CN110029190A

CN110029190A - 一种甘蓝型油菜耐旱基因及其分子标记与应用

Info

Publication number: CN110029190A
Application number: CN201910446222.9A
Authority: CN
Inventors: 刘列钊; 李阳阳; 王嘉; 唐章林; 周清元; 卢坤; 林呐; 李加纳
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2019-05-27
Filing date: 2019-05-27
Publication date: 2019-07-19

Abstract

本发明公开了一种甘蓝型油菜基因及其应用。本发明筛选了一个在油菜不同生育期都具有功能的耐旱性相关基因BnA.NF‑YA7，根据BnA.NF‑YA7基因SNP位点设计的dCAPS标记能准确鉴定出耐旱材料，具有一定的通用性、广适性、时效性。能够进行甘蓝型油菜耐旱种质资源鉴定和分子标记辅助选择，为选育耐旱且农艺、品质性状优良的育种材料或品种奠定了基础。

Description

一种甘蓝型油菜耐旱基因及其分子标记与应用

技术领域

本发明涉及一种甘蓝型油菜的耐旱基因及其分子标记与应用。

背景技术

作物的耐旱性表型是由自身的生理抗性和结构特性以及生长发育进程的节奏与农业气候因素变化配合的程度决定的，与作物种类、材料基因型、形态性状、生理生化过程及干旱发生时期、强度及时间长短有关，是一个复杂的综合性状。

作物耐旱性鉴定技术最常用的是大田直接鉴定，此外也有旱棚控水鉴定和控制土壤水分含量的盆钵试验。鉴定指标主要包括产量、形态、生理和生化指标等，此外也根据多项指标所测数据获得材料耐旱总级别值或采用模糊数学中的隶属函数法鉴定材料耐旱性。大田直接鉴定法仅限于在干旱、半干旱地区或干旱季节进行鉴定，受外界环境限制；而旱棚与盆钵鉴定受设施空间限制，不利于大规模材料在同一时期即同一环境下进行耐旱性鉴定。此外，对单个指标进行鉴定缺乏准确性，而对多个指标进行鉴定程序复杂、耗时、耗工且对材料具有破坏性。

油菜是我国重要的油料作物，当前主栽的甘蓝型油菜在整个生长季节需水量较大，对干旱的适应能力较差。甘蓝型油菜的耐旱性是由多基因控制并易受环境因素影响的复杂综合性状，但近年来，甘蓝型油菜在干旱胁迫方面的研究也主要集中于QTL、显著关联标记和候选基因的挖掘，目前并未获得具有显著耐旱性的等位基因，无法用于分子标记辅助选择在种质资源鉴定和耐旱品种选育方面的应用。

在甘蓝型油菜耐旱种质资源鉴定和新品种选育过程中，主要采用常规鉴定方法，而常规鉴定方法耗工耗时、效率较低下，对材料具有破坏性，易受外界环境和主观意识影响、准确性较差，严重制约了耐旱性品种的选育。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种甘蓝型油菜的耐旱基因及其分子标记与应用，本发明所述的基因，在芽期、苗期和成熟期都可被诱导表达，且具有所述等位基因的材料在芽期、苗期和成熟期都具有较强的耐旱性。本发明利用所述等位基因开发的分子标记，可通过分子标记鉴定种质资源耐旱性和辅助选育耐旱性新品种，不易受环境影响，准确性高；只需要利用植株少许叶片提取DNA，对育种材料破坏性小；可在早期进行选择，效率高，有利于加快培育耐旱、高产和优质品种的进程。

本发明解决上述问题所采用的技术方案是：

甘蓝型油菜的耐旱基因,该基因为甘蓝型油菜A09染色体的一个核转录因子的等位基因，其位于19159584bp处的碱基为C。

本发明所述的甘蓝型油菜基因BnA.NF-YA7(位于甘蓝型油菜A09染色体的一个核转录因子)的等位基因，位于A09染色体19158540bp-19160295bp,具体地，位于19159584bp的碱基为C。现有技术公开的甘蓝型油菜基因序列中，位于19159584bp处的碱基为G，本发明与现有甘蓝型油菜公开的序列不同。进一步地，现有技术中，未见有该位置基因序列的等位基因被用于甘蓝型油菜抗旱品种筛选的相关记载，且现有的序列不能用于识别或者鉴定或者确认该甘蓝型油菜油菜是否属于抗旱品种，而本发明的序列能够用于识别或者鉴定或者确认该甘蓝型油菜油菜是否属于抗旱品种。

进一步地，所述基因位于甘蓝型油菜A09染色体19159555bp-19159690bp的序列，具有SEQ ID NO:1所示的序列。

上述基因序列在在筛选、选育、制备或检测甘蓝型油菜耐旱品种中的应用。

上述的序列作为分子标记在筛选、选育、制备或检测甘蓝型油菜耐旱品种中的应用。

具体地，如甘蓝型油菜具有上述的基因序列，则为耐旱型甘蓝型油菜。

一种甘蓝型油菜耐旱品种的筛选、选育、制备或检测方法，包括如下步骤：

1)基于甘蓝型油菜A09染色体位于19159584bp的碱基位点，利用dCAPS Finder2.0在线网站设计引物，结合限制性内切酶NdeI开发dCAPS标记；

2)提取多个株系的DNA，测序判断，如甘蓝型油菜具有上述的基因序列，则为耐旱型甘蓝型油菜。

具体地，所述步骤1)中，甘蓝型油菜A09染色体位于19159584bp的碱基为该基因第三个外显子上的SNP。

具体地，所述步骤2)中，提取DNA后进行PCR扩增所用的左右引物序列为：

左引物5'-CCATATCCAGATCCTTACTACAGACATAT-3'；

右引物5'-TCCCATTAAATGTGCATGTACCTGA-3'。

所述步骤2)中，提取DNA后进行进行PCR扩增、酶切和电泳，电泳完成后用凝胶成像系统观察，若显示的条带位于105bp处，则为耐旱材料。

所述PCR扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃复性1min，35个循环；72℃延伸10min，12℃保存。

所述PCR扩增反应体系如下：12.5μL 2×Taq Master Mix缓冲液，10μmol/L的引物各0.5μL，50～100ng基因组DNA，5U/μL的Easy Taq酶0.25μL，ddH2O双蒸水补足至25μL；

所述PCR扩增产物采用1.8％琼脂糖凝胶电泳电泳检测，上样量5.0μL；电泳缓冲液为0.5×TAE，120V电泳25min；电泳完成后用凝胶成像系统观察。

综上所述，本发明的有益效果是：

1)本发明筛选了一个在油菜不同生育期都具有功能的耐旱性相关基因的等位基因序列。

2)根据甘蓝型油菜一个耐旱等位基因序列SNP位点设计的dCAPS标记，结合本发明筛选的耐旱基因，判断该植株是否具有该耐旱基因，进而能准确鉴定出该植株是否为耐旱材料，具有一定的通用性、广适性、时效性。能够进行甘蓝型油菜耐旱种质资源鉴定和分子标记辅助选择，为选育耐旱且农艺、品质性状优良的育种材料或品种奠定了基础。

3)根据本发明的基因序列和分子标记，可以广泛用于甘蓝型油菜筛选、选育、制备或检测甘蓝型油菜耐旱品种。

附图说明

图1是甘蓝型油菜基因变异与甘蓝型油菜耐旱性的关联分析(a:GP；b:GI；c:连锁不平衡分析(LD))；

图2是20％PEG6000胁迫下不同单倍型的GP与GI比较分析(a:BnA.NF-YA7(位于甘蓝型油菜A09染色体的一个核转录因子)单倍型分析；b:5种单倍型材料GI的箱图；c:5种单倍型材料GP的箱图；d:5种单倍型材料在PEG处理下的发芽表现；e:5种单倍型材料的GP和GI统计图(p<0.05))；

图3是20％PEG6000胁迫下不同单倍型材料耐旱性比较(a：20％PEG6000处理7天后5种单倍型材料的耐旱性表现；b：20％PEG6000处理7天后5种单倍型材料的存活率；c：20％PEG 6000胁迫下5种单倍型材料叶片含水量的动态变化)；

图4是干旱胁迫下5种单倍型不同株系耐旱性比较(a：干旱处理3周后5种单倍型不同株系材料的耐旱性表现；b：干旱处理后5种单倍型材料的生理分析(POD、SOD和CAT)；c：干旱处理后5种单倍型材料的ABA含量；d：干旱处理后5种单倍型材料的可溶性蛋白和脯氨酸含量；e：干旱胁迫下5种单倍型材料根冠比；f：干旱处理后5种单倍型材料的MDA含量；g：干旱胁迫下5种单倍型材料叶片相对含水量)；

图5是不同单倍型材料dCAPS标记表现。

具体实施方式

本发明的筛选出一种甘蓝型油菜耐旱基因BnA.NF-YA7(位于甘蓝型油菜A09染色体的一个核转录因子)的等位基因，位于A09染色体19158540bp-19160295bp,具体地，位于19159584bp的碱基为C。

具体地，该甘蓝型油菜耐旱等位基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

上述基因序列和分子标记能够用于筛选、选育、制备或检测甘蓝型油菜耐旱品种；其具体应用方法为：如甘蓝型油菜具有上述的基因序列，则为耐旱型甘蓝型油菜。

下面结合实施例及附图，对本发明作进一步地的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：甘蓝型油菜干旱胁迫下种子发芽率(GP)和发芽指数(GI)全基因组关联分析

本实施例中所用的520份种质资源为我国油菜育种和科研单位共同收集的。每份种质资源选取50粒饱满种子利用4％NaClO溶液进行消毒处理，均匀置于铺有滤纸的0.9cm直径培养皿中。首次，干旱胁迫处理加入30ml 20％PEG6000溶液，对照加入30ml ddH₂O₂，之后干旱胁迫处理加入15ml 20％PEG6000溶液，对照加入15ml ddH₂O₂，持续到第7天。进行3次重复试验，调查统计发芽率(GP)和发芽指数(GI)。结合60K芯片分析获得的基因型数据基于MLM模型进行关联分析，获得干旱胁迫下与发芽率(GP)和发芽指数(GI)显著关联的SNP。并根据显著关联SNP所在衰减区间及拟南芥基因功能注释进一步预测筛选耐旱性相关的候选基因。

表1BnA.NF-YA7基因的多态性位点及其三种分析模型下与干旱胁迫下181份甘蓝型油菜种子GP和GI的关联分析结果

甘蓝型油菜干旱胁迫下种子发芽率(GP)和发芽指数(GI)候选基因关联分析：如表1所示，基于全基因组重测序结果，在BnA.NF-YA7基因内部及启动子区域(起始密码子上游2kb)共检测到18个SNP。根据这些SNP数据和PEG处理下的181份材料GP和GI表型数据基于不同分析模型进行关联分析，SNP(S9_19159584)均与干旱胁迫下种子的GP和GI显著相关(p<0.01,图1a,b)。同时，在对这18个SNP进行连锁不平衡(LD)分析时发现，S9_19159584与基因内部SNP的LD值较低，与启动子区域的SNP的LD值较高(图1c)。这些结果表明BnA.NF-YA7基因内存在与甘蓝型油菜耐旱差异相关的遗传变异，即S9_19159584与甘蓝型油菜耐旱性关联。

实施例2：单倍型分析及耐旱性表型鉴定：

根据重测序检测到的18个SNP，进行单倍型分析，共获得5个主要的单倍型(Hap,Haplotype)(图2a)，比较这些单倍型在干旱胁迫下的GP和GI，结果发现Hap4的GP和GI要显著高于Hap3和Hap5(p<0.05)，Hap1仅次于Hap4，而Hap2属于中间类型(图2b,c)。利用20％PEG6000模拟胁迫，选取5种单倍型的不同株系进行验证，结果表明在PEG6000处理下，不同单倍型材料的GP与GI与前期研究结果一致，Hap4的种子GP和GI均最高，其次为Hap1，而Hap3和Hap5单倍型材料在PEG6000处理下的GP和GI均较低(图2d,e)。此外，比较不同单倍型材料在苗期的耐旱性结果表明，无论是在20％的PEG6000模拟干旱环境下(图3a)还是自然干旱环境下(图4a)，不同单倍型材料苗期耐旱性结果与种子发芽表现一致。20％PEG6000模拟干旱条件下，处理7天以后Hap4和Hap1单倍型材料的存活率仍分别高达87.5％和56.5％，而Hap2和Hap3单倍型材料的存活率仅为10.25％和12.5％(图3a,b)。叶片含水量测定结果显示，PEG6000处理1h开始，5种单倍型材料叶片含水量均急剧下降，胁迫后3h达到最低值，此后叶片含水量逐步开始恢复，Hap4和Hap1单倍型材料恢复较快，在12h时已接近处理前的含水量，而其他3种单倍型材料直到72h仍未完全恢复(图3c)，表明Hap1和Hap4较Hap2、Hap3和Hap5能较快适应外界渗透势的变化。另外，盆栽实验结果表明在连续干旱处理3周后，Hap4和Hap1单倍型材料较其它3种单倍型材料表现出更强的耐旱性(图4a)。生理测定表明，5种单倍型材料在干旱处理后呈现明显的差异。干旱处理后，Hap4单倍型材料的脯氨酸和可溶性蛋白含量均显著高于其它单倍型材料，尤其是Hap3。相反，Hap4单倍型材料的SOD、CAT和MAD含量均显著低于Hap3，ABA含量无明显差异。根冠比测定结果显示，耐旱类型的Hap1和Hap4的根冠比显著小于不耐旱的Hap2、Hap3和Hap5，表明不耐旱的单倍型材料对干旱胁迫极度敏感，受胁迫后地上部分生长受到抑制，而耐旱的单倍型材料根系发达，同时地上部分正常生长，因而导致耐旱类型的根冠比小于不耐旱类型。此外，叶片相对含水量测定结果显示耐旱类型的Hap1和Hap4的叶片相对含水量显著高于不耐旱的Hap2、Hap3和Hap5(图4b-g)。上述结果进一步证实，干旱条件下，BnA.NF-YA7基因18个SNP不同单倍型间具有明显的耐旱性差异。极端表型的两种单倍型Hap3和Hap4的差异主要集中在基因内的10个SNP上。10个SNP中有2个SNP位于UTR区域，5个位于内含子上，外显子上只存在3个SNP。实施例1的试验结果表明，其中在第3个外显子上的SNP(S9_19159584)与甘蓝型油菜耐旱性关联，即SNP(S9_19159584)能够准确的将5种单倍型分为耐旱和不耐旱两种不同类型(图2a)。

实施例3：利用BnA.NF-YA7靶向dCAPS分子标记进行耐旱性鉴定

一种甘蓝型油菜耐旱品种的筛选方法，包括如下步骤：

1)基于基于甘蓝型油菜A09染色体位于19159584bp的碱基位点，利用dCAPSFinder 2.0在线网站设计引物，结合限制性内切酶NdeI开发dCAPS标记；

2)提取多个株系的DNA，经下述鉴定后如甘蓝型油菜具有SEQ ID NO.1所述的基因序列，则为耐旱型甘蓝型油菜。

具体地，所述步骤2)中，提取DNA后进行进行PCR扩增、酶切和电泳，PCR扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃复性1min，35个循环；72℃延伸10min，12℃保存。PCR扩增反应体系如下：12.5μL2×Taq Master Mix缓冲液，10μmol/L的引物各0.5μL，50～100ng基因组DNA，5U/μL的Easy Taq酶0.25μL，ddH2O双蒸水补足至25μL。扩增产物采用采用1.8％琼脂糖凝胶电泳电泳检测，上样量5.0μL；电泳缓冲液为0.5×TAE，120V电泳25min；电泳完成后用凝胶成像系统观察，若显示的条带位于105bp处，则具有SEQID NO.1所示的基因序列，为耐旱材料。

具体地，提取DNA后进行PCR扩增所用的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，即引物序列为：5'-CCATATCCAGATCCTTACTACAGACATAT-3'和5'-TCCCATTAAATGTGCATGTACCTGA-3'。

提取将实施例2中5种单倍型材料多个株系的DNA，按本实施例方法进行PCR扩增、酶切和电泳，电泳完成后用凝胶成像系统观察，结果显示，Hap4和Hap1具有SEQ ID NO.1所示的基因序列，其显示的条带位于105bp处，为耐旱材料。

结果表明，本发明开发的dCAPS标记与表型共分离且能够正确将5种单倍型分为耐旱和不耐旱两类(图5)。

如上所述，可较好的实施本发明。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南大学

<120> 一种甘蓝型油菜耐旱基因及其分子标记与应用

<130> 一种甘蓝型油菜耐旱基因及其分子标记与应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 136

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜

<400> 1

ccatatccag atccttacta cagaagtatc tttgcaccaa acccacaagc gtatccacca 60

cgaccttatg aaaccggggt atggtgtatt acaacgattt cttgatttgg atcatgttaa 120

cagcattttt cacatc 136

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccatatccag atccttacta cagacatat 29

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcccattaaa tgtgcatgta cctga 25

Claims

1.一种甘蓝型油菜的耐旱基因,其特征在于，该基因为甘蓝型油菜A09染色体的一个核转录因子的等位基因，其位于19159584bp的碱基为C。

2.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜的耐旱基因，其特征在于，所述基因的特征序列位于甘蓝型油菜A09染色体19159555bp-19159690bp，具有SEQ ID NO:1所示的序列。

3.权利要求1或权利要求2所述的基因序列在筛选、选育、制备或检测甘蓝型油菜耐旱品种中的应用。

4.权利要求1或权利要求2所述的分子标记在筛选、选育、制备或检测甘蓝型油菜耐旱品种中的应用。

5.一种甘蓝型油菜耐旱品种的筛选、选育、制备或检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

2)提取多个株系的DNA，如甘蓝型油菜具有权利要求1或权利要求2所述的基因序列，则为耐旱型甘蓝型油菜。

6.根据权利要求5所述的甘蓝型油菜耐旱品种的筛选、选育、制备或检测方法，其特征在于，所述步骤2)中，提取DNA后进行PCR扩增所用的左右引物序列分别为：

左引物：5'-CCATATCCAGATCCTTACTACAGACATAT-3'；

右引物：5'-TCCCATTAAATGTGCATGTACCTGA-3'。

7.根据权利要求6所述的甘蓝型油菜耐旱品种的筛选、选育、制备或检测方法，其特征在于，所述步骤2)中，提取DNA后进行进行PCR扩增、酶切和电泳，电泳完成后用凝胶成像系统观察，若显示的条带位于105bp处，则为耐旱材料。

8.根据权利要求6所述的甘蓝型油菜耐旱品种的筛选、选育、制备或检测方法，其特征在于，所述PCR扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃复性1min，35个循环；72℃延伸10min，12℃保存。

9.根据权利要求6所述的甘蓝型油菜耐旱品种的筛选方法，其特征在于，所述PCR扩增反应体系如下：12.5μL 2×Taq Master Mix缓冲液，10μmol/L的引物各0.5μL，50～100ng基因组DNA，5U/μL的Easy Taq酶0.25μL，ddH2O双蒸水补足至25μL。

10.根据权利要求6所述的甘蓝型油菜耐旱品种的筛选方法，其特征在于，所述PCR扩增产物采用1.8％琼脂糖凝胶电泳检测，上样量5.0μL；电泳缓冲液为0.5×TAE，120V电泳25min；电泳完成后用凝胶成像系统观察。