CN109957615B - 一种单细胞基因组目标区域捕获的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种单细胞基因组目标区域捕获的方法。具体的通过对单细胞基因组进行全基因组扩增，对扩增后的基因组进行打断、末端修复、3'端加A、加接头、PCR扩增、目标区域捕获、对目标区域捕获的DNA片段进行PCR扩增及测序。通过本发明提供的方法可以提高捕获测序结果的覆盖度，提高捕获结果的特异性。
Description
技术领域
本发明涉及一种单细胞基因组目标区域捕获的方法，属于基因检测技术领域。
背景技术
单细胞测序在2011年被《Nature Methods》列为年度值得期待的技术之一，在2013年被《Science》列为年度最值得关注的六大领域榜首，其越来越受到科研工作者的青睐，相关的研究成果也井喷式地发表在各顶级期刊上，这些都表明，单细胞测序已逐渐成为科研热点。
单细胞测序技术可以剖析细胞的异质性，揭示肿瘤细胞基因组中发生的变异。有助于我们描述肿瘤细胞的克隆结构，并追踪疾病的进展和扩散范围。目前该技术已广泛地应用在辅助生殖、癌症、神经学和免疫学等领域。
单细胞目标区域捕获测序是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组之后定制目标基因组区域的探针，与基因组DNA进行杂交，将目标区域DNA富集后进行高通量测序的技术手段。单细胞目标区域测序技术用于揭示细胞群体差异和细胞进化关系，也有助于发现和验证疾病特别是癌症的相关候选基因或相关位点，在临床诊断和药物开发方面有着巨大的应用潜力[1]。目标区域捕获测序的优势在于只对感兴趣的基因组区域进行研究，而且在获得相同数据量时测序深度更深，结果更准确；而且与常规基因组测序相比，其不仅费用较低，数据阐释也更为简单。
单细胞基因组目标区域捕获测序相较于正常样本(无需扩增基因组，基因组的量足够进行目标区域捕获测序的样本)基因组的目标区域捕获测序的效果还是有明显区别的。首先，单细胞基因组只有两个拷贝，总量约6pg。在扩增过程中，可能无法重现完整的基因组。其次，假如丢失的部分恰是芯片探针的区域，那么就会影响捕获特异性，造成数据量浪费。而且在相同测序深度下，单细胞目标区域捕获测序的靶区域覆盖度较普通基因组的要低。
参考文献
[1]Wang,Y.et al.Clonal evolution in breast cancer revealed by singlenucleus genome sequencing.Nature 512,155–160(2014).
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种单细胞基因组目标区域捕获的方法，通过优化全基因组扩增流程、文库构建流程以及目标区域捕获流程，从而提高捕获测序结果的覆盖度和捕获结果的特异性。
1.一种单细胞基因组目标区域捕获的方法，包括：
步骤A：采用多重置换扩增方法对单细胞基因组进行等温扩增，获得扩增后的基因组；
步骤B：取3μg扩增后的基因组进行打断，获得片段化的DNA片段；
步骤C：将片段化的DNA片段进行末端修复，获得平末端DNA片段；
步骤D：将平末端DNA片段进行3'端加A，获得3'端加A的DNA片段；
步骤E：将3'端加A的DNA片段进行加接头，获得加接头的DNA片段；
步骤F：将加接头的DNA片段进行PCR扩增，获得扩增的DNA片段；
步骤G：将扩增的DNA片段进行目标区域捕获，获得捕获的DNA片段；
步骤H：将捕获的DNA片段进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
步骤I：将PCR扩增产物进行测序；
其中，所述步骤A中等温扩增的条件为30℃反应2小时；
所述步骤F中PCR扩增的循环数为4～6个循环；
所述步骤G中目标区域捕获的条件为65℃反应16～24小时。
2.根据项1所述方法，其中，所述步骤A之后还包括：
步骤A-1：使用核苷酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:44所示的引物对扩增后的基因组进行PCR扩增。
3.根据项1或2任一项所述的方法，其中，所述步骤F中加接头的DNA片段的量为100～250ng。
4.根据项1或2任一项所述的方法，其中，所述步骤F中加接头的DNA片段的量为150～200ng。
5.根据项1～4任一项所述的方法，其中，所述步骤F中PCR扩增的循环数为5个循环。
6.根据项1～5任一项所述的方法，其中，所述步骤G中目标区域捕获的条件为65℃反应24小时。
7.根据项1所述的方法，其中，所述步骤B与步骤C之间、步骤C与步骤D之间、步骤D与步骤E之间、步骤E与步骤F之间、步骤F与步骤G之间、步骤G与步骤H之间、步骤H与步骤I之间，和/或在步骤I之后包括对DNA片段进行纯化的步骤。
本发明的有益效果：与现有技术相比，发明提供了一种单细胞基因组目标区域捕获的方法，通过优化全基因组扩增流程、文库构建流程以及目标区域捕获流程，缩短了捕获测序的时间，提高了捕获测序结果的覆盖度和捕获结果的特异性。
具体实施方式
以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种单细胞基因组目标区域捕获的方法，包括：
步骤A：采用多重置换扩增方法对单细胞基因组进行扩增，获得扩增后的基因组；
步骤B：取3μg扩增后的基因组进行打断，获得片段化的DNA片段；
步骤C：将片段化的DNA片段进行末端修复，获得平末端DNA片段；
步骤D：将平末端DNA片段进行3'端加A，获得3'端加A的DNA片段；
步骤E：将3'端加A的DNA片段进行加接头，获得加接头的DNA片段；
步骤F：将加接头的DNA片段进行PCR扩增，获得扩增的DNA片段；
步骤G：将扩增的DNA片段进行目标区域捕获，获得捕获的DNA片段；
步骤H：将捕获的DNA片段进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
步骤I：将PCR扩增产物进行测序；
其中，所述步骤A中扩增的条件为30℃反应2小时；
所述步骤F中PCR扩增的循环数为4～6个循环；
所述步骤G中目标区域捕获的条件为65℃反应16～24小时。
所述多重置换扩增方法，可以参见例如美国专利US6,124,120。该多重置换扩增方法通常包括使一组引物、DNA聚合酶和靶核酸在溶液中接触；以及对所述溶液进行扩增，使得进行所述靶核酸的扩增反应以复制该靶核酸；就单细胞基因组扩增而言，通常认为需要更长的扩增反应时间，例如用于单细胞基因组扩增的REPLI-g Single Cell Kit(Qiagen公司)的操作说明书中规定的扩增反应时间为8小时。但本发明的发明人研究发现，当扩增反应时间超过2小时时，扩增反应产物的产量已经达到基本饱和，优选的，所述扩增时间为2小时。
优选地，步骤A之后还包括步骤A-1：使用核苷酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:44所示的引物对扩增后的基因组进行PCR检测，进一步检测扩增后的基因组的完整性，有效避免使用扩增效果差的扩增后的基因组进行建库，以及后续研究产生带来的时间及成本的浪费。
常规的文库构建方法中，为了满足文库质控，上机测序以及其他的检测的需求，通常认为文库构建的起始量为100ng～2μg。例如TruSeq Nano DNA试剂盒(Illumina公司)操作说明书建议的文库起始量为100～200ng，TruSeq DNA PCR-Free试剂盒(Illumina公司)操作说明书中建议的文库起始量为1～2μg。在本发明中，发明人发现通过提高文库起始量能够提高基因组中目标区域的覆盖度，优选地，所述文库起始量为3μg。
所述步骤B使用超声或酶切方法进行打断，以及其他本领域技术人员已知的打断方法均可在本步骤中使用。
所述步骤C使用缓冲液、T4 DNA Polymerase、Klenow DNA Polymerase、T4polynucleotide Kinase、dNTP进行末端修复，反应体系及反应条件按照常规的末端修复条件进行即可。
所述步骤D使用缓冲液、Klenow Exo(-)、dATP进行3'端加A，反应体系及反应条件按照常规的3'端加A步骤进行。
所述步骤E使用缓冲液、接头、T4DNA Ligase进行加接头，所述接头为常规测序建库步骤中使用的接头，无特殊限制使用能够实现本步骤的任何接头。反应体系和反应条件按照常规的加接头步骤进行。
本发明中，所述步骤F中取加接头的DNA片段的量在100～250ng，通常认为F步骤直接将加接头的DNA片段全部进行PCR扩增，优选地，所述加入加接头的DNA片段的量为150～200ng，所述PCR扩增循环数为4～6个循环，优选地，PCR扩增循环数为5个。
所述步骤G中使用现有的杂交试剂盒进行杂交，例如SureSelect TargetEnrichment System试剂盒(Agilent Technologies公司)说明书中规定反应条件为65℃反应48～72小时，优选地，所述步骤G中杂交捕获的条件为65℃反应16～24小时。
优选地，在本发明的单细胞基因组目标区域捕获的方法的各个步骤之间例如步骤B与步骤C之间、步骤C与步骤D之间、步骤D与步骤E之间、步骤E与步骤F之间、步骤F与步骤G之间、步骤G与步骤之间、步骤H与步骤I之间，和/或在步骤I之后可以对DNA片段进行纯化的步骤。
实施例1
本实施例通过使用SureSelectXT Reagent kit,HSQ,96(Aligent公司)进行文库构建及杂交捕获。
1单细胞基因扩增
1.1处理分选细胞：
在超净工作台中将细胞直接分选到3μL PBS中，不经过冻融。
1.2单细胞全基因组扩增(WGA)：
采用MDA进行全基因组扩增，使用REPLI-g Single Cell Kit试剂盒(Qiagen公司)。
a)准备DLB Buffer：向提供的管中加入500μL的水，彻底混匀，短暂离心。DLBBuffer可以在-20℃保存6个月。
b)所有Buffer和试剂在使用之前要涡旋混匀。
c)PCR仪热盖温度调为70℃。
d)准备足够量的Buffer D2(变性Buffer)，Buffer D2在-20℃最长可以保存3个月。每个反应需要3μL的Buffer D2
e)用kit提供的PBS将细胞体积补足为4μL。
f)加入3μL Buffer D2，温和混匀，短暂离心。
g)65℃扩增10钟。
h)加入3μL反应终止液，温和混匀，短暂离心，置于冰上。
将REPLI-g sc DNA Polymerase置于冰上，其他试剂室温融化，涡旋混匀，短暂离心。
i)配制mix，配好后短暂离心。
加入40μL mix到步骤h)中10μL变性的DNA中，30℃扩增2小时。65℃放置3分钟以使REPLI-g sc DNA Polymerase失活。取10μL加40μL水，用1×Ampure beads纯化，用40μL EB溶解，获得扩增后的基因组。
1.3 WGA产物质检
用Qubit BR和安捷伦2100检测浓度及片段大小。
1.4扩增效率检测
引物列表
反应体系：
反应条件如下：
利用2％凝胶电泳检测PCR产物扩增情况。
2文库构建
2.1打断
取3μg扩增后的基因组，80μL打断体系，进行200bp片段化。加入1.8×Ampurebeads纯化，用50μL水溶解，获得片段化DNA片段。
2.2末端修复
反应条件：20℃反应30分钟，加入180μL Ampure beads纯化(1.8×)，70％酒精(Twice)，32μL ddH2O洗脱，获得平末端DNA片段。
2.3 3'端加A
反应条件：37℃反应30分钟，加入90μL Ampure beads纯化(1.8×)，70％酒精(Twice)，29.5μLddH2O洗脱，获得3'端加A的DNA片段。
2.4加接头
反应条件：20℃反应15分钟，加入90μL Ampure beads(1.8×)纯化，70％酒精(Twice)，32μLddH2O洗脱，获得加接头的DNA片段。
2.5 PCR扩增
反应条件：
反应结束后每个样本加入45μL Ampure beads(0.9×)纯化，70％酒精(Twice)，26μL ddH2O洗脱，获得DNA文库。
2.6文库质量检测
构建的DNA文库采用安捷伦2100生物分析仪检测文库的片段大小。
3目标区域捕获
使用的芯片为在Agilent公司定制的1.4M的肿瘤芯片，命名为SureSelect Hyb3。
3.1文库准备
取750ngDNA文库进行真空浓缩至体积3.4μL。
3.2 Block Mix准备
3.3封闭反应
热盖至105℃，95℃反应5分钟，65℃5分钟。
3.4 Hybridization Mix准备
准备好之后放在冰盒上备用，使用前65℃预热至澄清。
3.5杂交捕获
保持步骤3.4的产物一直处于65℃，先加入5μL Capture Library，然后迅速加入15μL杂交Mix，吹吸混匀，盖预热至105℃，65℃反应24小时，获得杂交产物。
3.6 SureSelect Wash Buffer准备
取600μL SureSelect Wash Buffer 2装于EP管，恒温65℃预热，备用。取200μLSureSelect Wash Buffer 1装于EP管，备用。
3.7 MyOne Streptavidin T1磁珠准备
混匀，用磁力架去上清，每50μL磁珠用200μL SureSelect Binding Buffer洗，重复洗涤三次，每50μL磁珠用200μLSureSelect Binding Buffer重悬，装于1.5mL EP管。
3.8 Binding DNA
取200μL步骤3.7准备好的磁珠加入到步骤3.5获得的杂交产物中，混匀，转移到剩余磁珠中，恒温混匀仪，1600rpm，25℃反应30分钟。
3.9磁珠洗涤
将步骤3.8中的样本取下，用掌上离心机进行离心，使用磁力架去上清，加入200μLSureSelect Wash Buffer 1，混匀后置于恒温混匀仪上25℃反应15分钟；
取下样本，磁力架上去上清，加入200μL SureSelect Wash Buffer 2(65℃)反应10分钟，重复三次；
加入20μL nuclease-free water混匀后，得到杂交产物，置于冰上备用。
3.10 PCR反应及产物纯化
反应条件如下：
反应结束后，取上清，0.9×Ampure beads磁珠纯化，70％酒精(Twice)，22μL EB洗脱。
3.11捕获文库质控
捕获文库采用安捷伦2100生物分析仪检测文库的片段大小。
对比例1
对比例1与实施例的不同在于：单细胞扩增k)步骤扩增温度为8小时并使用SureSelectXT Reagent kit,HSQ,96进行文库构建及目标区域捕获，操作步骤与产品说明书中记载的步骤一致。
对比例2
对比例2与实施例的不同在于：使用正常样本，利用SureSelectXT Reagent kit,HSQ,96进行文库构建及目标区域捕获，操作步骤与产品说明书中记载的步骤一致。
其中M1为对比例1的样本编号，M2为实施例的样本编号(使用本发明的方法)，M3为对比例2的样本编号。测序的质控结果如下表，在相同的测序数据量下，可以看出样本M1、M2、M3的数据质控均合格，其中，通过质控数据的比较，样本M2与样本M3在各个数据指标中数值基本一致，样本M1的数据指标较差，特别是在捕获特异性方面，M2、M3的目标区域的捕获效率分别为77.59％、80.7％，而M1的捕获效率为64.2％，样本M2的捕获特异性与样本M3基本一致而且高于M1。从目标区域覆盖度来说，样本M1的目标区域覆盖度为85.39％，M2、M3的目标区域覆盖度分别为99.31％、99.31％，样本M2基本涵盖了目标区域，明显高于M1样本，故通过本发明的方法，单细胞目标区域捕获测序的结果在目标区域覆盖度及捕获特异性方面有显著提高，与正常样本基因组捕获测序结果接近。
Raw Reads：原始下机的Reads数；
Clean Reads：过滤后的Reads的个数；
Clean Reads Rate(％)：过滤后得到的Clean Reads占Raw Reads的比例；
Ns Reads：去除的含N比例大于5％的Reads数；
Ns Reads Rate(％)：去除的含N比例大于5％的Reads占Raw Reads的比例；
Raw Q30Bases Rate(％)：Raw Reads中测序质量值大于30(错误率小于0.1％)的碱基占总碱基(Raw Bases)的比例；
Clean Q30Bases Rate(％)：Clean Reads中测序质量值大于30(错误率小于0.1％)的碱基占总碱基(Clean Bases)的比例；
Target Region：基因组目标区域捕获区域大小
Reads Mapped To Genome：比对到参考基因组上的Reads个数；
Map Rate(％)：比对到参考基因组上的碱基百分比；
Capture Specificity(％)：比对到基因组目标捕获区域的Reads数占比对到基因组Reads的比例；
Duplication Rate(％)：去除的PCR重复的Reads数占Mapped Reads的比例；
Uniq Rate(％)：比对到基因组唯一位置的Reads占去除PCR重复后比对上的Reads的比例；
Coverage Of Target Region(％)：基因组目标捕获区域Uniq Reads的平均测序深度，即用于后续分析的数据深度。
上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
工业实用性
根据本发明，提供了一种单细胞基因组目标区域捕获的方法。
序列表
<110> 安诺优达基因科技（北京）有限公司
<120> 一种单细胞基因组目标区域捕获的方法
<130> 1704SSCN
<150> 2017114314506
<151> 2017-12-26
<160> 44
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 1
hrtatggctg cccactcctt ag 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 2
hrgacctcgg cctggactac ta 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 3
hrctggggct cttcaaactg ag 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 4
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<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 5
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( )
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<212> DNA
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<400> 7
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 8
hrtcaaaata atgggcctgg aa 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 10
hrtcaaaaga agtgggagga ttg 23
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 11
hrcaccactc cacagggaga at 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 12
hrcagagacc aagggagaaa cg 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 13
hrtcgtctac ctcctccctc ct 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 14
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<212> DNA
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hrgggttttg gtgttgagaa aaa 23
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<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 16
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 17
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<211> 22
<212> DNA
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<400> 18
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 19
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 20
hrgagagcat tggcctccat ag 22
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 21
hrgatgcagg gagggtatgt gt 22
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 22
hrccttgcca gtaggtttcc tg 22
<210> 23
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<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 23
hracccttcc actggacctc tt 22
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
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<400> 24
hrcatttgct gcctcacttg tc 22
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 25
hrtctccagt tttgaggggc ta 22
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
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<400> 26
hrttggcctc cacttcattt ct 22
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<211> 22
<212> DNA
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<400> 27
hrggatggaa ctagccatgc ag 22
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 28
hrggaggatc actgcacacc tt 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 29
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( )
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<400> 32
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 33
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<211> 22
<212> DNA
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<400> 34
hrccccggaa tagaccactt tc 22
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<212> DNA
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<211> 22
<212> DNA
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<400> 36
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<211> 22
<212> DNA
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hratgtgaga cgtcatgggt gt 22
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<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 38
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<212> DNA
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( )
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<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 42
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<400> 43
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<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( )
<400> 44
hrtgccattc cctctaatcc tg 22
Claims (6)
1.一种单细胞基因组目标区域捕获的方法，包括：
步骤A：采用多重置换扩增方法对单细胞基因组进行等温扩增，获得扩增后的基因组；
步骤B：取3μg扩增后的基因组进行打断，获得片段化的DNA片段；
步骤C：将片段化的DNA片段进行末端修复，获得平末端DNA片段；
步骤D：将平末端DNA片段进行3'端加A，获得3'端加A的DNA片段；
步骤E：将3'端加A的DNA片段进行加接头，获得加接头的DNA片段；
步骤F：将加接头的DNA片段进行PCR扩增，获得扩增的DNA片段；
步骤G：将扩增的DNA片段进行目标区域捕获，获得捕获的DNA片段；
步骤H：将捕获的DNA片段进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
步骤I：将PCR扩增产物进行测序；
其中，所述步骤A中等温扩增的条件为30℃反应2小时；
所述步骤A之后还包括：
步骤A-1：使用核苷酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:44所示的引物对扩增后的基因组进行PCR扩增；
所述步骤F中PCR扩增的循环数为4～6个循环；
所述步骤G中目标区域捕获的条件为65℃反应16～24小时。
2.根据权利要求1任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤F中加接头的DNA片段的量为100～250ng。
3.根据权利要求1任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤F中加接头的DNA片段的量为150～200ng。
4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤F中PCR扩增的循环数为5个循环。
5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤G中目标区域捕获的条件为65℃反应24小时。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤B与步骤C之间、步骤C与步骤D之间、步骤D与步骤E之间、步骤E与步骤F之间、步骤F与步骤G之间、步骤G与步骤H之间、步骤H与步骤I之间，和/或在步骤I之后包括对DNA片段进行纯化的步骤。
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