CN109988780B

CN109988780B - 基于甲基丙烯酸缩水甘油酯的高性能基因载体及其应用

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Publication number: CN109988780B
Application number: CN201910210177.7A
Authority: CN
Inventors: 倪沛红; 李磊; 何金林; 张明祖
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2019-03-19
Filing date: 2019-03-19
Publication date: 2021-07-09
Anticipated expiration: 2039-03-19
Also published as: CN109988780A

Abstract

本发明公开了基于甲基丙烯酸缩水甘油酯的高性能基因载体及其应用，基于甲基丙烯酸酯类构建三种功能化的阳离子聚合物载体（缩写为PGEA、PGAP和PGHA），可以直接在水中溶解，并能够有效的将带有负电的基因完全固定住。在肝素钠的存在下，PGEA、PGAP和PGHA三种阳离子聚合物载体与基因复合物溶液在体内血液循环过程中具有较好的稳定性以及在细胞内具有较好的转染效果。与聚乙烯亚胺（PEI）相比，本发明公开的含有羟基的阳离子聚合物能够促进阳离子聚合物载体/基因络合物的内吞和转录。本发明能够有效控制所需阳离子聚合物的分子量，精密合成不同聚合度的阳离子聚合物载体。本发明中，实验条件较为温和，操作简单，提纯方便，适合工业化生产。因而可以用来构建不同功能化修饰的阳离子聚合物载体，并且将来作为基因载体具有较大的市场应用前景。

Description

基于甲基丙烯酸缩水甘油酯的高性能基因载体及其应用

技术领域

本发明属于生物医用高分子材料领域，具体涉及基于甲基丙烯酸缩水甘油酯构建高性能的基因载体及其制备方法与应用。

背景技术

基因治疗由于在治疗癌症、传染病、先天免疫缺陷以及心血管疾病方面有潜在的应用价值，因而引起众多科研工作者的关注和广泛研究。据文献报道，基因治疗的核心是基因传递，进入细胞内从而进行基因表达。游离的基因可以被内吞进入细胞内；但是通过实验证明，游离的DNA或RNA对血清中核酸酶的消化作用非常敏感，易于被降解，从而导致游离的基因在细胞内的转染效率较低；因此这种方法的进程对于有效的生物效应来说太慢。此外，由于胞内障碍和胞外障碍都会阻碍基因的传递、转录和表达，所以，基因治疗需要一种合适的传递系统。因此，发展有效的基因载体对基因治疗十分重要。

基因传递体系包括：病毒载体和非病毒载体；虽然病毒载体可以使外源基因在细胞中有效表达，但是病毒载体也有很多缺点。例如：不可控细胞分裂的可能性，高免疫原性，转导组织炎症，随机的基因融合和外源基因尺寸受限等。相反，非病毒基因载体有低免疫原性，适应性强等特点，具有可负载较大尺寸外源基因和大规模生产的潜能。因此，利用化学合成的方法构建高效率的基因载体吸引了众多科研工作者的关注。

为取代病毒基载体，科学家们努力设计并合成出不同结构的阳离子聚合物作为基因载体。然而这些阳离子型高分子量基因载体具有自身的缺点，例如：毒性大，稳定性较差，转染效率低和功能单一等；尤其是对于基因治疗来说，构建出阳离子聚合物基因载体来提高复合物的稳定性以及转染效率是一项急需解决的难题。

发明内容

本发明的目的是，提供阳离子型高分子聚合物基因载体的构建方法；与聚乙烯亚胺（PEI）相比，本发明的聚合物阳离子作为基因载体具有较低的毒性，较好的稳定性以及较好的转染效率。

本发明采用如下技术方案：

基于甲基丙烯酸缩水甘油酯构建的聚阳离子基因载体，由下列化学结构式表达：

式中，x为50～70。

优选的，所述基于甲基丙烯酸缩水甘油酯的高性能基因载体的分子量为1.0´10⁴～3.0´10⁴ g mol^-1。

上述基于甲基丙烯酸缩水甘油酯的高性能基因载体的制备方法包括以下步骤：

（1）惰性气体条件下，以甲基丙烯酸缩水甘油酯为原料，在链转移剂和引发剂存在下，通过聚合反应，制备聚甲基丙烯酸缩水甘油酯；

（2）利用小分子化合物对聚甲基丙烯酸缩水甘油酯进行开环反应，制备基于甲基丙烯酸缩水甘油酯的高性能基因载体。

本发明还公开了基于甲基丙烯酸缩水甘油酯的高性能基因载体的制备方法，包括以下步骤：

一种基因药物，所述基因药物的制备方法包括以下步骤：

（2）利用小分子化合物对聚甲基丙烯酸缩水甘油酯进行开环反应，制备基于甲基丙烯酸缩水甘油酯的高性能基因载体；

（3）将基因溶液与基于甲基丙烯酸缩水甘油酯的高性能基因载体水溶液混合，得到基因药物。

一种基因药物的制备方法，包括以下步骤：

本发明惰性气体条件下，以甲基丙烯酸缩水甘油酯为原料，在链转移剂和引发剂存在下，通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合，制备聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）；将聚甲基丙烯酸缩水甘油酯完全溶解在溶剂中，利用三种不同的小分子化合物分别对聚甲基丙烯酸缩水甘油酯的侧基环氧基团进行开环反应，从而得到三种阳离子聚合物。

将基因溶液与基于甲基丙烯酸缩水甘油酯的高性能基因载体水溶液混合，涡旋30秒，然后静置30分钟，得到基因药物。

本发明中，步骤(1)中，惰性气体为氮气；引发剂为偶氮二异丁腈；链转移剂为4-氰基-4-二硫代苯甲酰氧基戊酸；4-氰基-4-二硫代苯甲酰氧基戊酸与甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔比为1∶（40～90）；聚合反应的温度为50℃～80℃，时间为5 h～15 h；

步骤(2)中，小分子化合物为乙醇胺、异丙醇胺或者N-羟乙基乙二胺；聚甲基丙烯酸缩水甘油酯中环氧官能团与小分子的摩尔比为1∶（10～20）；开环反应的温度为50℃～80℃，时间为5 h～15 h；

步骤（3）中，基因溶液与基于甲基丙烯酸缩水甘油酯的高性能基因载体水溶液混合得到的混合液中，氮磷比为0.5～6。

上述基于甲基丙烯酸缩水甘油酯的高性能基因载体在制备基因药物中的应用。

本发明基于甲基丙烯酸缩水甘油酯构建的聚阳离子基因载体，由下列化学结构式表达：

式中，x为40～90。

本发明中，利用可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合，制备聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）；利用乙醇胺（EA）、异丙醇胺（AP）N-羟乙基乙二胺（HA）以及3-二丁氨基丙胺（DA）分别对聚甲基丙烯酸缩水甘油酯进行功能化反应，产物分别简写为PGEA、PGAP、PGHA以及PGDA，数均分子量为1.0´10⁴～3.0´10⁴ g mol^-1；其中，PGDA构建的聚合物水溶性较差，无法作为基因载体，而PGEA、PGAP和PGHA构建的基因载体可以直接在水中进行溶解，能够有效的将基因固定住，然后递送进多种细胞内。聚合物PGEA、PGAP和PGHA自身表现出低毒的特性和较高的转染效率，这是由于本发明的阳离子聚合物基因载体有利于促进载体/基因复合物胞内吞噬以及基因片段在细胞内的转录和表达。

本发明中，上述基于甲基丙烯酸缩水甘油酯构建阳离子聚合物载体的制备方法，具体可举例如下：

(1) 惰性气体条件下，以甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）为原料，以4-氰基-4-二硫代苯甲酰氧基戊酸（4-CPDB）为链转移剂，偶氮二异丁腈（AIBN）为引发剂，通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合，制备聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）；

所述4-氰基-4-二硫代苯甲酰氧基戊酸（4-CPDB）的化学结构式为：

所述聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）聚合物的化学结构式为：

(2) 分别以乙醇胺（EA）、异丙醇胺（AP）、N-羟乙基乙二胺（HA）以及作为对比的3-二丁氨基丙胺（DA）四种不同的小分子对聚甲基丙烯酸缩水甘油酯的侧基环氧基团（PGMA）进行开环反应，从而得到四种功能化阳离子聚合物，分别简写为PGEA、PGAP、PGHA和PGDA，可作为基因载体；

步骤(1)中，惰性气体为氮气；引发剂为偶氮二异丁腈；链转移剂为4-氰基-4-二硫代苯甲酰氧基戊酸（4-CPDB）；4-氰基-4-二硫代苯甲酰氧基戊酸与甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔比为1∶（40～90）；

步骤(2)中，反应溶剂为N, N-二甲基甲酰胺（DMF）；聚甲基丙烯酸缩水甘油酯中环氧官能团与四种小分子（EA、AP、HA以及作为对比的DA）的摩尔比为1∶（10～20）；

所述乙醇胺（EA）、异丙醇胺（AP）、N-羟乙基乙二胺（HA）以及3-二丁氨基丙胺（DA）功能化的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）载体，分别简写为PGEA、PGAP、PGHA和PGDA聚合物，其中这四种聚合物的化学结构式分别为：

步骤(1)中，可逆加成-断裂链转移反应的温度为50℃～80℃，时间为5 h～15 h；步骤(2)中，开环反应时，反应温度为50℃～80℃，反应时间为5 h～15 h。

本发明公开的功能化修饰的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯类基因载体的生物性能测试，包括以下步骤：

(1) 将制备出的阳离子聚合物PGEA、PGAP以及PGHA溶解在水中，待完全溶解后，配置成不同浓度的聚合物溶液，向聚合物溶液中加入一定浓度的基因溶液，涡旋30秒，静置30分钟；分别得到三种阳离子聚合物与DNA的复合物，即PGEA/DNA复合物、PGAP/DNA复合物以及PGHA/DNA复合物的混合溶液；利用电泳仪对PGEA/DNA复合物、PGAP/DNA复合物和PGHA/DNA复合物固定DNA的能力和稳定性进行研究；

(2)对不同浓度的PGEA、PGAP、PGHA以及PEI阳离子聚合物的细胞毒性进行研究，利用MTT法测试PGEA、PGAP、PGHA以及PEI阳离子聚合物与正常细胞以及两种肺癌细胞的细胞毒性，利用从而来验证PGEA、PGAP、PGHA以及PEI阳离子聚合物载体的生物相容性；

(3) 对不同氮磷比的PGEA/DNA复合物、PGAP/DNA复合物以及PGHA/DNA复合物体外细胞转染效率进行研究；在一定氮磷比的条件下，PGEA/DNA复合物、PGAP/DNA复合物以及PGHA/DNA复合物对A549和H1299肺癌细胞的细胞毒性测试。

步骤(1)中，配置不同氮磷比的阳离子聚合物/DNA溶液，配置不同浓度的肝素钠溶液，其浓度分别为0.1，0.3，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mg mL^-1。利用凝胶阻滞电泳来验证基因载体与DNA的复合作用以及利用动态光散射（DLS）测试阳离子聚合物/DNA复合物溶液的Zeta电位值；

步骤(2)中，聚合物的浓度分别为1.8 mg/mL，1.5 mg/mL，1.2 mg/mL，0.9 mg/mL，0.6 mg/mL，0.3 mg/mL，0.15 mg/mL；基因的浓度为0.3μg/mL；

步骤(3)中，三种聚合物的浓度分别是1000 mg/mL，500 mg/mL，250 mg/mL，125mg/mL，62.5 mg/mL，31.25 mg/mL，15.63 mg/mL，7.81 mg/mL，3.90 mg/mL，1.95 mg/mL，正常细胞为成纤维细胞（L929），肺癌细胞分别为A549和H1299，氮磷比分别为0，1，3，6；一定氮磷比是6。

本发明还公开了上述基于甲基丙烯酸缩水甘油酯构建阳离子型聚合物载体，再利用三种小分子对其进行侧链功能化修饰，分别得到三种聚甲基丙烯酸酯类的阳离子基因载体；并公开了聚甲基丙烯酸酯类基因载体的生物相容性，压缩基因的稳定性以及载体/基因复合物在细胞内的转染效率等。

本发明利用可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合的方法，制备了聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）；利用三种小分子化合物对聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）进行功能化修饰，得到三种PGEA、PGAP和PGHA阳离子聚合物；三种PGEA、PGAP和PGHA阳离子聚合物在水溶液中能够与带负电荷的基因复合，能够有效地将带负电的基因完全固定住，具有较好的稳定性和较好的转染效率。所制备的PGEA、PGAP和PGHA阳离子聚合物，与聚乙烯亚胺（PEI）相比，能够促进阳离子聚合物/基因复合物的内吞和转录。此制备方法操作简单，能够精密控制高分子基因载体结构，易于工业化生产，并具有较好的市场前景。

进一步的技术方案，在步骤(1)～(2)完成后，分别对产物进行提纯处理，所述纯化过程包括以下步骤：

PGMA聚合物的纯化：在反应结束后，将反应溶液转移至透析袋中，先用DMF溶液进行透析12 h，每隔6 h更换一次DMF溶液；然后再利用二次水透析24 h，每隔6 h换一次二次水。待透析结束后，将透析袋中所得到的聚合物溶液冷冻干燥，即可获得步骤（1）的产物。

PGEA、PGAP和PGHA聚合物的纯化：在反应结束后，将反应溶液转移至透析袋中，先用DMF溶液进行透析12 h，每隔6 h更换一次DMF溶液；然后再利用二次水透析24 h，每隔6h换一次二次水。待透析结束后，将透析袋中所得到的聚合物溶液冷冻干燥，即可获得步骤(2)的产物。

上述技术方案中，透析时采用截留分子量为7000 Da的透析袋。

本发明公开的是基于甲基丙烯酸酯类构建的三种阳离子聚合物载体PGEA、PGAP和PGHA，可以直接在水中溶解，并能够有效地将带有负电荷的基因片段完全固定住；在肝素钠的存在下，分别用三种阳离子聚合物载体PGEA、PGAP和PGHA与基因复合物，能够保持较好的稳定性以及在细胞内具有较好的转染效果。与聚乙烯亚胺（PEI）相比，所制备含有羟基的阳离子聚合物，自身的毒性较小，侧链含有大量的羟基能够促进阳离子聚合物/基因复合物在细胞内吞和转录。

由于上述方法的实施，本发明与现有的技术相比，具有以下优点：

1. 本发明通过可逆加成—断裂链转移（RAFT）聚合的方法，制备聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）；此方法可以有效控制聚合物的分子量，精密合成不同分子量的基因载体，根据所需定量合成基因载体。

2. 本发明将三种功能化的阳离子聚合物与国际金标PEI基因载体相比较，具有较好的生物相容性，并且可以增加基因载体的水溶性，降低聚合物自身的毒性，促进胞内吞噬以及提高基因载体自身的转染效率。

3. 本发明的聚合物结构可有效控制，实验条件较为温和，操作简单，提纯方便，适合工业化生产。

附图说明

图1为实施例一中4-氰基-4-二硫代苯甲酰氧基戊酸的核磁共振氢谱图，溶剂为氘代二甲亚砜；

图2为实施例一中聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）的核磁共振氢谱图，溶剂为氘代氯仿；

图3为实施例一中聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）的凝胶渗透色谱图；

图4为实施例二中PGEA的核磁共振氢谱图，溶剂为氘水；

图5为实施例三中PGAP的核磁共振氢谱图，溶剂为氘水；

图6为实施例四中PGHA的核磁共振氢谱图，溶剂为氘水；

图7为红外光谱图，其中，(A) PGEA、(B) PGAP、(C) PGHA；

图8为实施例五中不同N/P比载体/基因复合物的Zeta电位值，其中，(A) PGEA/基因复合物溶液、(B) PGAP/基因复合物溶液、(C) PGHA/基因复合物溶液以及(D) PEI/基因复合物溶液;

图9为实施例五中不同N/P比载体/基因复合物溶液的凝胶电泳图像，其中，(1)PGEA/基因复合物溶液、(2) PGAP/基因复合物溶液、(3) PGHA/基因复合物溶液以及(4)PEI/基因复合物溶液;

图10为实施例五中阳离子聚合物/基因按一定N/P（N/P = 6）复合，加入不同浓度的外源负电荷物质肝素钠干扰后的凝胶电泳图像，其中，(1) PGEA/基因复合物溶液、(2)PGAP/基因复合物溶液、(3) PGHA/基因复合物溶液以及(4) PEI/基因复合物溶液;

图11为实施例六中L929细胞、A549细胞以及H1299细胞分别与不同浓度的聚合物PGEA、PGAP以及PGHA溶液培养48 h后的细胞存活率；

图12为实例七中不同N/P比的阳离子聚合物载体/基因复合物溶液在A549细胞内的表达情况，其中，(A) PGEA/基因复合物溶液、(B) PGAP/基因复合物溶液、(C) PGHA/基因复合物溶液；

图13 为实例八中游离基因以及三种聚合物/DNA复合物溶液对A549和H1299两种癌细胞的细胞存活率：(A) A549细胞与游离的DNA、PGEA/DNA、PGAP/DNA和PGHA/DNA（N/P=6）复合物溶液的细胞存活率；(B) H1299 细胞与游离的DNA、PGEA/DNA、PGAP/DNA和PGHA/DNA（N/P=6）复合物溶液的细胞存活率；

图14为PGEA水溶液、PGAP水溶液、PGHA水溶液以及PGDA水溶液的照片图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步描述：

实施例一：聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）的合成

首先，在惰性气体气氛条件下，以甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）为原料，以4-氰基-4-二硫代苯甲酰氧基戊酸（4-CPDB）为链转移剂，偶氮二异丁腈（AIBN）为引发剂，通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合，制备聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）；具体合成方法如下：将放入搅拌子的250mL支管圆底烧瓶，在120℃烘箱中干燥24 h，取出，塞上玻璃塞，通过乳胶管与油泵相连，将支管圆底烧瓶抽真空至室温后，再通入高纯氮气。在通气过程中，加入4-氰基-4-二硫代苯甲酰氧基戊酸（4-CPDB，50 mg，0.18 mmol）、甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA，1.996 g，14.1 mmol）以及偶氮二异丁腈（AIBN，0.09 mmol，14.24 mg），向支管圆底烧瓶加入8 mL干燥后的N, N-二甲基甲酰胺（DMF）；再通入高纯氮气，抽真空，如此反复三次后充满氮气。搅拌待完全溶解，转移至70℃油浴中反应12 h。

迅速降温终止反应。选用截留分子量为7000 Da的透析袋对聚合反应的溶液进行透析，透析时间为48 h，每6 h更换一次透析水，目的是除去未参加反应的单体。将透析液冷冻干燥，获得淡红色的固体。即聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）聚合物，产率为88.8%。其中4-氰基-4-二硫代苯甲酰氧基戊酸（4-CPDB）和聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）核磁共振氢谱图分别见图1和图2。其中，x为40～90。

利用凝胶渗透色谱仪（HLC-8320，TOSOH）)测定聚合物的分子量及分子量分布，仪器流动相为THF，流速为0.35 mL min^-1以聚苯乙烯（PS）作为标样,测定温度为40℃。制备方法如下：称取约10 mg样品溶解在5 mL THF中，依次经过中性氧化铝砂芯、0.45 μm滤头过滤后进行测试。聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）的流出曲线如图3所示。

实施例二：乙醇胺功能化修饰的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGEA）的合成

向50 mL的单口瓶中依次加入聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA，120 mg，0.015mmol）和0.5 mL的乙醇胺（EA），然后向支管圆底烧瓶加入6 mL干燥后的N, N-二甲基甲酰胺（DMF）；搅拌待完全溶解，转移至70℃油浴中反应6 h。

待反应结束后。选用截留分子量为7000 Da的透析袋对反应溶液进行透析，透析时间为24 h，每6 h更换一次透析水，目的是除去未参加反应的乙醇胺。将透析液冷冻干燥，获得白色絮状粉末（PGEA）。产率为95.8%，产物的核磁共振氢谱图如图4所示。

实施例三：异丙醇胺功能化修饰的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGAP）的合成

向50 mL的单口瓶中依次加入聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA，120 mg，0.015mmol）和0.5 mL的异丙醇胺（AP），然后向支管圆底烧瓶加入6 mL干燥后的N, N-二甲基甲酰胺（DMF）；搅拌待完全溶解，转移至70℃油浴中反应6 h。

待反应结束后。选用截留分子量为7000 Da的透析袋对反应溶液进行透析，透析时间为24 h，每6 h更换一次透析水，目的是除去未参加反应的异丙醇胺。将透析液冷冻干燥，获得白色絮状粉末（PGAP）。产率为90.8%，产物的核磁共振氢谱图如图5所示。

实施例四：N-羟乙基乙二胺功能化修饰的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGHA）的合成

向50 mL的单口瓶中依次加入聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA，120 mg，0.015mmol）和0.5 mL的N-羟乙基乙二胺（HA），然后向支管圆底烧瓶加入6 mL干燥后的N, N-二甲基甲酰胺（DMF）；搅拌待完全溶解，转移至70℃油浴中反应6 h。

待反应结束后。选用截留分子量为7000 Da的透析袋对反应溶液进行透析，透析时间为24 h，每6 h更换一次透析水，目的是除去未参加反应的N-羟乙基乙二胺。将透析液冷冻干燥，获得白色絮状粉末（PGHA）。产率为93.3%，产物的核磁共振氢谱图如图6所示。

在利用红外光谱（FT-IR）来近一步验证PGEA，PGAP以及PGHA这三种阳离子聚合物的结构。附图7为PGEA，PGAP以及PGHA的红外光谱图。结合附图4、5、6可以证明反应产物符合实验设计。

利用相同方法构建了3-二丁氨基丙胺功能化修饰的PGMA阳离子聚合物，缩写为PGDA；但是，由于PGDA的溶解性较差，并未对其结构进行表征。

本发明主要是构建聚甲基丙烯酸缩水甘油酯侧链含有氨基和羟基的聚阳离子基因载体，能够促进聚阳离子载体与外源基因形成络合物，从而促进载体/基因复合物的跨膜运输以及提高所载基因在细胞内的转录与表达。本发明构建的分子量较大的阳离子聚合物可以有效地将质粒DNA络合成稳定的复合物，并且载体/基因复合物能够在血液循环过程中保持稳定性，通过内吞作用进入细胞内，将压缩的基因进行释放，从而在胞内进行转录与表达，尤其是能够提高基因在体内表达后的稳定性，改善基因的代谢动力学和生物分布，提升基因的细胞内吞率和提高基因的胞内运输效率。

实施例五：聚合物/基因复合物的Zeta电位和凝胶阻滞电泳实验

首先通过直接溶解法制备不同浓度的阳离子聚合物，取出阳离子聚合物水溶液，向其中加入相同体积的DNA水溶液（DNA为小牛胸腺DNA），涡旋30 秒，静置30 min。制备出不同氮磷比（N/P=0.5，1，2，3，4，5和6）的聚合物/基因复合物。利用动态光散射（DLS）分别对其Zeta电位进行表征，观察比较Zeta电位随纳米粒子N/P的变化趋势。不同氮磷比的PGEA/基因、PGAP/基因、PGHA/基因以及PEI/基因复合物的Zeta电位值如图8所示，其中A、B、C、D分别是代表PGEA/基因、PGAP/基因、PGHA/基因以及PEI/基因复合物的Zeta电位值，氮磷比在0.5以上时，PGEA/基因、PGAP/基因以及PGHA/基因复合物的Zeta电位值均为正值；氮磷比在1以上时，PGEA/基因、PGAP/基因以及PGHA/基因复合物的Zeta电位值达到20 mV，这说明已经完全将基因固定住。

不同的N/P由公式（1）可计算得到，其中，M ₁代表聚合物中阳离子载体的质量，M _DNA为DNA的质量。

（1）

根据不同的N/P比值，在一定量的DNA溶液中加入不同浓度的阳离子聚合物溶液，漩涡震荡使其完全混合均匀。阳离子聚合物溶液带正电，DNA溶液带负电，通过静电作用压缩DNA，形成聚合物与DNA的复合物溶液。将上述10 μL复合物溶液和2 μL的缓冲溶液（6 ×DNA loading buffer）混合，点样到含有0.1 μL mL^-1 Gel Red的琼脂糖凝胶（1 wt%琼脂糖）中进行电泳测试。电泳电压为80 V，时间为30 min，缓冲溶液为0.5 × TBE溶液。电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于化学发光成像仪（365 nm）中拍摄电泳结果。测试结过如图9所示，其中(1)、(2)、(3)和(4)分别是代表不同氮磷比的PGEA/基因、PGAP/基因、PGHA/基因以及PEI/基因复合物的凝胶电泳图像。其中第1列是对照组，为裸DNA与核酸荧光染料Gel Red作用产生的荧光图像；第2-8列分别加入不同N/P的复合物，每一列的N/P依次递增，分别为0.5，1，2，3，4，5和6。从图中可以看出，随着N/P的增大，点样孔中的荧光强度越大，证明在点样孔中滞留的DNA的量越多。这是由于加入聚合物的浓度增大，对DNA的固定作用增强。当N/P大于等于2（第3-6泳道）时，DNA已被完全固定，DNA的荧光条带均滞留在点样孔中，没有未被固定的DNA逃逸出来，表明所有的DNA都与阳离子聚合物发生复合，因而没有发生DNA的迁移。从图8和图9中可以看出，当氮磷比为1时，PGEA/DNA、PGAP/DNA、PGHA/DNA以及PEI/DNA络合物的Zeta电位值均大于10 mV。当N/P比大于1时，PGEA/DNA、PGAP/DNA、PGHA/DNA以及PEI/DNA络合物可以压缩DNA，起到稳定DNA的目的。但是相同浓度下，PEI聚合物自身的毒性较大，携载DNA时，对正常细胞具有较大的毒副作用。

作为基因载体，一个重要评价就是聚合物压缩DNA后在体内循环中遇到外源负电荷离子的干扰时能否依然保持稳定。肝素钠是一种带有强负电荷的聚阴离子物质，本发明利用肝素钠来模拟体内血液中带负电荷的大分子，当阳离子聚合物/基因复合物与肝素钠混合时，带负电荷的肝素钠会与带正电的阳离子载体发生电荷中和作用，与基因竞争阳离子载体，因此可以用来评价三种聚合物与负载基因的稳定性。将阳离子聚合物/DNA按一定的N/P（N/P = 6）混合制备成复合物后，加入不同浓度的肝素钠溶液，与复合物混合均匀后形成一系列不同肝素钠浓度的混合溶液，静置30 min，然后进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图10所示。第1列是DNA对照组，第2-8列混合溶液中肝素钠浓度分别为0.1，0.3，0.5，0.7，0.8，0.9，1 mg mL^-1。从图中可以看出，当肝素钠浓度在0.1-1.0 mg mL^-1之间变化时，对阳离子聚合物与DNA的复合没有影响，DNA仍然被阳离子载体固定，滞留在点样孔中，未有向正极移动的迹象。这说明当肝素钠存在时，阳离子载体仍能与DNA有很好的复合作用，可以在血液循环中为基因提供一个稳定的环境，保护其在体内循环过程中不被降解。图10中表示是四种络合物中加入不同浓度肝素钠溶液的凝胶阻滞电泳图；从图中可以看出，与PEI/DNA络合物相比，PGEA/DNA、PGAP/DNA和PGHA/DNA络合物载还原环境下都能维持络合物的稳定性。

实施例六：阳离子聚合物PGEA、PGAP、PGHA以及PEI生物相容性的研究

将正常细胞（L929细胞）以及两种肺癌细胞（A549和H1299细胞）的细胞培养在补充有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，置于37℃，5% CO₂（相对湿度为90%）的培养箱中培养，定期更换培养液。选择处在生长活跃期的细胞接种于每孔含有100 μL DMEM培养基的96孔板中，培养24 h。用直接溶解法配置PGEA、PGAP、PGHA以及PEI 聚合物溶液（聚合物浓度为5 mg mL^-1），将一系列不同浓度的PGEA、PGAP、PGHA以及PEI聚合物溶液加入到96孔板中，继续培养48 h。接着加入25 μL的MTT试剂，进一步培养4 h后，用酶标仪（Bio-Rad model 680）在570 nm下测量对应的吸光度。

细胞存活率的计算方法为：细胞存活率 (Cell viability) (%) = [A]_treated/[A]_control × 100%，其中，[A]_treated为PGEA、PGAP、PGHA以及PEI聚合物溶液所测得的吸光度，而[A]_control为不含PGEA、PGAP、PGHA以及PEI聚合物溶液所测得的吸光度。每个样品测试三次，取其平均值。如图11所示，在相同浓度的条件下，阳离子聚合物PGEA、PGAP和PGHA对L929、A549以及H1299的细胞存活率均高于聚合物PEI对L929、A549以及H1299细胞的细胞存活率。

实施例七：阳离子聚合物PGEA、PGAP和PGHA运载基因能力的表征

以A549细胞作为实验细胞，利用活细胞工作站的荧光显微镜，对PGEA/基因、PGAP/基因以及PGHA/基因在A549细胞内的转染情况进行观察，选择聚合物与基因的N/P为0，1，3以及6作为研究对象。具体步骤如下：将A549细胞培养在含有10% FBS的DMEM培养基中，置于37.5℃、5% CO₂、相对湿度为90%的培养箱中进行培养。将生长活跃期的细胞接种于F35 mm含有1 mL培养基的培养皿中，使其贴壁生长。移除培养基，再加入1 mL新鲜培养基，其中含有10%的游离基因和不同N/P比的聚合物/基因复合物溶液（游离基因以及载体固定的基因浓度分别为3 mg L^-1），放入活细胞工作站的培养箱中用倒置荧光显微镜观察细胞内绿色荧光强度随不同N/P比的变化情况。图12显示了A549细胞在不同N/P比的条件下，PGEA/基因、PGAP/基因以及PGHA/基因在细胞内的转染效果：（A）表示PGEA/基因复合物在不同N/P比的条件下的基因转染情况；（B）表示PGAP/基因复合物在不同N/P比的条件下的基因转染情况；（C）表示PGHA/基因复合物在不同N/P比的条件下的基因转染情况。这些结果表明：通过绿色荧光强度的对比可以发现，裸的基因几乎没有出现绿色荧光，这说明裸的基因没有出现转录与表达；而N/P=3和6时，PGEA/基因、PGAP/基因以及PGHA/基因复合物都有绿色荧光的出现，这说明三种阳离子聚合物PGEA、PGAP以及PGHA能够提高基因的转染效率，利于基因在细胞内的转录与表达。

实施例八：阳离子聚合物PGEA/DNA、PGAP/DNA和PGHA/DNA复合物的细胞毒性实验

采用常规的MTT法检测细胞存活和生长，其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将外源性MTT（噻唑蓝）还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。DMSO能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在570 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。两种肺癌细胞（A549和H1299细胞）的细胞培养在补充有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，置于37℃，5% CO₂（相对湿度为90%）的培养箱中培养，定期更换培养液。选择处在生长活跃期的细胞接种于每孔含有100 μL DMEM培养基的96孔板中，培养24 h。用直接溶解法配置PGEA/DNA、PGAP/DNA和PGHA/DNA复合物物溶液，分别将三种PGEA/DNA、PGAP/DNA和PGHA/DNA复合物物溶液加入到96孔板中，继续培养48 h。接着加入25μL的MTT试剂，进一步培养4 h后，用酶标仪（Bio-Rad model 680）在570 nm下测量对应的吸光度。

细胞存活率的计算方法为：细胞存活率 (Cell viability) (%) = [A]_treated/[A]_control × 100%，其中，[A]_treated为PGEA/DNA复合物、PGAP/DNA复合物以及PGHA/DNA复合物溶液所测得的吸光度，而[A]_control为不含PGEA/DNA复合物、PGAP/DNA复合物以及PGHA/DNA复合物溶液所测得的吸光度。每个样品测试三次，取其平均值。如图13所示，在相同浓度的条件下，游离的DNA对癌细胞基本上没有毒性；而其余PGEA/DNA复合物、PGAP/DNA复合物以及PGHA/DNA复合物在基因浓度在50 mg L^-1时，PGEA/DNA复合物、PGAP/DNA复合物以及PGHA/DNA复合物具有一定抑制癌细胞的能力。

图14为PGEA水溶液、PGAP水溶液、PGHA水溶液以及PGDA水溶液的照片图，可以看出，本发明选择三种小分子制备的聚合物具有优异的水溶性。

本发明采用甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）为反应单体，利用可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合的方法，得到聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）。分别利用乙醇胺、异丙醇胺以及N-羟乙基乙二胺对聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）的侧链进行开环，反应得到三种PGEA、PGAP以及PGHA阳离子聚合物载体，可以直接在水中溶解，并能够有效的将带有负电的基因完全固定住；在不同浓度肝素钠的条件下，PGEA、PGAP以及PGHA阳离子聚合物载体与基因复合，具有较好的稳定性以及在细胞内具有较好的转染效果。所制备含有羟基的阳离子聚合物，与聚乙烯亚胺（PEI）相比，能够促进阳离子聚合物/基因复合物的内吞和转录。

本发明中，三种阳离子聚合物载体（PGEA、PGAP和PGHA）与聚乙烯亚胺（PEI）相比，三者自身具有较低的生物毒性。此外，在较低氮/磷比的条件下，可以将基因完全固定住，并能够在负电的环境中保持一定的稳定性。PGEA、PGAP和PGHA阳离子聚合物的侧链含有羟基，能够提高基因载体的溶解性和促进基因载体的跨膜运输；能够促进所载基因在细胞内的转录与表达，从而实现基因在目标细胞内的高效表达。