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CN109971657B - 一种高产糖化酶的米根霉及其应用 - Google Patents

一种高产糖化酶的米根霉及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高产糖化酶的米根霉及其在青稞小曲制曲工艺优化中的应用，属于微生物和发酵酿造工程领域。所述米根霉是从中国西藏不同地区青稞小曲中分离得到，其筛选方法是收集粉碎青稞小曲，使用培养基的方法对霉菌进行分离和纯化，然后经过初筛、复筛和发酵实验，测定菌株糖化酶、液化酶和蛋白酶活力，挑选发酵性能良好且糖化酶活力相对较高的菌株；使用该菌株能有效提高具有西藏地区特色的青稞小曲的糖化活力和质量稳定性。

Description

一种高产糖化酶的米根霉及其应用
技术领域
本发明属于属于微生物和发酵酿造工程领域，具体涉及一种高产糖化酶的米根霉及其筛选方法，该高产糖化酶的米根霉已经保存到广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO.60628；本发明还涉及该米根霉在优化青稞小曲制曲工艺中的应用。
背景技术
传统青稞酒是以西藏主要粮食作物青稞为原料，加入青稞小曲糖化发酵而成的特色鲜明的发酵酒，因其是西藏酒文化的代表、具有口感适宜、酒精度低以及营养功效高等特点传承至今。是藏族人民在亲友聚会、重大节日、迎宾待客、婚丧嫁娶等场合上必不可少的佳酿。可谓与当地人民的生产生活息息相关。
青稞小曲是由西藏人民采用传统自然接种方式制作的酿酒发酵剂，含有丰富的微生物及其产生的酶，参与了酿酒过程中的糖化、液化、酒精发酵和风味的形成，其质量优劣对出酒率以及酒体品质具有极大的影响，故有“曲是酒之骨”之称。所以，青稞小曲中的微生物很大程度上决定了青稞酒的品质和风味。目前，由于地理位置、酿造工艺、制曲原料和环境等因素的影响致使青稞小曲质量不稳定，从而导致青稞酒出现出酒率低，有苦涩等不愉悦风味物质的产生、酒体浑浊、不同地区口味差异大和不易储存等酒体品质不稳定的问题。
糖化酶在青稞小曲中的作用是自淀粉的非还原性末端开始依次水解α-1,4-葡萄糖苷键产生葡萄糖，应用于微生物发酵生成酒精中，为后续的发酵提供原料和营养物质，是青稞酒发酵过程中关键酶之一。另外，青稞小曲中起糖化作用的主要是霉菌，将原料中的淀粉转化成还原糖用于其它微生物生长利用。糖化酶活力是评价酒曲质量的重要指标之一，糖化酶活力较高有利于对原料的充分利用且有利于提高出酒率。
所以筛选糖化酶活力高的霉菌，特别是筛选发酵性能良好的霉菌菌株，是提高青稞小曲糖化酶活力、为生产适合西藏地区青稞酒酿造的小曲以及稳定和提升青稞酒的品质主要措施之一。
发明内容
本发明的目的之一在于针对目前西藏地区青稞小曲质量不稳定的现状，提供一株高产糖化酶的米根霉，能显著提高和稳定青稞小曲糖化酶活力的米根霉菌株，对于开发具有西藏地区特色的青稞小曲产品具有重要意义。
本发明的另一个目的在于提供上述米根霉的筛选方法。
本发明的再一个在于将上述米根霉用于制作西藏地区的青稞小曲。
为了实现上述发明目的，本发明提供一株高产糖化酶的米根霉，该霉菌的分类学命名为Rhizopus oryzae，生物材料为：Rhizopus oryzae YC666，于2019年4月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO.60628。
本发明提供的高产糖化酶米根霉，经过72h固体PDA培养基上生长的菌落为绒毛状、最初呈白色，后变为灰褐色，干燥，大而疏松，不透明，菌丝相互缠绕，易挑起，铺满整个平板；本发明提供的米根霉糖化酶活力为1400～1500mg/g·h，液化酶活力为1.3～1.4g/g·h，中性蛋白酶活力为800～900μg/g·min，酸性蛋白酶活力为60～100μg/g·min。
本发明提供上述米根酶的筛选方法，包括如下步骤：
步骤1)在西藏不同地区收集的青稞小曲，取适量将其粉碎，无菌操作下梯度稀释涂布于分离培养基中，于28℃培养箱中静置培养2～3d，随机选取具有典型霉菌菌落特征的单菌落，划线分离纯化2-3次，斜面保存备用；
步骤2)将分离的霉菌菌株进行初筛、复筛和发酵试验，获得糖化酶活力非常高的一株霉菌。
在本发明一些优选实施方式中，所述步骤2)中初筛方法采用霉菌产糖化酶透明圈和蛋白酶透明圈试验，具体包括以下步骤：采用点接法，用无菌牙签将霉菌菌株依次点接于初筛培养基上，在28℃下培养72小时，测量菌落直径D，向培养皿中加入4mL稀碘液，5min后，测量透明圈直径d，选择比值d/D较大的菌株点接于产蛋白酶初筛培养基上，在28℃下培养72小时，测量菌落直径D和透明圈直径d，选择d/D比值较大的菌株。在本发明一些更优选的实施方式中，所使用的初筛培养基和产蛋白酶初筛培养基，所含组分分别为：
初筛培养基：可溶性淀粉10g/L，酵母浸粉1.5g/L，NaNO3 1.5g/L，K2HPO4 1g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4 0.5g/L，FeSO4 0.01g/L，琼脂20g/L；
产蛋白酶初筛培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，脱脂奶粉3g/L，琼脂20g/L。
在本发明一些优选实施方式中，所述步骤2)中复筛方法采用霉菌制曲的发酵性能(糖化力、液化力和蛋白酶活力)试验，具体过程为：将霉菌孢子悬浮液(孢子数在106个/mL左右)按10％的接种量接入麸皮培养基，混匀，28℃培养72h，进行扣瓶，继续培养至6d。于鼓风干燥箱内，40℃烘干12h；按照QB/T 4257—2011测定麸曲的糖化力、液化力，按照GB/T23527—2009测定蛋白酶活力，选择发酵性能良好的菌株；在本发明一些更优选地实施方式中，所使用的麸皮培养基的组分与制备具体过程为：将麸皮过80目筛，以40％的水料比将水喷洒于麸皮上，混匀，润料30min，分装于500mL三角瓶内，每瓶装30g，121℃灭菌30min，待温度降至30～35℃时，打散备用。
在本发明一些优选实施方式中，所述步骤2)中所述的发酵试验具体步骤如下：
①模拟青稞小曲原料的制作：将青稞粉过80目筛后放入盆内，盖上盆盖，121℃熟化30min；冷却后按照40％水料比用喷壶均匀喷水于青稞粉上，拌匀，过20目筛；麸皮过80目筛，以40％水料比将水喷洒于麸皮上，混匀，润料30min；青稞粉与麸皮以1:2比例混匀，分装于500mL三角瓶内，每瓶装30g，121℃灭菌30min，待培养基冷却后，打散备用；
②模拟青稞小曲发酵：将权利要求5中复筛得到的霉菌制得孢子悬浮液，分别按10％的接种量接入青稞粉麸皮培养基，混匀，28℃培养72h，扣瓶，继续培养至6d；于鼓风干燥箱内，40℃烘干12h；按照QB/T 4257—2011测定麸曲的糖化力，选择糖化力相对较高的霉菌Rhizopus oryzae YC666。
在本发明一些具体实施方式中，所述步骤1)中的分离培养基为PDA(含氯霉素)培养基，具体地，所述的PDA(含氯霉素)培养基组分为：马铃薯浸粉3g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，氯霉素0.1g/L。
在本发明一些具体实施方式中，所述步骤1)中的斜面保存培养基为PDA培养基，所含组分为：马铃薯浸粉3g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L。
在本发明一些具体实施方式中，所述的霉菌孢子悬浮液制备具体过程是：
于活化的菌株斜面倒入10mL的无菌生理盐水，用接种针刮下斜面上菌丝，将试管中的孢子打散混匀，用血球计数板计数，并稀释孢子数至106个/mL左右。
在本发明一些具体实施方式中，所使用的麸皮培养基制备的具体过程是：将麸皮过80目筛，以40％的水料比将水喷洒于麸皮上，混匀，润料30min，分装于500mL三角瓶内，每瓶装30g，121℃灭菌30min，待温度降至30℃左右时，打散备用。
本发明提供一种青稞小曲制曲工艺，该工艺采用本发明提供的米根霉Rhizopusoryzae YC666进行青稞小曲制曲工艺；在本发明一些具体实施方式中，将本发明提供的米根霉Rhizopus oryzae YC666制成孢子悬浮液后，按照青稞小曲发酵工艺进行生产。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明提供的米根霉优化后青稞小曲，其糖化酶活力为1482mg/g·h，与商业化米根霉相比糖化酶活力提高了15％，与传统青稞小曲相比糖化酶活力提高了67％；其次，本发明提供的米根霉的液化酶活力为1.3～1.4g/g·h，中性蛋白酶活力为800～900μg/g·min，酸性蛋白酶活力为60～100μg/g·min，可作为糖化菌在西藏地区的特色青稞小曲制曲工艺优化中应用，有效提高具有西藏地区特色的青稞小曲的糖化活力和质量稳定性。
2.本发明提供的米根霉菌株用于工业生产青稞小曲发酵中，菌丝发达，更适合用于青稞小曲的发酵；其次本发明提供的菌株颜色为白色，更接近青稞小曲的颜色。
3.本发明通过添加米根霉Rhizopus oryzae YC666制成曲香味浓郁的青稞小曲。
具体实施方式
本发明提供的米根霉，该霉菌的分类学命名为Rhizopus oryzae，生物材料为：Rhizopus oryzae YC666，于2019年4月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO.60628。
以下结合具体的实施例对本发明进行详细地说明。
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的模拟青稞小曲原料的制作，具体过程如下：
将青稞粉过80目筛后放入搪瓷盆内，盖上盆盖，121℃熟化30min。冷却后按照40％水料比用喷壶均匀喷水于青稞粉上，拌匀，过20目筛；另外，麸皮过80目筛，以40％水料比将水喷洒于麸皮上，混匀，润料30min。青稞粉与麸皮以1:2比例混匀，分装于500mL三角瓶内，每瓶装30g，121℃灭菌30min，待培养基冷却后，打散备用。
下述实施例中的麸皮培养基的组分与制备具体过程是：
将麸皮过80目筛，以40％的水料比将水喷洒于麸皮上，混匀，润料30min，分装于500mL三角瓶内，每瓶装30g，121℃灭菌30min，待温度降至30℃左右时，打散备用。
下述实施例中的霉菌孢子悬浮液制备具体过程是：
于活化的菌株斜面倒入10mL的无菌生理盐水，用接种针刮下斜面上菌丝，将试管中的孢子打散混匀，用血球计数板计数，并稀释孢子数至106个/mL左右。
下述实施例中的所使用的初筛培养基和产蛋白酶初筛培养基配方如下：
初筛培养基：可溶性淀粉10g/L，酵母浸粉1.5g/L，NaNO3 1.5g/L，K2HPO4 1g/L，NaCl0.5g/L，MgSO4 0.5g/L，FeSO4 0.01g/L，琼脂20g/L；
产蛋白酶初筛培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，脱脂奶粉3g/L，琼脂20g/L。
下述实施例中的PDA培养基配方如下：
马铃薯浸粉3g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L。
下述实施例中的PDA(含氯霉素)培养基配方如下：
PDA(含氯霉素)培养基：马铃薯浸粉3g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，氯霉素0.1g/L。
实施例1高产糖化酶霉菌的分离、纯化及鉴定
对采自西藏不同地区青稞小曲所分离的21株霉菌菌株进行分离、鉴定和筛选。其分离方法采用平板稀释涂布法挑取单菌落并进行连续两次纯化，鉴定方法采用传统形态学并结合ITS区域序列分析。
该菌株经形态学并结合ITS区域序列分析，鉴定为米根霉的新株，具体鉴定结果如下：
⒈形态学观察方法和结果：经过72h培养，在PDA(含氯霉素)培养基上生长的菌落为绒毛状、最初呈白色，后变为灰褐色，干燥，大而疏松，不透明，菌丝相互缠绕，易挑起，铺满整个平板。
⒉ITS区域序列分析方法和结果：
⑴霉菌基因组DNA的提取采用试剂盒法，具体方法按植物基因组DNA提取试剂盒说明书进行。
⑵霉菌ITS区域特异性片段的扩增采用通用引物ITS1/ITS4由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；PCR扩增条件为95℃预变性3min，95℃变性45s，53℃退火30s，72℃延伸45s(35次循环)，最后72℃延伸8min；PCR扩增体系(25uL)的组成为：10×PCR Buffer2.5μL，d NTPs 2μL，DNA模板1μL，Taq酶0.3μL，ITS1 1μL，ITS4 1μL，用dd H2O补至25μL，混匀。随后对PCR扩增产物进行检测：取5uL PCR扩增产物与1uL混匀，点样于1％琼脂糖凝胶上。电泳缓冲液为1×TAE，120V电压下，电泳20min，由凝胶成像系统对电泳图谱拍照并进行分析，采用2000bp DNAMarker判断PCR扩增产物的大小，结果显示霉菌的特异性片段长度约为600bp。
③霉菌ITS序列分析：PCR扩增产物由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，根据测序结果，利用BLAST软件从Genbank核酸序列数据库中进行同源序列搜索，比较试验菌株与已知霉菌菌株相应序列的相似程度。
根据目前霉菌分子系统学研究领域的观点：即具有相同或相似ITS序列(序列同源性≥99％)的菌株属于同一物种，根据序列分析结果确定与基因库参考菌株的序列同源性≥99％的菌株为米根霉。
实施例2高产糖化酶米根霉的筛选
对经鉴定的菌株经过透明圈初筛、复筛和发酵试验，得到数株具有优良酿造特性的霉菌菌株，然后在模拟青稞小曲制曲原料中以10％的接种量(孢子数：106个/mL)接种，在28℃下发酵6天，发酵结束后测定青稞小曲的糖化酶活力，并进行感官指标评定。
经过反复筛选、验证和酿造研究，从西藏地区青稞小曲中分离得到了一株糖化酶活力高，并且发酵性能良好的米根霉，用该菌株酿造的青稞小曲具有很高且稳定的糖化酶活力，用该菌株酿造的青稞小曲表面长满白色菌丝且分布均匀，无杂菌，曲香味浓，无杂味。
具体筛选过程如下：
⒈霉菌的产透明圈能力测试：采用点接法，用无菌牙签将霉菌菌株点接于产糖化酶菌株初筛培养基上，在28℃下培养72小时，测量菌落直径D，向培养皿中加入4mL稀碘液，5min后，测量透明圈直径d，选择比值d/D较大的菌株点接于产蛋白酶初筛培养基上，在28℃下培养72小时，测量菌落直径D和透明圈直径d，选择比值d/D较大的菌株。
⒉霉菌的发酵性能测试：将霉菌孢子悬浮液按10％的接种量接入麸皮培养基，混匀，28℃培养72h，进行扣瓶，继续培养至6d。于鼓风干燥箱内，40℃烘干12h；按照QB/T4257—2011测定麸曲的糖化力、液化力，按照GB/T 23527—2009测定蛋白酶活力，选择发酵性能良好的菌株。
⒊发酵试验：将霉菌制得孢子悬浮液，分别按10％的接种量接入青稞粉麸皮培养基，混匀，28℃培养72h，进行扣瓶，继续培养至6d。于鼓风干燥箱内，40℃烘干12h；按照QB/T4257—2011测定麸曲的糖化力，选择糖化力最高的米根霉。
对比例1商业米根霉的分离
将购自安琪酵母股份有限公司的甜酒曲梯度稀释涂布于分离培养基中，于28℃培养箱中静置培养3d，选取具有米根霉菌落特征的单菌落，划线分离纯化2-3次，斜面保存备用。
实施例3小型制曲比较试验
实施例2获得高产糖化酶米根霉与对比例获得商业米根霉在青稞小曲原料中的小型制曲比较试验。
在3个5L广口瓶里分别装500g青稞粉麸皮培养基，分别加入筛选得到的高产米根霉、商业化米根霉和西藏地区某产区青稞小曲，使其孢子悬浮液终浓度达到106个/mL左右，按照青稞小曲发酵试验工艺进行生产。发酵结束后测定糖化酶活力以及感官指标评定。
表1两种米根霉菌株和西藏地区青稞小曲糖化力测定结果
Figure BDA0002056020910000061
表2两种米根霉菌株和西藏地区青稞小曲生产青稞小曲的感官指标评价结果
Figure BDA0002056020910000062
添加高产糖化酶米根霉制成的青稞小曲，其糖化力最高，为1482±77.38mg/g·h，曲表面菌丝均匀，表面呈白色，无杂菌。因此筛选的菌株符合工业发酵的要求，同时筛选菌株的糖化酶活力均高于商业米根霉和西藏某产区青稞小曲；发酵青稞小曲的曲香味浓，无异味，更有益于制备西藏特色青稞酒产品。

Claims (3)

1.一株高产糖化酶的米根霉，该米根霉的分类学命名为Rhizopus oryzae，保藏号为GDMCC NO.60628。
2.如权利要求1所述的米根霉在青稞小曲制曲工艺中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，将米根霉制成孢子悬浮液后，按照青稞小曲发酵工艺进行生产。
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周金虎等.甜酒曲中一株高产淀粉酶根霉的筛选与鉴定.《酿酒科技》.2018,(第295期), *
甜酒曲中一株高产淀粉酶根霉的筛选与鉴定;周金虎等;《酿酒科技》;20180828(第295期);1.4实验方法、2结果与分析、第40页左栏结论部分 *
袁亦舟等.青稞酒曲微生物多样性分析及米根霉制曲条件优化.《食品与发酵工业》.2018,(第05期), *
青稞酒曲微生物多样性分析及米根霉制曲条件优化;袁亦舟等;《食品与发酵工业》;20181231(第05期);摘要，第40-41页1.4 *

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