CN109953999B - 由灵芝多糖、猪苓多糖组成的具有免疫增强作用的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种由灵芝多糖、猪苓多糖组成的具有免疫增强作用的组合物及其用途。该多糖组合物包含灵芝多糖和猪苓多糖，组合物中的灵芝多糖和猪苓多糖之间具有配伍功效，二者协同作用，显著提高了机体的NK细胞活力、巨噬细胞的功能以及显著增强机体的免疫力。

Description

由灵芝多糖、猪苓多糖组成的具有免疫增强作用的组合物

技术领域

本发明属于保健品领域，具体涉及由灵芝多糖、猪苓多糖组成的具有免疫增强作用的组合物，更具体地，涉及食用菌多糖组合物、多糖组合物在制备食品、药品或保健品中的用途、多糖组合物在制备试剂盒中的用途以及具有免疫增强作用的食品、保健品或药品。

背景技术

免疫系统是机体避免疾病的防御系统，在维持机体内环境和生理平衡上起到重要的作用。免疫功能低下时，机体容易出现身体疲乏睡眠质量差、食欲下降，此外免疫功能低下容易诱发与细菌、病毒、真菌相关感染等。利用天然药植物开发天然增强机体免疫功能具有明显优势。

食用菌是餐桌上备受欢迎的美食，同时食用菌具有丰富的营养价值。研究表明，食用菌中含有多种功效成分是研发天然药物或保健品的优势原料，具有高效，毒副作用小或无毒，不易产生抗药性等特点。研究表明，从食用菌中提取的生物活性物质，如多糖、核苷类、三萜类和矿物质等，具有抗氧化、抗癌、治疗糖尿病、抗过敏、心血管保护、抗病毒、抗菌和寄生虫、解毒以及肝脏保护的功能。

灵芝是一种传统的食药菌，在中国、日本等亚洲国家被当作促进健康和长寿的药物已有数千年的使用历史，传统中医理论认为，灵芝具有补气安神，扶正固本的功效。灵芝中所含多糖是其主要有效成分之一，据报道，灵芝多糖具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血脂等广泛的药理作用。灵芝多糖因其广泛的功效，成为了研发保健品和药品的常见天然类原材料。

猪苓也是一种食药两用的真菌类药材，作为我国传统珍贵中药同样具有数千年的使用历史。中医理论认为，猪苓具有利水渗湿的作用。从猪苓中提取的多糖类物质具有抗氧化，抗肿瘤等药理作用。目前猪苓多糖已被做成注射液以及胶囊，与抗肿瘤化疗药物联用增强化疗药的疗效并减少其毒副作用。

灵芝和猪苓均为可食用的蘑菇和应用历史悠久的传统天然药物，均始载于《神农本草经》。《神农本草经》中上品通常作为“君药”，中品为“臣药”，灵芝被列为上品，谓其具有“久食，轻身不老，延年神仙”的功效”，猪苓被列为“中品”，并称其具有“利水道，久服轻身，能不老”的特点。灵芝作为君药，调节机体五脏，补气安神；猪苓作为臣药，通利水道。同时灵芝和猪苓均有延年益寿的作用，二者配伍，具有补而不伤正的特点。该书对灵芝和猪苓的记载，为灵芝和猪苓合用提供理论基础。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

发明人发现，灵芝多糖和猪苓多糖配伍后，组成的制剂可有效用于治疗或改善机体的免疫功能，从灵芝和猪苓中提取的高纯度的水溶性多糖按一定比例组成的组合物在小鼠经口实验中均表现为无毒，具有协同增强免疫作用，可明显提高机体的NK细胞活力，巨噬细胞的功能。

为此，本发明提出一种食用菌多糖组合物。根据本发明的实施例，所述多糖组合物包含灵芝多糖和猪苓多糖。如前所述，根据本发明实施例的食用菌多糖组合物中的灵芝多糖和猪苓多糖之间具有配伍功效，二者协同作用，显著提高了机体的NK细胞活力、巨噬细胞的功能以及显著增强机体的免疫力。

根据本发明的实施例，上述多糖组合物进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述多糖组合物包含3份重量的灵芝多糖和1份重量的猪苓多糖。发明人发现，所述灵芝多糖和猪苓多糖在上述配方下，二者之间的协同作用显著，在提高机体的NK细胞活力、巨噬细胞的功能以及显著增强机体的免疫力方面效果更加显著。

在本发明的第二方面，本发明提出了前面所述的多糖组合物在制备食品、药品或保健品中的用途，所述食品、药品或保健品用于增强机体免疫。利用前面所述的多糖组合物所制备的食品、药品或保健品可显著提高机体的免疫力。

根据本发明的实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述增强机体免疫是通过如下方式的至少之一实现的：

协同增强巨噬细胞的功能；

增强机体迟发性变态反应能力；

明显提高机体的NK细胞活力。

在本发明的第三方面，本发明提出了前面所述的多糖组合物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于下列的至少之一：增强巨噬细胞的功能；提高NK细胞活力。根据本发明实施例的药物组合物可用于科学研究的实验中，用于提高巨噬细胞的功能或提高NK细胞活力，效果显著。

在本发明的第四方面，本发明提出了增强巨噬细胞的功能或提高NK细胞活力的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括将待处理巨噬细胞或NK细胞与前面所述的多糖组合物接触。发明人在实验中发现，当利用前面所述的组合物处理巨噬细胞或NK细胞时，可显著提高巨噬细胞的功能或NK细胞的活力，增强NK细胞的杀伤力。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述待处理细胞为巨噬细胞，所述多糖组合物在反应体系中的浓度为50～200μg/mL。发明人发现，当采用浓度为50～200μg/mL，如100μg/mL或200μg/mL的多糖组合物处理巨噬细胞后，巨噬细胞的吞噬能力显著增强，如50μg/mL或100μg/mL的多糖组合物处理巨噬细胞后，巨噬细胞释放NO显著增强。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种具有免疫增强作用的食品、保健品或药品。根据本发明的实施例，所述食品、保健品或药品包含前面所述的食用菌多糖组合物。根据本发明实施例的食品、保健品或药品，没有毒性，在提高机体免疫力方面效果显著。

根据本发明的实施例，上述食品、保健品或药品还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述食品、保健品或药品还包括食品、保健品或药品可接受的辅料。所述药物与药学上可接受的辅剂成分一起可制成相应制剂，如可以是为颗粒、片剂、胶囊、注射液、口服液。进而有利于食品、保健品或药品的保存或被机体吸收，增加活性成分的有效利用率。

具体实施方式

实施例1

(1)灵芝多糖、猪苓多糖组合物协调增强小鼠巨噬细胞系RAW264.7的吞噬能力。

样品处理与实验方法

分别称取纯度为98％的水溶性灵芝多糖和猪苓多糖200克，溶于50mL细胞培养基中，用0.22nm过滤器过滤，组合物由3份灵芝多糖，1份猪苓多糖组成，制备浓度为4mg/mL的原液，4℃短期储存，-20℃长期储存。

将巨噬细胞系RAW264.7以4×10⁴/孔的数目种于96孔板，细胞培养24小时后，加入不同浓度的多糖溶液(50、100、200μg/mL)和5μg/mL脂多糖LPS，继续培养24小时后，根据中性红试剂盒(碧云天生物公司)提供的说明书处理细胞，在酶标仪上检测560nm处吸光度，用于评价巨噬细胞的吞噬能力。

实验结果

从表1可知，脂多糖LPS(阳性对照)可明显增强巨噬细胞吞噬中性红的能力，差异有显著性(P<0.0001)。与空白对照组比，灵芝多糖、猪苓多糖均能增强巨噬细胞吞噬中性红的能力，在一定浓度范围内呈剂量依耐性。与灵芝多糖比，组合物刺激巨噬细胞的吞噬中性红的能力有增强的趋势。与猪苓多糖组比，组合物刺激巨噬细胞的吞噬中性红的能力增强，并在浓度为100,200μg/mL时，具有显著性(见表1)。在该实验中，若将各浓度的3/4份灵芝多糖平均OD值+1/4份猪苓多糖平均OD值与组合物的平均OD值比较，发现3/4份灵芝多糖平均OD值+1/4份猪苓多糖平均OD值小于组合物的平均OD值(见表2)。本实验表明，灵芝多糖，猪苓多糖能增强巨噬细胞的吞噬能力，由灵芝多糖、猪苓多糖组成的组合物，灵芝多糖、猪苓多糖之间具有协同作用，能够协同增强巨噬细胞功能，其增强巨噬细胞功能的作用显著大于同样质量的单独灵芝多糖和单独猪苓多糖作用效果的加和。

表1：组合物对小鼠巨噬细胞系RAW264.7中性红吞噬能力的影响

注：与空白对照组相比，^*：P<0.05,^**：P<0.01,^***：P<0.001。与同剂量组合物相比，^▲：P<0.05,^▲▲：P<0.01。

表2：3/4份灵芝多糖平均OD值+1/4份猪苓多糖平均OD值与组合物的平均OD值的比较

(2)灵芝多糖、猪苓多糖组合物协调增强小鼠巨噬细胞系RAW264.7产生NO的能力

样品处理和实验方法同前，实验结束后，根据NO试剂盒(碧云天生物公司)提供的说明书处理细胞，并用试剂盒提供的标准品制作标准曲线，在酶标仪上检测560nm处吸光度，通过标准曲线计算各组NO相对释放量，该实验用于评价巨噬细胞释放NO的能力。

实验结果

从表3可知，脂多糖LPS(阳性对照)可明显增强巨噬细胞释放NO的能力，差异有显著性(P<0.0001)。与空白对照组比，灵芝多糖、猪苓多糖均能增强巨噬细胞释放NO的能力，在一定浓度范围内呈剂量依耐性。与灵芝多糖比，组合物刺激巨噬细胞释放NO的能力的趋势。与猪苓多糖组比，组合物刺激巨噬细胞释放NO的能力增强，并在浓度为50，100μg/mL时，具有显著性(P<0.05)(见表3)。在该实验中，若各浓度的3/4份灵芝多糖平均NO释放量+1/4份猪苓多糖平均NO释放量与组合物的平均NO释放量比较，发现3/4份灵芝多糖平均NO释放量+1/4份猪苓多糖平均NO释放量小于组合物的平均NO释放量(见表4)。本实验表明，灵芝多糖，猪苓多糖能增强巨噬细胞释放NO的能力，由灵芝多糖、猪苓多糖组成的组合物，灵芝多糖、猪苓多糖之间具有协同作用，能够协同增强巨噬细胞功能，其增强巨噬细胞功能的作用显著大于同样质量的单独灵芝多糖和单独猪苓多糖作用效果的加和。

表3：组合物对小鼠巨噬细胞系RAW264.7释放NO能力的影响

注：与空白对照组相比，^*：P<0.05,^**：P<0.01,^***：P<0.001。与同剂量组合物相比，^▲：P<0.05。

表4：3/4份灵芝多糖平均NO释放量+1/4份猪苓多糖平均NO释放量与组合物的平均NO释放量的比较

实施例2

灵芝多糖、猪苓多糖组合物对小鼠的免疫调节作用药效试验

1)分组与剂量设计

将组合物(超纯水溶解)配成低、中、高三个浓度：0.0036g/mL、0.012g/mL和0.036g/mL。将动物分为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组每组12只，小鼠的灌胃容量为0.1mL/10g.BW。对照组用超纯水灌胃，各组小鼠每天灌胃1次，0.10mL/10g.BW，连续灌胃30天。灌胃结束，进行各项指标的测定。

2)实验方法和结果

实验方法参照《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)中关于增强免疫功能检测进行。并采用SPSS软件进行单因素方差分析实验结果。

(1)组合物对小鼠细胞免疫功能的影响

小鼠用2％(v/v)SRBC腹腔免疫，每只鼠注射0.2mL(约1×10⁸个SRBC)。4天后，在左后足跖部部位皮下注射20％(v/v)SRBC，每只鼠20μL(约1×10⁸个SRBC)，注射后于24h测量左后足跖厚度，同一部位测量三次，取平均值。实验结果见表5。

表5：组合物对小鼠DTH的影响

注：与溶剂对照组比，^*：P<0.05

结果：与对照组比，中剂量组足趾厚度明显增加，差异具有显著性(P<0.05)。

(2)组合物对小鼠单核—巨噬细胞功能影响

给药30天后，小鼠腹腔注射2％鸡红细胞悬液。间隔30min，颈椎脱处死动物，经腹腔注入生理盐水2mL，轻揉小鼠腹部，剪开腹壁皮肤，吸出腹腔洗液1mL，平均分滴于2片载玻片上；放入湿盒内，37℃孵育30min；用生理盐水漂洗。晾干，以1:1丙酮甲醇溶液固定,4％(v/v)Giemsa-磷酸缓冲液染色3min，再用蒸馏水漂洗晾干，显微镜下进行观察记数。实验结果见表6。

表6：组合物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞功能的影响

注：与溶剂对照组比，^**：P<0.01。a:剔除未观察到鸡红细胞的涂片。

结果：与对照组相比，中、高剂量组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞功能(吞噬率和吞噬指数)与溶剂对照组相比明显增强(P<0.01)。

(3)组合物对小鼠NK细胞活性测定

无菌取脾，制成单细胞悬液。过滤及Hanks液洗2次后，重悬，裂解红细胞后再加入Hanks液。离心去上清；完全培养液重悬，调整细胞浓度为5×10⁶个/mL。取靶细胞(YAC-1细胞)和效应细胞各100μL(效靶比50：1)，加入96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40各100μL；上述各项均设三个平行孔，于37度、5％CO₂培养4h，离心96孔培养板，每孔取上清100μL置96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μL，反应5min，每孔加入1mol/L的HCl 30μL，在酶标仪490nm处测定光密度值。实验结果见表7。

表7：组合物对小鼠NK细胞活性的影响

注：与溶剂对照组比，^**：P<0.01

结果：与空白对照相比，中剂量组小鼠的NK细胞活性与溶剂对照组相比明显增强，其他各剂量组均未见明显变化。

3)结论

小鼠经口给予0.036、0.12和0.36g/kg.BW的组合物30天后，中剂量组小鼠迟发性变态反应能力较溶剂对照组明显增强；中、高剂量组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞功能(吞噬率和吞噬指数)与溶剂对照组相比明显增强；中剂量组小鼠的NK细胞活性与溶剂对照组相比明显增强。检测结果表明，组合物对小鼠的巨噬细胞吞噬功能有明显的增强作用；对NK细胞活性有明显的增强作用。提示组合物具有增强免疫力的作用。

实施例3

大剂量组合物对小鼠的影响

1)实验方法

选用ICR小鼠20只，雌雄各半。按0.2ml/10g体重24小时内经口灌胃给组合物2次(间隔4小时)。组合物给药浓度为4g/ml。组合物给药剂量为16.0g/kg体重(根据大量文献，小鼠药效剂量通常在0.1g/kg左右，相当于小鼠药效剂量的160倍)。动物隔夜禁食16小时后给药，随后观察动物中毒表现、死亡数和死亡时间，每天观察1次，共观察14天。观察期内，分别于给药后的第1、7和14天称量小鼠体重。实验结束后，处死动物并进行大体解剖。

2)实验结果

组合物按16.0g/kg体重给小鼠灌胃，观察期14天内，动物未见明显中毒反应。动物体重增长基本正常(见表8)。动物处死后大体解剖观察，各脏器均未见明显异常。结果表明，两种性别小鼠经口急性毒性LD50均大于16.0g/kg体重。根据保健食品急性毒性分级标准，小鼠经口急性毒性中，组合物属于无毒级。

表8：组合物对小鼠体重的影响

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (6)

1.一种用于增强机体免疫的食用菌多糖组合物，其特征在于，包含3份重量份的灵芝多糖和1份重量份的猪苓多糖。

2.权利要求1所述的多糖组合物在制备食品、药品或保健品中的用途，所述食品、药品或保健品用于增强机体免疫。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述增强机体免疫是通过如下方式的至少之一实现的：

协同增强巨噬细胞的功能；

增强机体迟发性变态反应能力；

明显提高机体的NK细胞活力。

4.权利要求1所述的多糖组合物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于下列的至少之一：

增强巨噬细胞的功能；

提高NK细胞活力。

5.一种具有免疫增强作用的食品、保健品或药品，其特征在于，包含权利要求1所述的食用菌多糖组合物。

6.根据权利要求5所述的食品、保健品或药品，其特征在于，所述食品、保健品或药品还包括食品、保健品或药品可接受的辅料。