相关周期性综合征(CAPS)、家族性地中海热综合征(FMF)以及某些形式的巨噬细胞激活综合征(MAS)。这些患者由于自发巨噬细胞激活和致热性细胞因子的释放而经历诸如周期性发热和无菌性炎症的诊断症状。

炎性体复合物充当响应于病原体相关信号和危险相关信号而触发炎症的关键的先天免疫效应子。已经证实，例如，炎性体感受蛋白NLRP1是人类皮肤中最突出的炎性体感受蛋白，并且所有病原性NLRP1突变都易于导致炎性体激活并且易于导致癌症。在机制上，已经证实NLRP1突变通过破坏PYD结构域和LRR结构域来引起自低聚化增加，所述PYD结构域和LRR结构域对于维持NLRP1作为无活性单体是必要的。来自患者的原代角质形成细胞被证实经历了自发炎性体激活和旁分泌IL-1信号传导，这足以引起症状，如皮肤炎症和表皮增生。

尽管NLR蛋白在全身性炎症中的功能是公认的，但是关于它们在器官特异性免疫应答和组织稳态中的作用知之甚少，特别是在例如皮肤的上皮组织中。除了形成结构屏障之外，人类皮肤还积极地与免疫系统相互作用以防止入侵的病原体和组织损伤。另一方面，慢性未消退的皮肤炎症可能导致多种皮肤疾病并且促进良性和恶性上皮皮肤病变的发展。

因此，需要用于治疗或预防皮肤病症和确定癌症易感性的方法和制剂。

发明内容

在一个方面，本发明涉及一种在有需要的受试者中治疗或预防自身免疫性皮肤病症和/或炎症性皮肤病症的方法，其包括施用治疗有效量的抑制剂，所述抑制剂能够抑制炎性体感受蛋白NLRP1(含核苷酸结合结构域、富含亮氨酸重复序列(NLR)家族、含热蛋白结构域蛋白1-NLPR1)的激活。

在另一个方面，本发明涉及一种在有需要的受试者中治疗或预防自身免疫性皮肤病症和/或炎症性皮肤病症的方法，其包括施用治疗有效量的防止皮肤中应激响应性分泌因子、已知的促炎性细胞因子、角质形成细胞分化标志物、炎性体依赖性细胞因子以及生长因子分泌的制剂。

在又另一个方面，本发明涉及一种在有需要的受试者中治疗或预防自身免疫性皮肤病症和/或炎症性皮肤病症的方法，其包括施用治疗有效量的降低炎性体依赖性细胞因子的作用的制剂。

在另一个方面，本发明涉及一种确定受试者的皮肤炎症是否是炎症性皮肤病症和/或自身免疫性皮肤病症的方法，其包括在从所述受试者获得的样品中检测NLRP1突变。

在另一个方面，本发明涉及一种确定受试者患炎症性皮肤病症和/或自身免疫性皮肤病症的可能性(或易感性)的方法，其包括在从所述受试者获得的样品中检测NLRP1突变。

在又另一个方面，本发明涉及一种在受试者中治疗皮肤炎症的方法，其包括在从所述受试者获得的样品中检测NLRP1突变；确定所述受试者是否具有NLRP1突变；并且其中当所述受试者具有NLRP1突变时，通过向有需要的受试者施用选自由以下各项组成的组中的任一种在所述受试者中治疗所述皮肤炎症：治疗有效量的抑制剂，所述抑制剂能够抑制炎性体感受蛋白NLRP1(含核苷酸结合结构域、富含亮氨酸重复序列(NLR)家族、含热蛋白结构域蛋白1-NLPR1)的激活；治疗有效量的防止皮肤中应激响应性分泌因子、已知的促炎性细胞因子、角质形成细胞分化标志物、炎性体依赖性细胞因子以及生长因子分泌的制剂；治疗有效量的降低炎性体依赖性细胞因子的作用的制剂；以及治疗有效量的炎性体感受蛋白NLRP1突变体。

在另一个方面，本发明涉及一种在有需要的受试者中治疗或预防皮肤肿瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的炎性体感受蛋白NLRP1突变体。

在另一个方面，本发明涉及一种分离的多肽或其片段，所述多肽与突变型NLRP1的多肽具有至少70％的序列同一性。

在又另一个方面，本发明涉及一种分离的核酸或其片段，所述核酸与突变型NLRP1的核酸具有至少70％的序列同一性。

在另一个方面，本发明涉及一种载体，其包含如本文所公开的核酸。

在另一个方面，本发明涉及一种宿主细胞，其包含如本文所公开的载体。

在一个方面，本发明涉及一种细胞培养系统，其包含如本文所公开的宿主细胞。

在另一个方面，本发明涉及一种在有需要的受试者中治疗肥胖和/或代谢紊乱的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的炎性体感受蛋白NLRP1突变体。

在又另一个方面，本发明涉及一种在有需要的受试者中治疗或预防癌症的方法，其包括施用治疗有效量的能够激活炎性体感受蛋白NLRP1的激活剂。

附图说明

在结合非限制性实施例和附图考虑时，通过参考详细说明将更好地理解本发明，在所述附图中：

图1示出了炎性体感受蛋白如何导致对皮肤癌的易感性增加以及炎性体中涉及的调节自身抑制的图示。

图2示出了家谱图，显示了MSPC家族和FKLC家族的谱系和临床特征。(A)MSPC家族(MSPC-TN-1、MSPC-RO-1以及MSPC-FR-1)和FKLC家族(FKLC-EG-1)的谱系。通过桑格测序(Sanger sequencing)验证所有加下划线的个体的NLRP1基因型。(B-L)MSPC和FKLC的主要临床症状。(B)脚跟上伴有上覆痂皮的硬结溃疡和周围角化过度症。(C)右脚外部上坚硬的鳞屑性结节和小趾上的甲下病变。(D)手掌和手指上多个离散的、自愈的、疣状角化棘皮瘤(一个病变在插图中详细说明)。(E)脚跟上的“溃疡性鳞状细胞增生性”斑块和脚底上的另一个更小的病变。(F)左手掌和手指上的多个离散的疣状丘疹和结节(一个病变在插图中详细说明)，这与角化棘皮瘤一致。(G)脚跟上伴有表面溃疡的鳞状细胞增生性角化棘皮瘤。(H)左眼显示伴有充血的结膜和角膜瘢痕形成。(I)闭塞性角膜瘢痕形成和周围的结膜炎症。(J)上臂上的多个离散的和半融合的苔藓样丘疹。(K)前臂上的多个离散的和半融合的苔藓样丘疹。(L)鱼际隆起和手指的掌侧面上的角化过度性丘疹(更详细示于插图中)。

图3示出了数据，显示了MSPC和FKLC是由NLRP1(人类皮肤中的主要炎性体感受蛋白)中的种系突变引起的。(A)NLRP1基因组基因座(顶部)和NLRP1蛋白质结构域结构(底部)。所有MSPC病例都在NLRP1外显子1中携带种系杂合错义突变，所述NLRP1外显子1编码热蛋白结构域(PYD)。FKLC-EG-1V:3和FKLC-EG-1V:5对于去除外显子5的框内缺失(p.F787_R843del)是纯合的。(B)哺乳动物中NLRP1 PYD的保守性。MSPC中的错义突变以灰色突出显示。(C)原代人类皮肤、骨髓以及脾脏组织中NLRP1和其他炎性体感受蛋白的转录物水平。(D)原代皮肤成纤维细胞、黑色素细胞、角质形成细胞以及外周血单核细胞(PBMC)中已知的炎性体感受蛋白、效应子以及底物的RT-PCR表达水平。所有细胞都是从健康供体分离的。KRT14是角质形成细胞特异性标志物。(E)原代FFPE皮肤切片中NLRP1mRNA和NLRP1蛋白质的检测。dapB：RNAscope原位染色的阴性对照。

图4示出了数据，显示了所有MSPC突变和FKLC突变都会引起NLRP1炎性体激活增加。(A)NLRP1突变体引起ASC-GFP斑点形成增加。将293T-ASC-GFP细胞用空载体、野生型NLRP1以及NLRP1突变体转染并且在转染后16小时固定。(B)NLRP1突变体增加ASC-GFP低聚化。如(A)中那样将ASC-GFP细胞转染。在37℃使用1mM DSS使细胞沉淀物交联15分钟。(C)在PYD结构域中表达致病性突变体或常见NLRP1SNP的293T-ASC-GFP细胞中ASC-GFP斑点形成的定量比较。(D)在炎性体重构的293T细胞中NLRP1突变体引起胱天蛋白酶-1前体激活和IL-1b前体切割增加。将293T-ASC-GFP细胞用野生型NLRP1和NLRP1突变体与胱天蛋白酶-1前体和V5标记的IL-1b前体转染。在转染后16小时收获细胞。(E)在永生化人类角质形成细胞中NLRP1突变体引起胱天蛋白酶-1激活、IL-1b前体切割以及IL-1b分泌增加。将N/TERT永生化角质形成细胞用所示的NLRP1变体转染并且在转染后16小时收获。使用针对NLRP1-PYD的抗体测量内源性和过表达的NLRP1的水平。在SDS-PAGE之前将条件培养基浓缩103倍。(F)NLRP1突变体引起的炎性体激活需要ASC。将N/TERT永生化角质形成细胞用对照siRNA和针对PYCARD(ASC)的siRNA转染。在转染后3天重新接种细胞并且用野生型NLRP1或NLRP1突变体重新转染。在cDNA转染后16小时通过ELISA测量分泌的IL-1b的水平。星号指示非特异性条带。

图5呈现了数据，显示了NLRP1热蛋白结构域是自身抑制性的并且MSPC突变破坏它的折叠。(A)所有注释的人类热蛋白结构域(PYD)的序列比较。NLRP1 PYD以灰色示出。来自其他已知炎性体组分的PYD以蓝色示出。(B)在已知的炎性体感受蛋白中MSPC中突变的残基的保守性。MSPC中突变的氨基酸残基以红色示出。相邻的常见多态性残基以蓝色示出。(C)NLRP1 PYD不使ASC-GFP斑点成核。将293T-ASC-GFP细胞用mCherry标记的NLRP1、NLRP3以及AIM PYD构建体转染并且在转染后24小时固定。(D)NLRP1的截短突变体。NLRP1在FIIND结构域中经历自身蛋白水解切割。(E)NLRP1截短突变体在ASC-GFP斑点形成方面的比较。通过瞬时转染使全长NLRP1和截短突变体在293T-GFP细胞中过表达。在转染后24小时固定细胞。(F)NLRP1截短突变体在角质形成细胞IL-1b分泌方面的比较。使全长NLRP1和截短突变体在N/TERT永生化角质形成细胞中过表达。在转染后16小时收集条件培养基并且通过IL-1bELISA分析。(G)NLRP1的C末端自身蛋白水解片段足以使ASC-GFP斑点成核。使HA标记的NLRP1(氨基酸1213至1414)在293T-ASC-GFP细胞中过表达。将细胞在转染后24小时固定并且用抗HA抗体染色。(H)NLRP1 PYD(PDB：1PN5)和NLRP3 PYD(PDB：3QF2)的结构比较。死亡结构域(DD)超家族共有的特征性α螺旋被标记为a1至a6。MSPC中突变的残基A54、A66以及M77在NLRP1 PYD中以灰色突出显示，而相邻的多态性残基以深灰色示出。结构上类似于MSPCNLRP1突变的NLRP3残基以黑色示出。(I)通过2D[¹⁵N,¹H]-HSQC NMR分析重组野生型NLRP1PYD与MSPC突变型PYD之间折叠状态的差异。来自GB1增溶标签的交叉峰的颜色是灰色的。深灰色箭头突出显示了天然折叠的PYD结构域特征性的单个NMR信号。阴影区域7.9ppm<d₁(¹H)<8.5ppm指示无规卷曲化学位移区域。星号表示Trp6和Trp67的吲哚侧链共振。

图6呈现了数据，显示了PYD结构域和LRR结构域阻遏NLRP1自低聚化。(A)野生型NLRP1和NLRP1突变体的不同构象。使野生型NLRP1和NLRP1突变体在293T细胞中瞬时过表达。在转染后48小时收获细胞沉淀物。在天然状态下通过蓝色非变性PAGE(顶部)或在变性状态下通过SDS-PAGE(底部)平行分析20mg的裂解物。箭头指示推定的NLRP1单体(约150kDa)。(B)NLRP1低聚化的结构域要求。NLRP1 DPYD突变体具有降低的积累水平。(C)NLRP1低聚化需要FIIND结构域内的自身蛋白水解切割。将切割位点突变F1212A引入到野生型NLRP1和NLRP1突变体中。使所有所得的突变体在293T细胞中表达并且如(A)和(B)那样分析。(D)切割突变F1212A减少293T-ASC-GFP细胞中由NLRP1突变体引起的ASC-GFP斑点形成。(E)FIIND结构域中的切割突变F1212A减少角质形成细胞中的炎性体激活。使野生型NLRP1和所示的NLRP1突变体在N/TERT角质形成细胞中过表达。在转染后16小时通过IL-1b ELISA分析条件培养基。(F)示出了提出的NLRP1激活模型。

图7示出了数据，显示了NLRP1突变体经由旁分泌IL-1信号传导引起炎性细胞因子释放和表皮增生。(A)永生化角质形成细胞中NLRP1表达的诱导。(B)在多西环素(doxycycline)诱导NLRP1突变体之后炎性体依赖性细胞因子IL-1a、IL-1b以及IL-18的分泌。在添加多西环素后16小时收获条件培养基并且通过ELISA分析。对于胱天蛋白酶-1抑制，在添加多西环素之前将细胞用Z-WEVD-FMK预处理1小时。(C)在对照与表达NLRP1突变体的角质形成细胞之间差异表达的转录物的RNA测序(RNA-seq)热图和GSEA分析。(D)表达NLRP1突变体的角质形成细胞中排名前列的上调基因包括应激、炎症以及分化相关的标志物。插图指示与原代角质形成细胞中IL-1a诱导的转录物的公开数据集重叠。(E)IL-1细胞因子在三维皮肤器官型培养物中诱导表皮增生。在“空气提升”后将重建的皮肤培养物保持未处理或用10ng/ml的IL-1a、IL-1b以及IL-18处理7天。(F)(E)中所示的经过IL-1a、IL-1b以及IL-18处理的三维皮肤器官型培养物中表皮厚度和Ki-67阳性细胞数的定量。

图8示出了数据，显示了MSPC和FKLC患者中角质形成细胞特异性炎性体激活的体内证据。(A)源自于健康供体以及MSPC和FKLC患者的原代角质形成细胞培养物的Luminex细胞因子/趋化因子分析。患者中排名前列的上调细胞因子以红色突出显示。使用单尾司图顿氏t检验(Student's t test)计算p值。(B)在早期传代的患者来源的原代角质形成细胞培养物中高水平的IL-1细胞因子。将细胞因子水平相对于细胞数归一化。(C)患者来源的原代角质形成细胞中内源性ASC低聚物形成增加。在第4代时收获所有角质形成细胞。箭头指示ASC单体和二聚体。星号指示非特异性条带。(D)与健康个体相比，MSPC或FKLC患者中血清IL-1b水平没有一致增加。(E)MSPC皮肤病变活检中炎症标志物S100A8和S100A9的诱导。(F)提出的MSPC和FKLC发病机制模型。

图9示出了MSPC和FKLC的特征性病变的组织学的图像和另外的临床症状(与上图2有关)。(A)局限性棘皮病、角化过度症以及乳头状瘤病，伴有局灶性苔藓样浸润。(B)角化过度症、棘皮病以及角化不良，伴有苔藓样浸润和色素失调症。A中所示的病变的高放大倍数视图。(C)分化良好的鳞状细胞癌(SCC)，伴有苔藓样炎症。(D)SCC，伴有明显的角质化和苔藓样炎症。C中所示的病变的高放大倍数视图。(E)轻度棘皮病和角化过度症。乳头状真皮中存在的胶样小体(凋亡角质形成细胞)。(F)棘皮病和角化过度症。乳头状真皮内的胶样小体与非活动性(burnt-out)苔藓样炎症一致。(G)紧靠右小脚趾甲的结痂鳞屑性丘疹。(H)躯干上的多个色素沉着鳞屑性丘疹。(I)下唇上的溃疡性鳞屑性丘疹。(J)大腿上的大小可变的小角化性丘疹。(K)成簇和局灶融合鳞屑性红斑丘疹。(L)脚跟和脚底上的局灶性角化病。(M)躯干上的多个暗色红斑丘疹。(N)多个聚集的角化过度性紫罗兰色丘疹。(O)躯干上的片状红斑斑疹和丘疹。(P)增厚的断裂的甲板，伴有累及甲皱和远端边缘的周围炎症。(Q)右脚趾甲增厚和不规则生长。(R)右脸颊上的紫罗兰色炎症斑块和结痂。

图10示出了数据，显示了FKLC先证者中NLRP1外显子5的纯合框内缺失和角质形成细胞中NLRP1的显著表达(与图3有关)。(A)人类NLRP1和啮齿类动物同源物的结构域结构的比较。上图：仅在人类NLRP1中发现N末端PYD，而其他结构域，包括LRR，是保守的。下图：FKLC-EG-1中缺失的氨基酸残基(F787-R842)的保守性。(B)FKLC-EG-1中NLRP1外显子5的种系缺失。左图：FKLC-EG-1基因组DNA中NLRP1外显子5缺失的PCR验证，其使用外显子4中的正向PCR引物和外显子6中的反向引物。右图：来自FKLC-EG-1患者的mRNA中外显子5缺失的NLRP1转录物的RT-PCR检测。使用Oragene唾液RNA收集试剂盒从口腔细胞中提取mRNA样品。(C)原代皮肤、骨髓以及脾组织中所有含PYD基因的转录物水平。从人类蛋白质图谱(HumanProtein Atlas)获得RNA-seq FKPM值。(D)各种人类组织中NLRP1和NLRP3的相对表达水平。小鼠胚胎干细胞(mES)作为阴性对照。请注意，GAPDH引物被设计成检测人类GAPDH和小鼠GAPDH。(E)通过RT-PCR测量原代角质形成细胞中已知炎性体感受蛋白、效应子以及底物的相对表达水平。从ENCODE项目(Consortium,2012)下载RNA-seq FKPM值。(F)原代人类角质形成细胞、N/TERT永生化角质形成细胞以及PBMC中NLRP1、NLRP3以及IL1B的相对表达水平。(G)手掌皮肤中NLRP1的RNAscope原位染色。dapB是阴性对照。(H)毛囊中NLRP1的RNAscope原位染色。dapB是阴性对照。

图11示出了数据，显示了MSPC中的NLRP1突变体引起THP-1衍生的巨噬细胞中ASC依赖性炎性体过度激活(与图4有关)。(A)测量THP-1衍生巨噬细胞中的炎性体激活的实验设计。(B)在添加多西环素(1mg/ml)后24小时NLRP1诱导的水平。(C)通过乳酸脱氢酶活性测量由于NLRP1突变体表达引起的细胞死亡增加。(D)由于NLRP1突变体表达引起的IL-1b分泌增加。(E)由NLRP1突变体诱导所引起的IL-1b分泌被胱天蛋白酶-1/4/5抑制剂Z-WEHD-FMK阻断。(F)由NLRP1A66V引起的IL-1b分泌增加依赖于胱天蛋白酶-1和ASC。先前报道了THP-1CRISPR敲除细胞系CASP1^-/-和PYCARD(ASC)^-/-。

图12示出了另外的数据，显示了NLRP1 PYD的自身抑制作用和病原性PYD突变体的错误折叠(与图5有关)。(A)MSPC NLRP1 PYD突变体不能使ASC-GFP斑点成核。所有NLRP1PYD突变体都被表达为mCherry标记的融合体并且转染到293T-ASC-GFP细胞中。(B)NLRP1N末端截短突变体在293T-ASC-GFP细胞中ASC-GFP斑点形成方面的比较。(C)NLRP1C末端截短突变体在ASC-GFP斑点形成方面的比较。包括NLRP3 PYD作为阳性对照。使所有突变体在293T-ASC-GFP细胞中表达并且在转染后24小时测定。(D)由NLRP1N末端截短突变体引起的胱天蛋白酶-1前体激活和IL-1b前体加工。将所有NLRP1突变体与胱天蛋白酶-1前体和IL-1b-V5前体在293T-ASC-GFP细胞中共转染。请注意，NLRP1 DPYD突变体(氨基酸93至1474)显示持续低表达水平并且在转染后16小时仅非常弱地可检测到。(E)由NLRP1C末端截短突变体引起的胱天蛋白酶-1前体激活和IL-1b前体加工。(F)所有纯化的NLRP1 PYD的凝胶过滤曲线。重组野生型和突变型NLRP1 PYD作为单体级分洗脱。插图：具有所有重组NLRP1 PYD的SDS-PAGE凝胶的考马斯染色(Coomassie stain)。(G)NLRP1 SNP变体的二维[¹⁵N,¹H]-HSQCNMR谱。(H)野生型PYD、PYD A66V以及PYD A54T的热解折叠曲线的比较。黑线表示数据与双态平衡折叠模型的拟合。垂直线报告了如从拟合程序中所获得的野生型PYD和它的突变体的单个熔融温度(Tm)。与野生型光谱相比，NLRP1-PYD突变体A66V和A54T的光谱具有降低的螺旋含量振幅和215nm处的单个b折叠主峰，这表明PYD的α-螺旋含量由于突变而显著降低。通过CD光谱法监测的热熔实验由GB1标签的解折叠主导，所述GB1标签对于所有构建体在约343K具有强解折叠转变。野生型PYD的热解折叠经由305K-335K范围内的加宽转变进行，这指示了非协同解折叠。突变体A66V和A54T这两者的光谱图缺乏这种宽转变，这与不存在稳定的PYD折叠一致。(I)NLRP3中结构上类似的MSPC突变消除了胱天蛋白酶-1激活。将所有突变体与胱天蛋白酶-1前体和IL-1b-V5前体在293T-ASC-GFP细胞中共转染。(J)NLRP3中类似的MSPC突变消除了ASC-GFP斑点形成。

图13示出了NLRP1激活机制的支持数据(与图6有关)。(A)野生型NLRP1主要是单体。将用HA标记的野生型NLRP1瞬时转染的293T细胞在含有1％毛地黄皂苷的BN-PAGE裂解缓冲液中裂解。将20mg裂解物连同1ng的纯化兔IgG一起在蓝色非变性PAGE上分析，继而使用兔抗HA抗体进行蛋白质印迹法。使用针对所有兔IgG亚型的HRP缀合的二抗将呈天然形式的NLRP1和纯化的兔IgG可视化。兔IgG具有约150kDa的分子量。(B)NLRP1M77T突变引起C末端切割片段的低聚化增加。使用蓝色非变性PAGE将20μG表达野生型NLRP1和NLRP1M77T的293T裂解物分级分离。在电泳之后，从凝胶上切下整个泳道并且切割成8个相等的块。在室温下在50mM Tris-HCl、0.1％SDS、150mM NaCl(pH 7)中将蛋白质从每一个凝胶级分中洗脱过夜并且浓缩50倍。通过SDS-PAGE沿第二维度进一步分析浓缩的蛋白质。(C)NLRP1 PYD对ASC丝形成的影响的荧光各向异性测量。ASC丝形成由pH值从3.7转变为7.0引发。在NLRP1PYD存在下没有检测到显著性差异。(D)重组NLRP1 PYD和在添加CARD之后的二维[¹⁵N,¹H]-HSQC NMR谱的叠加。没有检测到显著的化学位移扰动。

图14示出了数据，显示了在角质形成细胞中NLRP1依赖性炎性体激活之后旁分泌IL-1信号传导的额外表征(与图7有关)。(A)在多西环素诱导NLRP1表达之后永生化角质形成细胞中ASC斑点的免疫染色。通过针对HA标签的免疫荧光染色检测野生型NLRP1和突变型NLRP1。(B)角质形成细胞中相对于内源性蛋白质(泳道1)的NLRP1诱导水平。使用来自相同的NLRP1蛋白质印迹的非特异性条带作为上样对照。(C)通过乳酸脱氢酶活性测量永生化角质形成细胞中NLRP1诱导后细胞死亡的诱导。(D)图6C和图6D中所示的RNA-seq样品中NLRP1转录物诱导的水平。(E)RNA-seq结果的Q-PCR验证：角质形成细胞分化标志物IVL和TGM1。(F)RNA-seq结果的Q-PCR验证：皮肤炎症标志物PI3和S100A9。(G)重组IL-1和TNFa以及MSPC原代角质形成细胞条件培养基诱导角质形成细胞中的皮肤炎症标志物。(H)重组IL-1和TNFa以及MSPC原代角质形成细胞条件培养基在成纤维细胞中诱导炎性细胞因子IL-6、IL-8以及KGF。诸如EGF和HB-EGF的其他生长因子对IL-1和TNFa刺激无响应并且用作阴性对照。(I)重组IL-1处理在离体器官型培养物中上调分层表皮中的炎症标志物S100A7、S100A8以及S100A9。将IL-1a、IL-1b以及IL-18添加到培养基中，各自的最终浓度是10ng/ml。在‘空气提升’后7天将所有培养物固定和染色。

图15示出了MSPC患者和FKLC患者中皮肤特异性炎性体激活的另外的体内数据(与图8有关)。(A)患者血清的Luminex细胞因子和趋化因子分析。在健康对照与先证者之间没有检测到显著的变化。(B)MSPC SCC活检中炎症标志物S100A7/牛皮癣素的免疫染色。

图16示出了数据，显示了塔拉博斯塔特(Talabostat)在NLRP1存在下诱导ASC-GFP斑点。

图17示出了数据，显示了塔拉博斯塔特诱导ASC-GFP低聚物。它显示使ASC-GFP低聚物交联并且蛋白质印迹数据显示保留的低聚物。

图18示出了数据，显示了塔拉博斯塔特诱导NLRP1低聚化。

图19示出了数据，显示了塔拉博斯塔特在角质形成细胞(IL-1β)中诱导常规的细胞焦亡。

图20示出了数据，显示了塔拉博斯塔特在角质形成细胞(ASC、形态)中诱导常规的细胞焦亡。

图21示出了数据，显示了塔拉博斯塔特在角质形成细胞(IF)中诱导常规的细胞焦亡。

图22呈现了数据，显示了塔拉博斯塔特诱导的细胞焦亡对炎性体组分的要求。

图23呈现了数据，显示了炎性体组分的siRNA基因敲低。

图24示出了数据，显示了塔拉博斯塔特诱导的细胞焦亡具有NLRP1和ASC依赖性。

定义

取代在本文中是通过提供野生型氨基酸残基，之后是位置编号，之后是待取代的取代氨基酸残基来指示的。如对于本领域技术人员来说将显而易见的是，氨基酸残基位置编号是参考野生型人类NLRP1的氨基酸序列(如图3B中所提供)。

如对于本领域技术人员来说将显而易见的是，氨基酸残基位置编号是参考野生型人类NLRP1的氨基酸序列(如图10A中所提供)。

具体实施方式

人类先天免疫系统中的一个关键途径依赖于炎性体复合物来激活，所述炎性体复合物由一系列例如配体感受性含核苷酸结合结构域、富含亮氨酸重复序列(NLR)蛋白、衔接蛋白ASC以及胱天蛋白酶-1组成。如本文所用的术语“炎性体”指的是一种多蛋白、细胞内复合物，其检测病原微生物和无菌应激源并且激活高度促炎性细胞因子白细胞介素-1b(IL-1b)和IL-18。炎性体也已知会诱导被称作细胞焦亡的细胞死亡形式。炎性体的失调与许多自身炎症性综合征和自身免疫性疾病有关。

举例来说，配体感受性含核苷酸结合结构域、富含亮氨酸重复序列(NLR)蛋白巡视胞质并且在配体结合后引发炎性体组装、焦亡性细胞死亡以及促炎性细胞因子释放。虽然炎性体复合物在生理条件下对于病原体清除来说是必要的，但是它们的异常激活可能对它们的宿主有害。在此，证实了炎性体感受蛋白NLRP1中的种系突变导致至少两种重叠的皮肤病症：多发性自愈性掌跖癌(MSPC)和家族性慢性苔藓样角化病(FKLC)。已经确定了一组非发热炎性体病症，从而揭示了热蛋白结构域的先前未知的自身抑制功能并且提供了NLRP1与皮肤炎症综合征和皮肤癌易感性之间的遗传联系。

因此，在一个实例中，公开了一种在有需要的受试者中治疗或预防自身免疫性皮肤病症和/或炎症性皮肤病症的方法。在一个实例中，所述方法包括施用治疗有效量的抑制剂，所述抑制剂能够抑制炎性体感受蛋白NLRP1(含核苷酸结合结构域、富含亮氨酸重复序列(NLR)家族含热蛋白结构域蛋白1-NLPR1)的激活。

如在此所用的术语“抑制(inhibiting)”或“抑制(inhibition)”指的是给定化合物限制、防止或阻断靶化合物的作用或功能的能力。这可以由例如抑制剂的结合，引起靶化合物的构象变化，从而使得靶化合物与未被抑制的靶化合物相比不能以正常方式进一步发挥功能而引起。抑制剂的结合可以是例如可逆的或不可逆的，这取决于抑制剂与靶分子结合的基本原理。就抑制机制而言，这可以使用不同的生物学或化学原理进行。举例来说，就酶抑制而言，抑制剂可以经由竞争性、无竞争性、非竞争性或混合的抑制来抑制酶。还可以经由共价失活来抑制酶，这是不可逆抑制的实例。

如本文所用的术语“能够抑制炎性体感受蛋白NLRP1的激活的抑制剂”或“NLRP1抑制剂”指的是能够抑制NLRP1激活的制剂或化合物。举例来说，能够防止NLRP1的低聚化(NLRP1蛋白启动下游途径的机制)的化合物被认为落入术语“NLRP1抑制剂”的范围内。

术语“低聚化”指的是连接单体(即单个单元)化合物以形成二聚体、三聚体、四聚体或更长链分子(也被称为多聚体或低聚物)的化学过程，所述单体化合物例如但不限于氨基酸、核苷酸、单糖或化学单体。

低聚化的实例包括但不限于自低聚化，这是一个肽单元与自身的一个或多个单元(在结构或序列方面是相同的)的低聚化；以及肽与在结构或序列方面不同的其他肽的低聚化的实例。

因此，在一个实例中，所述抑制剂通过防止NLRP1的低聚化来抑制NLRP1的激活。在另一个实例中，所述抑制剂通过防止NLRP1的自低聚化来抑制NLRP1的激活。在另一个实例中，所述抑制剂通过防止NLRP1或其片段与炎性体衔接蛋白ASC(凋亡斑点蛋白)之间的低聚化来抑制NLRP1的激活。

其他抑制方法包括例如抑制蛋白质，例如受体或另外的蛋白质的预期结合配偶体的结合，这是通过显示与例如受体相同的结合位点，但是不以与肽结合后预期结合配偶体的方式相同的方式起作用而实现的。蛋白质抑制的另一个实例是模拟天然抑制剂的功能，从而抑制靶蛋白的功能。因此，在一个实例中，抑制剂通过模拟野生型PYD结构域(热蛋白结构域)和野生型LRR(富含亮氨酸重复序列)结构域的功能来抑制NLRP1的激活。

能够实现这样的抑制的化合物或制剂可能不属于相同的化学族或具有结构相似性，而是根据它们充当NLRP1抑制剂的能力而被分组在一起。如上文所公开的这样的抑制剂的实例是但不限于小分子、抗体、多肽以及核酸。在一个实例中，NLRP1或其片段与炎性体衔接蛋白ASC之间的低聚化的抑制剂是但不限于小分子、抗体、多肽以及核酸。

可以防止NLRP1的自激活特性的另一种方法是例如通过防止NLRP1的蛋白水解切割。蛋白水解切割是肽通常被降解，换句话说，切割成更短的片段的过程。在一些实例中，只有肽的特定区段被切割，例如肽的N末端或C末端，从而赋予切割的肽以新的能力或先前隐匿的能力。这样的肽的一个实例是酶原，其是酶的无活性前体。酶原需要生物化学变化(例如揭示活性位点的水解反应、切割成活性形式或改变构型以揭示活性位点)以使它变成活性酶。

因此，在一个实例中，所述抑制剂防止NLRP1的蛋白水解切割。在另一个实例中，蛋白水解切割的位置在NLRP1的FIIND结构域内。在另一个实例中，其中蛋白水解切割的位置在位置1212处的苯丙氨酸与位置1213处的丝氨酸之间(也被写成F1212-S1213)。

在另一个实例中，蛋白水解切割的抑制剂选自由小分子、抗体、多肽以及核酸组成的组。

本文还公开了在受试者中治疗或预防自身免疫性皮肤病症和/或炎症性皮肤病症的方法。在一个实例中，所述方法包括施用治疗有效量的制剂，所述制剂防止皮肤中应激响应性分泌因子(也被称为促炎性细胞因子)、角质形成细胞分化标志物、炎性体依赖性细胞因子以及生长因子的分泌。

在一个实例中，炎性体依赖性细胞因子是但不限于IL-1α(白细胞介素-1α)、IL-1β(白细胞介素-1β)以及IL-18(白细胞介素-18)。在另一个实例中，所述炎性体依赖性细胞因子是至少一种、至少两种或更多种炎性体依赖性细胞因子。在又另一个实例中，所述炎性体依赖性细胞因子是本文公开的炎性体依赖性细胞因子中的一种、两种、三种或四种。

本文还公开了一种确定受试者的皮肤炎症是否是炎症性皮肤病症和/或自身免疫性皮肤病症的方法。

炎症性皮肤病症和/或自身免疫性皮肤病症的实例是但不限于MSPC(多发性自愈性掌跖癌)、FKLC(家族性慢性苔藓样角化病)、结膜、CAPS(隐热蛋白相关周期性综合征)、FMF(家族性地中海热综合征)、MAS(巨噬细胞激活综合征)、KA(角化棘皮瘤)、MSEE(多发性自愈性鳞状细胞上皮癌)、KLC(慢性苔藓样角化病)、耐卡姆氏病(Nekam's disease)、银屑病、白癜风相关自身免疫性疾病、表皮炎症、增生(例如上皮增生)、泛发型白癜风、艾迪生氏病(Addison's disease)、先天性弓形体病、毛发角化病、扁平苔癣以及皮肤肿瘤(例如上皮性皮肤肿瘤)。在一个实例中，所述炎症性皮肤病症和/或自身免疫性皮肤病症是MSPC。在另一个实例中，所述MSPC是但不限于MSPC-TN-1、MSPC-RO-1、MSPC-FR-1以及MSPC SCC。在又另一个实例中，所述炎症性皮肤病症和/或自身免疫性皮肤病症是FKLC。在另一个实例中，所述FKLC是FKLC-EG-1。在一个实例中，所述炎症性皮肤病症和/或自身免疫性皮肤病症是皮肤肿瘤。在另一个实例中，所述皮肤肿瘤是皮肤癌。在另一个实例中，所述皮肤癌是鳞状细胞癌(例如皮肤鳞状细胞癌或恶性鳞状细胞癌)。

本文公开了一种在有需要的受试者中治疗或预防癌症的方法。在一个实例中，所述方法包括施用治疗有效量的能够激活炎性体感受蛋白NLRP1的激活剂。

这样的能够激活炎性体感受蛋白NLRP1的激活剂的实例是但不限于已知具有抗赘生物和/或造血刺激活性的化合物。在另一个实例中，所述激活剂是小分子。如本文所述的这样的激活剂的实例是但不限于塔拉博斯塔特、CHEMBL305170、CHEMBL195189、CHEMBL383705、CHEMBL16709、CHEMBL66032、CHEMBL63406、CHEMBL1790483、CHEMBL63698、CHEMBL1813248、CHEMBL460984以及CHEMBL65406。在一个实例中，所述激活剂是塔拉博斯塔特，其也被称为Val-boro-Pro(PubChemCID：6918572)。

本文还公开了一种在有需要的受试者中治疗肥胖、代谢综合征和/或代谢紊乱的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的炎性体感受蛋白NLRP1突变体。

如本文所用的术语“肥胖”指的是其中多余的体脂已经积累到可能对健康产生负面影响的程度的医学病症。一般来说，当受试者的身体质量指数(BMI)超过30kg/m²时，所述受试者被认为是肥胖的，由此25kg/m²至30kg/m²的范围被定义为是超重的，所述身体质量指数是通过将人的体重除以人的身高的平方所获得的测量值。如由世界卫生组织(WorldHealth Organisation)所确立的肥胖的定义提供于下表中：

尽管如此，本领域技术人员将了解的是，肥胖的BMI指数定义可以根据受试者的种族或遗传而变化。举例来说，对于来自东亚国家的受试者，更低的BMI值可能适用。这是因为在比对于例如白种人所定义的标准BMI值低的BMI值下出现由于肥胖所引起的负面健康后果。举例来说，日本将肥胖定义为大于25kg/m²的任何BMI值，而中国利用大于28kg/m²的BMI值来定义肥胖。

已经证实小鼠中NLRP1的缺失会导致肥胖和代谢综合征/代谢紊乱。不受理论所束缚，认为NLRP1的丧失引起IL-18产生和脂解作用减少，如在患有IL-18缺乏症的受试者中所看到的那样。白细胞介素-18(IL-18)已经被证实由炎性体复合物中的胱天蛋白酶-1激活并且已经被证实具有抗肥胖作用。如本文所用的术语“代谢综合征”指的是以下五种医学病症中的至少三种的聚类(产生总共16种可能的组合，所有这些组合被理解为属于代谢综合征)：腹部(中心型)肥胖(还参见外瘦内胖TOFI个体)、高血压、高血糖、高血清甘油三酯以及低高密度脂蛋白(HDL)水平。代谢综合征与患心血管疾病和2型糖尿病的风险有关。所述综合征被认为是由潜在的能量利用和储存障碍所引起。

如本文所用的术语“代谢紊乱”指的是其中体内的异常化学反应改变正常代谢过程的情况。这样的代谢紊乱的根本原因可以是但不限于潜在的遗传突变或单基因异常。这些突变和/或异常中的大多数是以常染色体隐性方式遗传的。可能由于代谢紊乱而出现的一些可能的症状是但不限于嗜睡、体重减轻、黄疸以及癫痫发作。所表现的症状被理解为根据存在的代谢紊乱的类型而变化。代谢紊乱的症状可以被分为四类：急性症状、迟发性急性症状、进行性全身症状以及永久症状。

代谢紊乱的实例是但不限于苯丙酮尿症(PKU)、恶性PKU、1型酪氨酸血症、2型酪氨酸血症、黑尿酸尿症、同型胱氨酸尿症、高同型半胱氨酸血症、枫糖浆尿病、丙酸血症、多种羧化酶缺乏症、甲基丙二酸血症、高脂血症和高胆固醇血症、脂肪酸氧化障碍、糖原贮积病、半乳糖血症、先天性糖基化障碍、嘌呤过量产生、莱-奈二氏综合征(Lesch-Nyhansyndrome)、I型和II型戈谢病(Gaucher disease)、泰-萨二氏病(Tay-Sachs disease)、法布里病(Fabry disease)、赫勒氏综合征(Hurler syndrome)、亨特综合征(Huntersyndrome)、圣菲利柏氏综合征(Sanfilippo syndrome)、马-拉二氏综合征(Maroteaux-Lamy syndrome)、莫尔基奥氏综合征(Morquio syndrome)、雷夫叙姆病(Refsum disease)以及丙氨酸乙醛酸转氨酶缺陷。

本文还公开了一种在有需要的受试者中治疗或预防皮肤肿瘤的方法。在一个实例中，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的炎性体感受蛋白NLRP1突变体。

如本文所用的术语“突变”或“突变的”指的是任何生物学生物体、病毒或染色体外遗传元件的基因组或核酸序列的一部分的天然或人工修饰或遗传改变。这种突变可以使用但不限于化学品和辐射来人工诱导，但是也可以在细胞分裂中核酸复制期间自发发生。突变可能会或可能不会引起生物体的可观测的特征(表型)发生可辨别的变化。已知有各种类型的突变，其可以是小规模突变或大规模突变。小规模突变的实例是但不限于取代突变、沉默突变、错义突变、无义突变、移码突变、插入以及缺失。大规模突变的实例是但不限于扩增、缺失、染色体易位、中间缺失、染色体倒位以及引起杂合性丧失的突变。突变也可以根据它们对所得产物的功能的影响来分组。这些包括但不限于功能丧失型(失活)突变、功能获得型(激活)突变、显性负性(反效等位基因)突变、致死突变以及回复突变或反突变。点突变例如也被称为单碱基修饰，是一种类型的突变，其引起遗传物质、DNA或RNA的单核苷酸碱基取代、插入或缺失。术语“移码突变”表示碱基对的添加或缺失，从而引起阅读DNA的阅读框的移位。

举例来说，沉默突变是DNA中的突变，其不会显著改变其中发生所述突变的生物体的表型。沉默突变可以在非编码区中(在基因外或内含子内)发生或它们可以在外显子内发生。当它们在外显子内发生时，它们不会引起蛋白质的氨基酸序列发生变化(也被称为同义取代)，或者它们引起具有与原始氨基酸相似的特性的替代氨基酸的插入。在任何一种情况下，所得表型没有显著的变化。短语沉默突变通常可与短语同义突变互换使用。然而，同义突变仅发生在外显子内，并且不总是沉默突变。同义突变是可以影响转录、剪接、mRNA转运以及翻译的突变，其中任一种都可以改变表型，从而使同义突变是非沉默的。

在一个实例中，所述NLRP1突变体是由突变的以下非限制性实例中的一个或多个产生的：取代、插入、缺失、移码突变、错义突变、无义突变、重复以及重复序列扩增突变。

在一个实例中，所述NLRP1突变体具有至少一个、至少两个、至少三个或更多个突变。在另一个实例中，所述NLRP1突变体具有一个、两个、三个或更多个突变。在又另一个实例中，所述突变位于PYD(热蛋白结构域)和/或LRR(富含亮氨酸重复序列)结构域处。在另一个实例中，位于PYD结构域处的突变是错义突变。在一个实例中，PYD结构域处的突变引起至少一个或两个或所有氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是但不限于A54T(其是位置54处的丙氨酸被取代成苏氨酸)、M77T(其是位置77处的甲硫氨酸被取代成苏氨酸)以及A66V(其是位置66处的丙氨酸被取代成缬氨酸)。在一个实例中，PYD结构域处的突变引起一个突变。在另一个实例中，PYD结构域处的突变引起两个突变。在又另一个实例中，PYD结构域处的突变引起三个突变。

在一个实例中，氨基酸取代是A54T。在另一个实例中，氨基酸取代是M77T。在另一个实例中，氨基酸取代是A66V。在一个实例中，所述突变包括两个氨基酸取代，其中一个氨基酸取代是A54T，并且另一个氨基酸取代是A66V或M77T之一。在另一个实例中，所述突变包括两个氨基酸取代，其中一个氨基酸取代是A54T，并且另一个氨基酸取代是M77T。在又另一个实例中，所述突变包括两个氨基酸取代，其中一个氨基酸取代是A54T，并且另一个氨基酸取代是A66V。在另一个实例中，所述突变包括三个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是A54T、A66V以及M77T。

术语“序列同一性”意指两个核酸或氨基酸序列在比较窗口上是相同的(即基于逐个核苷酸或逐个残基)。术语“序列同一性百分比”是通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列，确定这两个序列中存在相同的核酸碱基(例如A、T、C、G、U或I)或残基的位置数量以得到匹配位置数量，将匹配位置数量除以比较窗口中的位置总数(即窗口大小)，并且将结果乘以100以得到序列同一性百分比来计算的。如本文所用的术语“基本同一性”表示多核苷酸或氨基酸序列的特征，其中所述多核苷酸或氨基酸包含在具有至少18个核苷酸(6个氨基酸)位置的比较窗口上，经常在具有至少24个-48个核苷酸(8个-16个氨基酸)位置的窗口上与参考序列相比具有至少85％的序列同一性，优选地至少90％至95％的序列同一性，更通常至少99％的序列同一性的序列，其中序列同一性百分比是通过在比较窗口上比较参考序列与所述序列来计算的，所述序列可能包括参考序列的总共20％或更少的缺失或添加。参考序列可以是更大序列的子集。

因此，在一个实例中，公开了一种分离的多肽或其片段，所述多肽与突变型NLRP1的多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％的序列同一性。在另一个实例中，公开了一种分离的核酸或其片段，所述核酸与突变型NLRP1的核酸具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％的序列同一性。

还公开了一种载体，其包含本文所述的核酸。本申请还描述了一种宿主细胞，其包含如本文所公开的载体或核酸。在一个实例中，所述宿主细胞是但不限于角质形成细胞和成纤维细胞(如真皮成纤维细胞)。在另一个实例中，公开了一种细胞培养系统，其包含如本文所述的宿主细胞。在又另一个实例中，所述细胞培养系统具有三维结构，例如三维器官型培养物、支架中的培养物等。

本文公开的方法之一是一种确定受试者发生炎症性皮肤病症和/或自身免疫性皮肤病症的可能性(或易感性)的方法。

在本文公开的方法中的任一种的一个实例中，所述皮肤炎症是炎症性皮肤病症。在另一个实例中，所述皮肤炎症是自身免疫性皮肤病症。在又另一个实例中，所述方法包括在从所述受试者获得的样品中检测NLRP1突变。

在另一个实例中，所述方法包括施用治疗有效量的降低炎性体依赖性细胞因子的作用的制剂。这样的制剂的实例是但不限于小分子、抗体、多肽以及核酸。在一个实例中，所述制剂是抗体。在另一个实例中，所述抗体是中和抗体。

本文还公开了一种在受试者中治疗皮肤炎症的方法，所述方法包括在从所述受试者获得的样品中检测NLRP1突变。在一个实例中，所述方法包括确定所述受试者是否具有NLRP1突变。在另一个实例中，所述方法包括当所述受试者被证实具有NLRP1突变时，通过施用以下各项中的任一种来治疗所述受试者的皮肤炎症：能够抑制炎性体感受蛋白NLRP1(含核苷酸结合结构域、富含亮氨酸重复序列(NLR)家族含热蛋白结构域蛋白1-NLPR1)的激活的抑制剂；防止皮肤中应激响应性分泌因子、已知的促炎性细胞因子、角质形成细胞分化标志物、炎性体依赖性细胞因子以及生长因子分泌的制剂；降低炎性体依赖性细胞因子的作用的制剂；以及炎性体感受蛋白NLRP1突变体。在一个实例中，所述制剂和抑制剂各自待以治疗有效量施用或各自以治疗有效量施用。在另一个实例中，所述方法包括在受试者中治疗皮肤炎症的方法，所述方法包括在从所述受试者获得的样品中检测NLRP1突变；确定所述受试者是否具有NLRP1突变，并且其中当所述受试者具有NLRP1突变时，通过向有需要的受试者施用选自由以下各项组成的组中的任一种来治疗所述受试者的皮肤炎症：治疗有效量的抑制剂，所述抑制剂能够抑制炎性体感受蛋白NLRP1(含核苷酸结合结构域、富含亮氨酸重复序列(NLR)家族、含热蛋白结构域蛋白1-NLPR1)的激活；治疗有效量的防止皮肤中应激响应性分泌因子、已知的促炎性细胞因子、角质形成细胞分化标志物、炎性体依赖性细胞因子以及生长因子分泌的制剂；治疗有效量的降低炎性体依赖性细胞因子的作用的制剂；以及治疗有效量的炎性体感受蛋白NLRP1突变体。

因此，在一个实例中，所述NLRP1突变是但不限于一个或多个取代、插入、缺失、移码突变、错义突变、无义突变、重复以及重复序列扩增。

在另一个实例中，所述NLRP1突变位于PYD(热蛋白结构域)和/或LRR(富含亮氨酸重复序列)结构域处。在又另一个实例中，所述突变位于PYD结构域处。在另一个实例中，所述突变位于LRR结构域处。

在一个实例中，与野生型(即非病变或非突变)NLRP1相比，通过样品中低聚化NLRP1的积累增加来检测NLRP1突变。在另一个实例中，通过抗ASC抗体检测低聚化的积累。在又另一个实例中，检测NLRP1突变的方法还包括检测和确定NLRP3的存在的步骤。

在另一个实例中，本文公开的方法还包括确定所述受试者的NLRP1单倍型。如本文所用的术语“单倍型”指的是生物体内从单个亲本一起遗传的一组基因。词语“单倍型”是词语“单倍体”和词语“基因型”的混成词，所述词语“单倍体”描述了仅具有一组染色体的细胞，所述词语“基因型”指的是生物体的遗传组成。单倍型可以描述一个染色体上从一个亲本一起遗传的一对基因，或者它可以描述染色体上从单个亲本一起遗传的所有基因。这组基因由于遗传连锁或在同一条染色体上彼此接近的基因通常一起遗传的现象而一起遗传。术语“单倍型”还可以指单核苷酸多态性(SNP)簇的遗传，所述单核苷酸多态性是个体之间DNA序列中单个位置处的变异。

对单倍型的检查可以帮助鉴定与健康和疾病状态有关的遗传变异模式。举例来说，如果单倍型与某种疾病有关，那么可以分析SNP簇附近的DNA段以试图鉴定负责导致所述疾病的一个或多个基因。

在一个实例中，利用但不限于以下各项中的至少一种对如本文所公开的一个或多个突变的存在或不存在进行分析和鉴定：外显子组测序；PCR、RT-PCR(逆转录酶)、qPCR(定量PCR)；蛋白质印迹法；凝胶电泳，诸如但不限于聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蓝色非变性PAGE以及二维PAGE；酶联免疫吸附测定(ELISA)；免疫组织化学，诸如但不限于组织学、免疫荧光染色；原位染色以及二丁二酰亚胺基辛二酸酯(DSS)交联剂方案。在一个实例中，如果通过RT-PCR进行本文公开的方法，那么引物或引物对选自如表4中所提供的引物。

可以对从受试者获得的样品进行本文公开的方法。所述样品可以是但不限于体液(例如但不限于唾液、血液、泪液、汗液、尿液、精液、羊水等)和皮肤(诸如但不限于从皮肤病变获得的皮肤)。在一个实例中，所述皮肤是但不限于表皮、光滑皮肤、足底皮肤、表皮附属物(如毛囊)、角质形成细胞、成纤维细胞(如真皮成纤维细胞)以及其组合。在另一个实例中，所述皮肤是角质形成细胞和/或成纤维细胞。

本文论述了两种重叠的孟德尔单基因皮肤病症：多发性自愈性掌跖癌(MSPC；OMIM：616964)和家族性慢性苔藓样角化病(FKLC)。这两种皮肤疾病是等位基因的并且由炎性体感受蛋白NLR家族含热蛋白结构域蛋白1(NLRP1)中的不同功能获得型突变引起。已经证实，NLRP1是人类皮肤中最显著表达的炎性体感受蛋白。经由对致病性突变的功能分析，证实NLRP1的激活机制不同于其他炎性体感受蛋白。野生型NLRP1通过PYD(热蛋白结构域)和LRR结构域的组合作用被保持为无活性单体。MSPC突变和FKLC突变分别破坏这两个结构域，从而导致组成型NLRP1自低聚化和炎性体激活。此外，证实在例如患者的角质形成细胞中存在自发的炎性体激活和IL-1分泌。使用离体器官型皮肤模型，证实炎性体依赖性IL-1细胞因子可以直接引起皮肤增生。这些发现将炎性体病症的临床多样性扩展到非发热性皮肤疾病。不受理论所束缚，认为本申请显示了将炎性体信号传导与炎症性皮肤病症和皮肤癌易感性相联系的遗传证据。

MSPC和FKLC的谱系和临床特征

已经引入了突尼斯血缘族(Tunisian kindred)(图2A，MSPC-TN-1)，其表现出常染色体显性皮肤顺序MSPC(OMIM616964)。受影响的患者在脚底和手掌皮肤上产生了许多溃疡性角化过度性结节状生长物。在临床上，这些病变类似于快速生长的良性增生性上皮性皮肤病变，其被称为角化棘皮瘤(KA)，但是显示出分化良好的鳞状细胞癌(SCC)的组织学特征(图2B-图2D)。这些病变大多在约6个月之后自发消退。然而，MSPC患者经历对恶性SCC的易感性增加(图2E；表1)。此外，15名患者中的12名(80％)产生组织学上以鳞状角化不良小叶为特征的结膜病变(图2H)。发现该血缘族中的推定MSPC基因座定位到染色体17p，这表明了类似的增生性皮肤病，即由TGFBR1中的突变引起的多发性自愈性鳞状细胞上皮癌(MSSE；OMIM132800)的不同遗传病因学。

基于这些症状，确定了两个另外的MSPC血缘族(图2A、图2F、图2G、图9C以及图9D)，包括最初被诊断为患有角膜上皮内角化不良的一个家族(MSPC-FR-1；图2I)。除了特征性掌跖KA之外，一小组MSPC患者还显示出不规则和增厚的趾甲(图9G)和毛发角化过度症(图9H、图9K、图9J；表1)。

进一步发现，第四个家族与MSPC共有几个临床特征(FKLC-EG-1)(图2A、图2L、图9L、图9M、图9Q以及图9R)。此外，受影响的儿童在手臂、腿部以及下躯干上表现出多个离散的和半融合的苔藓样丘疹(图2J、图2K、图9N以及图9O)。基于这些症状，两个受影响的同胞被诊断为患有FKLC。慢性苔藓样角化病(KLC)也被称为耐卡姆氏病，其是没有确定的遗传病因学的大部分散发的慢性皮肤炎症性病症。进一步的临床检查揭示，双亲也显示出明显的，尽管不太严重的皮肤表型，包括脚底角化病、毛囊角化过度症(图9L和图9M)以及黄斑淀粉样变性(表1)，这表明了该血缘族中的皮肤病变由半显性等位基因引起。

为了确定MSPC和FKLC中的一个或多个因果突变，对从MSPC1-TN-1IV:13以及FKLC-EG-1V:3和V:5中分离的基因组DNA进行全外显子组测序。在去除注释的多态性之后，在候选基因组基因座(染色体17：1,541,109-12,964,181)内鉴定出NLRP1基因的外显子1中的单个杂合外显子变体(染色体17：5,487,118G>A，hg19)。进一步的桑格测序确认了在16个其他MSPC-TN-1家族成员中，该突变与疾病分离(图2A，顶部)。根据PolyPhen2和SIFT算法，所得的氨基酸变化A54T(图3A和图3B)影响高度保守的残基并且不受理论所束缚，被认为是有害的。此外，发现该错义突变在另一个先前鉴定出的错义突变M77T附近，所述M77T先前已经在MSPC-FR-1中被鉴定出(图3A和图3B)。MSPC-TN-1的一个成员，即III:5被报告是无症状的，尽管其是A54T突变的携带者，这表明存在可能的修饰基因等位基因。对来自MSPC-RO-1索引患者III:3的NLRP1外显子1进行桑格测序揭示了第三杂合突变A66V(图3A和图3B；表2)，其在另外的家族成员中与疾病分离(图2A)。在MSPC-RO-1或其他MSPC家族中的TGFBR1编码序列中没有发现突变(表3)。

因此，在一个实例中，NLRP1突变位于PYD(热蛋白结构域)处。在另一个实例中，PYD结构域处的突变包括至少一个或两个或所有氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是但不限于A54T(其是位置54处的丙氨酸被取代成苏氨酸)、M77T(其是位置77处的甲硫氨酸被取代成苏氨酸)以及A66V(其是位置66处的丙氨酸被取代成缬氨酸)。在一个实例中，PYD结构域处的突变包括一个突变。在另一个实例中，PYD结构域处的突变包括两个突变。在又另一个实例中，PYD结构域处的突变包括三个突变。在另一个实例中，PYD结构域处的突变是错义突变。

对FKLC-EG-1V:3和V:5进行全外显子组测序揭示了这两个受影响的儿童都在NLRP1基因座内携带纯合缺失，其去除了第五外显子(图3A和图10A)。后续的桑格测序揭示了这种缺失以杂合状态存在于双亲中(图10B，左侧)并且在未受影响的同胞中不存在。截短的外显子5缺失的转录物可容易地在从先证者V:3分离的总mRNA中检测到(图10B，右侧)。在蛋白质水平上，这产生内部框内缺失p.F787_R843del，其去除了六个富含亮氨酸重复序列(LRR)中的第一个和前面的接头区域的一部分(图3A和图10A)。综上所述，这些发现表明MSPC和FKLC是由相同基因NLRP1中的不同种系突变引起的等位基因病症。不受理论所束缚，认为FLKC-EG-1中的两个受影响的儿童的严重症状归因于半显性NLRP1突变等位基因的纯合遗传，其在杂合亲本中表现为更轻度的皮肤缺损。

NLRP1是人类皮肤中的主要炎性体感受蛋白

与其他炎性体感受蛋白，例如像NLRP3相比，NLRP1的生理功能仍然不太了解。全基因组关联研究已经暗示了银屑病和白癜风相关自身免疫性疾病中的NLRP1单倍型(OMIM：606579)，这表明了NLRP1可能在皮肤特异性免疫应答中起作用。为了探索NLRP1在皮肤中的潜在功能，分析了人类蛋白质图谱RNA-seq数据库中NLRP1的组织表达谱。发现与具有更有限的组织分布的其他NLR，如NLRP3、AIM2、NLRC4以及MEFV相反，NLRP1广泛表达(图3C、图3D以及图10C)。进一步发现，皮肤被发现具有所测试的所有人类组织中最高表达水平的NLRP1(FKPM(每百万个定位片段中外显子的每千碱基的片段数)＝58.2±17.4)，而包括NLRP3、AIM2、NLRC4以及MEFV的其他已知炎性体感受蛋白在皮肤中不表达(FKPM<1)(图3C、图10C以及图10D)。

接下来，检查了皮肤中三种主要细胞类型，即角质形成细胞、黑色素细胞以及成纤维细胞中NLRP1和其他炎性体组分的转录物水平。NLRP1在角质形成细胞和成纤维细胞中可通过RT-PCR容易地检测到，但是在黑色素细胞中不容易检测到。相反，其他已知的炎性体NLR中没有一种可以在皮肤细胞类型中被检测到(图3D，左侧)。角质形成细胞表达所有其他炎性体组分，包括CASP1、ASC(也被称为PYCARD)、IL-1B以及IL-18，但是成纤维细胞不表达(图3D，右侧，泳道3和图10E)。实际上，培养的原代角质形成细胞中IL-1B和IL-18的水平超过未受刺激的外周血单核细胞(PBMC)中的水平(图3D和图10F)，这表明角质形成细胞在没有先前致敏的情况下准备好引发炎性体信号传导。

接下来，在石蜡保存的原代人类皮肤样品中验证NLRP1的表达。使用RNAscope原位染色，发现NLRP1mRNA在光滑皮肤和脚底皮肤中整个表皮和真皮成纤维细胞中表达(图3E，顶部和图10G)，这与RT-PCR结果一致。这通过使用抗NLRP1抗体进行免疫组织化学染色来证实(图3E，中间和底部)。此外，NLRP1在诸如毛囊的表皮附属物中表达(图10H)，这与在MSPC患者和FKLC患者中看到的毛囊角化过度症一致(图9H、图9J、图9K、图9M以及图9O；表1)。

MSPC突变和FKLC突变引起炎性体激活增加

许多激活炎性体的NLR蛋白共有共同的结构域结构，其包含N末端PYD，之后是NACHT结构域、进化上保守的NTP酶结构域以及LRR结构域。一般来说，认为NLR PYD引发炎性体组装，而NACHT结构域和LRR结构域调节自缔合和/或配体结合。在所有含有PYD的NLR中，人类NLRP1独特地具有C末端胱天蛋白酶激活和募集结构域(CARD)，其前面是自身蛋白水解“功能不明(function-to-find)”结构域(FIIND；图3A)，这两者都促进炎性体激活。

在N末端PYD内发现MSPC中的所有三个种系错义突变，即A54T、A66V以及M77T(图3A和图3B)。然而，该结构域在非灵长类动物哺乳动物物种中的NLRP1同源物中是不存在的，可能除了狗和马之外。鼠类基因组含有三种NLRP1同源物，即Nlrp1a、Nlrp1b以及Nlrp1c，但是它们中没有一种编码PYD(图10A，顶部)。相反，FKLC-EG-1中缺失的氨基酸残基(F787-R843)在人类与啮齿类动物之间是保守的并且包括LRR结构域中的第一个LRR以及前面的接头区域的一部分(图10A)。不受理论所束缚，认为NLRP1LRR结构域参与自身抑制，这是因为NLRP1DLRR突变体已经被证实在体外引起组成型炎性体激活。类似地，接头区域已经牵涉到鼠类Nlrp1a的自身抑制，尽管它在人类NLRP1中的作用尚不清楚。

因此，在一个实例中，PYD结构域处的突变是错义突变。在另一个实例中，LRR结构域处的突变是缺失。在又另一个实例中，所述缺失是框内缺失。

错义突变是核酸序列中存在的点突变。一个单核苷酸的这种改变引起密码子结合，其编码不同的氨基酸，从而引起所得肽发生变化。

如本文所用的术语“框内缺失”指的是核酸序列中的任何插入或缺失，其可被3整除，从而不引起核酸序列的阅读框发生变化。

在一个实例中，所述突变处于LRR结构域处，引起位置787处的氨基酸苯丙氨酸至位置843处的精氨酸的缺失(即F787至R843或F787_R843del)。换句话说，LRR结构域处的突变引起氨基酸F787至R843之间氨基酸序列的截短，从而保留氨基酸F878至R843。

为了研究MSPC突变和FKLC突变的功能后果，测试了过表达的NLRP1突变体是否可以使炎性体衔接蛋白ASC的低聚物组装体成核。当用编码NLRP1MSPC和FKLC突变体的质粒转染稳定表达ASC-GFP的293T细胞(293T-ASC-GFP)时，观测到相对于表达野生型NLRP1的细胞，具有ASC-GFP斑点的细胞百分比显著增加(图4A)。此外，在DSS交联之后，在过表达NLRP1突变体的细胞中观测到更高量的ASC二聚体和低聚物(图4B，泳道3、泳道4、泳道5和泳道8对比泳道2)。这些体外结果表明，与野生型NLRP1相比，MSPC和FKLC中的NLRP1突变体可以引起炎性体组装增加。

由于NLRP1中的高度天然多态性，因此克隆了在PYD中具有非同义SNP的NLRP1的所有次要等位基因。16个SNP中没有一个显著改变具有斑点的293T-ASC-GFP细胞的百分比(图4C)，这支持了在MSPC患者中发现的NLRP1变体是真实的、罕见的致病性突变体。

接下来，检查MSPC中的NLRP1突变体以观测这些突变体是否可以引起胱天蛋白酶-1对IL-1b前体的加工增加。为此，使野生型NLRP1、NLRP1突变体、胱天蛋白酶-1前体以及IL-1b前体在HEK293T ASC-GFP细胞中过表达以重建功能性炎性体复合物。与野生型NLRP1相比，所有三种MSPC和FKLC突变体都引起更高量的IL-1b前体切割(图4D，泳道3、泳道4和泳道5对比泳道2；泳道11对比泳道10)，其水平与已知的功能获得型NLRP3R262W突变体相当(图4D，泳道7对比泳道6)。总之，这些结果证实所有NLRP1突变体都在体外引起炎性体的过度激活。此外，发现当在永生化角质形成细胞中以生理水平表达时，所有四种疾病相关的NLRP1突变体都引起显著量的成熟IL-1b分泌(图4E，泳道4-泳道7对比泳道3)。发现这种效应依赖于衔接蛋白ASC，这是因为经过针对ASC的siRNA预处理的角质形成细胞在突变型NLRP1过表达之后显示出分泌的IL-1b水平显著降低(图4F，插图，泳道2对比泳道1和泳道3)。

尽管FKLC突变体F787_R843del的功能获得效应可以容易地通过LRR结构域的自身抑制功能来合理说明，但是证实了被广泛认为会促进ASC组装的PYD中的突变可以产生类似的效应。为了获得另外的证据确认MSPC NLRP1突变体的功能获得效应，产生稳定的THP-1细胞系，其表达多西环素诱导型野生型和突变型NLRP1(A54T、M77T或A66V；图11A和图11B)。表达NLRP1突变体的THP-1巨噬细胞经历细胞死亡和成熟IL-1b分泌增加(图11C和图11D)，这可以被胱天蛋白酶-1抑制剂Z-WEHD-FMK(图11E)或CRISPR/Cas9介导的ASC(PYCARD)或胱天蛋白酶-1(CASP1)缺失(图11F)阻断。总之，这些结果进一步证实NLRP1MSPC突变足以引起炎性体激活增加。

NLRP1的热蛋白结构域充当非典型的自身抑制性结构域

与其他炎性体感受蛋白相比，NLRP1独特地由PYD和CARD这两者组成(图3A)。人类基因组中编码的所有PYD的序列比较揭示了NLRP1 PYD定义它自身的分支(图5A)。然而，MSPC中突变的所有氨基酸残基，即A54、A66以及M77在其他NLR中是保守的，包括已知的炎性体感受蛋白NLRP3、AIM2以及MEFV(图5B)。

为了进一步表征A54T、A66V以及M77T如何引起炎性体过度激活，测试了这些突变直接增强ASC低聚物组装的可能性。虽然当在293T ASC-GFP细胞中表达成mCherry融合蛋白时NLRP3 PYD结构域和AIM2PYD结构域这两者都引起稳健的ASC斑点形成(图5C)，但是野生型NLRP1 PYD和突变型PYD在相同的环境中都不引起ASC斑点(图5C和图12A)。因此，认为NLRP1 PYD不可能直接增强ASC斑点形成。

基于这些结果并且不受理论所束缚，认为NLRP1 PYD起到了与其他PYD根本不同的作用，并且它将NLRP1维持在自身抑制的无活性状态，而不是直接参与ASC低聚物形成。因此，测定了一系列N末端截短的NLRP1突变体在293T ASC-GFP细胞中引发ASC斑点形成的能力(图5D、图5E以及图12B)。类似于MSPC突变体M77T，所有N末端截短突变体都显示出具有ASC-GFP斑点的细胞百分比增加到约3倍至6倍(图5D和图5E)并且引起IL-1b加工增加(图12D，泳道3-泳道9对比泳道2)。值得注意的是，简单地去除PYD(氨基酸93至1474；图5D)引起ASC-GFP斑点形成增加和IL-1b加工增加，尽管该突变体的表达水平非常低(图12D，泳道4)。此外，缺乏PYD的所有NLRP1截短突变体都引起永生化角质形成细胞中内源性IL-1b的分泌增加(图5F)。实际上，C末端自身蛋白水解片段(氨基酸1213至1474)足以使ASC-GFP斑点成核(图5G)并且强烈激活炎性体信号传导(图5D至图5F)。

相反，缺乏CARD的所有C末端截短突变体都未能增加293T ASC-GFP细胞中ASC斑点的数量(图5F和图12C)，增加IL-1b加工(图12D，泳道10和泳道11对比泳道2和泳道3，以及图12E，泳道8-泳道11对比泳道7)或激活永生化人类角质形成细胞中的IL-1b分泌，即使在M77T突变存在下也是这样(图5F)。综上所述，这些结果证实了NLRP1 PYD是自身抑制结构域，而包含CARD的C末端自身蛋白水解片段负责激活炎性体。

MSPC中的NLRP1突变破坏PYD结构域折叠

NLRP1 PYD的功能表征表明了三个错义MSPC突变可能通过破坏PYD依赖性自身抑制来引起炎性体过度激活。先前已经证实，NLRP1 PYD形成一束五个螺旋，这与由六个螺旋组成的规范死亡结构域超家族折叠形成对比(图5H)。有趣的是，MSPC突变A54T、A66V以及M77T都影响沿着中心螺旋(a4和a5)位于疏水核心内的残基(图5H)。这些残基的突变因此预期会使PYD结构不稳定。为了测试这一点，纯化重组野生型和突变型NLRP1 PYD。除了M77T之外，所有重组PYD都是可溶的并且被分离到>99％纯度(图12F，插图)并且作为单一单体从尺寸排阻色谱中洗脱(图12F)。然后，使用溶液中二维[¹⁵N,¹H]-HSQC NMR查询所有重组NLRP1PYD的折叠状态。虽然野生型NLRP1 PYD以及三种PYD SNP变体S55L、E63K和Q64L显示出天然折叠蛋白特征性的良好分散的化学位移谱(图5I左侧和图12G)，但是发现两种MSPC突变体A54T和A66V都填充“无规卷曲”区域(图5I，中间和右侧)，这表明A54T和A66V突变体在溶液中错误折叠/解折叠。通过重组野生型和突变型NLRP1 PYD的圆二色性分析证实了这些发现(图12H)。作为需要这些保守残基维持整体PYD构造的进一步证据，发现将MSPC突变“移植”到NLRP3中(图5H)消除了PYD依赖性炎性体激活(图12I和图12J)。

NLRP1 PYD和LRR介导的自身抑制的机制基础

阐明NLRP1激活的结构基础在传统上受到了NLRP1的真正配体的缺乏的阻碍。据推断，从MSPC和FKLC血缘族中鉴定的激活突变体提供了一个独特的机会来探索NLRP1炎性体激活的机制基础。

为了解决这个问题，使用蓝色非变性PAGE(BN-PAGE)来直接可视化野生型和患者来源的突变型NLRP1蛋白的天然构象。过表达的野生型NLRP1在非变性条件下迁移为约150kDa的分子尺寸处的显著条带(图6A，顶部和中间)，其在尺寸上类似于天然兔IgG(图13A)和SDS-PAGE上变性未切割的NLRP1(图6A，底部)。因此，大多数野生型NLRP1分子可能是单体的。相反，对于MSPC突变体和FKLC突变体，这种150kDa单体物质的丰度显著降低。相反，这些突变体主要作为高分子量低聚物迁移(图6A，泳道2至泳道5)。这些结果表明PYD结构域和LRR结构域独立地为将NLRP1维持成单体并且防止自发自低聚化所需。

与该模型一致，DPYD突变体(氨基酸93至1474)仅作为高分子量低聚物被发现(图6B，泳道4，顶部)，尽管它的表达水平低(图6B，泳道4，中间)。相反，CARD从NLRP1M77T突变体中缺失显著减少了低聚物形成(图6B，泳道3对比泳道2)。另一方面，C末端自身蛋白水解片段(氨基酸1213至1474；分子量：约30kDa)仅作为约1000kDa的低聚物存在(图6B，泳道5)。连同先前的功能实验(图5A至图5F)一起，推测该片段含有NLRP1低聚化和炎性体激活所需的所有关键结构要素。因此，阻断经由自身蛋白水解切割产生该片段被认为抑制NLRP1突变体激活炎性体。实际上，当将切割位点突变F1212A引入MSPC突变体和FKLC突变体中(图6C，底部)时，它严重减少NLRP1低聚化并且引起单体150kDa条带的再现(图6C，泳道4、泳道6和泳道8对比泳道3、泳道5和泳道7)。在功能上，F1212A突变消除了MSPC突变体和FKLC突变体使ASC-GFP斑点在293T细胞中成核(图6D)和激活角质形成细胞中胱天蛋白酶-1依赖性IL-1b分泌(图6E)的能力，这确认了自身蛋白水解切割是NLRP1低聚化和下游炎性体激活的先决条件。

使用二维PAGE进一步表征C末端切割片段在NLRP1MSPC突变体中的作用。通过BN-PAGE将表达NLRP1的293T裂解物分级分离，从切下的凝胶切片洗脱，并且通过还原SDS-PAGE进一步分离。全长野生型NLRP1和它的C末端片段这两者都主要存在于对应于约150kDa的更低分子量级分中，这类似于天然四聚体GAPDH(图13B，级分5，底部)。相反，NLRP1M77T突变体显示出高分子量级分中C末端片段的水平增加(图13B，中间，级分1-4)，这表明NLRP1突变体的低聚化增加确实可以归因于C末端自身蛋白水解片段。

综上所述，这些发现使我们得到了NLRP1功能的模型，如图6F中所示。虽然野生型NLRP1在不存在配体的情况下作为无活性单体存在，但是与推定配体的结合快速引起NLRP1以依赖于FIIND结构域内的自身蛋白水解切割的方式自低聚化。当PYD结构域或LRR结构域分别如在MSPC和FKLC中那样突变时，该自抑制机制丧失。这触发了组成型自低聚化和自发炎性体激活。此外，不同于其他NLR PYD，重组NLRP1 PYD在体外不引发ASC丝形成(图13C)，并且没有检测到NLRP1 PYD与CARD之间的直接相互作用(图13D)。

NLRP1激活经由旁分泌IL-1信号传导引起表皮炎症和增生

由于原代人类表皮角质形成细胞是表达NLRP1炎性体的所有组分的主要皮肤细胞类型(图3)，因此角质形成细胞内的NLRP1激活被认为直接导致MSPC和FKLC病变。永生化角质形成细胞中的NLRP1过表达(图7A和图14B)仅在表达NLRP1突变体的细胞中引起核周ASC斑点(图14A)并且引起释放到培养基中的炎性体依赖性细胞因子IL-1a、IL-1b以及IL-18的水平增加到>100倍(图7B)。与特异性胱天蛋白酶1抑制剂Z-WEVD-FMK共孵育消除了这种增加(图7B)。此外，相对于野生型NLRP1，表达NLRP1突变体的角质形成细胞表现出细胞死亡增加到>5倍，如通过乳酸脱氢酶释放所测量(图14C)。

随后，使用下一代RNA测序来表征MSPC NLRP1突变体对角质形成细胞基因表达的影响(图7C)。差异调节的转录物的无监督的聚类清楚地区分表达突变型NLRP1的角质形成细胞与对照，尽管过表达的水平非常适度(FKPM的1.2倍；图14D)。基因集富集分析(GSEA)揭示了上调转录物中IL-1/NFkB信号传导途径基因的显著富集(图7C，右侧)，这表明了IL-1/NFkB激活可能是在MSPC和FKLC中看到的皮肤病变的驱动因素。

对上调转录物的更仔细检查揭示了与原代角质形成细胞中重组IL-1a诱导型基因的先前数据集的显著重叠(图7D，插图)。这些包括应激响应性分泌因子、已知的促炎性细胞因子以及角质形成细胞分化标志物(图7D、图14E以及图14F)。这些结果表明NLRP1炎性体激活的后果远远延伸超出了直接焦亡性细胞死亡和起始细胞的IL-1释放。分泌的IL-1细胞因子可能触发周围细胞释放其他炎性细胞因子，从而产生旁分泌促炎性环境。与该模型一致，用重组IL-1和TNFa以及来自MSPC原代角质形成细胞培养物的条件培养基处理引起角质形成细胞应激标志物S100A9和PI3(图14G)以及来自真皮成纤维细胞的IL-6、IL-8和FGF7(也被称为角质形成细胞生长因子，KGF)(图14H)的转录物水平增加。鉴于这些细胞因子和生长因子在皮肤炎症性和增生性疾病中起作用，进一步认为在MSPC患者和FKLC患者中看到的复发性、局灶性角化过度生长是IL-1驱动的促炎性和促增殖性旁分泌信号传导的直接结果。实际上，用IL-1a、IL-1b以及IL-18处理的皮肤器官型培养物显示出表皮厚度(图7E和图7F，左侧)和基底层中增殖性Ki67阳性细胞(图7E和图7F，右侧)的显著增加以及基底上层角蛋白-10和内披蛋白阳性分化角质形成细胞的扩增(图7E)。这与RNA-seq实验中所示的角质形成细胞分化标志物的上调(图6D和图S6E)以及MSPC病变和FKLC病变的高度角质化性质(图1B-图1D、图1F、图1L以及图S1F)一致。此外，IL-1处理的离体表皮显著上调应激标志物S100A8/9和S100A7/牛皮癣素(图14I)。该数据提供了进一步的证据表明旁分泌IL-1/NFkB信号传导足以引起表皮增生。

MSPC患者和FKLC患者中的角质形成细胞炎性体激活的体内证据

为了研究患者细胞中的内源性NLRP1炎性体，从两名MSPC先证者MSPC-TN-1IV:2(NLRP1A54T/+)和MSPC-RO-1III:3(NLRP1A66V/+)以及一名FKLC先证者FKLC-EG-1V:3(NLRP1F787_R843del/F787_R843del)和她的轻度受影响的父亲FKLC-EG-1III:5(NLRP1F787_R843del/+)获得皮肤钻取活检。成功分离了五个独立的角质形成细胞培养物并且命名为NLRP1A54T/+病变、NLRP1A54T/+非病变、NLRP1A66V/+非病变、NLRP1F787_R843del/F787_R843del病变以及NLRP1NLRP1F787_R843del/+。使用Luminex平台比较患者的原代角质形成细胞的细胞因子和趋化因子谱与源自于无关健康供体的那些。真正的炎性体依赖性细胞因子IL-1b是源自于MSPC先证者和FKLC先证者的角质形成细胞培养物中上调的排名第一的细胞因子，其次是TNFa、IL-1RA、IL-1a、TGFa以及GM-CSF(图8A；p<0.05，单尾t检验)。使用定量ELISA确认IL-1b、IL-18以及IL-1a分泌的显著增加(图8B)。这些结果表明MSPC患者和FKLC患者的角质形成细胞易于在培养物中引起自发炎性体激活和细胞因子释放。还有可能在来自MSPC患者和FKLC患者的DSS交联的角质形成细胞裂解物中通过蛋白质印迹观测到内源性ASC低聚物，但是在源自于健康供体的角质形成细胞中不能观测到(图8C，泳道1和泳道2对比泳道3-泳道6)。没有观测到来自MSPC患者和FKLC患者的血清中IL-1b水平的增加(图8D和图15A)。

有趣的是，源自于FKLC-EG-1先证者的父亲的角质形成细胞也显示出ASC低聚物形成，尽管事实上没有对IL-1b和IL-18分泌的显著诱导。据推测，F787_R843del突变在杂合状态下仅引起轻度的炎性体激活，这与他的亚临床症状一致。在这方面，值得注意的是，鼠类Nlrp1a的相同区域中的激活性功能获得型突变在杂合状态下不显示出表型，但是已经被证实当育种成纯合性时引起严重的自身炎症。最终，在来自MPSC先证者MSPC-TN-1IV:20(NLRP1A54T/+)的原发性鳞状细胞增生性皮肤病变活检中验证了炎症标志物S100A8/9和S100A7/牛皮癣素的上调(图8E和图15B)，这进一步证实了MSPC病变由于NLRP1炎性体激活而经历慢性的、未消退的炎症反应。

综上所述，已经基于上文提供的信息解决了两种皮肤病症MSPC和FKLC的遗传病因学。证实了MSPC患者在掌跖皮肤以及结膜和角膜上皮中经历复发性角化棘皮瘤(KA)，并且对恶性鳞状细胞癌具有高度易感性。FKLC与MSPC共有许多临床症状，但是表现出更严重的症状，如四肢和躯干上泛发的苔藓样丘疹病变。

NLRP1功能获得型和功能丧失型变体的后果

结果表明这两种疾病是等位基因的并且都由炎性体感受蛋白NLRP1中的种系突变引起。虽然所有MSPC病例都由NLRP1的PYD中的杂合错义突变引起，但是FKLC起源于高度保守的NLRP1LRR结构域内的内部缺失的双等位基因遗传。在功能上，NLRP1中的所有MSPC突变和FKLC突变都是功能获得型并且引起炎性体激活增加。

尽管内源性NLRP1在免疫防御中的功能仍尚不清楚，但是值得注意的是，诸如大象、刺猬以及海豚的其他哺乳动物中的NLRP1同源物已经获得了大量无效突变，以致NLRP1可以被认为是这些哺乳动物物种中的假基因。重要的是，已经发现至少五个健康个体在NLRP1中携带纯合剪接位点突变。对这些可能的NLRP1无效健康个体的鉴定表明了缺乏NLRP1与功能获得型突变相比可能不那么有害。

MSPC和FKLC的发病机制的模型

不受理论所束缚，认为慢性的、未消退的角质形成细胞驱动的炎症构成了MSPC和FKLC中病理学的基础(图8F)。这两种疾病中的特征性复发性局灶性病变都被认为起源于选择的角质形成细胞中NLRP1炎性体的异常激活。随后IL-1细胞因子的快速局部释放促使涉及邻近的角质形成细胞和成纤维细胞的旁分泌信号传导网络开始，从而引起继发性炎性细胞因子和生长因子，如TNFa和KGF的分泌。这种异常的“伤口愈合”样响应然后引起表皮增生和角化棘皮瘤形成。随着病变生长并且破坏皮肤屏障，浸润的免疫细胞可能起作用以控制和限制病变，从而引起如在MSPC患者中所观测到的消退。然而，多年来持续未消退的炎症被认为有助于获得额外的致癌突变并且促进向SCC发展的恶性转化(图8F)。

PYD介导的炎性体调节的机制

进行的生物化学分析揭示了NLRP1的独特生物化学特性。NLRP1 PYD出人意料地充当自身抑制结构域，这不同于其他已知炎性体感受蛋白的PYD。因此，尽管同时具有PYD和CARD，但是认为NLRP1应当在功能上被分类为含NOD、LRR以及CARD(NLRC)蛋白，而不是含NOD、LRR以及热蛋白结构域(NLRP)蛋白。NLRP1 PYD与LRR结构域非冗余地起作用以将NLRP1维持在无活性单体形式。当任何一个结构域发生突变时，如在MSPC和FKLC的情况下那样，这种自身抑制机制丧失。这导致NLRP1低聚化的倾向增加。进一步证实单体向低聚物的转变是NLRP1炎性体激活的必要步骤并且需要FIIND结构域的自身蛋白水解切割。这些发现定义了炎性体调节的机制并且为未来的结构研究提供了概念框架。

炎性体在皮肤癌易感性和皮肤炎症性疾病中

鼠类研究已经暗示了上皮增生中的炎性体组分。本文所示的数据建立了异常炎性体激活与遗传性炎症性和增生性皮肤病症之间的联系。因此，炎性体调节可以在临床上用于并且在临床上用于改善慢性皮肤炎症性疾病和降低上皮性皮肤肿瘤的风险。

NLRP1在一般人群中是高度多态的。认为每一种NLRP1单倍型与不同的激活倾向有关，MSPC突变体和FKLC突变体代表该范围的极端。这一思路与先前的全基因组关联研究(GWAS)一致，所述全基因组关联研究将NLRP1SNP与泛发型白癜风、艾迪生氏病以及先天性弓形体病相联系。此外，FKLC的表型与几种常见的皮肤病显著重叠，如毛发角化病和扁平苔癣，对这些疾病的机制见解目前缺乏。

本文说明性描述的发明可以在不存在本文没有具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制条件的情况下被适当地实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当被宽泛地并且不加限制地解读。此外，本文所用的术语和措辞已经被用作描述性术语而非限制性术语，并且并不意图在使用这些术语和措辞时排除所示的和所述的特征或其部分的任何等同方案，但应当认识到的是，各种改动方案在要求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当了解的是，尽管已经通过优选的实施方案和任选的特征明确地公开了本发明，但是本文所公开的其中所体现的发明的改动方案和变化方案可以由本领域技术人员所采取，并且这些改动方案和变化方案被认为落入本发明的范围内。

除非上下文另外明确规定，否则如本申请中所用的单数形式“a/an(一)”和“所述”包括复数指代对象。举例来说，术语“一种遗传标志物”包括多种遗传标志物，包括其混合物和组合。

如本文所用的术语“约”在制剂的组分浓度的背景下通常意指指定值+/-5％，更通常是指定值+/-4％，更通常是指定值+/-3％，更通常是指定值+/-2％，甚至更通常是指定值+/-1％，并且甚至更通常是指定值+/-0.5％。

在整个本公开中，某些实施方案可以范围的形式被公开。应当了解的是，呈范围形式的说明仅仅是为了方便和简洁起见并且不应当被理解成对所公开范围的范围的硬性限制。因此，对范围的说明应当被认为是已经具体地公开了该范围内的所有可能的子范围以及单个数值。举例来说，对诸如1至6的范围的说明应当被认为是已经具体地公开了该范围内诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等子范围以及单个数值，例如1、2、3、4、5以及6。无论范围的宽度如何，这均适用。

某些实施方案也可以被宽泛地和一般性地描述于本文中。落入一般性公开内的较缩小内容和亚类分组中的每一个也形成本公开的一部分。这包括以从所述类中去除任何主题的附带条件或负面限制条件来一般性地说明实施方案，不论所排除的内容是否在本文被具体地叙述。

本发明已经在本文中被广泛地和一般地描述。落入一般性公开内的较缩小内容和亚类分组中的每一个也形成本发明的一部分。这包括以从所述类中去除任何主题的附带条件或负面限制条件来一般性地说明本发明，不论所排除的内容是否在本文被具体地叙述。

其他实施方案在以下权利要求和非限制性实施例内。此外，在本发明的特征或方面以马库什组(Markush group)来描述的情况下，本领域技术人员将认识到的是，本发明也因此以马库什组的任何单个成员或成员的子组来描述。

实验部分

实验模型和受试者细节

MSPC受试者和FKLC受试者

由临床遗传学家和/或皮肤科医生鉴定和诊断MSPC家族和FKLC家族。使用OrageneDNA收集试剂盒(OG-500，DNAGenotek公司)从唾液中分离所有基因组DNA样品。在以下机构中根据当地伦理审查委员会要求从所有单个家族成员获得知情同意书：法国图卢兹(Toulouse,France)的保护人权委员会西南地区和海外II(Comitéde Protection desPersonnes Sud-Ouest et Outre-Mer II)和保护人权委员会西南地区和海外II；国家传染病研究所(National Institute for Infectious Diseases)“Matei Bals”；罗马尼亚布加勒斯特的“卡罗尔戴维拉”医药大学("Carol Davila”University of Medicine andPharmacy,Bucharest,Romania)；突尼斯苏斯的哈吉德大学医院(Farhat HachedUniversity Hospital,Sousse,Tunisia)；埃及亚历山大大学的医学院(Faculty ofMedicine,Alexandria University,Egypt)；新加坡科技研究局的医学生物学研究所(Institute of Medical Biology,A*STAR,Singapore)。

细胞培养

在补充有10％FBS的完全高葡萄糖DMEM培养基(生命科技公司(LifeTechnologies))中培养所有293T和衍生细胞系。在补充有10％FBS的RPMI-1640培养基中培养THP-1细胞。通过与400ng/ml佛波醇肉豆蔻酰乙酸酯一起孵育48小时来诱导THP-1分化。来自健康人类皮肤的原代角质形成细胞和成纤维细胞是在完全知情同意的情况下从去识别化的剩余手术废物中获得以及在完全伦理许可的情况下经由IMB皮肤细胞库(IMB SkinCell Bank)获得。来自MSPC患者和FKLC患者的原代角质形成细胞是从新鲜皮肤钻取活检中分离并且在小鼠3T3饲养细胞上培养。在补充有300mM CaCl₂的KSFM培养基(生命科技公司)中培养永生化的N/TERT-1角质形成细胞。

方法细节

MSPC家族的外显子组测序

对于MSPC外显子组测序，使用Illumina TruSeq外显子组富集试剂盒(Illumina公司)对1mg纯化的基因组DNA进行外显子组捕获。在UCLA临床基因组学中心(UCLA ClinicalGenomics Centre)使用Illumina HiSeq2500高输出模式进行测序作为100bp(碱基对)配对末端运行。使用Novoalign(2.07版)将序列读段与人类参考基因组(人类GRCh37/hg19基因组版本)比对。通过Picard(1.42版)鉴定PCR重复并且使用GATK(基因组分析工具包)(1.1版)重新比对插入和缺失(INDEL)，重新校准质量分数，呼叫、过滤、重新校准和评价变体。使用变体注释器X(Variant Annotator X，VAX)注释所测序的蛋白质编码区和侧接连接区中的SNV和INDEL，所述变体注释器X是定制的Ensembl变体效应预测器(Yourshaw等,2014)。在整个外显子组中实现约85倍的平均覆盖度。

FKLC-EG-1的外显子组测序

在知情同意之后，使用溶液内杂交，使用SureSelect全外显子50Mb 4.0版(安捷伦科技公司(Agilent))对来自两名受影响的同胞的基因组DNA进行全外显子组捕获，之后以100bp配对末端读段进行大规模平行测序(Illumina HiSeq2000)。使用BCFtools应用程序(samtools.github.io/bcftools/)过滤所得的变体呼叫，过滤最小覆盖度(过滤具有少于四个读段的呼叫)并且对质量进行硬过滤(从进一步分析中过滤具有质量<20的变体)。然后使用ANNOVAR工具(www.openbioinformatics.org/annovar/)关于基因和对蛋白质序列和/或剪接的影响对该高质量呼叫组进行注释。经由另外轮次的ANNOVAR注释针对dbSNP135(www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)、来自千人基因组计划(1000Genomes project)(www.1000genomes.org/)和国家卫生研究院心脏、肺和血液研究所Grand Opportunity外显子组测序计划(National Institutes of Health Heart,Lung and Blood InstituteGrand Opportunity Exome Sequencing Project)(esp.gs.washington.edu/drupal/)的群体频率估计值以及已经经由相同的生物信息学分析管道处理的约2000个对照外显子组进行进一步注释。

RT-PCR、原位染色以及免疫组织化学

人类组织RNA阵列购自Clontech公司。使用iScript cDNA合成试剂盒，根据制造商的说明书(Clontech公司)，使用20μl中1μg纯化的RNA进行cDNA合成。使用HotStart Taq聚合酶(快而精公司(QIAGEN))，使用1μl的10倍稀释的cDNA进行RT-PCR。使用SYBR绿色主混合物(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))，使用1μl的10倍稀释的cDNA在三个重复孔中进行Q-PCR。引物列于表4中。

在知情同意的情况下从去识别化的剩余手术废物中获得用于免疫组织化学的对照皮肤切片。使用‘棕色试剂盒’，使用制造商提供的对照(dapB和POLII)以及定制合成的针对人类NLRP1的探针来进行RNAscope(Advanced Cell Diagnostics公司)染色。使用兔多克隆NLRP1抗体(Adipogen公司，AL176)遵循标准免疫组织化学方案进行NLRP1染色。对于抗原修复，将载片在柠檬酸钠缓冲液(10mM柠檬酸钠、0.05％Tween 20[pH 6.0])中在95℃加热20分钟。将一抗在抗体稀释缓冲液(于PBS中10％正常山羊血清、1％BSA)中在4℃稀释过夜。使用Dako EnVision兔HRP试剂盒(安捷伦科技公司)将信号可视化。

质粒构建

为了构建用于瞬时转染的质粒，使用标准限制性克隆，用ClaI和XhoI位点将PCR扩增的NLRP1和NLRP3cDNA克隆到pCS2+载体中。通过将对应的cDNA片段InFusion克隆到AgeI-EcoRI线性化的pTRIPZ骨架(Clontech公司)中来构建多西环素诱导型NLRP1和NLRP3表达质粒。通过在pCDH-puro(系统生物公司(Systems Bio))中进行Infusion克隆(Clontech公司)来组装ASC-GFP慢病毒构建体。

瞬时转染和稳定慢病毒过表达

在293T细胞中通过共转染第二代辅助质粒产生所有慢病毒，使用Lenti-X(Clontech公司)浓缩并且保持为冷冻原液直到使用为止。使用Lipofectamine2000(生命科技公司)进行293T瞬时转染实验，而使用FugeneHD(普洛麦格公司(Promega))，根据提供的方案，使用‘3:1’比率进行永生化角质形成细胞中的所有转染实验。汇集的针对人类PYCARD(ASC)的siRNA购自赛默飞世尔公司并且使用Lipofectamine RNAiMax(生命科技公司)转染。

二丁二酰亚胺基辛二酸酯(DSS)交联

将所有收获的细胞沉淀物保持在-80℃直到使用为止。对于DSS交联，将来自6孔板中的汇合孔的细胞沉淀物在37℃在持续混合下在200μl的1mM DSS的PBS溶液中悬浮15分钟。将交联的沉淀物以20,000RCF离心5分钟。将蛋白质复合物在95℃在1倍Laemmli SDS-PAGE缓冲液中溶解10分钟并且再次以20,000RCF离心5分钟。使用上清液进行蛋白质印迹分析。

SDS-PAGE、蛋白质印迹以及ELISA

使用布拉德福德测定(Bradford assay)定量蛋白质裂解物并且对于SDS-PAGE，每孔使用20mg。使用TransBlot(伯乐公司(Bio-rad))，使用‘混合分子量’设置(25V，7分钟)转移蛋白质。通过在4℃与在含有1％Tween-20和3％脱脂乳的1×TBS中稀释的一抗孵育过夜来进行蛋白质印迹法。严格根据制造商推荐的方案进行所有ELISA实验。

免疫荧光

将293T-ASC-GFP细胞以约70％汇合度接种到聚赖氨酸包被的盖片上。将N/TERT永生化角质形成细胞接种到未包被的盖片上。将所有细胞培养在生长培养基中并且使其贴壁过夜。将盖片用于1×PBS中4％的多聚甲醛固定并且用于1×PBS中0.5％的Triton-X透化。将所有一抗在含有1％BSA和0.05％Triton-X的PBS中稀释。在温和混合下在4℃进行一抗孵育过夜。在室温下进行二抗孵育1小时至2小时。使用含有DAPI的Prolong Gold封片介质(赛默飞世尔公司)来封固盖片。

蓝色非变性PAGE和二维PAGE

使用NativePAGE Bis-Tris凝胶系统(赛默飞世尔公司)，根据制造商的说明书，在稍有改动的情况下进行蓝色非变性PAGE。简单地说，使用Lipofectamine 2000试剂(赛默飞世尔公司)在标准6孔板中以每孔1μg质粒的比率用各种NLRP1表达质粒转染293T细胞。在转染后48小时收获细胞并且在含有1％毛地黄皂苷的样品制备缓冲液中裂解，通过以20,000RCF离心10分钟来澄清并且用考马斯(Coomassie)G-250补充到0.25％的最终浓度。对于BN-PAGE使用每孔10μl的蛋白质裂解物。在150V恒定电压下使用‘深蓝色’阴极缓冲液进行电泳约1小时，继而在250V下使用‘淡蓝色’缓冲液进行电泳约1.5小时。使用Trans-Blot Turbo系统在25V下将蛋白质转移到PVDF膜上10分钟，并且通过标准蛋白质印迹程序检测而没有推荐的乙酸固定步骤。对于二维PAGE，切下整个BN-PAGE凝胶泳道并且切割成8个切片。在室温下在持续混合下将每一个切片在含有50mM Tris-HCl、150mM NaCl以及0.1％SDS的洗脱缓冲液中洗脱过夜。第二天，使用Amicon Ultra 0.5mL过滤器(MWCO＝30kDa)(默克密理博公司(Merck Millipore))将上清液浓缩到40ml并且补充以10ml 1×Laemmli缓冲液。

Luminex多重细胞因子/趋化因子阵列

使用人类细胞因子/趋化因子组I(HCYTMAG-60K-PX41，默克密理博公司)，根据制造商的方案进行Luminex多重细胞因子和趋化因子阵列。在Multiple Experiment Viewer(www.tm4.org)中使用‘分层聚类’分析来自不同样品的细胞因子水平。

重组蛋白纯化和NMR结构分析

使重组GB1-PYD WT和它的突变体在大肠杆菌BL21中表达。通过Superdex 75凝胶过滤色谱(通用电气医疗公司(GE healthcare))使用含有50mM Na₂HPO₄、50mM NaCl、20mMDTT的洗脱缓冲液(pH 6.5)将所有重组蛋白从可溶性级分中纯化到均一。对于NMR研究，通过使用以¹⁵NH₄Cl制备的标准M9基本培养基来产生U-¹⁵N标记的蛋白质。在含有95％/5％H₂O/D₂O、50mM Na₂HPO₄、50mM NaCl、20mM DTT的缓冲液(pH 6.5)中以100mM至200mM的蛋白质浓度制备NMR样品。由于切割蛋白的溶解度低，因此将重组PYD维持成GB1融合蛋白用于NMR实验。在配备有室温和低温三共振探针的Bruker 600和700MHz光谱仪中在25℃记录二维[¹⁵N,¹H]-HSQC谱。

RNA-Seq

使用Illumina TruSeq链式mRNA试剂盒处理总RNA样品。使用KAPA qPCR和Agilent生物分析仪定量制备的文库并且在Illumina HiSeq-2000上测序。使用Galaxy套件中的TopHat和CuffLink处理和定位读段。使用CuffDiff获得差异基因表达。

PYD的系统发育分析

从Prosite下载人类基因组中PYD的氨基酸序列并且使用Muscle算法进行比对。使用ClustalW2-Phylogency，使用邻接聚类法计算序列相似性并且使用Tree-Of-Life(itol.embl.de/)可视化。

三维皮肤器官型共培养

简单地说，将所有溶液保持在冰上，通过使用8份胶原(大鼠尾I型胶原(碧迪生物科技公司(BD biosciences))，悬浮在乙酸中)与含有1×10⁵个正常人类成纤维细胞(NHF)的1份10×DMEM和1份FBS混合来形成每一个凝胶。然后将胶原-NHF混合物加载到细胞培养插入物(碧迪生物科技公司)中并且使其在37℃凝固，之后将NHF培养基添加到培养物中。在三天之后，将1×10⁶个正常人类原代角质形成细胞(NHK)在NHK培养基中接种到胶原凝胶的顶部上。第二天，将培养物升高到空气-培养基界面。在空气提升之后，然后用细胞因子IL-1a(R&D系统公司(R&D Systems)、IL-1b(R&D系统公司)、IL-18(MBL公司)的混合物处理凝胶以得到各自10ng/ml的最终浓度，或未处理作为对照。然后通过每2天-3天更换一次培养基来更换添加剂。在7天之后收获器官型共培养物并且包埋在OCT中以用于冷冻切片。

器官型培养物的免疫荧光染色

使三维器官型培养物的冷冻切片暴露于1:1甲醇:丙酮固定，之后与10％山羊血清一起孵育20分钟以阻断非特异性结合。然后在4℃添加一抗过夜。一抗包括兔ki67(ab15580，艾博抗公司(Abcam)，1:50)、小鼠角蛋白10(克隆DEC10，徕卡公司(Leica)，1:50)、内披蛋白(克隆SY5，艾博抗公司，1:100)、S100A7(克隆MAC 387，丹科公司(Dako)，1:50)以及S100A9/8(牛皮癣素，NovousBio公司，1:50)。然后在室温下添加二抗(AlexaFluor594山羊抗兔或AlexaFluor 488山羊抗小鼠)20分钟。用DAPI复染核。使用Hydromount封片介质(National Diagnostics公司)将盖片封固到载玻片上，之后进行显微镜可视化。

NLRP1 PYD结构域的圆二色谱法

在Chirascan qCD系列分光偏振计上进行圆二色性(CD)测量。将样品在50mM磷酸盐缓冲液、50mM NaCl、20mM DTT(pH 7.4)中稀释到0.1mg/mL的最终蛋白质浓度。通过测量280nm处的吸光度来确定蛋白质浓度。在293K的温度下使用0.1cm的路径长度在比色皿中在200nm-260nm的波长范围内记录天然CD谱。在进行实验之前将样品预平衡15分钟。将对于单独的缓冲液所获得的‘空白’信号从单个蛋白质光谱中减去。通过使用由Peltier装置控制的水浴在293K至365K的范围内监测222nm处的椭圆率来获得热变性CD曲线。以0.1K间隔和1.5秒的响应时间记录信号。如下将CD信号转换成平均残基摩尔椭圆率：

[θ]＝10⁶θ/[C]NI

其中[C]是蛋白质浓度，N是蛋白质残基数并且l是路径长度(cm)。计算的平均残基摩尔椭圆率是以deg cm²dmol^-1给出的。使用最小二乘最小化分析CD热解折叠数据以用于拟合双态平衡解折叠模型。

ASC成丝的荧光各向异性

使用基于荧光偏振的测定来测量ASC丝形成的反应动力学。在过夜反应中并且在变性条件下使Dylight Fluor 488不可逆地缀合到ASC的单个半胱氨酸残基上。通过透析和尺寸排阻色谱法进一步纯化发色团标记的ASC-PYD以去除未反应的游离染料。通过快速混合到生理pH值条件来引发ASC丝重建。丝形成伴随有与单体ASC-PYD共价连接的荧光团的旋转相关时间的变化，这引起荧光偏振发生变化。在Synergy H1Hybrid微孔板读数器(Biotek公司)上测量荧光偏振时程。在120分钟的总时间内以10秒时间间隔获取数据。

定量和统计分析

使用定制的ImageJ工作流程来计算含有ASC-GFP斑点的细胞的百分比。简单地说，在ImageJ中使用DAPI图像的二进制强度阈值处理、‘分水岭’滤波器，之后是自动‘粒子计数’算法来对每个图像的总细胞数进行计数，最小截止半径是50个像素。以相同的方式使用GFP图像对ASC-GFP斑点进行计数，不同的是没有应用分水岭滤波器并且最小半径设定为10个像素。对于每一个样品，随机选择三个视野并且对至少100个细胞进行评分。除了涉及原代患者角质形成细胞和血清的实验(图8和图15)之外，基于三个独立的平行测定计算所有条形图，其中由三个技术平行测定计算误差棒。

以下实验使用对样品身份不知情的实验进行：Luminex细胞因子/趋化因子阵列(图8A)、293T-ASC-GFP测定的所有图像分析、原代角质形成细胞和患者血清的ELISA(图8B至图8D)。其他实验没有以盲法方式进行。

除了Luminex阵列数据(其中使用单尾t检验(图8A))之外，使用双尾司图顿氏t检验(Student's t test)计算所有成对比较的p值。在GraphPad Prism 6或Microsoft Excel中使用TTEST函数进行统计检验。条形图被绘制为平均值±SDM并且统计显著性如下表示：*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001。

数据和软件可用性

数据资源

在本文中报告的RNA-seq数据的登录号是GEO：GSE85791。

表2：MSPC-RO-1III:3的NLRP1外显子变体

*位置参考GRCh37/hg19

表3：MSPC-RO-1患者的TGFBR1外显子的桑格测序结果

*使用TA克隆验证序列。四个克隆中的一个携带从A18到A26的多态丙氨酸重复序列中的框内缺失，从而引起1个丙氨酸的去除。

表4：基因分型和RT-PCR引物

表5：关键资源表

软件和算法

Claims

1.用于检测NLR家族含热蛋白结构域蛋白1(NLPR1)中的一种或多种突变的试剂在制备诊断剂中的用途，所述诊断剂用于一种确定受试者患MSPC(多发性自愈性掌跖癌)或FKLC(家族性慢性苔藓样角化病)的可能性或易感性的方法，所述方法包括检测从所述受试者获得的样品中NLPR1中的一种或多种突变，其中当一种或多种NLRP1突变位于其热蛋白结构域和/或富含亮氨酸重复序列结构域时，所述受试者具有增加的患所述MSPC或FKLC的可能性或易感性，其中NLPR1中的所述一种或多种突变包括选自由以下各项组成的组的至少一个或两个或所有氨基酸取代：A54T、M77T以及A66V，并且其中一种突变引起位置787处的氨基酸苯丙氨酸至位置843处的精氨酸的缺失。

2.用于检测NLPR1中的一种或多种突变的试剂在制备诊断剂中的用途，所述诊断剂用于一种确定受试者的皮肤炎症是否由MSPC或FKLC引起的方法，所述方法包括检测从所述受试者获得的样品中NLPR1中的一种或多种突变，其中当一种或多种NLRP1突变位于其热蛋白结构域和/或富含亮氨酸重复序列结构域时，所述受试者的皮肤炎症是由MSPC或FKLC引起，其中NLPR1中的所述一种或多种突变包括选自由以下各项组成的组的至少一个或两个或所有氨基酸取代：A54T、M77T以及A66V，并且其中一种突变引起位置787处的氨基酸苯丙氨酸至位置843处的精氨酸的缺失。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述方法进一步包括检测与来自未携带所述NLRP1突变的个体的样品相比，来自所述受试者的样品中增加的低聚化的含C末端胱天蛋白酶募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白的积累。

4.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述样品选自由体液和皮肤组成的组。

5.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述样品是表皮附属物。

6.根据权利要求4所述的用途，其中所述皮肤是表皮。

7.根据权利要求4所述的用途，其中所述皮肤是光滑皮肤。

8.根据权利要求4所述的用途，其中所述皮肤是足底皮肤。

9.根据权利要求4所述的用途，其中所述皮肤是角质形成细胞和/或成纤维细胞。

10.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述MSPC选自由以下各项组成的组：MSPC-TN-1、MSPC-RO-1、MSPC-FR-1以及MSPC SCC。

11.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述FKLC是FKLC-EG-1。

12.根据权利要求3所述的用途，其中所述方法进一步包括：

a)从所述受试者分离角质形成细胞并将所述细胞进行体外培养；

b)从角质形成细胞培养物获得细胞裂解物并向所述细胞裂解物施加化学交联剂；

c)使用含C末端胱天蛋白酶募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白抗体，通过蛋白质印迹法分析所述细胞裂解物以检测含C末端胱天蛋白酶募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白的低聚化，其中低聚化通过存在对应于比单个含C末端胱天蛋白酶募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白的分子尺寸更大的分子尺寸的蛋白条带来指示。

13.治疗有效量的能够抑制NLRP1激活的抑制剂在制备用于在受试者中治疗MSPC或FKLC的药物中的用途，其中所述受试者具有位于其热蛋白结构域和/或富含亮氨酸重复序列结构域的一种或多种NLRP1突变，其中NLPR1中的所述一种或多种突变包括选自由以下各项组成的组的至少一个或两个或所有氨基酸取代：A54T、M77T以及A66V，并且其中一种突变引起位置787处的氨基酸苯丙氨酸至位置843处的精氨酸的缺失。

14.根据权利要求13所述的用途，其中与来自未携带所述NLRP1突变的个体的样品相比，来自所述受试者的样品中低聚化的含C末端胱天蛋白酶募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白的积累增加。

15.根据权利要求14所述的用途，其中通过以下步骤检测低聚化的积累：a)从所述受试者分离角质形成细胞并将所述细胞进行体外培养；b)从角质形成细胞培养物获得细胞裂解物并向所述细胞裂解物施加化学交联剂；c)使用含C末端胱天蛋白酶募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白抗体，通过蛋白质印迹法分析所述细胞裂解物以检测含C末端胱天蛋白酶募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白的低聚化，其中低聚化通过存在对应于比单个含C末端胱天蛋白酶募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白的分子尺寸更大的分子尺寸的蛋白条带来指示。

16.根据权利要求13所述的用途，其中所述抑制剂通过以下来抑制NLRP1激活：

1)防止NLRP1的低聚化；或

2)防止NLRP1的蛋白水解切割，其中蛋白水解切割的位置在NLRP1的FIIND结构域内，其中蛋白水解切割的位置在位置1212处的苯丙氨酸与位置1213处的丝氨酸之间。

17.根据权利要求14所述的用途，其中所述样品选自由体液和皮肤组成的组。

18.根据权利要求14所述的用途，其中所述样品是表皮附属物。

19.根据权利要求17所述的用途，其中所述皮肤是表皮。

20.根据权利要求17所述的用途，其中所述皮肤是光滑皮肤。

21.根据权利要求17所述的用途，其中所述皮肤是足底皮肤。

22.根据权利要求17所述的用途，其中所述皮肤是角质形成细胞和/或成纤维细胞。

23.根据权利要求13所述的用途，其中所述MSPC选自由以下各项组成的组：MSPC-TN-1、MSPC-RO-1、MSPC-FR-1以及MSPC SCC。

24.根据权利要求13所述的用途，其中所述FKLC是FKLC-EG-1。