CN109988753A - 肺炎克雷伯氏菌噬菌体的冻干保护剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

肺炎克雷伯氏菌噬菌体的冻干保护剂及其制备方法和应用，包括克雷伯氏菌噬菌体φYSZKA，保藏编号为：CCTCC M 2018513，分类命名为Klebsiella phage φYSZKA。按质量份由以下成分组成：脱脂奶粉50份，胰蛋白胨30份，葡萄糖10份，蔗糖20份，无水硫酸镁1份，明胶2份，甘油1.5份本发明运用添加冻干剂对噬菌体进行真空冷冻，并将冻干粉装在顶空瓶中常温或4℃储存。该冻干粉可保存90天后存活率不低于90%，为噬菌体疗法在农业、医疗、食品、环境等领域运输及应用提供了一种菌株储存的优选方法。

Description

肺炎克雷伯氏菌噬菌体的冻干保护剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于噬菌体冻干技术领域，具体涉及一种肺炎克雷伯氏菌噬菌体(Klebsiella phage)的冻干保护剂及其制备方法和应用。

背景技术

肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella.Peneumoniae)是一种自然环境中广泛存在的致病细菌，容易对老年人、婴幼儿等免疫力较低的人群引发医源性感染。肺炎克雷伯氏菌是一种形状为较短粗的杆菌，单独、成双或短链状排列，无芽胞，无鞭毛，有较厚的荚膜，多数有菌毛，主要存在于人体肠道、呼吸道，可引起支气管炎、肺炎，泌尿系和创伤感染，甚至败血症、脑膜炎、腹膜炎等。联合国粮农组织/世界卫生组织(FAO/WHO)将其列为婴儿配方奶粉中的病原菌之一，必须在成品奶粉及原料中实施监控。克雷伯氏菌一般对先锋霉素、氨基糖类(链霉素、庆大霉素、卡那霉素等)、氯霉素、多粘菌素等易产生耐药性，是当今医学研究领域的热点之一。因此，研究靶向灭活肺炎克雷伯氏菌的生物技术方法十分必要。

细菌噬菌体(Bacteriaphage，Phage)是一类专属性捕食活体宿主细菌而存活的生物体，在土壤、水、空气乃至人和动物体表或肠道内均广泛分布，据估算其总量达到10³¹～10³²。申请人前期通过对抗生素污染土壤采样，在实验室内利用双层平板法分离筛选获得一株抗性肺炎克雷伯氏菌专属性噬菌体该噬菌体对抗生素抗性的肺炎克雷伯氏菌具有良好的防治效果，可以广泛应用到空气净化剂、消毒剂、食品饲料等领域。但是对于肺炎克雷伯氏菌噬菌体的长效保存方法则需要进一步研究，是当下面临重要难点之一。常见的噬菌体保存方法是低温储藏法，即将噬菌体液体放在4℃/-20℃/-80℃低温保存，但该方法保存的噬菌体存活率低，保存时间短，不利于噬菌体在实际中的应用。因此亟待研发一种能够长效保存噬菌体的方法。

真空冷冻干燥法的出现为解决上述问题提供了一种全新的思路，该方法是将噬菌体与冻干保护剂混合后制成冻干粉，进而维持其微生物活性，但是针对不同种类噬菌体如何最大限度确保其冻干后的存活率、抗酸碱、抗热等特性需要进一步研究。通过相关文献查阅和专利检索，已经公开了几种噬菌体冻干保护剂，但是未发现有关肺炎克雷伯氏菌噬菌体相关的专利。与本发明最接近的有三项专利，申请号：CN201710983707.2、CN201610415919.6、 CN201610422048.0分别是一种鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1冻干保护剂、一种噬菌体的冻干粉胶囊保存方法、一种噬菌体的冻干保存方法。申请号：CN201710983707.2提供了一种鼠伤寒沙门氏菌噬菌体ФSa-1的冻干保护剂，其主要成分为脱脂奶粉、魔芋粉、蔗糖、谷氨酸钠、硫代硫酸钠、微晶纤维素、Tris、该方法噬菌体ФSa-1的存活率高达75％；申请号： CN201610415919.6提供了一种胶囊保存方法，即将噬菌体液和噬菌体保存保护剂混合均匀后制成冻干粉，冻干粉过筛后分装于胶囊壳中密封保存，该方法可在室温保存噬菌体，方便运输；申请号：CN201610422048.0提供了一种涉及大肠杆菌噬菌体、乳酸杆菌噬菌体、分歧杆菌噬菌体、副溶血弧菌噬菌体的保存方法，将噬菌体液和保护剂(脱脂乳、硅藻土、糖醇、 DEAE-葡聚糖、阿拉伯胶、牛血清白蛋白、麦芽糖糊精、蜂蜜、棉子糖、磷酸铝、氯化钠、硫酸镁、氯化钙、甘油、阿拉西A和水)混合后制备成冻干粉，并将冻干粉在无菌条件下密封于安瓿瓶中保存。

这几项专利都提供了噬菌体冻干保存的方法，但是在实际应用中，不同种类噬菌体的最适保存方法也不尽相同。此外，现有专利更是未曾涉及肺炎克雷伯氏菌噬菌体的冻干保存方法，亟待进一步开发关于肺炎克雷伯氏菌噬菌体的冻干保存方法。

现有技术存在的主要缺陷是：我国食品及医药领域常用的噬菌体制剂多以液体形式保存，其存在制备成本高、存活效率低，保存时间短、运输过程繁琐等缺点，而且噬菌体制剂或噬菌体应用多是依赖于国外的公司(如俄罗斯Immunopreparat Research ProductiveAssociation 公司、格鲁吉亚Biochimpharm公司和Phage Therapy Center等)，针对不同种类的噬菌体，亟待研发具有我国自主知识产权的冻干保存方法。

缺陷产生的主要原因有：1915年英国科学家Frederick W.Twort发现了一种可以裂解宿主细菌的微生物——噬菌体，噬菌体被人们认为是一种可以灭杀致病细菌的有效方法。但是随着当时抗生素时代的兴起而逐渐沉寂，直到20世纪70年代噬菌体的研究开始再次成为人们关注研究热点。近年来，噬菌体疗法逐渐被应用到医疗、农业、食品等领域，各国学者对噬菌体的研究多是对噬菌体的分离筛选以及相关机理研究，对于噬菌体的实际应用特别是对其冻干保存方法的研究相对较少。因而，亟需开展针对噬菌体最佳的冻干保存方法的技术研发工作。

发明内容

解决的技术问题：发明针对上述现有技术缺陷，提供一种肺炎克雷伯氏菌噬菌体的冻干保护剂及其制备方法和应用。该方法通过分离和纯化肺炎克雷伯氏菌的专属性噬菌体，筛选出灵敏度高、效价高、裂解时间短的一株肺炎克雷伯氏菌噬菌体作为优选菌株。运用真空冷冻干燥法将筛选获得的噬菌体与保护剂混合制成冻干粉，于钳口顶空瓶中低温保存，并定期测定其存活率、抗热、抗酸碱等相关生物学特性，从而确定一种肺炎克雷伯氏菌噬菌体的最佳冻干保存方法。该方法可以最大程度保持肺炎克雷伯氏菌噬菌体的活性，具有广泛的生物防治作用和实际应用价值。

技术方案：肺炎克雷伯氏菌噬菌体的冻干保护剂，按质量份由以下成分组成：脱脂奶粉 20-60份，胰蛋白胨10-50份，葡萄糖5-25份，蔗糖10-50份，无水硫酸镁1-5份，明胶1-5份，甘油1-3份。

优选的，脱脂奶粉40-60份，胰蛋白胨20-40份，葡萄糖10-20份，蔗糖10-30份，无水硫酸镁1-3份，明胶1-3份，甘油1-2份。

进一步优选的，脱脂奶粉50份，胰蛋白胨30份，葡萄糖10份，蔗糖20份，无水硫酸镁1份，明胶2份，甘油1.5份。

上述噬菌体为肺炎克雷伯氏菌噬菌体2018年8月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO: M 2018513，分类命名为Klebsiella phage保藏单位地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。

上述肺炎克雷伯氏菌噬菌体的冻干保护剂的制备方法，按比例将胰蛋白胨、葡萄糖、蔗糖、无水硫酸镁、明胶、甘油混合灭菌，冷却后添加相应比例的脱脂奶粉。

上述冻干保护剂在肺炎克雷伯氏菌噬菌体冻干保存中的应用。

本发明的工作原理是：1、噬菌体是一类特异性“捕食”宿主菌而存活的微小生物体，可分为裂解性和溶源性两种；2、烈性噬菌体会在环境迁移过程中识别宿主细菌细胞膜表面受体蛋白，尾部会进行特异性吸附到细胞膜上，核酸通过空心的尾部将自身DNA注入宿主细菌体内，执行侵入过程，接着噬菌体DNA将利用宿主体内的核酸碱基对和能量物质，快速完成自身核酸复制和蛋白质合成，进而在细菌体内装配和增殖大量子代噬菌体，并释放细胞壁溶壁酶，致使宿主细菌破裂死亡，破坏细菌内部结构，最终完成裂解释放的过程；3、真空冷冻干燥技术具体是指先对样品进行低温冻结处理，随后在真空无菌环境中将样品多余的水分进行升华处理，再对样品进行解析干燥处理，从而达到除去结合水的最终目的；4、冻干保护剂是在噬菌体冷冻干燥过程及冻干后储存阶段保护其基本性质和原始功能的一类有效物质；5、选用的噬菌体来源于自然环境，不进行任基因改造，环境友好。

有益效果：1、真空冷冻干燥添加适当的保护剂保证噬菌体的冻干后的存活率不低于90％，保存时间大于3个月；2、噬菌体冻干粉保护剂条件简单、成本制备低廉、便于储存、方便运输、使用操作简便、靶向灭活、易于推广；3、冻干保护剂配方对噬菌体的pH、抗热特性具有积极促进作用；4、与噬菌体单独冻干相比存活率提高40.1％；5、与现有低温保藏技术相比，该冻干方法能增强噬菌体对耐热和耐pH的能力。本发明的噬菌体冻干粉可以被制备成饲料添加剂、清洁剂或消毒剂等各种形式的产品，能够在较广的温度范围和pH条件下灭活抗性肺炎克雷伯氏菌。该方法对于我国医药、食品等领域中抗生素抗性肺炎克雷伯氏菌污染修复工作具有广泛运用前景。

附图说明

图1是肺炎克雷伯氏菌噬菌体双层平板噬菌斑图；

图2是肺炎克雷伯氏菌噬菌体的透射电镜图；

图3是肺炎克雷伯氏菌噬菌体液体在不同温度下的存活率图；

图4是肺炎克雷伯氏菌噬菌体不同保存方法的存活率图；

图5是肺炎克雷伯氏菌噬菌体冻干粉在不同温度下的存活率图。

具体实施方式

以下具体实施方式不以任何形式限制本发明的技术方案，凡是采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案均落在本发明的保护范围。

所述噬菌体是前期保存的专属性“捕食”肺炎克雷伯氏菌的噬菌体，保藏编号为： CCTCC NO: M 2018513，保藏日期：2018年8月1日，分类命名为Klebsiella phage噬菌体可见到椭圆型的头部和一条收缩的长尾，头长径约100nm，横径约72nm，尾长约110nm；其噬菌斑呈清晰透明、边缘整齐、无晕环的圆斑，直径约1～2mm；潜伏期22min，爆发期35min；最佳感染复数(MOI)为0.001。根据国际病毒分类委员会第九次报告，噬菌体属于长尾噬菌体科(Siphoviridae Bacteriophage)。

所述噬菌体在保存方法上仍存在一定的不足，并未有发明提到肺炎克雷伯氏菌噬菌体的保存方法，本发明根据CN201710983707.2、CN201610415919.6、CN201610422048.0 介绍的方法以及前期研究积累，针对噬菌体的生物学特性确定了原料和最佳配比的保护剂，其质量份比如下：脱脂奶粉50份，胰蛋白胨30份，葡萄糖10份，蔗糖20份，无水硫酸镁1份，明胶2份，甘油1.5份。

其中，冻干保护剂中的脱脂奶粉、胰蛋白胨、葡萄糖与蔗糖通过氢键作用力围绕在悬浮液中的含有噬菌体的液滴的周围，这样形成了一层保护噬菌体的稳定界面膜，能够提高噬菌体蛋白质不受温度的影响；无水硫酸镁能够将冷冻干燥过程中的pH调整到该噬菌体活性物质的稳定状态；明胶和甘油可以增强生物活性材料物理、化学方面的保护，极大增加冻干后样品的粘性，提高其稳定性。

所述冻干粉制备完成后于无菌条件下装入10mL的钳口顶空瓶中，封好铝盖，低温储藏。

实施例1：

1.肺炎克雷伯氏菌噬菌体的分离纯化

供试土壤样品采自江苏省南京市横梁奶牛场粪便堆积池周围污染土壤。土壤基本理化性质：沙粒23.8％，壤粒45.4％，粘粒31.8％，pH 7.7，全氮1.7g·kg^-1，水溶性氮1.7g·kg^-1，全磷1.3g·kg^-1，全钾17.5g·kg^-1，CEC 19.4cmol·kg^-1。

取新鲜土壤样品10g，加入100mL无菌水中，30℃，250rpm振荡培养5h，8000rpm离心5min，上清液经0.22μm滤膜除菌，取9mL滤液与1mL生长到对数期的肺炎克雷伯氏菌悬液加入40mL 3×LB液体培养基，加氯化钙固体至溶液终浓度1mmol·L^-1，30℃，250rpm 摇床培养12h，所得培养液8000rpm，离心5min，再经0.22μm滤膜除菌，即获得噬菌体原液；采用双层平板法筛选噬菌体并提纯，取上述滤液100μL与100μL的肺炎克雷伯氏菌悬液混匀，室温静置20min，加入5mL的0.75％半固体LB琼脂培养基，混匀后平铺倒入LB 固体平板上，30℃培养10～12h，观察噬菌斑，待出现噬菌斑(图1中噬菌斑直径约为1-2mm)，挑取单个边缘清晰透明的噬菌斑到含有宿主菌的LB液体中，30℃，250rpm培养8h；8000rpm 离心5min，0.22μm滤膜除菌，将获得一株噬菌体命名为保存在SM缓冲液中， 4℃低温储存。

2.肺炎克雷伯氏菌噬菌体的微生物学特性鉴定

对噬菌体进行电镜观察。将噬菌体原液滴在铜网上，用pH 7.0，2％磷钨酸负染90s后，用滤纸吸去多余染液，干燥后于日立H-7650型透射电子显微镜下观察其形态。

噬菌体可见到椭圆型的头部和一条收缩的长尾(图2)，头长径约100nm，横径约72nm，尾长约110nm；其噬菌斑呈清晰透明、边缘整齐、无晕环的圆斑，直径约1～2 mm(图1)，根据国际病毒分类委员会第九次报告，噬菌体属于长尾噬菌体科(Siphoviridae Bacteriophage)。

感染复数(Multiplicity of Infection，MOI)又称作噬菌体滴度，是指感染发生之前噬菌体与宿主菌数量的比值。基于上述操作获得两株噬菌体，取噬菌体滤液100μL，按感染复数分别为100∶1、10∶1、1∶1、1∶100、1∶1 000、1∶10 000加入对数期宿主菌悬液100μL。30℃摇床振荡培养5h。用双层平板法测定各组噬菌体滴度(表1)。噬菌体最佳感染复数为0.001。

表1最佳感染复数的测定

测定噬菌体一步生长曲线。按最佳感染复数，取500μL噬菌体与500μL宿主菌悬液加入9ml LB液体培养基中，37℃，150rpm振荡培养，每10min取样，离心过滤，并用双层平板法测定噬菌体滴度。噬菌体的潜伏期22min，爆发期35min。

实施例2：

冻干保护剂的筛选

1)结合现有关于噬菌体冻干保护剂的成分以及前期研究积累，本发明对肺炎克雷伯氏菌噬菌体冷冻干燥所选用的保护剂初步拟定为：脱脂奶粉、蛋白胨、葡萄糖、蔗糖、无水硫酸镁、明胶、甘油。每种保护剂单独使用时对的冻干保护效果验证研究，将上述冻干保护剂分别溶于1L无菌水中，115℃，30min高压灭菌，冷却后与富集好的噬菌体滤液1：1混匀后冷冻干燥。将冻干粉于室温保存15天后验证其存活率，其结果如表2所示。

表2不同保护剂对噬菌体的保护效果

从表2中可以看出单独添加8种冻干保护剂，在保存15天后，都能提高噬菌体的存活率。冻干保护效果依次为无水硫酸镁>蛋白胨>甘油>脱脂奶粉>蔗糖>明胶>葡萄糖，其中无水硫酸镁的保护效果相对最好，噬菌体存活率达到69.35％。

2)进一步筛选不同保护剂之间组合的保护效果，根据上述确的最佳浓度，即脱脂奶粉 50g/L，蛋白胨30g/L，葡萄糖10g/L，蔗糖20g/L，无水硫酸镁1g/L，明胶2g/L，甘油1.5g/L，选取无水硫酸镁作为底物，按照冻干保护效果的顺序依次添加剩余保护剂，验证不同保护剂之间组合物对噬菌体的保护效果。具体实验操作同1)。

表3不同保护剂组合对噬菌体的保护效果

注：“√”表示添加该组分；“-”表示不添加该组分。

结果如表3所示，随保护剂组分逐渐增加，其效果最好的是8种保护剂按最佳浓度混合使用，噬菌体的存活率达到90.58％。

实施例3：

噬菌体液体稳定性验证试验。

按照上述方法富集噬菌体富集后8000rpm，离心5min，0.22μm滤膜过滤，取滤液1mL在无菌条件下分装到40个2mL离心管中，将上述离心管分成四组分别放到常温、4℃、-20℃、-80℃保藏。并在第30d、60d、90d时利用双平板法测定其效价。结果见图3。

由图3可知，噬菌体在常温与-80℃保藏时存活率最低，保存90天后，噬菌体存活率分别为3.4％、11％，不建议用作长期保藏；在4℃与-20℃保存时，噬菌体保存效果相对较好，其中4℃保存效果最好，第90天时噬菌体存活率达到52.8％，建议噬菌体于4℃低温储藏。

实施例4：

噬菌体冻干保存试验研究

通过现有噬菌体的保存方法研究，并结合肺炎克雷伯氏菌噬菌体的生物学特性，本发明自主研发冻干粉保护剂，主要成份为：脱脂奶粉50g/L，蛋白胨30g/L，葡萄糖10g/L，蔗糖20g/L，无水硫酸镁1g/L，明胶2g/L，甘油1.5g/L，去离水1L。并验证比较冻干法与液体低温法(4℃)对噬菌体保存效果。

根据上述情况设置三组处理：处理一，噬菌体液体单独低温保存，用移液枪量取1mL富集后的滤液(10⁷pfu/mL)分装到2mL离心管中，4℃保存；处理二，将噬菌体液体与保护剂按1：1混合均匀，用移液枪量取1mL混匀后的噬菌体液体于2mL离心管中，4℃保存；处理三，将噬菌体混合液液体与保护剂按1：1混合均匀后分装到离心管中，-20℃预冷，将真空冷冻干燥机(德国Marin Christ公司，ALPHA 1-4/2-4LD plus；宽x高x深，390x415x540mm；凝冰效率，4kg/24h)预热30min 后放入冻干后样品，冻干结束后将噬菌体冻干粉分装到10mL的钳口顶空瓶(直径×高，22.5×46mm)中，4℃保存。上述处理每隔15天取样测其效价，并计算其存活率。在无菌条件下，用一次性注射器向钳口顶空瓶中注射1mL无菌水，轻轻震荡，将溶解后的噬菌体液体稀释，用双层平板法验证其存活率。由图4结果发现，第90天使时，与单独低温保存相比添加保护剂后(处理二、处理三)的噬菌体存活率显著升高，处理三中将噬菌体滤液制成粉干粉后的存活率最高，为93.3％，验证该发明提供的保护剂对噬菌体的活性具有明显保持效果，对于噬菌体的在农业、医疗、食品等领域应用提供了一种技术支撑。

实施例5：

噬菌体粉干粉保存的稳定性试验

根据上述试验方法，将噬菌体冻干粉按等份分装到钳口顶空瓶中，并分别保存到室温、4℃、-20℃，每隔15天取一瓶冻干粉，加入1mL无菌水，轻微震荡溶解，采用双层平本法验证噬菌体的存活率，判断冻干粉存放的最适条件。有图5结果可知，冻干粉在常温、4℃、-20℃保存条件下活性比较稳定，噬菌体存活率均在85％以上，其中在4℃保存时效果最好，噬菌体存活率为93.4％。说明噬菌体更适合用冻干粉4℃保存。

实施例6：

冻干保存法对噬菌体的耐热影响

验证冻干后对噬菌体耐热性的影响，设置两组处理：处理一按1mL/管的比例取新鲜富集后的液体(10⁹pfu/mL)放在6个离心管中，并将改组离心管分别放置30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴锅静止放置30min，稀释适当浓度后分别利用双层平板法验证噬菌体的效价；处理二取6瓶4℃保存的噬菌体冻干粉，用1mL无菌水溶解后，参照处理一的方法分别放置30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴锅静止放置30min，稀释适当浓度后分别利用双层平板法验证噬菌体的效价。结果表2所示，70℃、80℃水浴30min后噬菌体冻干粉(处理二)耐热性明显增强，效价分别下降到5.75×106pfu/mL、8.65×104pfu/mL，耐热性较滤液(处理一)的提升1～2个数量级。证明冻干保存方法有助于提高噬菌体φYSZKA耐热性。

表4噬菌体在不同温度下水浴30min后效价(pfu/mL)

实施例7：

冻干保存法对噬菌体耐pH的影响

验证冻干后对噬菌体耐pH的影响，设置两组处理：处理一按1mL/管的比例取新鲜富集后的液体(10⁹pfu/mL)放在6个离心管中，调节pH为2、4、6、8、10，静止30min后，稀释适当浓度后利用双层平板法验证噬菌体的效价；处理二取6瓶4℃保存的噬菌体冻干粉，用1mL调节好pH的缓冲液溶解后，静止30min，稀释适当浓度后利用双层平板法验证噬菌体的效价。结果表3所示，在不同pH体系中静止30min 后，pH为2～6时，处理二与处理一相比对酸碱的耐受能力明显增强，处理二的噬菌体效价提升了1～2数量级，pH为8～10时，处理二与处理一相比对效价也略有提升，分别为8.15×10⁸ pfu/mL、4.75×10⁷pfu/mL。证明冻干保存方法有助于提高噬菌体φYSZKA对pH耐受性。

表5噬菌体在不同pH下的效价(pfu/mL)

本发明提出一种肺炎克雷伯氏菌噬菌体的冻干保存方法，试验证明冻干粉保存可以有效维持并延长噬菌体的保存时间、耐热和耐酸碱的能力，提高其存活率。该发明提供的冻干粉在常温和4℃都具有良好的保存效果，可为噬菌体在农业、医疗、食品、环境等领域运输及应用提供一种技术支撑。

Claims (6)

1.肺炎克雷伯氏菌噬菌体的冻干保护剂，其特征在于按质量份由以下成分组成：脱脂奶粉20-60份，胰蛋白胨10-50份，葡萄糖5-25份，蔗糖10-50份，无水硫酸镁1-5份，明胶1-5份，甘油1-3份。

2.根据权利要求1所述肺炎克雷伯氏菌噬菌体的冻干保护剂，其特征在于脱脂奶粉40-60份，胰蛋白胨20-40份，葡萄糖10-20份，蔗糖10-30份，无水硫酸镁1-3份，明胶1-3份，甘油1-2份。

3.根据权利要求1所述肺炎克雷伯氏菌噬菌体的冻干保护剂，其特征在于按质量份：脱脂奶粉50份，胰蛋白胨30份，葡萄糖10份，蔗糖20份，无水硫酸镁1份，明胶2份，甘油1.5份。

4.根据权利要求1-3任一所述肺炎克雷伯氏菌噬菌体的冻干保护剂，其特征在于所述噬菌体为肺炎克雷伯氏菌噬菌体φYSZKA，2018年8月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2018513，分类命名为Klebsiella phage φYSZKA，保藏单位地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。

5.权利要求1-3任一所述肺炎克雷伯氏菌噬菌体的冻干保护剂的制备方法，其特征在于按比例将胰蛋白胨、葡萄糖、蔗糖、无水硫酸镁、明胶、甘油混合灭菌，冷却后添加相应比例的脱脂奶粉。

6.权利要求1-3任一所述冻干保护剂在肺炎克雷伯氏菌噬菌体φYSZKA冻干保存中的应用。