CN109975095A - 一种荧光原位杂交的前处理液及前处理方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种荧光原位杂交的前处理液及前处理方法。所述前处理液包含弱酸缓冲液、1‑5％的非离子表面活性去污剂及10‑30％的甘油。优选地，所述弱酸缓冲液是柠檬酸盐溶液，包含柠檬酸三钠二水和柠檬酸一水。所述前处理方法包括对石蜡包埋的组织切片进行烤片处理之后，用本发明的前处理液处理切片，用一步处理取代常规操作中的三步二甲苯脱蜡、三步乙醇梯度复水、预处理等7个步骤。本方法在保证实验效果的前提下，缩短了前处理时间、简化了操作流程，并且用安全的试剂取代了二甲苯等有毒性的试剂，安全环保。

Description

一种荧光原位杂交的前处理液及前处理方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种石蜡包埋切片荧光原位杂交的前处理液以及相应的前处理方法。

背景技术

福尔马林固定的石蜡包埋(Formalin-fixed paraffin embedded，FFPE)切片是病理学的核心材料，是术后或者活检的组织学样本，经福尔马林固定、酒精脱水、二甲苯透明、液态石蜡浸润后被制作成石蜡包块。对包块进行切片后，贴于载玻片得到石蜡包埋切片(以下简称切片)，广泛应用于HE、免疫组织化学、荧光原位杂交等分子病理检测技术中。

荧光原位杂交(FISH)是20世纪80年代发展起来的一种分子生物学与细胞遗传学相结合的新技术，其原理是利用荧光标记的DNA探针与样本DNA的互补区域进行杂交，目前已经被广泛应用于遗传病诊断、病毒感染分析、产前诊断、肿瘤遗传学和基因组研究等许多领域。

为了使石蜡包埋切片能够用于FISH实验，首先必须进行脱蜡和前处理。而前处理是荧光原位杂交实验中目标DNA充分暴露且与探针结合的关键步骤之一。前处理的目的，在于打开由福尔马林固定导致的大分子之间的交联，使整个细胞呈松散状，便于后续的蛋白酶对蛋白质的消化分解。不充分的前处理会导致酶消化不完全，DNA不能够充分暴露进而导致杂交效果差甚至杂交失败。

目前FFPE样本的前处理需经过烤片、脱蜡、复水、预处理、酶消化等多个步骤，然后再进行杂交、洗涤及DAPI复染。从脱蜡到预处理整个过程大约需要65-85分钟，且会使用二甲苯、硫氰酸钠等有毒、有刺激性气味的化学试剂。二甲苯对眼睛及上呼吸道均有强烈的刺激作用，高浓度时对神经系统有麻醉作用，而且实验室必须有通风橱或全排式生物安全柜才能使用；硫氰酸钠会引起以神经、消化系统和皮肤损害为主的全身性疾病。这些有毒害试剂不但对操作人员的自身安全存在隐患，对实验室设施要求更高，而且对企业后续处理这些化学品废弃物的投入成本更高。因此，在保证实验效果的前提下，若能够缩短前处理时间、简化前处理步骤且达到环保的目的，将会大幅提升工作的效率、提高实验人员的安全性。

发明内容

本发明涉及一种前处理液，其包含弱酸缓冲液、非离子表面活性去污剂及甘油。优选地，所述非离子表面活性去污剂选自Triton X-100、Tween-20、NP-40中的至少一种，更优选Triton X-100、Tween-20、NP-40中的一种，例如Triton X-100。优选地，所述弱酸缓冲液是柠檬酸盐溶液，包含0.005-0.015M的柠檬酸三钠二水(或称柠檬酸三钠二水合物)，和0.0015-0.0025M的柠檬酸一水(或称柠檬酸一水合物)。优选地，所述柠檬酸盐溶液包含0.01M的柠檬酸三钠二水，和0.002M的柠檬酸一水。

所述柠檬酸盐溶液的pH值为6.0-9.0，优选为6.0。

本发明的前处理液包含1-5％的非离子表面活性去污剂，优选1％。

本发明的前处理液包含10-30％的甘油，优选10％。

本发明还涉及一种荧光原位杂交的前处理方法，其包括在对石蜡包埋的组织切片进行烤片处理之后，用上述前处理液处理切片。

优选地，前处理液的处理时间为10-60分钟，处理温度为80±15℃。

更优选地，前处理液的处理时间为25分钟，处理温度为80±1℃。

本发明的前处理液主要采用了高温和特殊化学试剂的组合等方法，达到快速脱蜡、解开甲醛交联的目的。本发明的溶液由特殊的化学物质组成，利用高温和表面活性剂等，使石蜡快速融化后与组织样本分离。与此同时，打开由福尔马林固定导致的蛋白质之间及蛋白质与核酸的甲醛交联，在细胞保留了天然形态的同时，使整个细胞的结构更加松散，利于后续的蛋白酶消化，从而确保DNA分子被充分暴露并有效地与荧光探针结合。

本发明中的前处理液有如下优点：

1)本发明前处理液可将FISH操作中的脱蜡、复水和预处理等7个步骤合并为一步，简化了操作流程，大幅度缩短操作时间，提升了工作效率，而且得到的样本检测结果信号点清楚、信噪比高。

2)本发明前处理液可选配方有多种组合，均可达到良好的实验效果。

3)本发明前处理液无需使用脱蜡试剂，节约成本。

4)本发明前处理液为一次性使用，可确保实验条件稳定，避免传统脱蜡试剂长期重复使用而导致脱蜡能力下降等问题对实验造成不良影响。

5)本发明中前处理液以柠檬酸盐溶液和表面活性剂代替二甲苯、硫氰酸钠等有毒害的试剂。可以避免由二甲苯对操作人员眼睛及上呼吸道的强烈刺激及高浓度二甲苯对神经系统的麻醉作用，避免硫氰酸钠中毒引起的神经、消化系统和皮肤损害为主的全身性疾病。本发明中前处理液对操作人员的自身安全有保障。

6)本试剂可以在普通实验室操作，无需通风橱或全排式生物安全柜等设备设施。本发明前处理液试剂无挥发性，稳定性好，可长期保存。

7)本发明中前处理液可避免污染环境，可以安全地排放，同时也节约了二甲苯、硫氰酸钠等化学废弃物的高处理成本。

附图说明

图1本发明与传统方法的操作流程对比图。

图2应用本发明检测非小细胞肺癌样本FISH-ALK结果图(1％Triton X-100配方)。

图3应用本发明检测乳腺癌样本FISH-HER2结果图(1％Triton X-100配方)。

具体实施方式

一.实验步骤

以下荧光原位杂交实验，以本发明的前处理液取代传统的三步二甲苯脱蜡、三步乙醇梯度洗涤、以及半小时左右的预处理。后续步骤采用美国雅培的酶消化、Vysis杂交探针、洗涤与复染试剂，分别对乳腺癌组织进行HER2扩增的检测，对非小细胞肺癌组织进行ALK融合的检测。

1.本发明所述前处理液适用于经福尔马林固定石蜡包埋的组织切片样本的荧光原位杂交(FISH)检测。离体新鲜组织应尽快浸入到10％中性缓冲福尔马林固定液中进行固定，固定时间在6-48小时，再经梯度酒精脱水、二甲苯透明、液态石蜡浸润以及包埋完成组织蜡块的制作。将石蜡包埋的组织蜡块在-20℃放置20分钟后，用组织切片机进行切片并贴于正电荷粘附的载玻片上，切片厚度推荐为4-6μm。

2.配制前处理液：

1)柠檬酸盐缓冲溶液：分别称取柠檬酸三钠二水1.5g，柠檬酸一水0.2g至一干净烧杯中，加入400ml纯水，调节pH至6.0，然后用500ml容量瓶准确定容，制备成柠檬酸盐缓冲溶液。

2)配制100mM Tris-HCl(pH8.0)，准备好甘油、Triton X-100、Tween-20、NP-40等试剂。然后按照如下配方配制实施例1-4的前处理液各50ml；

3.烤片：将已经制备好的石蜡包埋的组织切片，放置在电热烘干箱中烤片，60℃烤片2小时或70℃烤片1小时。

4.前处理：提前在水浴锅中预热50ml前处理液至80±1℃，将步骤3的切片浸入到已经预热完成的前处理液中，温浴20-30分钟(视组织情况而定，需要按照组织类型选择最佳温浴时间。对绝大多数样本而言，优选25分钟，本次实验中乳腺癌组织、非小细胞肺癌组织的预处理时间均为25分钟)，随后将切片浸入纯水中2-3分钟清洗残余的前处理液。

5.蛋白酶处理：提前在37℃水浴中预热50ml蛋白酶处理液，加入胃蛋白酶使其浓度为0.5mg/ml(＞400U/mg)。预热完成后，将步骤4的切片从纯水中取出，浸入胃蛋白酶消化液中20-30分钟(视组织情况而定，需要按照组织类型选择最佳温浴时间。对绝大多数样本而言，优选25分钟。本次实验中乳腺癌组织、非小细胞肺癌组织的消化时间均为25分钟)，随后将切片浸入纯水中2-3分钟清洗残余的蛋白酶消化液。

6.梯度酒精脱水：提前配制好70％、85％、100％的梯度酒精各50ml，将步骤5的切片从纯水中取出，依次浸没在70％、85％、100％的梯度酒精中各脱水1分钟后，用吸水纸擦拭载玻片背面及边缘，室温下晾干。

7.加探针：在-20℃冰箱中取出FISH探针，避光回温至常温(15-35℃)，混匀后取出10μl探针滴加至切片组织处，取盖玻片覆盖切片上全部组织，最后用橡胶水泥将盖玻片四周密封以保证探针不会挥发。

8.DNA变性与杂交：设置Thermobrite杂交仪的温度及时间，ALK变性条件73℃、3分钟，杂交条件37℃、16-24小时；HER2变性条件75℃、5分钟，杂交条件37℃、16-24小时。将玻片分别置于相应的Thermobrite杂交仪上，进行变性与杂交。

9.洗涤：杂交结束后将玻片上的橡胶水泥轻轻剥离，注意不要滑动盖玻片，将载玻片放入到洗涤缓冲液I中，上下轻轻震荡，使盖玻片与载玻片分离；再将载玻片浸入到已73℃(ALK)、72℃(HER2)预热的洗涤缓冲液II中洗涤，精确计时2分钟，取出载玻片置于70％乙醇中浸泡1分钟。

10.DAPI复染：将载玻片置于避光处自然晾干，在-20℃冰箱中取出DAPI复染液并回温至室温，先取10μl DAPI复染液滴加在切片组织处，再取盖玻片覆盖切片全部组织使组织与DAPI复染液能够充分接触，最后赶走气泡并用透明指甲油在盖玻片四周封片，-20℃保存。

11.镜检：用OLYMPUS荧光显微镜镜检，在DAPI通道观察细胞核的染色情况，在橘绿通道下判读信号点。记录数据并拍照存档。

4个实施例的前处理液配方FISH检测效果如下：

+++：信号点清楚、信噪比高，DAPI镜检细胞核效果好；

++：信号点较清楚、信噪比较高，DAPI镜检细胞核可见个别小空洞；

+：信号点不清楚、信噪比低，DAPI镜检细胞核可见较多空洞，影响观察信号点。

实施例1中1％Triton X-100的配方检测非小细胞肺癌样本FISH-ALK的结果如图2所示(实施例2-4“+++”各组结果与之相似)。

实施例1中1％Triton X-100的配方检测乳腺癌样本FISH-HER2的结果如图3所示(实施例2-4“+++”各组结果与之相似)。

二.结论

由图2和图3可以看出，采用本发明的方法获得的荧光信号强度高(彩色相片中为橘绿色)、信号点清楚、背景暗，信噪比好。

此外，采用本发明的方法大大节省实验操作时间，平均处理时长大约25分钟，相比传统的方法(包括三步二甲苯脱蜡、三步乙醇梯度复水、晾干、预处理步骤)的大约65～85分钟，节省约2/3时间。

以上实施例只是帮助理解本发明的原理。对于本领域的一般技术人员来说，依据本发明的实施例，在具体实施方式以及应用范围上均可以做出改变。本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (11)

1.一种荧光原位杂交的前处理液，其包含弱酸缓冲液、非离子表面活性去污剂及甘油。

2.权利要求1所述的前处理液，其包含1-5％的非离子表面活性去污剂。

3.权利要求1所述的前处理液，其中所述非离子表面活性去污剂选自Triton X-100、Tween-20、NP-40中的至少一种。

4.权利要求1所述的前处理液，其中所述非离子表面活性去污剂是Triton X-100。

5.权利要求1所述的前处理液，其包含10-30％的甘油。

6.权利要求1所述的前处理液，其中所述弱酸缓冲液是柠檬酸盐溶液。

7.权利要求6所述的前处理液，其中所述柠檬酸盐溶液包含0.005-0.015M的柠檬酸三钠二水，和0.0015-0.0025M的柠檬酸一水。

8.权利要求6所述的前处理液，其中所述柠檬酸盐溶液，其pH值为6.0-9.0。

9.一种荧光原位杂交的前处理方法，其包括在对石蜡包埋的组织切片进行烤片处理之后，用权利要求1-8任一项的前处理液处理切片。

10.权利要求9的前处理方法，其中前处理液的处理时间为10-60分钟，处理温度为80±15℃。

11.权利要求10的前处理方法，其中前处理液的处理时间为25分钟，处理温度为80±1℃。