CN110004125B

CN110004125B - 一种海洋细菌来源新型耐碱耐有机溶剂酯酶及应用

Info

Publication number: CN110004125B
Application number: CN201910230293.5A
Authority: CN
Inventors: 许学伟; 李杨; 丁祎; 吴月红; 洪利国; 程虹
Original assignee: Second Institute of Oceanography MNR
Current assignee: Second Institute of Oceanography MNR
Priority date: 2019-03-26
Filing date: 2019-03-26
Publication date: 2022-05-20
Anticipated expiration: 2039-03-26
Also published as: CN110004125A

Abstract

本发明涉及一种海洋细菌来源新型耐碱和有机溶剂羧酸酯酶Eij5及其编码基因与应用。羧酸酯酶Eij5编码基因来自Erythrobacter jejuensis KCTC23090^T，所涉及酯酶基因经异源表达后，底物为对硝基苯酚丁酸酯(C4)时表现出最高催化活性，催化水解pH值范围为6.5‑10.5，催化水解温度范围为25‑55℃，能耐受多种有机溶剂和金属离子。该酯酶具有耐盐碱耐有机溶剂的特性，可应用于食品加工，手性药物合成和含盐碱、含有机溶剂条件下的环境修复和工业生产。

Description

一种海洋细菌来源新型耐碱耐有机溶剂酯酶及应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种海洋细菌来源新型耐碱和有机溶剂酯酶、其编码基因及其应用。

背景技术

酯酶(EC 3.1.1.2)是一类能够催化酯健形成和断裂的水解酶，广泛存在于动物、植物和微生物中。微生物酯酶参与酯化，转酯及水解等多种生物化学反应。酯酶所催化的反应具有反应条件温和、反应效率高、副产物少、不需要辅酶等优点，且水解具有极强的区域专一性和立体特异性，因此，酯酶广泛地应用于食品加工、精细化工、生物医学、手性药物及环境治理等各个领域。

深海是一个天然的微生物资源宝库，深海来源酯酶通常具有与环境相关的优良性质，例如热稳定、耐盐、耐碱、耐低温等，从海洋微生物中筛选具有独特性质的酯酶已成为开发新型工业用酶的一个重要方向。近年来，随着测序技术的发展，许多新发现的细菌类群得以被全基因组测序，通过生物信息学分析对基因组注释后，对注释的蛋白进行序列筛选并结合功能筛选，可筛选出一些具有独特生化性质的新酶基因。

本发明从一种深海细菌中筛选到一种新型耐碱和有机溶剂酯酶基因，并对该基因进行了重组表达，重组酶具有耐盐碱、耐金属离子、耐有机溶剂和去垢剂等特点，可应用于食品加工，手性药物合成和含盐碱、含有机溶剂条件下的环境修复和工业生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的海洋细菌来源水解酶、其编码基因及其制备方法，该水解酶可用于高温高盐条件下酯类降解及其他酯类化合物的生物催化和转化。

本发明涉及一种具有水解酶活性的分离的多肽，其选自下组：

(a)多肽，其与SEQ ID NO:2的多肽所示序列一致；或

(b)多肽，其为SEQ ID NO:2所示多肽的远离催化中心位置进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸得到的突变体，该突变体具有与SEQ ID NO:2所示的蛋白序列至少90％以上的同源性及至少90％以上的水解酶活性。

本发明所述的具有水解酶活性的多肽，其来源于一种能表达耐盐碱和有机溶剂酯酶的菌株Erythrobacter jejuensis KCTC23090^T，该细菌分离自韩国济州岛海滨海水，分类命名为Erythrobacter jejuensis，自韩国大田KCTC菌种库购买。

基于全基因组序列分析筛选从Erythrobacter jejuensis KCTC23090获得水解酶基因Eij5，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。基因Eij5大小为951bp，碱基组成为165 A(17.35％)、175 T(18.40％)、321 C(33.75％)和290 G(30.49％)，编码蛋白大小为316个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。将该水解酶Eij5氨基酸序列在GenBank数据库中进行同源搜索，与之一致性最高的是不同属细菌Erythrobacter litoralisHTCC2594^T中的酯酶，一致性为83％(其在GenBank数据库中的注册号为WP_011414343.1)。氨基酸序列分析结果表明，活性位点丝氨酸位于具有甘氨酸-X-丝氨酸-X-甘氨酸特征的保守序列内(氨基酸位置为161-166)，与255位天冬氨酸，285位组氨酸共同构成酯酶的催化中心，89-92位氨基酸构成组氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸序列为第IV家族酯酶保守特征序列，综上所述，Eij5为酯类水解酶第IV家族中新成员。

在不影响Eij5蛋白活性前提下，可对SEQ ID NO:2所示的远离催化中心氨基酸位置(优选远离161-166、255和285氨基酸位置)的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有Eij5活性的衍生蛋白质。根据本领域技术的公知常识，蛋白质的生物学活性是与其功能结构域密切相关的。一般来说，发生在蛋白质催化结构域内的位点突变，可能因对蛋白质二维和三维结构产生影响，进而影响其生物学活性。而对于发生在远离功能结构域(优选161-166、255和285氨基酸位置)的氨基酸位点，由于这一区域不参与蛋白功能构象，氨基酸的个别点突变不会对蛋白质的生物学活性产生实质性影响，从而能够基本保留原蛋白质的生物学功能。优选的水解酶Eij5突变体具有至少与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列90％以上的同源性，更优选具有至少95％以上的同源性，最优选具有至少99％以上的同源性。所述的突变体能够基本保留水解酶Eij5的生物学功能，优选该突变体具有与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的水解酶至少90％以上的酶活性，更优选具有至少95％以上的酶活性，最优选至少99％以上的酶活性。

本发明还涉及SEQ ID NO:2的成熟多肽或其同源序列的包含取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的人工变体，突变位置优选小于5个，更优选小于3个，最优选仅为1个位置氨基酸的突变。保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如Η.Neurath和R.L.Hill，1979于The Proteins，Academic Press，NewYork中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly等。

可使用已知的诱变、重组和/或改组方法，然后进行相关的筛选过程，如由Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science，241：53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156；WO95/17413或者WO 95/22625所公开的那些，进行一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并加以测试。其他可使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等，1991，Biochemistry 30:10832-10837；美国专利号5，223，409；WO92/06204)和区域定向诱变(region-directed mutagenesis)(Derbyshire等，1986，Gene46:145和1988，DNA 7:127)。

本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含编码本发明具有水解酶活性的水解酶Eij5的核苷酸序列，或由编码本发明具有水解酶Eij5活性的突变体的核苷酸序列组成。

本发明涉及编码具有水解酶Eij5活性的分离的多核苷酸，其选自下组：

(a)多核苷酸，其与SEQ ID NO:1的核苷酸所示序列一致；或

(b)多核苷酸，其为对SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中除481-498、763-765和853-855位核苷酸外的其他核苷酸进行替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸得到的突变体基因，该多核苷酸具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列至少90％以上的同源性。

本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含编码本发明水解酶Eij5的核苷酸序列。该序列与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列一致；将该水解酶Eij5氨基酸序列在GenBank nr数据库中进行同源搜索，与之一致性最高的是不同属细菌Erythrobacter litoralisHTCC2594^T中的酯酶，一致性为83％(其在GenBank数据库中的注册号为WP_011414343.1)。该基因编码催化活性中心氨基酸的密码子位于基因SEQ ID NO:1的481-498、763-765和853-855号碱基对。

本发明还提供对SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中除481-498、763-765和853-855位核苷酸外的其他核苷酸进行替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留水解酶Eij5蛋白生物学活性的突变体基因。优选的水解酶Eij5突变体基因具有至少与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列90％以上的同源性，更优选具有至少95％以上的同源性，最优选具有至少99％以上的同源性。

本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，可以用许多方式操作编码本发明水解酶的分离的多核苷酸以提供水解酶的表达。所述分离的多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。调控序列可以是适当的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。利用基因克隆技术，可将克隆到的水解酶Eij5基因连接到合适的载体上，并转化或转染到原核生物或真核生物宿主表达制备重组水解酶Eij5。合适的原核生物宿主包括各种细菌如E.coli等，合适的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞)等，优选采用原核表达系统E.coli。

合适的载体为本领域技术人员所熟知的各种可商业化购买的原核或真核表达载体，原核表达载体如pET系列载体，pQE系列载体；酵母表达载体pPICZ-α-A，pHIL-D2，pPIC9，pHIL-S1(Invitrogen Corp.San Diego.California.USA)；动物细胞表达载体pSVK3、pMSG(Amersham Pharmacia Biotech Inc.USA)等。

本发明涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，可以用许多方式操作编码本发明水解酶的分离的多核苷酸以提供水解酶的表达。所述分离的多核苷酸与一个或多个调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。调控序列可以是适当的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸，可有利地用于水解酶Eij5的重组生产中。将包含本发明的多核苷酸的载体导入宿主细胞，宿主细胞的选择在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。宿主细胞可以是在本发明的水解酶Eij5的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。利用基因克隆技术，可将克隆到的水解酶Eij5基因连接到合适的载体上，并转化或转染到原核生物或真核生物宿主表达制备重组水解酶Eij5。合适的原核生物宿主包括各种细菌如E.coli等，可通过如下原生质体转化或或电穿孔法将载体转化到原核细胞中。合适的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞)等。本发明优选采用原核表达系统E.coli表达生产水解酶Eij5。一个优选的例子是将本发明筛选到的水解酶基因eij5连接到大肠杆菌表达载体pSMT3上，并转化到大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)中，经诱导表达出高活性的重组酶。

本发明还涉及用于产生本发明所述水解酶Eij5的方法，其包括：

(a)在有助于产生水解酶Eij5的条件下培养重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含SEQ ID NO：1所示核苷酸或其至少一个突变位点的核苷酸；

(b)回收所述多肽。

在本发明的产生方法中，使用本领域已知的方法在适合于产生所述水解酶Eij5的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述水解酶Eij5的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，则其能够从细胞裂解物回收。

所得水解酶Eij5可以使用本领域已知的方法回收。例如，可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)或差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)等方法。

本发明还提供了水解酶Eij5或能表达水解酶Eij5的宿主菌在工业上的应用，例如可用于催化酯类水解。通过酯酶活力测定表明，水解酶Eij5具有酯酶活性。Eij5或上述能表达Eij5的宿主菌可用于水解短链脂肪酸酯，例如C4-C8短碳链脂肪酸酯.优选的短链脂肪酸脂为具有C4-C8短碳链的对硝基苯酚酯，例如对硝基苯酚丁酸酯、对硝基苯酚己酸酯和对硝基苯酚辛酸酯等，其中底物为对硝基苯酚丁酸酯(C4)时催化活性最高，酶活为42.5U/mg。

Eij5催化水解温度范围为25～55℃，优选为45℃；所述水解的pH值为6.5～10.5，优选为7.0。在0.8mol/L NaCl条件下仍有酶学活性；在Ba²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺和Sr²⁺存在下可保留51％-90％以上活性；在添加有机溶剂DMF、DMSO、甘油、甲醇条件下，酶活基本不变，在添加EDTA与去垢剂TritonX-100条件下，酶学活性增大。

本发明从韩国济州岛海滨海水来源的细菌Erythrobacter jejuensisKCTC23090^T中筛选获得新的耐盐碱耐有机溶剂水解酶基因，发现了该基因编码蛋白具有优良的酶学特性，可应用于催化解酯和酶法合成酯产品生产过程中。获得的水解酶基因可克隆到合适的宿主中实现异源表达，实现工业化生产耐盐碱耐有机溶剂水解酶，为后续的工业应用提供成本低廉的耐盐碱有机溶剂水解酶起始材料。该酶的生产可在洗涤剂、废水处理、精细化工、制药和环境修复等含盐和含有机溶剂生产工艺中显示出重要的经济和社会价值。

附图说明

图1为纯化水解酶Eij5的聚乙酰胺凝胶电泳分析图。

图2为水解酶Eij5的底物特异性图。C2：对硝基苯酚乙酸酯；C4：对硝基苯酚丁酸酯、C6：对硝基苯酚己酸酯；C8：对硝基苯酚辛酸酯；C10：对硝基苯酚癸酸酯；C12：对硝基苯酚十二酸酯；C14：对硝基苯酚十四酸酯；C16：对硝基苯酚十六酸酯；定义底物为C4时测定值为100％。

图3为水解酶Eij5最适反应pH图。

图4为水解酶Eij5最适反应温度图。

图5为二价阳离子对水解酶Eij5活性影响图。

图6为有机溶剂对水解酶Eij5活性影响图。

具体实施方式

实施例1 水解酶基因eij5的获取

基于分离自韩国济州岛海滨海水来源的细菌ErythrobacterjejuensisKCTC23090^T全基因组、开放阅读框预测及基因注释结果，筛选脂类水解酶相关基因。通过Blastp(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对序列与数据库中已知水解酶基因序列的同源性。经数据库比对分析获得951bp，碱基组成为165 A(17.35％)、175 T(18.40％)、321C(33.75％)和290 G(30.49％)，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。编码蛋白大小为316个氨基酸残基，其氨基酸序列如下所示(其三字母氨基酸序列如SEQ ID No.2所示)：

将该Eij5蛋白序列在GenBank中进行同源搜索，与之氨基酸序列一致性最高的是不同属细菌Erythrobacter litoralis HTCC2594^T中的酯酶一致性为83％(其在GenBank数据库中的注册号为WP_011414343.1)。

系统发育分析表明，水解酶Eij5属于酯酶第IV家族。氨基酸序列分析结果显示，活性位点丝氨酸位于具有甘氨酸-X-丝氨酸-X-甘氨酸特征的保守序列内(氨基酸位置为161-166)，与255位天冬氨酸，285位组氨酸共同构成酯酶的催化中心，89-92位氨基酸构成组氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸保守序列。其氨基酸序列特征符合第IV家族酯类水解酶特征。

综上所述，Eij5应为酯酶家族的一名新成员。

实施例2 基因Eij5的重组表达质粒和重组菌株的构建

将本发明获得的基因Eij5克隆到表达载体上，构建重组表达菌株。基于NCBI ORFFinder的ORF分析获得的基因开放阅读框序列，设计扩增全基因的上游引物Eij5F(5’-TCGCGGATCCATGAATGACGGCAATCCCTTCG-3’，BamHI)和下游引物Eij5R(5’-TCCCGAGCTCTCAGGCGTTCCCCGCCAGC-3’，SacI)，PCR扩增确认基因全长序列。采用酶切克隆的方法构建表达质粒，即用BamHI和SacI双酶切PCR产物，纯化后的片段与经BamHI和SacI双酶切的质粒pSMT3连接，采用CaCl₂转化法转化至E.coli DH5α中，卡那霉素抗性筛选阳性克隆。采用质粒抽提试剂盒(Omega，美国)提取阳性克隆的质粒，经BamHI和SacI双酶切鉴定，获得接近1000bp左右的DNA片段，经测序鉴定为基因eij5。将重组表达质粒转化到E.coliRosetta(DE3)表达菌株中，构建表达重组菌株。

实施例3 利用重组表达菌株表达重组基因Eij5

将构建好的3ml重组表达菌株转接到100ml含有50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀达到0.6，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达，转入16℃以150r/min振荡培养20h。低温离心收集菌体，重悬于NTA-10溶液(500mM氯化钠，10mM咪唑，20mM Tris盐酸，pH 8.0)中，在冰上进行超声波破碎处理。低温离心收集上清，采用NTA-Ni²⁺亲和柱层析纯化表达蛋白。所表达的重组蛋白含有N端的6×His tag，可亲和吸附到层吸柱上，经过不同浓度的咪唑溶液梯度洗脱，收集洗脱液。经SDS-PAGE检测目的蛋白在洗脱液中的分布情况。利用ULP1酶在透析袋中切除重组蛋白N端的类泛素SUMO，并采用NTA-Ni²⁺亲和柱层析去除SUMO蛋白，收集样品进行SDS-PAGE检测。得到电泳纯的重组蛋白Eij5，分子量约33kDa(图1)。用Brandford法测定蛋白质浓度。

实施例4 重组基因Eij5的活性检测

利用对硝基苯酚丁酸酯法测定纯化的重组水解酶Eij5活性。具体操作：1ml反应体系中包括1mM对硝基苯酚丁酸酯，100mM磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(pH 7.0)和4.04ng纯酶蛋白，采用紫外可见光分光光度计(Beckman DU800型，美国)于45℃条件下连续测定吸光值A₄₀₅ 2min，使用失活的酶液作为对照用于调零。一个酶活力单位定义为每分钟从对硝基苯酚酯催化产生lμmol对硝基苯酚的所需要的酶量。测得的酯酶活性为42.5U/mg。

实施例5 水解酶Eij5底物特异性分析

水解酶Eij5的底物特异性分析采用体系(1ml)：100mM磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(pH 7.5)，1mM底物，加入4.04ng纯酶蛋白，在25℃下连续测定吸光值A₄₀₅ 2min。测定采用的底物为：对硝基苯酚乙酸酯(C2)，对硝基苯酚丁酸酯(C4)，对硝基苯酚己酸酯(C6)，对硝基苯酚辛酸酯(C8)，对硝基苯酚癸酸酯(C10)，对硝基苯酚十二酸酯(C12)，对硝基苯酚十四酸酯(C14)，对硝基苯酚十六酸酯(C16)。经测定表明，Eij5对酰基碳链较短的对硝基苯酚酯(C4、C6和C8)具有较高催化活性，其中底物为对硝基苯酚丁酸酯(C4)时催化活性最高。结果表明，水解酶Eij5对酰基碳链较短脂类物质具有较好催化活性(图2)。

实施例6 水解酶Eij5最适反应条件分析

水解酶Eij5最适反应pH在3.0～10.5范围内测定。具体操作为：在不同pH缓冲液中加入1mM对硝基苯酚丁酸酯和4.04ng纯酶蛋白，在40℃下连续测定吸光值A₃₄₈ 2min。测定使用的缓冲液为：100mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0～6.0)，100mM磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(pH 6.0～7.5)，100mM Tris盐酸缓冲液(pH 7.5～9.0)和100mM 2-环己胺基乙磺酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.0～10.5)。测定结果表明，Eij5最适反应pH为7.0，在pH 6.5～10.5范围内具有活性(图3)。

水解酶Eij5最适反应温度在15～60℃范围内测定。具体操作为：1ml反应体系中，加入1mM对硝基苯酚丁酸酯，100mM磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(pH 7.0)和4.04ng纯酶蛋白，分别在15、20、25、30、35、40、45、50、55和60℃条件下连续测定吸光值A₄₀₅ 2min。测定结果表明Eij5的反应温度范围为25～55℃，最适反应温度为40℃(图4)。

实施例7 水解酶Eij5酶学稳定性分析

二价阳离子和金属螯合剂对水解酶Eij5活性影响的测定具体操作为：在反应体系中分别加入10mM Ba²⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Sr²⁺、Zn²⁺和乙二胺四乙酸(EDTA)，测定酶活性。测酶活体系为：1ml反应体系中，加入1mM对硝基苯酚丁酸酯，100mM磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(pH 7.0)和4.04ng纯酶蛋白，于40℃下连续测定吸光值A₄₀₅2min。测定结果表明，Eij5活性在Ba²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺和Sr²⁺存在下对酶活影响不大(保留85％以上活性)，在Mn²⁺、Zn²⁺、Co²⁺存在条件下对其酶活抑制作用较强，Eij5酶活可被Cd²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺完全抑制，EDTA可增强其活性(图5)。

有机溶剂和去垢剂对水解酶Eij5活性影响的测定具体操作为：在反应体系中分别加入15％(v/v)有机溶剂：丙酮(Acetone)、乙腈(Acetonitrile)、乙醇(Ethanol)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、甘油(Glycerol)、异丙醇(Isopropanol)和甲醇(Methanol)，或1％去垢剂(w/v或v/v)：SDS、吐温20(Tween 20)、吐温80(Tween80)和TritonX-100测定酶的活性。测活体系为：1ml反应体系中，加入1mM对硝基苯酚丁酸酯，100mM磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(pH 7.0)和4.04ng纯酶蛋白，于45℃下连续测定吸光值A₄₀₅ 2min。测定结果表明，Eiij5酯酶在DMF、DMSO、甘油、甲醇存在条件下可保持70％以上活性，SDS和Tween 20可抑制Eij5酯酶活性(相对活性<10％),而TritonX 100可增强其活性(图6)。

序列表

<110> 自然资源部第二海洋研究所

<120> 一种海洋细菌来源新型耐碱耐有机溶剂酯酶及应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 951

<212> DNA

<213> Erythrobacter jejuensis

<400> 1

atgaatgacg gcaatccctt cgtgcgcgat gatgtggcag ccttcctcgc cttgctggaa 60

caggcaggcg gcccgccgat caacgaagtc tcgctggagg aagcgcgcgg cgcctatatg 120

gcgctgcacc agatggctga ccgcccggcc cgtgatctcg ccgtgatcac cgatctgaca 180

tgcccaggcc cgggtggcga tatacccctg cgcctgtatg attcccgtga cagccgcgat 240

cctggcccgg tgatctgttt ctaccatggc ggcggattcg tgatcggcga tctcgatacc 300

caccacaatc tgtgcaccga aatcgcgcat cagatggatt tgcccgtggt ggcggtcgat 360

taccggctcg cgccggagca ccccttcccc gccccgatcg aggattgcat tgccgccagc 420

cgctggatcg ctgactcgcc cgaagcattg ggccgcccgg ccaccggcat tatcccgatt 480

ggcgatagcg cgggcggcaa tgcgaccatc gttgtaagcc aggcgctggc ccggcaaccg 540

gcggacacgc ctgtcctcct gcaggtgccg atcttcccgc tcgccagcga ctcggcaggc 600

tcaaccagcc tggaagaatt cgccgaggga tttgtcctca ccaaggtcgc gatcgaattc 660

ttcgaagcgg gctaccagcc cgacaaggcc gatccccgag ccatgccgat cctgggcagc 720

catgcgggca caccgccctc gatcgtagtc accgccagcc tcgatccgat ccgcgattcc 780

gggcgtgatt atgctgcggc actggcgcag gccgggattg atcatgtgtt cctggaggtt 840

gccggcggca ctcacagttt caccaatctg cgacaggcag tgcccagcta ccagaccgag 900

cttgagcggg tctttgccgc gatgaagctg atgctggcgg ggaacgcctg a 951

<210> 2

<211> 316

<212> PRT

<213> Erythrobacter jejuensis

<400> 2

Met Asn Asp Gly Asn Pro Phe Val Arg Asp Asp Val Ala Ala Phe Leu

1 5 10 15

Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gly Gly Pro Pro Ile Asn Glu Val Ser Leu

20 25 30

Glu Glu Ala Arg Gly Ala Tyr Met Ala Leu His Gln Met Ala Asp Arg

35 40 45

Pro Ala Arg Asp Leu Ala Val Ile Thr Asp Leu Thr Cys Pro Gly Pro

50 55 60

Gly Gly Asp Ile Pro Leu Arg Leu Tyr Asp Ser Arg Asp Ser Arg Asp

65 70 75 80

Pro Gly Pro Val Ile Cys Phe Tyr His Gly Gly Gly Phe Val Ile Gly

85 90 95

Asp Leu Asp Thr His His Asn Leu Cys Thr Glu Ile Ala His Gln Met

100 105 110

Asp Leu Pro Val Val Ala Val Asp Tyr Arg Leu Ala Pro Glu His Pro

115 120 125

Phe Pro Ala Pro Ile Glu Asp Cys Ile Ala Ala Ser Arg Trp Ile Ala

130 135 140

Asp Ser Pro Glu Ala Leu Gly Arg Pro Ala Thr Gly Ile Ile Pro Ile

145 150 155 160

Gly Asp Ser Ala Gly Gly Asn Ala Thr Ile Val Val Ser Gln Ala Leu

165 170 175

Ala Arg Gln Pro Ala Asp Thr Pro Val Leu Leu Gln Val Pro Ile Phe

180 185 190

Pro Leu Ala Ser Asp Ser Ala Gly Ser Thr Ser Leu Glu Glu Phe Ala

195 200 205

Glu Gly Phe Val Leu Thr Lys Val Ala Ile Glu Phe Phe Glu Ala Gly

210 215 220

Tyr Gln Pro Asp Lys Ala Asp Pro Arg Ala Met Pro Ile Leu Gly Ser

225 230 235 240

His Ala Gly Thr Pro Pro Ser Ile Val Val Thr Ala Ser Leu Asp Pro

245 250 255

Ile Arg Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Ala Ala Ala Leu Ala Gln Ala Gly

260 265 270

Ile Asp His Val Phe Leu Glu Val Ala Gly Gly Thr His Ser Phe Thr

275 280 285

Asn Leu Arg Gln Ala Val Pro Ser Tyr Gln Thr Glu Leu Glu Arg Val

290 295 300

Phe Ala Ala Met Lys Leu Met Leu Ala Gly Asn Ala

305 310 315

Claims

1.一种具有水解酶活性的分离的多肽，其与SEQ ID NO:2的多肽所示序列一致。

2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述的具有水解酶活性的多肽来源于细菌Erythrobacter jejuensis。

3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述水解酶的催化中心为SEQ ID NO:2所示的161-165、255和285号氨基酸位置。

4.一种编码具有权利要求1所述多肽的多核苷酸，其与SEQ ID NO:1的核苷酸所示序列一致。

5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于：所述的多核苷酸具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列至少95％以上的同源性。

6.根据权利要求5所述的多核苷酸，其特征在于：所述的多核苷酸具有与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列至少99％以上的同源性。

7.一种核酸构建体，其包含与一种或多种调控序列可操作地连接的权利要求4的多核苷酸，所述调控序列在合适的表达宿主中指导所述多肽的产生。

8.一种重组表达载体，其包含权利要求7的核酸构建体。

9.根据权利要求8所述的重组表达载体，其特征在于：所述的载体为原核表达载体如pET系列载体，pQE系列载体；酵母表达载体pPICZ-α-A，pHIL-D2，pPIC9，pHIL-S1；或动物细胞表达载体pSVK3、pMSG。

10.根据权利要求9所述的重组表达载体，其特征在于：所述的载体为大肠杆菌表达载体pSMT3。

11.一种宿主，其由权利要求8-10任一项所述的载体经转化或转染细菌、酵母或工程哺乳动物细胞得到。

12.根据权利要求11所述的宿主，其为E.coli细菌、甲醇酵母或中国仓鼠卵巢细胞。

13.根据权利要求12所述的宿主，其为E.coli细菌。

14.一种产生权利要求1-3任一项所述多肽的方法，其包括：

(a)、在有助于产生水解酶的条件下培养权利要求11所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含SEQ ID N0:1所示核苷酸或其至少一个突变位点的核苷酸；

(b)、回收所述多肽。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(2)中，回收方法包括离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

16.据权利要求15所述的方法，其特征在于：所述方法步骤(2)中，通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括离子交换层析、亲和层析、疏水层析、聚焦层析、大小排阻层析或差示溶解度方法。

17.权利要求1所述的水解酶或权利要求11所述的能表达水解酶的宿主在催化C2-C10碳链脂肪酸酯类水解中的应用。

18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述短链脂肪酸酯为C4-C8短碳链脂肪酸酯。

19.根据权利要求18所述的应用，其特征在于，所述的C4-C8短链脂肪酸酯为具有C4-C8短碳链的对硝基苯酚酯。

20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于，所述的C4-C8短链脂肪酸酯为对硝基苯酚丁酸酯、对硝基苯酚己酸酯和对硝基苯酚辛酸酯。

21.根据权利要求17-20任一项所述的应用，其特征在于，所述的水解酶催化水解温度范围为25～55℃。

22.根据权利要求21所述的应用，其特征在于，所述的水解酶催化水解温度为45℃。

23.根据权利要求17-20任一项所述的应用，其特征在于，所述的水解酶催化水解的pH值为6.5～10.5。

24.根据权利要求23所述的应用，其特征在于，所述的水解酶催化水解pH值为7。