CN110028564B - 水稻耐盐转录因子OsC3H38及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及水稻耐盐转录因子OsC3H38及其编码基因和应用。水稻耐盐转录因子OsC3H38的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明涉及的编码基因OsC3H38过表达提高了转基因水稻在不同发育时期的耐盐性，同时改善了耐逆相关的生理指标，提高了耐盐标记基因的表达量。

Description

水稻耐盐转录因子OsC3H38及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及水稻耐盐转录因子OsC3H38及其编码基因和应用。

背景技术

转录因子在作物的细胞分化、生长发育、非生物胁迫耐受等过程中发挥重要的作用。锌指蛋白家族是一类具有手指状结构域的转录因子，其通过与靶分子DNA、RNA、DNA－RNA的序列特异性结合，或与其他锌指蛋白结合以及形成同源二聚体结构，在转录和翻译水平上调控基因的表达，锌指蛋白家族是植物中参与非生物胁迫调控的重要转录因子类型。根据锌指蛋白的保守域的结构，锌指蛋白有C2H2型、C3H型、C4型和C6型等很多种类型，其中C3H型是发现较晚的一种锌指蛋白，现有技术对动物中C3H型蛋白的研究较多，而仅研究了水稻、拟南芥、大豆等少数几个植物中的C3H型锌指基因的功能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水稻耐盐转录因子OsC3H38。

本发明的再一目的在于提供上述水稻耐盐转录因子OsC3H38的编码基因。

本发明的再一目的在于提供含有上述编码基因的重组表达载体。

本发明的再一目的在于提供含有上述编码基因的重组菌株。

本发明的再一目的在于提供上述水稻耐盐转录因子OsC3H38及其编码基因的应用。

本发明的再一目的在于提供提高水稻耐旱性的方法。

本发明的水稻转录因子OsC3H38，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：

MAEHLASIFGTEKDRVNCPFYFKIGACRHGDRCSRLHNRPTVSPTIVLANMYQRPDMITPGVDAQGQPIDPEKMQEHFEDFYEDIYEELSKFGEVETLNVCDNLADHMIGNVYVQFREEEQAVAAHNALQGRFYSGRPIIVEYSPVTDFREATCRQFEENSCNRGGYCNFMHVKQIGRELRRKLYGGRSRRSHGRSRSPSPRHRRGNRDRDDFRRERDGYRGGGDGYRGGGGGGGGDGYRGGDSYRGGGGGGRRGGGSRYDRYDDGGRRRHGSPPRRARSPVRESSEERRAKIEQWNREREEKP

本发明的水稻转录因子OsC3H38的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示：

ATGGCGGAGCATTTGGCTTCAATATTTGGGACTGAGAAGGATAGGGTTAACTGCCCCTTTTACTTCAAGATTGGGGCTTGCCGTCATGGGGATCGTTGCTCCCGTCTGCACAACAGGCCAACTGTGTCGCCGACAATTGTGCTTGCTAACATGTATCAGCGCCCTGATATGATCACACCAGGAGTCGATGCTCAAGGCCAACCTATTGATCCTGAAAAGATGCAGGAGCACTTTGAGGATTTCTATGAGGATATCTATGAGGAGCTGAGCAAGTTTGGTGAGGTTGAGACCCTCAATGTCTGTGATAACCTTGCTGACCACATGATAGGCAATGTGTATGTCCAGTTCAGGGAGGAAGAACAGGCAGTCGCTGCGCATAATGCCCTTCAAGGTCGCTTCTACTCAGGGCGCCCAATAATTGTTGAGTATTCCCCTGTGACTGATTTCCGTGAGGCGACCTGTAGGCAGTTTGAGGAGAACAGCTGCAACCGTGGGGGCTACTGTAATTTTATGCATGTAAAGCAGATTGGCAGGGAGCTCAGGAGGAAGCTTTATGGGGGGCGATCCAGGAGGAGCCATGGGAGAAGCCGCAGCCCAAGCCCACGCCACAGGAGGGGCAATCGTGACCGTGATGATTTCCGCCGTGAACGTGATGGTTATCGTGGTGGTGGTGATGGTTACCGTGGCGGCGGCGGTGGCGGTGGTGGTGACGGTTACCGCGGCGGTGATAGTTACCGTGGTGGTGGTGGTGGTGGACGCAGGGGTGGGGGCAGCAGGTATGACAGGTATGATGATGGAGGAAGGCGCAGGCATGGCAGCCCCCCAAGGCGTGCAAGGAGCCCAGTCAGGGAAAGCAGCGAGGAACGCAGGGCGAAGATTGAACAGTGGAACCGTGAACGGGAGGAAAAGCCTTGA

本发明还提供含有上述编码基因的重组表达载体。

本发明还提供含有上述编码基因的重组菌株。

根据本发明的提高水稻耐盐的方法包括向水稻中导入水稻耐盐相关基因OsC3H38的步骤。

本发明的有益效果：

试验结果表明，在175mM NaCl和5μM ABA处理后，野生型水稻中OsC3H38基因的表达量分别上调5.8倍和8.0倍；OsC3H38蛋白定位在细胞核里，具有转录激活活性，说明OsC3H38是受高盐和ABA诱导表达的转录因子。对经过DNA水平和RNA水平的鉴定的OsC3H38转基因水稻进行耐盐性鉴定，结果发现，OsC3H38基因的上调表达提高了转基因水稻在幼苗期和分蘖期的耐盐性，提高了转基因水稻在盐胁迫条件下的叶绿素含量和脯氨酸含量及胁迫条件下全闭气孔的比率，降低了转基因水稻的丙二醛含量；而OsC3H38基因下调表达对转基因水稻的耐逆表型及耐逆相关生理指标的影响则与OsC3H38基因过表达情况下的相反。OsC3H38基因过表达上调了耐逆标记基因OsLEA3、OsSRO1C和OsRAB21的表达量。因此，表型、生理水平和分子水平均表明OsC3H38基因上调表达提高了转基因植物对高盐的耐受性。

OsC3H38过表达提高了转基因水稻在不同发育时期的耐盐性，同时改善了耐逆相关的生理指标，提高了耐盐标记基因的表达量。因此，在水稻中提高OsC3H38基因的表达量，可以提高水稻在高盐条件下的存活率，上调其下游耐盐相关基因的表达量，提高了植株的耐盐性，可以用于农作物耐盐品种的培育。

附图说明

图1显示水稻OsC3H38基因在高盐和ABA处理下的表达量变化；

图2显示OsC3H38蛋白的亚细胞定位情况；

图3显示OSCH38的转录激活活性鉴定结果，其中，A为OsC3H38转基因酵母在不同培养基上的生长情况，B为OsC3H38转基因酵母的X-gal显色结果；

图4显示对获得的OsC3H38转基因水稻的鉴定情况，其中，A为OsC3H38转基因水稻的PCR结果，B为OsC3H38转基因水稻不同株系的基因表达情况，C为OsC3H38RNAi转基因水稻不同株系的基因表达情况；

图5显示转基因水稻在幼苗期的耐盐性鉴定情况，其中，A为OsC3H38转基因水稻不同株系的生长情况，B为OsC3H38RNAi转基因水稻不同株系的生长情况；

图6显示转基因水稻在幼苗期的耐盐性鉴定情况，其中，A为OsC3H38转基因水稻不同株系的地上部分长度，B为OsC3H38RNAi转基因水稻不同株系的地上部分长度；

图7显示对OsC3H38转基因水稻在分蘖期的耐盐性鉴定情况；

图8显示野生型和OsC3H38转基因水稻在盐胁迫前后的不同生理指标的测定结果；

图9显示OsC3H38过表达转基因水稻的耐逆相关标记基因的表达量。

具体实施方式

实验材料

供试植物材料为野生型水稻(Oryza sativa)日本晴(Nipponbare)、OsC3H38过表达转基因水稻和OsC3H38RNAi转基因水稻。

供试菌种：大肠杆菌DH5α菌种、农杆菌EHA105菌种、酵母菌AH109。

实施例1分析OsC3H38基因在不同处理条件下的表达模式

对野生型水稻进行175mM NaCl和5μM ABA处理，分别于处理0h、1h、6h、9h、12h和24h时取叶片为材料，用Trizol分别提取不同材料的总RNA，反转录后进行定量PCR分析，检测OsC3H38的转录水平。用于检测OsC3H38基因的引物对序列如下：

正向引物为:5′-GGTTCCACTGTTCAATCTTCGC-3′；

反向引物为:5′-TATGATGATGGAGGAAGGCGC-3′。

用于检测内参基因(actin)的表达量的引物对为：

正向引物为:5′-TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3′；

反向引物为:5′-TGCACAATGGATGGGTCAGA-3′。

如图1所示，OsC3H38基因在175mM NaCl处理1h时开始表达上调，至胁迫24h时，上调倍数达到5.8倍；而在5μM ABA处理后先下调表达，在处理6h时表达量开始上调表达，在胁迫12h时表达量是对照的8倍左右。因此，OsC3H38的表达受高盐和ABA诱导，是一个响应盐胁迫的耐逆相关基因。

实施例2 OsC3H38基因的克隆及其编码蛋白的转录因子特征分析

1.克隆OsC3H38基因

以实施例1中的高盐胁迫12h的叶片材料的cDNA为模板，设计PCR引物序列，正向引物为：5′-AGCAAAGCGGGGATTCAG-3′，反向引物为：5′-GAACCGGCCATCCATAGAG-3′，进行RT-PCR扩增，对扩增产物进行电泳，回收、加A，与T-载体连接后转化大肠杆菌DH-5α，筛选阳性克隆后进行测序，获得测序正确的克隆命名为pT-OsC3H38，完成OsC3H38基因的克隆。

2.OsC3H38蛋白定位于细胞核里

构建OsC3H38与GFP融合表达载体p1300-OsC3H38::GFP，将该载体与对照p1300-GFP分别转化农杆菌，分别获得阳性菌后进行摇培，集菌后分别注射烟草表皮细胞，注射后培养40-48h内取叶片进行confocal观察。

如图2所示，转化p1300-GFP的烟草表皮细胞的细胞核和细胞膜中都有绿色荧光，而转化p1300-OsC3H38::GFP的烟草中只在细胞核中发现绿色荧光，证明OsC3H38蛋白定位在细胞核中。

3.OsC3H38蛋白具有转录激活活性

构建pGBKT7-OsC3H38质粒，转化酵母菌AH109，获得转化成功的酵母菌后，分别挑取5-6个克隆，分别用超纯水悬浮，并梯度稀释至10倍、100倍，分别取不同的悬浮液各2μL点在SD/Trp-/His-培养基上，于28℃培养箱静置培养3d后观察结果。以pGBKT7空载体的转化结果做为对照。

如图3中A所示，pGBKT7和pGBKT7-OsC3H38转化的酵母菌均能在SD/Trp-培养基上正常生长；在SD/Trp-/His-培养基上pGBKT7的转化子不能生长，而pGBKT7-OsC3H38的转化子则能正常生长。上述结果说明OsC3H38蛋白能够启动报告基因His的表达。

分别将图3中A的一缺培养基上生长2d的包含质粒pGBKT7或pGBKT7-OsC3H38的酵母菌液点于干净滤纸上，经液氮冻融裂解后进行X-gal显色反应。

如图3中B所示，含pGBKT7的酵母菌没有被染蓝，而含pGBKT7-OsC3H38的酵母菌被染蓝了，表明OsC3H38蛋白成功激活LacZ报告基因的表达。

上述结果表明OsC3H38蛋白在酵母中具有转录激活活性。

因此，本发明的OsC3H38蛋白是定位在细胞核里的、具有转录激活活性的转录因子。

实施例3鉴定OsC3H38的耐盐功能

构建pMDC32-OsC3H38过表达载体和pTCK303RNAi载体，分别转化农杆菌EHA105；得到鉴定正确的转化子后，分别转化日本晴水稻，获得转基因水稻植株。分别对获得的不同转基因株系水稻进行DNA和RNA水平鉴定，鉴定结果如图4所示。鉴定后培养3-4代，获得转基因纯合株系用于以下实验。

1.OsC3H38过表达转基因水稻幼苗的耐逆性检测

将萌发后正常生长3d的OsC3H38过表达转基因水稻株系和野生型日本晴水稻幼苗转移到含175mM NaCl的1/2MS培养基上进行处理，7d后对水稻地上部分的长度进行测量并统计数据。

如图5、6所示，1/2MS培养基上的对照组中3个OsC3H38过表达转基因株系、3个OsC3H38RNAi转基因株系与野生型日本晴的地上部分的长度没有显著差异；175mM NaCl处理后，3个OsC3H38过表达转基因株系的株高均高于野生型日本晴的，而3个OsC3H38RNAi转基因株系的株高均低于野生型日本晴的。因此，OsC3H38基因的上调表达增强了转基因水稻幼苗对盐胁迫的耐受性。

2.OsC3H38过表达转基因水稻分蘖期耐盐性检测

将不同株系的水稻种子萌发7d后，选取长势一致的幼苗转移到花盆中，移栽时将转基因株系和野生型对照的幼苗分别种在同一个花盆的两侧。在温室正常培养30d后改用175mM NaCl浇灌进行盐处理，盐处理18d复水6d后，观察表型。

如图7所示，日本晴水稻茎部和叶片枯萎、变黄，OsC3H38过表达转基因水稻幼苗的叶片更绿、更挺拔；盐处理22d复水10d后相对于野生型幼苗，OsC3H38RNAi转基因水稻幼苗的叶片更加萎蔫。因此，OsC3H38基因上调表达提高了转基因水稻在分蘖期的耐盐性。

因此，OsC3H38基因上调表达提高了转基因水稻的耐盐性，是水稻耐盐的正调节子。

实施例4 OsC3H38的耐逆机理

1.OsC3H38过表达改善细胞的耐逆相关生理指标

以盐胁迫处理3d的不同水稻株系为材料，进行叶绿素含量、脯氨酸含量以及丙二醛含量等耐逆相关生理指标的检测。

如图8所示，盐处理条件下，过表达转基因水稻株系的叶绿素含量、脯氨酸含量和全闭气孔的比率均高于野生型日本晴的相应指标，丙二醛的含量却低于日本晴的；而OsC3H38RNAi转基因水稻的叶绿素含量、脯氨酸含量和全闭气孔的比率均低于野生型水稻的相应指标，丙二醛含量却比野生型水稻的高。

因此，盐胁迫后的生理指标测定的数据与表型结果一致，OsC3H38上调表达导致了叶片细胞在生理水平发生综合改变，从而提高了水稻的耐盐能力。

2.OsC3H38过表达提高了转基因株系中抗逆相关的标记基因的表达

以表1中的序列为引物，利用实时定量PCR技术分别检测OsC3H38过表达株系中与非生物胁迫相关的标记基因的表达量。

表1耐逆相关基因的实时定量PCR引物

如图9所示，OsC3H38上调表达提高了OsLEA3、OsSRO1C和OsRAB21的表达量，而OsDREB1B的表达量变化不明显。OsLEA3、OsSRO1C和OsRAB21是已知的具有耐盐功能的基因，它们上调表达有利于植株耐盐。因此，OsC3H38基因从分子水平上调节了细胞的耐盐能力，有利于水稻对胁迫做出快速反应。

序列表

<110> 河北师范大学

<120> 水稻耐盐转录因子OsC3H38及其编码基因和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 304

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

Met Ala Glu His Leu Ala Ser Ile Phe Gly Thr Glu Lys Asp Arg Val

1 5 10 15

Asn Cys Pro Phe Tyr Phe Lys Ile Gly Ala Cys Arg His Gly Asp Arg

20 25 30

Cys Ser Arg Leu His Asn Arg Pro Thr Val Ser Pro Thr Ile Val Leu

35 40 45

Ala Asn Met Tyr Gln Arg Pro Asp Met Ile Thr Pro Gly Val Asp Ala

50 55 60

Gln Gly Gln Pro Ile Asp Pro Glu Lys Met Gln Glu His Phe Glu Asp

65 70 75 80

Phe Tyr Glu Asp Ile Tyr Glu Glu Leu Ser Lys Phe Gly Glu Val Glu

85 90 95

Thr Leu Asn Val Cys Asp Asn Leu Ala Asp His Met Ile Gly Asn Val

100 105 110

Tyr Val Gln Phe Arg Glu Glu Glu Gln Ala Val Ala Ala His Asn Ala

115 120 125

Leu Gln Gly Arg Phe Tyr Ser Gly Arg Pro Ile Ile Val Glu Tyr Ser

130 135 140

Pro Val Thr Asp Phe Arg Glu Ala Thr Cys Arg Gln Phe Glu Glu Asn

145 150 155 160

Ser Cys Asn Arg Gly Gly Tyr Cys Asn Phe Met His Val Lys Gln Ile

165 170 175

Gly Arg Glu Leu Arg Arg Lys Leu Tyr Gly Gly Arg Ser Arg Arg Ser

180 185 190

His Gly Arg Ser Arg Ser Pro Ser Pro Arg His Arg Arg Gly Asn Arg

195 200 205

Asp Arg Asp Asp Phe Arg Arg Glu Arg Asp Gly Tyr Arg Gly Gly Gly

210 215 220

Asp Gly Tyr Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Gly Tyr Arg

225 230 235 240

Gly Gly Asp Ser Tyr Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Arg Gly Gly

245 250 255

Gly Ser Arg Tyr Asp Arg Tyr Asp Asp Gly Gly Arg Arg Arg His Gly

260 265 270

Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Ser Pro Val Arg Glu Ser Ser Glu Glu

275 280 285

Arg Arg Ala Lys Ile Glu Gln Trp Asn Arg Glu Arg Glu Glu Lys Pro

290 295 300

<210> 2

<211> 915

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

atggcggagc atttggcttc aatatttggg actgagaagg atagggttaa ctgccccttt 60

tacttcaaga ttggggcttg ccgtcatggg gatcgttgct cccgtctgca caacaggcca 120

actgtgtcgc cgacaattgt gcttgctaac atgtatcagc gccctgatat gatcacacca 180

ggagtcgatg ctcaaggcca acctattgat cctgaaaaga tgcaggagca ctttgaggat 240

ttctatgagg atatctatga ggagctgagc aagtttggtg aggttgagac cctcaatgtc 300

tgtgataacc ttgctgacca catgataggc aatgtgtatg tccagttcag ggaggaagaa 360

caggcagtcg ctgcgcataa tgcccttcaa ggtcgcttct actcagggcg cccaataatt 420

gttgagtatt cccctgtgac tgatttccgt gaggcgacct gtaggcagtt tgaggagaac 480

agctgcaacc gtgggggcta ctgtaatttt atgcatgtaa agcagattgg cagggagctc 540

aggaggaagc tttatggggg gcgatccagg aggagccatg ggagaagccg cagcccaagc 600

ccacgccaca ggaggggcaa tcgtgaccgt gatgatttcc gccgtgaacg tgatggttat 660

cgtggtggtg gtgatggtta ccgtggcggc ggcggtggcg gtggtggtga cggttaccgc 720

ggcggtgata gttaccgtgg tggtggtggt ggtggacgca ggggtggggg cagcaggtat 780

gacaggtatg atgatggagg aaggcgcagg catggcagcc ccccaaggcg tgcaaggagc 840

ccagtcaggg aaagcagcga ggaacgcagg gcgaagattg aacagtggaa ccgtgaacgg 900

gaggaaaagc cttga 915

Claims (1)

1.提高水稻耐盐性的方法，其特征在于，所述方法包括向水稻中导入水稻耐盐相关基因OsC3H38的步骤，所述水稻耐盐相关基因OsC3H38的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

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