CN109957565B - 一种修饰的siRNA分子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种修饰的siRNA分子及其应用。本发明提供了一种抑制PCSK9基因表达的siRNA分子，包括互补形成双链区的正义链和反义链，所述正义链和/或所述反义链包括15‑27个核苷酸或由15‑27个核苷酸组成，所述反义链与序列表中序列81的至少15个、16个、17个，18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个连续的核苷酸互补，所述双链区的长度为15‑25bp，所述siRNA分子中的至少一个核苷酸经过修饰。经配体修饰siRNA分子具高抑制活性和稳定性，还具肝靶向性。该siRNA分子可用于治疗和/或预防PCSK基因介导的疾病，包括心血管疾病和肿瘤性疾病。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种修饰的siRNA分子及其应用，具体涉及一种抑制PCSK9基因表达的siRNA分子及其药物组合物，以及使用所述siRNA分子或其药物组合物降低PCSK9基因表达水平的方法。
背景技术
RNA干扰(RNAi)广泛存在于自然界的物种中，自Andrew Fire和Craig Mello等人1998年在线虫(Caenorhabditiselegans，C.elegans)中首次发现RNAi现象，Tuschl和PhilSharp等人2001年证实在哺乳动物中也存在RNAi之后，关于RNAi的机制原理、基因功能和临床应用等研究取得了一系列的进展。RNAi在防御病毒感染，防转座子跳跃等多种机体保护机制中发挥关键作用(Hutvágner et al.,2001；Elbashir et al.,2001；Zamore 2001)。基于RNAi机制开发的产品是十分有前景的候选药物。小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)能够发挥RNA干扰作用，是实现RNAi的主要工具。
枯草溶菌素前蛋白转化酶9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type9，PCSK9)是枯草溶菌素丝氨酸蛋白酶家族的成员，其参与调节低密度脂蛋白受体(LDLR)蛋白的水平。肝脏是PCSK9表达的主要部位。其他重要表达部位包括胰腺、肾脏以及肠。LDLR通过清除血液中的低密度脂蛋白(LDL)预防动脉粥样硬化和高胆固醇血症。过表达研究指出PCSK9可以控制LDLR的水平。同时，研究发现小鼠中PCSK9敲除后，血中胆固醇水平降低，以及表现出对他汀类药物在降低血液胆固醇中增强的敏感性。以上研究显示，PCSK9的抑制剂对于血液中LDL-C浓度的降低，以及对治疗PCSK9介导的疾病可能是有益的。
目前已有报道靶向PCSK9的抑制剂，但仍需开发针对该靶点的其它抑制剂，使其具有更好的疗效、特异性、稳定性、靶向性或耐受性等。
发明内容
本发明的目的是提供一种抑制PCSK9基因表达的siRNA分子、试剂、试剂盒及其药物组合物，以及上述siRNA分子、试剂、试剂盒或药物组合物在抑制或降低PCSK9基因表达或治疗PCSK9基因介导的疾病或症状的方法和用途。
一个方面，本发明提供了一种抑制PCSK9基因表达的siRNA分子，包括互补形成双链区的正义链和反义链，所述正义链和/或所述反义链包括15-27个核苷酸或由15-27个核苷酸组成，所述反义链与序列表中序列81的15个、16个、17个，18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个连续的核苷酸互补，所述双链区的长度为15-25bp，优选为19-21bp，所述siRNA分子中的至少一个核苷酸经过修饰。
所述siRNA分子由两条链组成，其中同靶mRNA结合的链称为反义链或引导链，另一条链称为正义链或过客链。术语“反义链”是指siRNA的这样一条链，所述链包括与靶序列完全或基本互补的区域。术语“正义链”是指siRNA的这样一条链，所述链包括与作为在此定义的术语反义链的区域基本互补的区域。术语“互补区域”是指反义链上与靶mRNA序列完全或基本互补的区域。在互补区域与靶序列不完全互补的情况下，错配可以位于分子的内部或末端区域中。如此处所使用，术语“互补”是指第一多核苷酸在某些条件例如严格条件下与第二多核苷酸杂交的能力。例如，严格条件可包括400mM NaCl、40mM PIPES pH 6.4、1mMEDTA在50℃或70℃下持续12-16小时。
所述siRNA分子通过RNAi作用，促进PCSK9mRNA的序列特异性降解，实现抑制PCSK基因表达或降低PCSK9基因表达的水平。
一些实施方案中，本发明提供了一种siRNA分子，其正义链的核苷酸序列如序列表中序列81或序列71所示，反义链的核苷酸序列如序列表中序列22或序列72所示。
一些实施方案中，所述修饰选自如下中任一种或多种：锁核酸(LNA)修饰、开环或非锁(UNA)修饰、2′-甲氧基乙基修饰、2′-O-甲基修饰、2′-O-烯丙基修饰、2′-C-烯丙基修饰、2′-氟代修饰、2′-脱氧修饰、2′-羟基修饰、硫代磷酸骨架修饰、DNA修饰、荧光探针修饰、配体修饰。
所述siRNA分子可选自实施例中表5。
一些实施方案中，本发明提供的siRNA分子的修饰方式包括：(1)正义链：长为17-21nt，如19nt；由2′-O-甲基修饰区和2′-氟代修饰区交替组成，每个修饰区的长度为1至3个核苷酸；5′末端和3′末端起的第一个修饰区的修饰方式相同；(2)反义链：长为19-23nt，如21nt；由2′-O-甲基修饰区、2′-氟代修饰区、未修饰区或DNA区交替组成，每个修饰区的长度为1至5个核苷酸；且从5′末端起的第2至5位的连续的核苷酸区，和从3′末端起的第1至3位的连续的核苷酸区，均是由硫代磷酸骨架连接。
更进一步地，所述siRNA分子的正义链结构如(A1)所示；所述siRNA分子的反义链结构如(A2)或(A3)或(A4)所示；
(A1)mUmCmAfUmAmGmGfCfCfUmGmGfAmGfUfUmUmAmU(序列76)；
(A2)fAfU(s)dA(s)dA(s)dAfCfUfCfCAGGfCfCfUAfUGA(s)mG(s)mG(序列73)；
(A3)fAfU(s)dA(s)dA(s)dAfCfUfCfCfAGGfCfCfUAfUfGfA(s)mG(s)mG(序列79)；
(A4)fAfU(s)dA(s)dA(s)dAfCfUfCfCAfGfGfCfCfUmAfUfGfA(s)mG(s)mG(序列80)；
其中，四种核糖核苷酸分别用A、U、C和G表示；四种脱氧核糖核苷酸分别用dA、dT、dC和dG表示；mA、mU、mC和mG分别表示经2′-O-甲基修饰的核糖核苷酸A、U、C和G；fA、fU、fC和fG分别表示经2′-氟代修饰的核糖核苷酸A、U、C和G；(s)表示前后两个核苷酸由硫代磷酸骨架连接。
更加具体的，所述siRNA分子为实施例表5中的RBP9-045-P5G11、RBP9-045-P5G16或RBP9-045-P5G17。
更进一步，所述siRNA分子为如下任一：
(a1)正义链：CCCAUGUCGACUACAUCGA mU(s)mU(序列1)；
反义链：UCGAUGUAGUCGACAUGGG mG(s)mC(序列2)；
(a2)正义链：GGCAGAGACUGAUCCACUU mU(s)mU(序列5)；
反义链：AAGUGGAUCAGUCUCUGCC mU(s)mC(序列6)；
(a3)正义链：GGGUCAUGGUCACCGACUU mU(s)mU(序列7)；
反义链：AAGUCGGUGACCAUGACCC mU(s)mG(序列8)；
(a4)正义链：GGUCUGGAAUGCAAAGUCA mU(s)mU(序列9)；
反义链：UGACUUUGCAUUCCAGACC mU(s)mG(序列10)；
(a5)正义链：GGACCCGCUUCCACAGACA mU(s)mU(序列17)；
反义链：UGUCUGUGGAAGCGGGUCC mC(s)mG(序列18)；
(a6)正义链：GGCAGAGACUGAUCCACUU(序列45)；
反义链：AAGUGGAUCAGUCUCUGCCUC(序列46)；
(a7)正义链：GGUCUGGAAUGCAAAGUCA(序列47)；
反义链：UGACUUUGCAUUCCAGACCUG(序列48)；
(a8)正义链：CCCAUGUCGACUACAUCGA(序列55)；
反义链：UCGAUGUAGUCGACAUGGGGC(序列56)；
(a9)正义链：CUAGACACCAGCAUACAGA(序列57)；
反义链：UCUGUAUGCUGGUGUCUAGGA(序列58)。
(a10)正义链：mGmCmAmCmCmCmUCAUAGGCCUGGmAmGmUmUmUmAmU(序列21)；
反义链：AUAAACUCCAGGCCUAUGAGGG(序列61)；
(a11)正义链：mGmCmAmCmCmCmUCAUAGGCCUGGmAmGmUmUmUmAmU(序列21)；
反义链：AUAAACUCCAGGCCUAUGA(序列62)；
(a12)正义链：mGmCmAmCmCmCmUCAUAGGCCUGGmAmGmUmUmUmAmU(序列21)；
反义链：AfUAAAfCfUfCfCAGGfCfCfUAfUGAGGGfUGfC(序列67)；
(a13)正义链：mGmCmAmCmCmCmUCAUAGGCCUGGmAmGmUmUmUmAmU(序列21)；
反义链：dAfUdAdAdAdCdTdCfCAGGfCfCfUAfUGAGGGfUGfC(序列68)；
(a14)正义链：mGmCmAmCmCmCmUCAUAGGCCmUGGmAmGmUmUmUmAmU(序列69)；
反义链：AUAAACUCCAGGCCUAUGAGGGUGC(序列22)；
(a15)正义链：mGmCmAmCmCmCmUCAUAGGCCmUGGmAmGmUmUmUmAmU(序列69)；
反义链：AfUAAAfCfUfCfCAGGfCfCfUAfUGAGGGfUGfC(序列67)；
(a16)正义链：UCAUAGGCCUGGAGUUUAU(序列71)；
反义链：fAfU(s)dA(s)dA(s)dAfCfUfCfCAGGfCfCfUAfUGA(s)mG(s)mG(序列73)；
(a17)正义链：mUmCmAfUmAmGmGfCfCfUmGmGfAmGfUfUmUmAmU(序列76)；
反义链：AfU(s)dA(s)dA(s)dAfCfUfCfCAmGmGfCfCfUAfUGA(s)mG(s)mG(序列77)；
(a18)正义链：mUmCmAfUmAmGmGfCfCfUmGmGfAmGfUfUmUmAmU(序列76)；
反义链：AfU(s)dA(s)dA(s)dAfCfUfCfCAmGmGfCfCfUAfUfGfA(s)mG(s)mG(序列78)。
其中，四种核糖核苷酸分别用A、U、C和G表示；四种脱氧核糖核苷酸分别用dA、dT、dC和dG表示；mA、mU、mC和mG分别表示经2′-O-甲基修饰的核糖核苷酸A、U、C和G；fA、fU、fC和fG分别表示经2′-氟代修饰的核糖核苷酸A、U、C和G；(s)表示前后两个核苷酸由硫代磷酸骨架连接。
更加具体的，所述siRNA为实施例表4中的RBP9-002、RBP9-008、RBP9-009、RBP9-010、RBP9-021、RBP9-116、RBP9-117、RBP9-121和RBP9-122中任一，或者为实施例表5中的RBP9-045-P1G2、RBP9-045-P1G3、RBP9-045-P1G8、RBP9-045-P1G9、RBP9-045-P2G1、RBP9-045-P2G8、RBP9-045-P4G11、RBP9-045-P5G14和RBP9-045-P5G15中任一。
配体是由宿主细胞摄取的部分。好的配体修饰可改善siRNA分子的细胞摄取、细胞内靶向、半衰期、或药物代谢或动力学性等性能。一些实施方案中，与不经配体修饰的siRNA相比，配体修饰的siRNA针对选定靶标(如特定的组织类型、细胞类型、细胞器等)，如肝细胞，具有增强的亲和力或细胞摄取力。好的配体修饰不会干扰所述siRNA的活性。
一些实施方案中，所述配体修饰为对所述siRNA分子的3’末端、5’末端和/或序列中间进行一个或多个配体修饰；其中，所述配体选自如下：胆固醇、生物素、维生素、半乳糖衍生物或类似物、乳糖衍生物或类似物、N-乙酰半乳糖胺衍生物或类似物、N-乙酰葡萄糖胺衍生物或类似物。所述配体靶向细胞表面受体，包括半乳糖、半乳糖胺、乳糖、或N-乙酰半乳糖胺/葡萄糖胺部分。所述配体优选靶向肝，尤其是肝的实质细胞。所述配体靶向ASGPR。所述配体还可为人血清白蛋白(HSA)、透明质酸、多肽等。
一些实施方案中，对所述siRNA分子的3’末端、5’末端和/或序列中间进行1-5个、2-4个或3个N-乙酰半乳糖胺衍生物或类似物修饰。
具体的，单个所述N-乙酰半乳糖胺衍生物的结构如式I所示：
其中，n为1-15的整数。
一些实施方案中，所述siRNA分子的正义链结构如(B1)或(B2)或(B3)所示；所述siRNA分子的反义链结构如(B4)或(B5)或(B6)或(B7)所示；
(B1)mUmCmAfUmAmGmGfCfCfUmGmGfAmGfUfUmUmAmU-ZZ；
(B2)mUmCmAfUmAmGmGfCfCfUmGmGfAmGfUfUmUmAmU-ZZZ；
(B3)mUmCmAfUmAmGmGfCfCfUmGmGfAmGfUfUmUmAmU-ZZZZ；
(B4)Cy5/-fAfU(s)dA(s)dA(s)dAfCfUfCfCAGGfCfCfUAfUGA(s)mG(s)mG；
(B5)Cy5/-fAfU(s)dA(s)dA(s)dAfCfUfCfCAfGfGfCfCfUmAfUfGfA(s)mG(s)mG；
(B6)fAfU(s)dA(s)dA(s)dAfCfUfCfCAGGfCfCfUAfUGA(s)mG(s)mG；
(B7)fAfU(s)dA(s)dA(s)dAfCfUfCfCAfGfGfCfCfUmAfUfGfA(s)mG(s)mG；
其中，四种核糖核苷酸分别用A、U、C和G表示；四种脱氧核糖核苷酸分别用dA、dT、dC和dG表示；mA、mU、mC和mG分别表示经2′-O-甲基修饰的核糖核苷酸A、U、C和G；fA、fU、fC和fG分别表示经2′-氟代修饰的核糖核苷酸A、U、C和G；(s)表示前后两个核苷酸由硫代磷酸骨架连接。
(B4)和(B5)所示的反义链的5’端修饰有荧光基团Cy5。
单个Z的结构如式I所示；ZZ表示两个相连的Z，ZZZ表示三个相连的Z，ZZZZ表示四个相连的Z，相邻的两个Z通过磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键相连；ZZ、ZZZ和ZZZZ均通过磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键与siRNA正义链核苷酸序列的3’末端核苷酸连接。
在所述ZZ中，两个Z结构中n的取值相等；在所述ZZZ中，三个Z结构中n的取值相等；在所述ZZZZ中，四个Z结构中n的取值相等。
如：n为3或8。所述n值为3时，Z可用L表示。所述n值为8时，Z可用S表示。
具体的，所述siRNA选自实施例中表9和表11。
更加具体的，配体修饰的所述siRNA分子结构为：
A：mUmCmAfUmAmGmGfCfCfUmGmGfAmGfUfUmUmAmU-ZZZ；
fAfU(s)dA(s)dA(s)dAfCfUfCfCAGGfCfCfUAfUGA(s)mG(s)mG；或
B：mUmCmAfUmAmGmGfCfCfUmGmGfAmGfUfUmUmAmU-ZZZ；
fAfU(s)dA(s)dA(s)dAfCfUfCfCAfGfGfCfCfUmAfUfGfA(s)mG(s)mG；
所述ZZZ结构及其与正义链核苷酸序列连接方式如下：
上述siRNA分子的每条链中可有0％-100％的经修饰的核苷酸，如5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％以上经修饰的核苷酸。所述修饰可在悬垂区或双链区。上述修饰可用于改善siRNA分子的体外或体内特征，例如稳定性、生物分布、抑制活性等。上述修饰可以组合使用。
上述siRNA分子的每条链末端具有悬垂或是平末端。包括任一链或双链的5’和/或3’有1-8个悬垂，如2个，3个，4个，5个，6个悬垂，悬垂任意选自U、A、G、C、T、dT。
所述siRNA分子能够抑制人、猴、大鼠或小鼠的PCSK9基因表达。
与所述siRNA相关的生物材料也属于本发明的保护范围。
所述与所述siRNA相关的生物材料，可为如下任一：
(A)能够产生所述siRNA的DNA分子；
(B)能够表达所述siRNA的载体；
(C)试剂或试剂盒，含有所述siRNA或者所述DNA分子或所述载体；
(D)药物组合物，由所述siRNA分子和药学上可接受的其它组分组成。
所述药物组合物包括药理学有效量的本发明的siRNA分子和其他药学可接受的组分。“有效量”是指能有效产生预期的药理学治疗效果的siRNA分子的量。“其他组分”包括水、盐水、葡萄糖、缓冲液(如PBS)，赋形剂、稀释剂、崩解剂、结合剂、润滑剂、甜味剂，调味剂，防腐剂或其组合。
所述药物组合物可用于预防和/或治疗由PCSK9基因介导的疾病，或者用于缓解由PCSK9基因介导的疾病的症状。
所述由PCSK9基因介导的疾病包括心血管疾病、血脂异常或肿瘤性疾病。所述心血管疾病包括动脉粥样硬化性心血管疾病，血脂异常包括血清中胆固醇和/或甘油三酯水平升高，低密度脂蛋白胆固醇升高或载脂蛋白B(ApoB)升高。具体如哺乳动物的高脂血症，高胆固醇血症、非家族性高胆固醇血症、多基因高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症、纯合性家族性高胆固醇血症或杂合性家族性高胆固醇血症。所述肿瘤性疾病如与PCSK9有关的黑色素瘤和转移性肝癌。
本发明还提供了如下任一所示的应用：
(I)所述siRNA或所述生物材料在抑制PCSK9基因表达或者制备用于抑制PCSK9基因表达的产品中的应用。
其中，所述抑制PCSK9基因表达为抑制或降低体内或体外细胞中人、猴、大鼠或小鼠的PCSK9基因表达水平。所述抑制PCSK9基因表达为所述PCSK9基因表达水平至少抑制或降低了95％、90％、85％、80％、75％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％。靶基因、靶RNA或靶蛋白水平的检测可用于预测或评估活性、效力或治疗结果。
所述细胞为表达PCSK9的哺乳动物细胞，如灵长类动物细胞、人细胞。较好是，靶细胞中PCSK9基因高水平表达。更好的是，细胞来源于脑、唾液腺、心脏、脾脏、肺脏、肝脏、肾脏、肠道、肿瘤。进一步更好的是，细胞为肝癌细胞，宫颈癌细胞。再进一步更好的是，细胞选自HepG2，Huh7，MHCC97H，Hela，小鼠原代细胞。
所述体外应用中，siRNA分子的细胞终浓度为0.1-1000nM，如10-500nM，25-300nM或50-100nM。
所述体内应用中，所述药物组合物可以通过任何合适的手段来施用，如胃肠外给药，胃肠给药包括肌肉、静脉、动脉、腹膜、或皮下注射。给药方式包括但不限于单次施用或多次施用。给药剂量范围为0.1mg/kg至100mg/kg，0.5mg/kg至50mg/kg、2.5mg/kg至20mg/kg、5mg/kg至15mg/kg，具体如3mg/kg、10mg/kg、33mg/kg。
在一些实施方案中，单剂量的药物组合物可以长久持续，PCSK9表达下降持续至少3、5、7、10、14或更长时间。
(II)所述siRNA或所述生物材料在降低血清中低密度脂蛋白(LDL)和/或低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)浓度或者制备用于降低血清中低密度脂蛋白(LDL)和/或低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)浓度的产品中的应用；
其中，所述降低血清中低密度脂蛋白(LDL)和/或低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)浓度为降低人、猴、大鼠或小鼠血清中低密度脂蛋白(LDL)和/或低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)浓度。
血清LDL(低密度脂蛋白)或LDL-C(低密度脂蛋白胆固醇)的浓度或含量至少减少了5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％。
(III)所述siRNA或所述生物材料在预防和/或治疗由PCSK9基因介导的疾病或者制备用于预防和/或治疗由PCSK9基因介导的疾病的产品中的应用；
(IV)所述siRNA或所述生物材料在缓解由PCSK9基因介导的疾病的症状或者制备用于缓解由PCSK9基因介导的疾病的症状的产品中的应用；
所述由PCSK9基因介导的疾病包括心血管疾病、血脂异常或肿瘤性疾病。所述心血管疾病包括动脉粥样硬化性心血管疾病，血脂异常包括血清中胆固醇和/或甘油三酯水平升高，低密度脂蛋白胆固醇升高或载脂蛋白B(ApoB)升高。具体如哺乳动物的高脂血症，高胆固醇血症、非家族性高胆固醇血症、多基因高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症、纯合性家族性高胆固醇血症或杂合性家族性高胆固醇血症。所述肿瘤性疾病如与PCSK9有关的黑色素瘤和转移性肝癌。
所述“高胆固醇血症”是指以增高的血清胆固醇为特征的状况。“高脂血症”是指以增高的血清脂质为特征的状况。“非家族性高胆固醇血症”是指不是由单一遗传性基因突变导致的以增高的胆固醇为特征的状况。“多基因高胆固醇血症”是指由多种遗传因子影响导致的、以增高的胆固醇为特征的状况。“家族性高胆固醇血症(familialhypercholesterolemia，FH)”是指以LDL-受体(LDL-R)中的突变、显著增高的LDL-C和动脉粥样硬化的过早发作(premature onset)为特征的常染色体显性代谢病症。“纯合性家族性高胆固醇血症(homozygous familial hypercholesterolemia，HoFH)”是指以母体和父体LDL-R基因的突变为特征的状况。“杂合性家族性高胆固醇血症(heterozygous familialhypercholesterolemia，HoFH)”是指以母体或父体LDL-R基因的突变为特征的状况。
所述PCSK基因介导的疾病或症状可由PCSK9基因过量表达、PCSK9蛋白过量产生引起，并可通过下调PCSK9基因表达进行调节。所述治疗是指PCSK9基因介导的疾病或症状的缓解、减轻或治愈，如血脂水平的降低，包括血清LDL、LDL-C水平的降低。
一些实施方案中，血清LDL、血清LDL-C的含量或浓度减少了5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。
另外，本发明所提供的经配体修饰的siRNA分子在制备肝脏靶向性药物中的应用也属于本发明的保护范围。其中，所述肝脏靶向性药物可用于治疗由PCSK9基因介导的肝脏疾病。
本发明的创新性体现在：1、经修饰的siRNA分子具有高稳定性和高抑制活性。2、经配体修饰的siRNA分子在保持了较高的抑制活性和稳定性的同时，还具有较好的肝靶向性和促进细胞内吞的能力，可降低对其他组织或器官的影响以及减少siRNA分子使用量，可达到减轻毒性和降低成本的目的；另外，配体修饰的siRNA分子无需转染试剂即可进入靶细胞和靶组织，降低了转染试剂的负性影响，如细胞或组织毒性。从而为靶向治疗提供可能。
需要说明的是，尽管能够尝试进行许多修饰来改善siRNA的性能，然而这些尝试通常很难阐释既介导RNA干扰又在血清中具有提高的稳定性(例如，具有对核酸酶的增加的抗性和/或延长的持续时间)。本发明的经修饰的siRNA具有高稳定性的同时保持了高的抑制活性。
缩写、简称和编号说明
“G”、“C”、“A”、“T”和“U”通常分别代表以鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶为碱基的核苷酸。
REL(Relative exprseeion level)：mRNA相对表达水平。
GalNAc：N-乙酰半乳糖胺。
修饰：N＝RNA；dN＝DNA；mN＝2'OMe修饰；fN＝2'F修饰；(s)＝PS骨架(即5'-硫代修饰的磷酸骨架)。
简称：RBP9-005-P3G6可简称为P3G6，依此类推。
编号：P3G6折线后的第一位表示是否有荧光标记(0表示“无”，1表示“有”)，第二位表示配体的个数，而第三位表示配体的类型，如P3G6-13L表示P3G6经过荧光标记、以及3个L的配体修饰；依此类推。
附图说明
图1示出了GalNAc-siRNA与受体的结合曲线。
图2示出了P5G11组小鼠6h活体成像图。
图3示出了P5G17组小鼠6h活体成像图。
具体实施方式
实施例1、PCSK9-siRNA活性筛选
一、siRNA设计
根据人PCSK9mRNA序列，选择不同位点设计多对PCSK9siRNAs，设计的所有单个siRNA均能靶向靶基因的所有转录本(如表1)，以上序列经序列相似性软件比对与其他所有非靶标基因序列有最低同源性。序列设计方法参考Elbashir et al.2002；Paddison etal.2002；Reynoldset al.2004；Ui-Tei et al.2004等人的方法。
参考文献
Elbashir,S.M.,Harborth,J.,Lendeckel,W.,Yalcin,A.,Weber,K.,&Tuschl,T.(2001).Duplexes of 21-nucleotide rnas mediate rna interference in culturedmammalian cells.Nature.
Zamore,P.D.(2001).Rna interference:listening to the sound ofsilence.Nature Structural Biology,8(9),746-50.
表1靶基因
| 靶基因 | 物种 | Gene ID | NM_ID |
| PCSK9 | Homo sapiens(人) | 255738 | NM_174936.3 |
二、siRNA合成
本发明中含有2’-羟基的核糖核苷酸的寡聚核苷酸均按照理论产量1μmol合成规格完成，称取1μmol规格通用固相支持物CPG或3’-胆固醇修饰CPG(Chemgenes产品)，2’-O-TBDMS保护RNA亚磷酰胺的单体、DNA单体、2’-甲氧基单体、2’-氟单体(Sigma Aldrich产品)溶解于无水乙腈溶液中，使其浓度达到0.2M。对于磷酸骨架硫代修饰的寡聚核苷酸以0.2MPADS溶液作为硫代试剂。配制5-乙硫基-1H-四唑(Chemgenes产品)乙腈溶液作为活化剂(0.25M)，配制0.02M碘的吡啶/水溶液作为氧化剂，以及3％三氯乙酸二氯甲烷溶液作为脱保护试剂，放置于ABI 394型号DNA/RNA自动合成仪对应的试剂指定位置。设置合成程序输入指定的寡聚核苷酸碱基序列，开始循环寡聚核苷酸合成，每步偶合时间6分钟，半乳糖配体对应L和S单体偶合时间10-20分钟。经自动循环后，完成寡核苷酸固相合成。以干燥氮气吹干CPG，转移到5ml EP管中，加入氨水/乙醇溶液(3/1)2ml，55℃加热16～18小时。在10000rpm的转速下离心10min，取上清液，抽干浓氨水/乙醇后得到白色胶状固体。将固体溶于200μl 1M TBAF THF溶液，室温震荡20小时。加入0.5ml 1M Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)，室温震荡15分钟，置于离心抽干机抽至体积为原体积1/2，除去THF。溶液用0.5ml氯仿萃取2次，加入1ml 0.1M TEAA上样液，将混合溶液倒入固相萃取柱，在HTCS LC-MS system(Novatia)系统上，完成质谱检测分析。一级扫描后以Promass软件归一化计算核酸分子量。
本发明中仅含脱氧核糖核苷酸或2’-甲氧基或2’-氟或LNA或2’-MOE修饰寡核苷酸按照理论产量1μmol合成规格完成，称取1μmol规格通用固相支持物CPG或3’-胆固醇修饰CPG(Chemgenes产品)，DNA单体、2’-甲氧基单体、2’-氟单体(Sigma Aldrich产品)溶解于无水乙腈溶液中，使其浓度达到0.2M。对于磷酸骨架硫代修饰的寡聚核苷酸以0.2M PADS溶液作为硫代试剂。配制5-乙硫基-1H-四唑(Chemgenes产品)乙腈溶液作为活化剂(0.25M)，配制0.02M碘的吡啶/水溶液作为氧化剂，以及3％三氯乙酸二氯甲烷溶液作为脱保护试剂，放置于ABI 394型号DNA/RNA自动合成仪对应的试剂指定位置。设置合成程序输入指定的寡聚核苷酸碱基序列，开始循环寡聚核苷酸合成，每步偶合时间6分钟，半乳糖配体对应单体偶合时间6-10分钟。经自动循环后，完成寡核苷酸固相合成。以干燥氮气吹干CPG，转移到5mlEP管中，加入氨水溶液2ml，55℃加热16～18小时。在10000rpm的转速下离心10min取上清液，抽干浓氨水/乙醇后得到白色或黄色胶状固体。加入1ml 0.1M TEAA上样液，将混合溶液倒入固相萃取柱，除去溶液中过量盐，所得寡聚核苷酸浓度由微量紫外分光光度计(KO5500)测定含量。在Oligo HTCS LC-MS system(Novatia)系统上，完成质谱检测分析。以一级扫描后以Promass软件归一化计算核酸分子量。
三、PCSK9-siRNA转染不同细胞
所有细胞均来自ATCC，也可来自公众可获取的其他来源；其他试剂均可商购。
表2细胞名称与种类
| 细胞名称 | Huh7 | HePG2 | MHCC97H | HeLa |
| 细胞种类 | 肝癌细胞 | 肝癌细胞 | 肝癌细胞 | 宫颈癌细胞 |
细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养基中，于5％CO2、37℃恒温培养箱中培养，待细胞处于对数生长期且状态良好时(70％汇合度)时转染试剂转染。调整细胞浓度为1×106/ml，6孔板中每孔加入1ml细胞溶液和5μl riboFect转染试剂。室温静置5min后加入5μl100nM siRNA，37℃、5％CO2孵育48h。
每次细胞铺板除了试验组，还设置如下对照组：NC为阴性对照(不相关siRNA)、Mock为转染试剂对照组、未处理对照组(UT组，不加siRNA)。试验组和对照组均有3次重复。
四、靶mRNA水平的实时定量PCR分析
1、转染48h后裂解细胞，Trizol法提取细胞总RNA。
2、Reverse Transcription mix反转录试剂盒用于反转录(广州市锐博生物科技有限公司)。
3、荧光定量PCR：
以β-actin基因为内参基因，利用Real-time PCR试剂盒SYBR Premix(2×)进行实时荧光定量PCR反应，使用美国Bio-Rad公司CFX96荧光定量PCR仪进行PCR反应。使用引物为：
表3引物
| PCSK9-qPCR-F(5’-3’) | AAGCCAAGCCTCTTCTTACTTCA |
| PCSK9-qPCR-R(5’-3’) | CCTGGGTGATAACGGAAAAAG |
4、数据分析
PCR反应结束后，一个样品的9个重复(每个样品3个转染重复，3个qPCR时重复)的Ct误差在±0.5，采用CFX 2.1进行相对定量分析。表4为优选的siRNA相对NC组的靶基因表达水平的平均值(NC组的mRNA相对表达水平为1)。
表4实时定量PCR检测结果
在HuH7、HepG2、HeLa、MHCC97H中进行的PCSK97siRNA筛选发现了在HuH7、MHCC97H、HeLa细胞中活性较高的siRNA分子，RBP9-045。且RBP9-045为人、小鼠、食蟹猴同源。
实施例2、PCSK9-siRNA的优化
一、抑制活性检测
对RBP9-045进行不同的修饰优化，其合成、转染、定量PCR检测步骤同实施例一。转染细胞为HeLa和Huh7细胞，结果见表5(REL-H：HeLa细胞中PCSK9mRNA相对表达水平；REL-7：Huh7细胞中PCSK9mRNA相对表达水平)。表5为相对NC组的靶基因表达水平的平均值(NC组的mRNA相对表达水平为1)。其中，NC为不相关siRNA阴性对照组，Mock为转染试剂对照组，UT为未处理细胞对照组。
表5 RBP9-045优化
结果表明，化学修饰的RBP9-045-P5G11、RBP9-045-P5G16、RBP9-045-P5G17在HeLa和Huh7细胞中抑制活性较高。
研究发现：修饰的方案是重要的，某些修饰会降低抑制活性。优选的修饰方案具有高的抑制活性：(1)反义链在3'-端处具有5'(s)mN(s)mN 3'结构的突出端，有利于反义链加载到RISC中，加强RNAi的干扰活性而不影响稳定性。(2)反义链的U和C均用氟代修饰，反义链从5端起2-8位的A均为DNA修饰，且DNA修饰的核苷酸间由硫代磷酸骨架连接。(3)正义链的3'-端和5'-端的连续的3个核苷酸经2′-O-甲基修饰，中间的U或C经氟代修饰，中间的A或G经2′-O-甲基修饰。
二、稳定性检测
RBP9-045-P5G11(简称P5G11，下同)、RBP9-045-P5G17(简称P5G17，下同)、RBP9-045-P4G10(简称P4G10，未修饰对照，下同)、人血清、C57小鼠血清、SD大鼠血清由广州市锐博生物科技有限公司提供；Tris-base购自MDBIO公司；六氟异丙醇(HFIP)及二异丙胺(DIPA)均为Fluka公司产品；甲醇为色谱纯，Burdick&Jackson公司产品；其他试剂为分析纯。
1、溶液配制
(1)5％氨水溶液：取25％氨水溶液4ml，加入至16ml的去离子水中；
(2)50μM siRNA溶液：取10mg/ml siRNA储备液(含5％甲醇)46μl，加入至660.5μl的去离子水中。
2、siRNA在不同基质中的稳定性检测
取50μM siRNA样品溶液90μl，分别加入至含810μl的去离子水、人血清、大鼠血清、小鼠血清中。取50μM siRNA对照溶液90μl，加入小鼠血清中。
37℃恒温水浴温孵0、0.25、0.5、1、2h后各取出100μl进行样品前处理。
(1)样品前处理
除去离子水样品直接进样分析外，其余取出的100μl生物基质样品分别加入250μl5％氨水溶液，混匀后加入100μl液-液萃取液(苯酚-氯仿-异戊醇混合物)，混匀后再将上述处理的样品4℃16000×g离心10min，取332μl的上清，然后于常温将上清氮吹至约30μl，加超纯水至100μl。复溶后的样品于4℃16000×g离心10min后，取上清进样分析。
(2)液质检测
超高效液相色谱/离子阱质谱联用仪(Waters Acquity UPLC/Thermo FisherLTQ)检测siRNA稳定性。
色谱条件：色谱柱：
Oligonucleotide BEH C18柱(2.5μm,2.1mm×50mm)，流动相：A(10mM DIPA，25mM HFIP in water)和B(10mM DIPA，25mM HFIP in water/MEOH(50/50,v/v))，梯度洗脱：0～3min:5％B；3～15min:5％→35％B；15～18min:35％→5％B；18～25min:5％B；流速：0.3ml/min；柱温：80℃；检测波长：260nm。质谱条件：离子源为电喷雾(ESI)电离源；喷雾电压为5kV；毛细管温度为350℃；扫描方式为负离子选择离子扫描(SIM)。
siRNA在不同基质中温孵不同时间后反义链(AS)和正义链(S)剩余百分比与温孵时间的曲线如表6和表7所示。由表6可知，化学修饰的siRNA样品的反义链在人血清中温孵2h后无损失，在纯水、大鼠和小鼠血清中温孵2h后分别剩余95％以上、85％以上和95％以上。而未修饰的siRNA对照在小鼠血清中温育0.5h后已检测不到。表7显示，修饰的siRNA样品的正义链在纯水中温孵2h后剩余95％以上，而在人、大鼠、小鼠血清中温孵2h后分别剩余45％以上，2％左右、5％左右。而未修饰的siRNA对照在小鼠血清中温育2h后仅剩余0.53％。结果表明，修饰的siRNA样品与未修饰的对照相比具有较高的化学稳定性，尤其在人血清中具有较高的稳定性。
表6 siRNA在不同基质中温孵不同时间后AS链剩余百分比
注："/"表示未检测到目标检测物。
表7 siRNA在不同基质中温孵不同时间后S链剩余百分比
实施例3、GalNAc-siRNA细胞靶向性检测
一、配体修饰的siRNA制备
1、半乳糖修饰单体L的合成
(1)化合物1合成
1L圆底烧瓶中，将δ-戊内脂(100g，1mol)，氢氧化钠(40g，1mol)和去离子水400mL混合，70℃反应6小时，TCL监控反应完毕，旋干反应液，加入200ml甲苯后旋干，得白色固体140g。
(2)化合物2合成
1L圆底烧瓶中，加入化合物1(140g，1mol)，无水丙酮500mL，溴化苄(205.2g，1.2mol)和催化剂四丁基溴化铵(16.2g，0.05mol)，加热回流。TLC监测反应，24h后反应完全，反应液冷却至室温后，减压除去丙酮，残渣溶于500mL乙酸乙酯中，依次用饱和硫酸氢钠200mL、饱和碳酸氢钠200mL和饱和食盐水200mL洗涤，有机相无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱(石油醚：乙酸乙酯＝1：1，体积比)分离得到透明油状液体175g，产率84％。
(3)化合物3合成
1L圆底烧瓶中，加入D-半乳糖盐酸盐(100g，0.46mol)和无水吡啶450mL，冰浴下缓慢加入乙酸酐325mL，三乙胺(64.5mL，0.46mol)，DMAP(2g，0.016mol)。常温反应过夜，析出大量固体，抽滤，滤饼用0.5N HCl溶液200mL淋洗，得白色固体162.5g，产率90％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：7.88(d,J＝9.2Hz,1H),5.63(d,J＝8.8Hz,1H),5.26(d,J＝3.1Hz,1H),5.05(d,J＝11.3,3.3Hz,1H),4.36(m,4H),2.11(s,3H),2.03(s,3H),1.98(s,3H),1.90(s,3H),1.78(s,3H)。
(4)化合物4合成
250mL圆底烧瓶中，加入化合物3(10g，25.7mmol)，无水二氯甲烷100mL，搅拌10分钟后加入三氟甲磺酸三甲基硅酯(7mL，38.7mmol)，室温反应过夜，反应液缓慢倾入碳酸氢钠(7g，79.5mmol)的水溶液(200mL)中搅拌0.5小时，有机相分离，无水硫酸钠干燥，经减压浓缩获得淡黄色胶体7.78g，产率92％。
(5)化合物5合成
100mL圆底烧瓶，将化合物4(5g，15.2mmol)，化合物2(3.8g，18.25mmol)溶于无水1，2-二氯乙烷50mL中，搅拌10分钟后加入三氟甲磺酸三甲基硅酯(0.55mL，3mmol)，常温过反应过夜，反应液二氯甲烷萃取，有机相用饱和碳酸氢钠50mL洗涤两遍，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，经硅胶柱(石油醚：乙酸乙酯＝3：2，体积比)分离得到透明油状液体6.94g，产率85％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ：7.69(d,J＝9.3Hz,1H),7.33–7.16(m,5H),5.28(d,J＝5.3Hz,1H),4.95(s,2H),4.93(q,J＝4.2Hz,1H),4.40(d,J＝8.6Hz,1H),4.00–3.86(m,3H),3.73–3.56(m,2H),3.36–3.21(m,1H),2.53(t,J＝8.2Hz,2H),2.11(s,3H),1.89(s,3H),1.83(s,3H),1.65(s,3H),1.59–1.36(m,4H).MS(ESI),m/z:560.2([M+Na]+)。
(6)化合物6合成
50mL圆底烧瓶，化合物5(3.3g，6.1mmmol)，Pd/C(0.33g,10％)溶于5mL甲醇和20mL乙酸乙酯中，接入氢气球，常温反应过夜。反应液硅藻土过滤，硅藻土甲醇淋洗，滤液减压浓缩旋干，得白色固体2.8g，产率95.5％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ：11.98(s,1H),7.79(d,J＝8.9Hz,1H),5.20(s,1H),5.0-4.95(q,J＝4.2Hz,1H),4.51-4.46(d,J＝7.2Hz,1H),4.15–3.97(m,3H),3.89–3.79(m,1H),3.80–3.69(m,1H),3.46–3.36(m,1H),2.22-2.14(t,J＝7.2Hz,2H),2.15(s,3H),2.00(s,3H),1.95(s,3H),1.87(s,3H),1.59–1.42(m,4H).MS(ESI),m/z:470.5([M+Na]+)。
(7)化合物7合成
以丝胺醇为原料，参照.Jun Young Choi等文献(Choi J Y,Borch R F.Highlyefficient synthesis of enantiomerically enriched 2-hydroxymethylaziridines byenzymatic desymmetrization.[J].Organic letters,2007,9(2):215-218.)的合成。白色固体，收率89％。MS(ESI),m/z:248.2([M+Na]+)。
(8)化合物8合成
以化合物2为原料，参照US 2011/0077389A1文献合成。白色固体，收率56％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ：7.41-7.37(d,J＝7.2Hz,2H),7.33-7.28(t,J＝6.9Hz,2H),7.27–7.19(m,5H),6.91-6.86(d,J＝8.2Hz,4H),5.16(s,2H),4.63–4.58(m,1H),4.05–3.97(m,1H),3.74(s,6H),3.04–2.99(m,2H),2.95–2.90(m,2H).MS(ESI),m/z:416.3([M+Na]+)。
(9)化合物9合成
250mL圆底烧瓶中，加入化合物6(10g，22.35mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)(5.14g，26.82mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(2.83g，24.59mmol)，二氯甲烷100mL。常温搅拌反应0.5h后加入化合物8(8.79g，22.35mmol)，TLC监测反应，4h后反应完全。反应液依次用饱和碳酸氢钠50mL和饱和食盐水50mL洗涤，有机相无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱(二氯甲烷：甲醇＝20：1，体积比)分离得到白色固体15.8g，产率86％。MS(ESI),m/z:845.2([M+Na]+)。
(10)化合物L单体合成
250mL双口瓶中，化合物1(5g，6.08mmol)，氮气保护，无水乙腈100ml，双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦(3.66g，12.16mmol)，搅拌下缓慢滴加乙硫基四唑的乙腈溶液(2.5M)(1.22ml，3.04mmol)，反应0.5h，TLC监测反应，0.5h后反应完全。减压浓缩除去乙腈，二氯甲烷100mL溶解，饱和食盐水100mL洗涤。有机相无水硫酸钠干燥，浓缩，经硅胶柱(石油醚：乙酸乙酯＝1：3，体积比)分离得到白色固体5.16g，产率83％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：7.84-7.79(d,J＝8.9Hz,1H),7.65-7.60(d,J＝8.9Hz,1H),7.41-7.37(d,J＝7.2Hz,2H),7.33-7.28(t,J＝6.9Hz,2H),7.27-7.19(m,5H),6.91-6.86(d,J＝8.2Hz,4H),5.20(s,1H),5.0-4.95(q,J＝4.2Hz,1H),4.51-4.46(d,J＝7.2Hz,1H),4.15-3.97(m,3H),4.05-3.96(m,1H),3.84-3.80(m,2H),3.89-3.79(m,1H),3.74(s,6H),3.71-3.69(m,1H),3.46-3.36(m,1H)，3.04-2.99(m,2H),2.95-2.90(m,2H)，2.88-2.84(m,2H),2.59-2.54(m,2H),2.22-2.14(t,J＝7.2 Hz，2H)，2.15(s,3H)，2.00(s,3H)，1.95(s,3H)，1.87(s,3H)，1.77(s,12H)，1.59-1.42(m,4H).MS(ESI),m/z:1045.5([M+Na]+)。
2、半乳糖S单体合成
(1)化合物10合成
100mL圆底烧瓶，化合物4(5g，15.2mmol)，10-十一烯醇(3.1g，18.24mmol)溶于50ml无水二氯甲烷中，搅拌10分钟后加入三氟甲磺酸三甲基硅酯(0.55mL，3.0mmol)，常温反应过夜，反应液用二氯甲烷萃取，有机相用饱和碳酸氢钠50mL洗涤两遍，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，经硅胶柱(石油醚：乙酸乙酯＝3：2，体积比)分离得到白色固体6.59g，产率87％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ：7.82(d,J＝3.3Hz,1H),5.86-5.73(m,1H),5.22(s,1H),5.02-4.9(m,3H),4.5-4.98(s,J＝3.5Hz,1H),4.08-3.99(m,3H),3.9-3.88(m,1H),3.73-3.65(m,1H),3.48-3.38(m,1H),2.12(s,3H),2.05-2.01(m,2H),2.00(s,3H),1.88(s,3H),1.66(s,3H),1.5-1.4(m,2H),1.39-1.3(m,2H),1.29-1.19(m,10H).MS(ESI),m/z:522.4([M+Na]+)。
(2)化合物11合成
100mL圆底烧瓶中，加入化合物10(4g，8.02mmol)，二氯甲烷50ml，乙腈50ml，去离子水70mL，分批加入NaIO4(6.86g，32.1mmol)，常温反应48h，TCL监控反应完毕。反应液加入去离子水100mL，二氯甲烷萃取三次(50mL×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩旋干，得淡褐色胶状产物4.1g，产率99％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ：11.99(s,1H),7.82(d,J＝3.3Hz,1H),5.22(s,1H),5.02-4.9(m,1H),4.5-4.98(s,J＝3.5Hz,1H),4.08-3.99(m,3H),3.9-3.88(m,1H),3.73-3.65(m,1H),3.48-3.38(m,1H),2.12(s,3H),2.05-2.01(m,2H),2.00(s,3H),1.88(s,3H),1.66(s,3H),1.5-1.4(m,2H),1.39-1.3(m,2H),1.29-1.19(m,10H).MS(ESI),m/z:540.26([M+Na]+)。
(3)化合物12合成
参照化合物1的合成。白色固体，产率85.6％。MS(ESI),m/z:915.5([M+Na]+)。
(4)化合物S合成
参照化合物L的合成。白色固体，产率82.1％。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ：7.82-7.78(d,J＝7.3Hz,1H),7.69-7.63(d,J＝7.3Hz,1H),7.41-7.37(d,J＝7.2Hz,2H),7.33-7.28(t,J＝6.9Hz,2H),7.27–7.19(m,5H),6.91-6.86(d,J＝8.2Hz,4H),5.22(s,1H),5.02-4.9(m,1H),4.5-4.98(s,J＝3.5Hz,1H),4.08-3.99(m,3H),4.05–3.97(m,1H),3.9-3.88(m,1H),3.84–3.80(m,2H),3.74(s,6H),3.73-3.65(m,1H),3.48-3.38(m,1H),3.04–2.99(m,2H),2.95–2.90(m,2H)，2.88–2.84(m,2H),2.61–2.55(m,2H),2.12(s,3H),2.05-2.01(m,2H),2.00(s,3H),1.88(s,3H),1.77(s,12H)，1.66(s,3H),1.5-1.4(m,2H),1.39-1.3(m,2H),1.29-1.19(m,10H).MS(ESI),m/z:1115.2([M+Na]+).
3、GalNac-siRNA合成
参见实施例一。
二、小鼠原代肝细胞分离
麻醉小鼠，剪开皮肤和肌肉层，暴露肝脏，将灌注导管插入门静脉，下腔静脉剪开小口，准备肝脏灌注。40℃预热perfusion Solution I(Hank’s，0.5mM EGTA，pH 8)和perfusion Solution II(Low-glucose DMEM，100U/mL Type IV，pH7.4)，37℃perfusionSolution I沿门静脉插管灌注肝脏，流速7mL/min，灌注5min，肝脏变灰白色为止。接着用37℃perfusion Solution II灌注肝脏，流速7mL/min，灌注7min。灌注完成后，取下肝脏置于Solution III(10％FBS low-glucose DMEM，4℃)终止消化，镊子划破肝脏包膜，轻轻抖动释放肝细胞。用70μm细胞滤器过滤肝细胞，50g离心2min后弃上清。用Solution IV(40％percoll low-glucose DMEM，4℃)重悬细胞，100g离心2min后弃上清。加入2％FBS low-glucose DMEM重悬细胞，备用。台盼蓝染色鉴定细胞活力。
三、测定GalNAc结合曲线和Kd值
将新鲜分离的小鼠原代肝细胞铺到96孔板中，2×104个/孔，100μl/孔。每孔分别加GalNAc-siRNA或siRNA(以不连GalNAc的siRNA为阴性对照)。每条GalNAc-siRNA设置终浓度0.9nM、8.3nM、25nM、50nM、100nM、150nM。4℃孵育2h后50g离心2min，弃上清。10μg/ml PI重悬细胞，染色10min后50g离心2min。用预冷的PBS洗细胞，50g离心2min后弃上清。PBS重悬细胞。流式细胞仪测定活细胞平均荧光强度MFI，GraphPad Prism5软件进行非线性拟合及Kd值计算。表8和图1的数据表明，配体修饰的GalNAc-siRNA在不加转染试剂的情况下促使体外肝细胞内吞/摄取，实现了对肝细胞的递送。同时不同GalNac结构的GalNAc-siRNA呈现出的细胞内吞和与受体结合能力有一定的差异。另从Bmax和Kd值判断2S、3S、4S、2L、3L、4L结构的GalNAc-siRNA与肝细胞的亲和能力较好。
表8各实验组Kd值和Bmax值
| P5G11-12L | P5G11-13L | P5G11-14L | P5G11-12S | P5G11-13S | P5G11-14S | |
| Bmax | 138360 | 90445 | 74461 | 87536 | 66276 | 81090 |
| Kd | 18.9 | 9.6 | 8.4 | 17.6 | 9.7 | 8.7 |
注：表中各GalNAc-siRNA的结构如表9所示。
表9靶向性检测的GalNAc-siRNA序列结构
注：P5G11-10中折线后的1表示经过荧光标记修饰；折线后的0表示没有经过靶向配体修饰；P5G11-13L中折线后的1表示经过荧光标记修饰；折线后的3L表示靶向配体修饰为3个L(LLL)，其它标注依次类推。结构中标注有“Cy5/-”的反义链，表示该反义链的5’端修饰有荧光基团Cy5。
实施例4、GalNAc-siRNA体外有效性检测
一、小鼠原代肝细胞中mRNA表达水平检测
24孔板预先用collagenI，rat tail包被，将新鲜分离的小鼠原代肝细胞铺到24孔板中，1×105个/孔，体积800μl/孔。每孔分别加入GalNAc-siRNA，GalNAc-siRNA设置终浓度为500nM。将细胞置于细胞培养箱培养48小时后，Q-PCR检测PCSK9mRNA表达。由结果可知(表10)，GalNAc-siRNA可通过内吞方式进入肝细胞并沉默PCSK9基因的表达。
2、Huh7细胞中mRNA表达水平检测
检测步骤参见实施例一，GalNAc-siRNA转染终浓度为50nM。
表10GalNAc–siRNA体外抑制活性
| 小鼠原代细胞(不加转染试剂)REL | Huh7细胞(加转染试剂)REL | |
| NC-03L | 1 | 1 |
| NC-03S | 1 | 1 |
| P5G11-03L | 0.80 | 0.19 |
| P5G11-03S | 0.72 | 0.17 |
| P5G17-03L | 0.81 | 0.18 |
| P5G17-03S | 0.77 | 0.16 |
注：P5G11-03L和P5G17-03L以NC-03L为对照，P5G11-03S和P5G17-03S以NC-03S为对照。各siRNA的结构如表11所示。
表11有效性检测的GalNAc-siRNA序列结构
注：P5G11-03L中折线后的0表示未经过荧光标记修饰；折线后的3L表示靶向配体修饰为3个L(LLL)，其它标注依此类推。
实施例5、体内肝脏靶向性试验
试验采用雄性、6～7周龄的SPF级Balb/c-nu小鼠24只(北京维通利华实验动物有限公司)，随机分成7组，空白对照组、P5G11-10组、P5G17-10组、P5G11-13L组、P5G11-13S组、P5G17-13L组、P5G17-13S组。各组动物数分别为2、3、3、4、4、4、4只，尾静脉注射给药，给药剂量约为10mg/kg(实验设计见表12)。药前、给药后15min、30min、1h、2h、4h、6h对所有动物进行活体成像，包括白光和X光成像。药后6小时安乐死后，取出脑、唾液腺、心脏、脾脏、肺脏、肝脏、肾脏和肠道进行离体器官成像(图2和图3)。
表12肝靶向实验设计
| 序号 | 组别 | 供试品 | 给药剂量(mg/kg) | 给药体积(mL) |
| 1 | 空白对照组 | 生理盐水 | 0 | 0.2 |
| 2 | NC1 | P5G11-10 | 10 | 0.2 |
| 3 | NC2 | P5G17-10 | 10 | 0.2 |
| 4 | 阳性组 | P5G11-13L | 10 | 0.2 |
| 5 | 阳性组 | P5G11-13S | 10 | 0.2 |
| 6 | 阳性组 | P5G17-13L | 10 | 0.2 |
| 7 | 阳性组 | P5G17-13S | 10 | 0.2 |
离体成像分析(表13-表14)结果显示，给药后6小时，P5G11-13L、P5G11-13S、P5G17-13L和P5G17-13S组肝脏的荧光强度均高于阴性对照组。结果表明，P5G11-13L、P5G11-13S、P5G17-13L和P5G17-13S对肝脏均有一定靶向性。
表13扣除背景后离体器官荧光强度值统计结果(×108ps/mm2)
表14荧光强度比值结果
| 脏器 | 唾液腺 | 肝脏 | 肾脏 | 肠道 |
| P5G11-13L/P5G11-10 | 0.95 | 2.89 | 0.74 | 0.98 |
| P5G11-13S/P5G11-10 | 0.75 | 4.52 | 0.88 | 1.15 |
| P5G17-13L/P5G17-10 | 0.99 | 2.22 | 1.40 | 1.20 |
| P5G17-13S/P5G17-10 | 1.15 | 3.07 | 1.00 | 1.31 |
实施例6、体内有效性检测
试验采用雄性、6～7周周龄的SPF级C57/B6小鼠(北京维通利华实验动物有限公司)，随机分组，每组4只，尾静脉注射给药(给药分组见表15)。给药3天和14天后，眼球后部放血收集0.25ml血液(采血后1h内送检)；随后安乐死小鼠，收集肝脏液氮中冷冻，-80℃下保存备用。将收集的肝脏用于PCSK9-mRNA水平检测，收集的血液用于LDL-C(低密度脂蛋白胆固醇)检测。
表15给药分组
| 编号 | 组别 | 试剂 | 给药剂量 | 给药体积(mL) |
| 1 | 空白对照 | 生理盐水 | 0 | 0.2 |
| 2 | NC3 | P5G11 | 33mg/kg | 0.2 |
| 3 | NC4 | P5G17 | 33mg/kg | 0.2 |
| 4 | 低剂量 | P5G11-13L-L | 3mg/kg | 0.2 |
| 5 | 中剂量 | P5G11-13L-M | 10mg/kg | 0.2 |
| 6 | 高剂量 | P5G11-13L-H | 33mg/kg | 0.2 |
| 7 | 低剂量 | P5G11-13S-L | 3mg/kg | 0.2 |
| 8 | 中剂量 | P5G11-13S-M | 10mg/kg | 0.2 |
| 9 | 高剂量 | P5G11-13S-H | 33mg/kg | 0.2 |
| 10 | 低剂量 | P5G17-13L-L | 3mg/kg | 0.2 |
| 11 | 中剂量 | P5G17-13L-M | 10mg/kg | 0.2 |
| 12 | 高剂量 | P5G17-13L-H | 33mg/kg | 0.2 |
| 13 | 低剂量 | P5G17-13S-L | 3mg/kg | 0.2 |
| 14 | 中剂量 | P5G17-13S-M | 10mg/kg | 0.2 |
| 15 | 高剂量 | P5G17-13S-H | 33mg/kg | 0.2 |
注：-L表示低剂量，-M表示中剂量，-H表示高剂量。
一、PCSK9-mRNA检测
1、方法
挑取绿豆大小的冻存小鼠肝脏组织全自动研磨机研磨。Trizol法提取小鼠肝脏组织中的总RNA，K550测定RNA纯度及浓度。使用qRT-PCR Starter Kit(广州市锐博生物科技有限公司)检测PCSK9基因的mRNA表达水平，并作组间比较。
2、结果
实验结果显示(表16)，低剂量组(3mg/kg)、中剂量组(10mg/kg)、高剂量组(33mg/kg)中PCSK9基因mRNA相对表达量均显著低于空白组，且差异具有统计学意义(P<0.01)。此外，相对空白组，各剂量的GalNAc-siRNA在在给药3天后下调至少75％的mRNA水平，给药14天后下调至少65％的mRNA水平，暗示该药物可能允许低频率的给药，从而便利患者。同时表明本发明的siRNA可显著下调小鼠肝脏中PCSK9基因的mRNA表达水平，且随药物剂量升高，下调幅度加大，存在剂量效应关系。
表16 GalNac-siRNA体内抑制活性(相对于空白生理盐水组)
二、LDL-C检测
1、方法
(1)分离血清：取200μL血液，4000rpm离心取上清待检测。
(2)生化仪检测：迈瑞BS-490生化仪检测LDL-C水平。
2、结果
结果(表17和表18)表明，不同剂量GalNAc-siRNA在小鼠体内具有靶向性，给药3-28天后的LDL-C(低密度脂蛋白胆固醇)、TC(血清总胆固醇)浓度与空白组(生理盐水)相比均有降低且具有一定程度的剂量依赖性。其中高剂量组给药3天后的LDL-C浓度可降低至少32％，TC浓度可降低至少23％；高剂量组给药14天后的LDL-C浓度可至少降低28％,TC浓度可降低至少23％；高剂量组给药28天后的LDL-C浓度可至少降低18％，TC浓度可至少降低17％。
表17 GalNAc-siRNA对LDL-C浓度(mmol/L)的影响
表18 GalNAc-siRNA对TC浓度(mmol/L)的影响
<110> 广州市锐博生物科技有限公司
<120> 一种修饰的siRNA分子及其应用
<130> GNCLN171642
<160> 83
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 各核苷酸均经2’OMe修饰
<400> 1
cccaugucga cuacaucgau u 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 各核苷酸均经2’OMe修饰
<400> 2
ucgauguagu cgacaugggg c 21
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 各核苷酸均经2’OMe修饰
<400> 3
gaggaggacu ccucugucuu u 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 各核苷酸均经2’OMe修饰
<400> 4
agacagagga guccuccucg a 21
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 各核苷酸均经2’OMe修饰
<400> 5
ggcagagacu gauccacuuu u 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 各核苷酸均经2’OMe修饰
<400> 6
aaguggauca gucucugccu c 21
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 各核苷酸均经2’OMe修饰
<400> 7
gggucauggu caccgacuuu u 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
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<222> (20)..(21)
<223> PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 各核苷酸均经2’OMe修饰
<400> 8
aagucgguga ccaugacccu g 21
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 各核苷酸均经2’OMe修饰
<400> 9
ggucuggaau gcaaagucau u 21
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 各核苷酸均经2’OMe修饰
<400> 10
ugacuuugca uuccagaccu g 21
<210> 11
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 各核苷酸均经2’OMe修饰
<400> 11
caggucugga augcaaaguu u 21
<210> 12
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 各核苷酸均经2’OMe修饰
<400> 12
acuuugcauu ccagaccugg g 21
<210> 13
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 各核苷酸均经2’OMe修饰
<400> 13
ccagcaagug ugacagucau u 21
<210> 14
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 各核苷酸均经2’OMe修饰
<400> 14
ugacugucac acuugcuggc c 21
<210> 15
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 各核苷酸均经2’OMe修饰
<400> 15
gguggaggug uaucuccuau u 21
<210> 16
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
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<222> (20)..(21)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 各核苷酸均经2’OMe修饰
<400> 16
uaggagauac accuccacca g 21
<210> 17
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 各核苷酸均经2’OMe修饰
<400> 17
ggacccgcuu ccacagacau u 21
<210> 18
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 各核苷酸均经2’OMe修饰
<400> 18
ugucugugga agcggguccc g 21
<210> 19
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(7)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(25)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<400> 19
cauaggccug gaguuuauuc ggaaa 25
<210> 20
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 20
uuuccgaaua aacuccaggc cuaug 25
<210> 21
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(7)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(25)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<400> 21
gcacccucau aggccuggag uuuau 25
<210> 22
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 22
auaaacucca ggccuaugag ggugc 25
<210> 23
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<212> RNA
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(7)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(25)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<400> 23
cacccucaua ggccuggagu uuauu 25
<210> 24
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 24
aauaaacucc aggccuauga gggug 25
<210> 25
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(7)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(25)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<400> 25
caccaagauc cugcaugucu uccau 25
<210> 26
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 26
auggaagaca ugcaggaucu uggug 25
<210> 27
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(25)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<400> 27
ccugcauguc uuccauggcc uucuu 25
<210> 28
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 28
aagaaggcca uggaagacau gcagg 25
<210> 29
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(7)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(25)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<400> 29
acaggccagc aagugugaca gucau 25
<210> 30
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 30
augacuguca cacuugcugg ccugu 25
<210> 31
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(7)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(25)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<400> 31
gggcucccug auuaauggag gcuua 25
<210> 32
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 32
uaagccucca uuaaucaggg agccc 25
<210> 33
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(7)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(25)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<400> 33
ggaggcuuag cuuucuggau ggcau 25
<210> 34
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 34
augccaucca gaaagcuaag ccucc 25
<210> 35
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 各核苷酸为脱氧核糖核苷酸
<400> 35
gccuggaguu uauucggaat t 21
<210> 36
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 各核苷酸为脱氧核糖核苷酸
<400> 36
uuccgaauaa acuccaggct t 21
<210> 37
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 37
gguggaggug uaucuccua 19
<210> 38
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 38
uaggagauac accuccacca g 21
<210> 39
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 39
cuggcuuccu ggugaagau 19
<210> 40
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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aucuucacca ggaagccagg a 21
<210> 41
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 41
gacaacacgu guguaguca 19
<210> 42
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 42
ugacuacaca cguguugucu a 21
<210> 43
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 43
gcaccugcuu ugugucaca 19
<210> 44
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 44
ugugacacaa agcaggugcu g 21
<210> 45
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 45
ggcagagacu gauccacuu 19
<210> 46
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 46
aaguggauca gucucugccu c 21
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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ggucuggaau gcaaaguca 19
<210> 48
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 48
ugacuuugca uuccagaccu g 21
<210> 49
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 49
gugucacaga gugggacau 19
<210> 50
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
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<210> 51
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 51
cagcaagugu gacagucau 19
<210> 52
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 52
augacuguca cacuugcugg c 21
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 53
caggucugga augcaaagu 19
<210> 54
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 54
acuuugcauu ccagaccugg g 21
<210> 55
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 55
cccaugucga cuacaucga 19
<210> 56
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 56
ucgauguagu cgacaugggg c 21
<210> 57
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 57
cuagacacca gcauacaga 19
<210> 58
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 58
ucuguaugcu ggugucuagg a 21
<210> 59
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 59
gccuggaguu uauucggaa 19
<210> 60
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 60
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<210> 61
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 61
auaaacucca ggccuaugag gg 22
<210> 62
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 62
auaaacucca ggccuauga 19
<210> 63
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 经2'OMe修饰
<400> 63
auaaacucca ggccuaugag ggugc 25
<210> 64
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 脱氧核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 经2'OMe修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(8)
<223> 各核苷酸均为脱氧核糖核苷酸
<400> 64
auaaactcca ggccuaugag ggugc 25
<210> 65
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 脱氧核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 经2'OMe修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(8)
<223> 各核苷酸均为脱氧核糖核苷酸
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auaaactcca ggccuaugag gg 22
<210> 66
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
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<222> (1)..(1)
<223> 脱氧核糖核苷酸
<220>
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<222> (2)..(2)
<223> 经2'OMe修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(8)
<223> 各核苷酸均为脱氧核糖核苷酸
<400> 66
auaaactcca ggccuauga 19
<210> 67
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(9)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> 经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> 经2'F修饰
<400> 67
auaaacucca ggccuaugag ggugc 25
<210> 68
<211> 25
<212> RNA
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<220>
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<222> (1)..(1)
<223> 脱氧核糖核苷酸
<220>
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<222> (2)..(2)
<223> 经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(8)
<223> 各核苷酸均为脱氧核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> 经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> 经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> 经2'F修饰
<400> 68
auaaactcca ggccuaugag ggugc 25
<210> 69
<211> 25
<212> RNA
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(25)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<400> 69
gcacccucau aggccuggag uuuau 25
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<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(7)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<220>
<221> misc_feature
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<223> 经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> 经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
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<223> 经2'OMe修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> 经2'OMe修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(25)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<400> 70
gcacccucau aggccuggag uuuau 25
<210> 71
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 71
ucauaggccu ggaguuuau 19
<210> 72
<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223>
<400> 72
auaaacucca ggccuaugag g 21
<210> 73
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(5)
<223> 各核苷酸通过PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(5)
<223> 各核苷酸均为脱氧核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(9)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> 各核苷酸通过PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<400> 73
auaaacucca ggccuaugag g 21
<210> 74
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(5)
<223> 各核苷酸通过PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(5)
<223> 各核苷酸均为脱氧核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(10)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> 经2'OMe修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
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<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> 各核苷酸通过PS骨架连接
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auaaacucca ggccuaugag g 21
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<211> 21
<212> RNA
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<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(7)
<223> 各核苷酸通过PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(12)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(14)
<223> 各核苷酸通过PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
<223> 各核苷酸均为脱氧核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<222> (17)..(19)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> 各核苷酸通过PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<400> 75
auaaactcca ggccuaugag g 21
<210> 76
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(7)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(10)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
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<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 经2'OMe修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(16)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(19)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<400> 76
ucauaggccu ggaguuuau 19
<210> 77
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(5)
<223> 各核苷酸通过PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(5)
<223> 各核苷酸均为脱氧核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(9)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> 各核苷酸通过PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<400> 77
auaaacucca ggccuaugag g 21
<210> 78
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(5)
<223> 各核苷酸通过PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(5)
<223> 各核苷酸均为脱氧核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(9)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(19)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> 各核苷酸通过PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<400> 78
auaaacucca ggccuaugag g 21
<210> 79
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(5)
<223> 各核苷酸通过PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(5)
<223> 各核苷酸均为脱氧核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(10)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(19)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> 各核苷酸通过PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<400> 79
auaaacucca ggccuaugag g 21
<210> 80
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(5)
<223> 各核苷酸通过PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(5)
<223> 各核苷酸均为脱氧核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(9)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(15)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> 经2'OMe修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(19)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> 各核苷酸通过PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<400> 80
auaaacucca ggccuaugag g 21
<210> 81
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 81
gcacccucau aggccuggag uuuau 25
<210> 82
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5’末端经Cy5修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(5)
<223> 各核苷酸通过PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(5)
<223> 各核苷酸均为脱氧核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(9)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> 各核苷酸通过PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<400> 82
auaaacucca ggccuaugag g 21
<210> 83
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5’末端经Cy5修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(5)
<223> 各核苷酸通过PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(5)
<223> 各核苷酸均为脱氧核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(9)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(15)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> 经2'OMe修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(19)
<223> 各核苷酸均经2'F修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> 各核苷酸通过PS骨架连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 各核苷酸均经2'OMe修饰
<400> 83
auaaacucca ggccuaugag g 21
Claims (6)
1.一种抑制PCSK9基因表达的siRNA分子，其特征在于：所述siRNA分子的正义链结构如(A1)所示；所述siRNA分子的反义链结构如(A2)或(A3)或(A4)所示；
(A1)mUmCmAfUmAmGmGfCfCfUmGmGfAmGfUfUmUmAmU；
(A2)fAfU(s)dA(s)dA(s)dAfCfUfCfCAGGfCfCfUAfUGA(s)mG(s)mG；(A3)fAfU(s)dA(s)dA(s)dAfCfUfCfCfAGGfCfCfUAfUfGfA(s)mG(s)mG；(A4)
fAfU(s)dA(s)dA(s)dAfCfUfCfCAfGfGfCfCfUmAfUfGfA(s)mG(s)mG；
其中，dA表示脱氧核糖核苷酸A；mA、mU、mC和mG分别表示经2′-O-甲基修饰的核糖核苷酸A、U、C和G；fA、fU、fC和fG分别表示经2′-氟代修饰的核糖核苷酸A、U、C和G；(s)表示前后两个核苷酸由硫代磷酸骨架连接。
2.根据权利要求1所述的siRNA分子，其特征在于：所述siRNA分子还经配体修饰，所述配体修饰为对所述siRNA分子的3’末端进行3个N-乙酰半乳糖胺衍生物修饰；
单个所述N-乙酰半乳糖胺衍生物的结构如式I所示：
其中，n为3或8。
3.根据权利要求2所述的siRNA分子，其特征在于：所述siRNA分子的正义链结构如(B2)所示；所述siRNA分子的反义链结构如(B4)或(B5)或(B6)或(B7)所示；
(B2)mUmCmAfUmAmGmGfCfCfUmGmGfAmGfUfUmUmAmU-ZZZ；
(B4)
Cy5/-fAfU(s)dA(s)dA(s)dAfCfUfCfCAGGfCfCfUAfUGA(s)mG(s)mG；(B5)
Cy5/-fAfU(s)dA(s)dA(s)dAfCfUfCfCAfGfGfCfCfUmAfUfGfA(s)mG(s)mG；
(B6)fAfU(s)dA(s)dA(s)dAfCfUfCfCAGGfCfCfUAfUGA(s)mG(s)mG；(B7)
fAfU(s)dA(s)dA(s)dAfCfUfCfCAfGfGfCfCfUmAfUfGfA(s)mG(s)mG；
其中，dA表示脱氧核糖核苷酸A；mA、mU、mC和mG分别表示经2′-O-甲基修饰的核糖核苷酸A、U、C和G；fA、fU、fC和fG分别表示经2′-氟代修饰的核糖核苷酸A、U、C和G；(s)表示前后两个核苷酸由硫代磷酸骨架连接；
单个Z的结构如权利要求2中的式I所示；ZZZ表示三个相连的Z，相邻的两个Z通过磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键相连；ZZZ通过磷酸二酯键或硫代磷酸二酯键与siRNA正义链核苷酸序列的3'末端核苷酸连接。
4.根据权利要求3所述的siRNA分子，其特征在于：在所述ZZZ中，三个Z结构中n的取值相等。
5.与权利要求1-4中任一所述siRNA相关的生物材料，为如下任一：
(B)能够表达权利要求1-4中任一所述的siRNA的载体；
(C)试剂或试剂盒，含有权利要求1-4中任一所述的siRNA或(B)中所述载体；
(D)药物组合物，由权利要求1-4中任一所述的siRNA分子和药学上可接受的其它组分组成。
6.应用，为如下任一：
(I)权利要求1-4中任一所述的siRNA或权利要求5所述的生物材料在制备用于抑制PCSK9基因表达的产品中的应用；
(II)权利要求1-4中任一所述的siRNA或权利要求5所述的生物材料在制备用于降低血清中低密度脂蛋白和/或低密度脂蛋白胆固醇浓度的产品中的应用；
(III)权利要求1-4中任一所述的siRNA或权利要求5所述的生物材料在制备用于预防和/或治疗由PCSK9基因介导的疾病的产品中的应用；
(IV)权利要求1-4中任一所述的siRNA或权利要求5所述的生物材料在制备用于缓解由PCSK9基因介导的疾病的症状的产品中的应用；所述由PCSK9基因介导的疾病为心血管疾病或肿瘤性疾病；所述心血管疾病为哺乳动物的高脂血症、高胆固醇血症、非家族性高胆固醇血症、多基因高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症、纯合性家族性高胆固醇血症或杂合性家族性高胆固醇血症；所述肿瘤性疾病为与PCSK9有关的黑色素瘤或转移性肝癌。
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