CN109943582A - 一种基于多巴胺脱羧酶催化产多巴胺的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于多巴胺脱羧酶催化产多巴胺的方法，该方法具体包括以下步骤：构建表达多巴脱羧酶（DDC）的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a‑DDC；培养基因工程菌BL21（DE3）/pET28a‑DDC并诱导表达DDC；收集上述菌体，用缓冲液重悬菌体后，超声破碎，离心去除杂质，得DDC的粗酶液；以多巴为底物，加入0.1‑1mM磷酸吡哆醛后调节反应体系的pH，加入DDC粗酶液反应得产物多巴胺。本发明方法是首次系统的做出从多巴到多巴胺的酶催化生产工艺，催化效率高达7.4g/l，转化率高达95％以上，环境友好，原料易得，生产成本低，工艺简单，反应条件温和，具有很好的工业化生产前景。
Description
技术领域
本发明属于生物酶催化技术领域，尤其涉及一种基于多巴胺脱羧酶催化产多巴胺的方法。
背景技术
多巴又称二羟苯丙氨酸，左旋多巴，由酪氨酸氧化产生的一种氨基酸，能通过血脑屏障，于体内转变为多巴胺。医疗上用于震颤麻痹症的治疗。
多巴胺为多巴胺受体激动药。多巴胺是脑内一种重要的神经递质，多巴胺能系统与神经精神性疾病密切相关，多巴胺是人体能自行合成的物质、有增强心肌收缩、增加心排血量、升高动脉血压、抗休克作用。由于它的突出生理功能，多巴胺人工合成的成功，使它成为抗休克的合成药物。经临床应用表明，多巴胺对于不同类型的休克均有显著疗效。为当今治疗帕金森病，药物依赖和精神分裂症等中枢神经疾病的药物开发，有着重要的理论研究意义和应用前景。多巴胺的合成难度大，成本高，对产品的纯度要求高，产量较少。因此，提供一种可以有效经济产生多巴胺是非常必要的。
现有技术生产多巴胺的方法，其中化工生产转化率低，成本高，污染严重，生物合成方法周期长，提取困难，本发明方法用的酶催化法，催化效率以及转化率高，环境友好，工业化前景好，是一种新型的酶催化方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于多巴胺脱羧酶催化产多巴胺的方法，该方法绿色环保，且与化学生产方法简单，成本低廉，适合产业化。
为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：
一种基于多巴胺脱羧酶催化产多巴胺的方法，包括以下步骤：
步骤1，构建表达多巴脱羧酶的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-DDC；
步骤2，培养多巴脱羧酶的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-DDC；
步骤3，收集步骤2中的基因工程菌，用pH5-9的缓冲液重悬后，超声破碎仪破碎；离心去除杂质，得到多巴脱羧酶的粗酶液；
步骤4，选取多巴作为底物，加入0.1-1mM磷酸吡哆醛，再添加缓冲溶液调节反应体系的pH至5-9，最后加入多巴脱羧酶粗酶液0.5-2g/l，40-45℃反应0.5h-3h，得到产物多巴胺，反应体系中底物多巴的终浓度不超过6g/l。
当反应结束后，可通过高效液相色谱法进行检测多巴胺。检测方法为Agilent1260 高效液相色谱；采用Agilent TC-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm,5μm）;以0.1%三氟乙酸溶液-乙腈（96:4）为流动相;流速1.0 ml·min-1;检测波长为280nm;柱温:室温。
作为改进的是，步骤1中所述构建表达多巴脱羧酶的基因工程菌的方法如下 ：根据已报导的异色瓢虫来源多巴脱羧酶DDC的氨基酸序列（GenBank: AMQ13055.1）进行密码子优化后，全基因合成该序列，亚克隆到载体pET28a上，获得重组质粒pET28a-DDC，将构建好的重组质粒pET28a-DDC用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到多巴脱羧酶表达菌种BL21（DE3）/pET28a-DDC。
作为改进的是，步骤2中基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-DDC培养方法具体为：挑取表达多巴脱羧酶的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-DDC的单菌落，接种于LB培养基，37℃培养至OD值达到0.6以上，再加入0.5mM的IPTG，18℃培养10-12小时，离心收集表达多巴脱羧酶的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-DDC。
作为改进的是，步骤4中多巴的终浓度量为5g/l，磷酸吡哆醛的添加量为0.4mM，反应体系的pH为6.8-7.0，反应温度为42℃，添加多巴脱羧酶粗酶液浓度为1g/l，反应时间为1h。
进一步改进的是，步骤4中所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、PBS缓冲液或Tris-盐酸缓冲液中一种。
作为改进的是，步骤4中多巴作为底物，初始浓度为2g/l，分次加入反应体系，且终浓度不超过6g/l。
作为改进的是，所述步骤3中超声破碎仪的功率为300W，破碎过程为间歇式破碎。
有益效果：
与现有技术相比，化学工艺中时以香兰素为原料，先与硝基甲烷发生反应，生成的4-羟基-3-甲氧基-β-硝基乙苯（简称硝基物）。硝基物以锌加盐酸作还原剂进行还原反应，制得4-羟基-3-甲氧基乙胺盐（简称还原物），还原物经氢溴酸水解去甲基，再转化成盐酸盐即得多巴胺。在化学合成中，多巴胺的合成难度大，对产品的要求的纯度比较高，产量很小，存在着成本高，污染严重等缺点。本发明一种基于多巴胺脱羧酶催化产多巴胺的方法，在之前从未具体的研究过生物催化过程，本发明方法绿色安全，多巴胺的产量达到7.4g/l,转化率高达95%以上，本发明原料易得，生产成本低工艺简单，反应条件温和，催化效率以及转化率高，环境友好，工业化前景好，生产安全。
附图说明
图1为实施例3中反应结束中产物的高效液相色谱图，其中，1-多巴胺标准品，2-多巴。
具体实施方式
实施例1
构建表达多巴脱羧酶的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-DDC
根据已报导的异色瓢虫来源多巴脱羧酶DDC的氨基酸序列（GenBank: AMQ13055.1）进行密码子优化后（优化处理的步骤委托金斯瑞完成），全基因合成该序列，亚克隆到载体pET28a上，获得重组质粒pET28a-DDC，将构建好的重组质粒pET28a-DDC用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到多巴脱羧酶表达菌种BL21（DE3）/pET28a-DDC。
实施例2
培养表达多巴脱羧酶的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-DDC，并诱导表达
挑取表达多巴脱羧酶的基因工程菌单菌落，接种于LB培养基，置于37℃培养；至OD值达到0.6，IPTG加入量为0.5mM，置于18℃-30℃培养10-12小时；揺瓶发酵结束后，离心收集表达多巴脱羧酶的基因工程菌，备用。将收集到的菌体用相应体积的缓冲液重悬起来，使用超声细胞破碎仪（破碎10min，超声2s，停3s，功率300W），破碎完成后，4000-8000rpm，4℃，离心8-10min获得多巴脱羧酶粗酶液，并用酶标仪测定蛋白浓度。
LB培养基的配方：10g/l蛋白胨，5g/l酵母粉，5g/l氯化钠。
实施例3
催化产多巴胺，具体操作步骤为反应体系为10ml，取初始浓度为2g/l的多巴作为底物，加入0.4mM的PLP，用PBS缓冲液调节体系pH为6.8，再加入1g/l的粗酶浓度，40℃震荡反应，每10-15min补加底物多巴，每次1-3g/l，保证反应过程中终浓度不超过6g/l。反应结束后，利用高效液相色谱法（采用Agilent TC-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm,5μm）；以0.1%三氟乙酸溶液-乙腈（96:4）为流动相；流速1.0 ml·min-1;检测波长为280nm;柱温:室温）检测多巴胺的生成量。多巴胺的产量达到7.4g/l,转化率高达95%以上。
实施例4
除粗酶液的添加量更改为0.5g/l外，其余同实施例3。反应结束后，通过高效液相色谱测得，多巴胺的产量达到7.0g/l,转化率达94%以上。
实施例5
除反应体系的pH为8外，其余同实施例1。反应结束后，通过高效液相色谱检测，多巴胺的产量达到4.0g/l,转化率达89%以上。
实施例6
以多巴为底物，采用步骤2培养的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-DDC直接催化生产多巴胺。除粗酶液更换为1g/l基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-DDC外，其余同实施例1。反应结束后，通过高效液相色谱检测，多巴胺的产量0.5g/l。
实施例7
除底物多巴一次性添加进入反应体系，且初始浓度为5g/l时，其余同实施例1，反应结束后，通过高效液相色谱检测，多巴胺的产量达到5.0g/l,转化率达91%以上。
实施例8
除不含PLP外，其余同实施例1，反应结束后，通过高效液相色谱检测，多巴胺的产量为0。
从实施例3-8的结果可以看出，本发明反应体系在pH为6.8时，催化反应效率好，且PLP是反应体系中不可缺少的添加物。现有技术有化工方法和生物合成方法，化工方法转化率低，成本高，污染严重生物合成方法周期长，提取困难。与现有技术相比，本发明一种生物酶催化产生多巴胺的方法绿色环保，多巴胺的产量达到7.4g/l，转化率高达95%以上，本发明原料易得，生产成本低、工艺简单，反应条件温和，催化效率以及转化率高，环境友好，工业化前景好。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种基于多巴胺脱羧酶催化产多巴胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，构建表达多巴脱羧酶的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-DDC；
步骤2，培养多巴脱羧酶的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-DDC；
步骤3，收集步骤2中的基因工程菌，用pH5-9的缓冲液重悬后，超声破碎仪破碎；离心去除杂质，得到多巴脱羧酶的粗酶液；
步骤4，选取多巴作为底物，加入0.1-1mM磷酸吡哆醛，再添加缓冲溶液调节反应体系的pH至5-9，最后加入多巴脱羧酶粗酶液0.5-2g/l，40-45℃反应0.5h-3h，得到产物多巴胺，反应体系中底物多巴的终浓度不超过6g/l。
2.根据权利要求1所述的一种基于多巴脱羧酶催化产多巴胺的方法，其特征在于，步骤1中所述构建表达多巴脱羧酶的基因工程菌的方法如下 ：根据已报导的异色瓢虫来源多巴脱羧酶（DDC）的氨基酸序列（GenBank: AMQ13055.1）进行密码子优化后，全基因合成该序列，亚克隆到载体pET28a上，获得重组质粒pET28a-DDC，将构建好的重组质粒pET28a-DDC用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到多巴脱羧酶表达菌种BL21（DE3）/pET28a-DDC。
3.根据权利要求1所述的一种基于多巴脱羧酶催化产多巴胺的方法，其特征在于，步骤2中基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-DDC培养方法具体为：挑取表达多巴脱羧酶的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-DDC的单菌落，接种于LB培养基，37℃培养至OD值达到0.6以上，再加入0.5mM的IPTG，18℃培养10-12小时，离心收集表达多巴脱羧酶的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-DDC。
4.根据权利要求1所述的一种基于多巴脱羧酶催化产多巴胺的方法，其特征在于，步骤4中多巴的终浓度量为5g/l，磷酸吡哆醛的添加量为0.4mM，反应体系的pH为6.8-7.0，反应温度为42℃，添加多巴脱羧酶粗酶液浓度为1g/l，反应时间为1h。
5.根据权利要去1所述的一种基于多巴脱羧酶催化产多巴胺的方法，其特征在于，步骤4中所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、PBS缓冲液或Tris-盐酸缓冲液中一种。
6.根据权利要求1所述的一种基于多巴脱羧酶催化产多巴胺的方法，其特征在于，步骤4中多巴作为底物，初始浓度为2g/l，分次加入反应体系，且终浓度不超过6g/l。
7.根据权利要求1所述的一种基于多巴脱羧酶催化产多巴胺的方法，其特征在于，所述步骤3中超声破碎仪的功率为300W，破碎过程为间歇式破碎。
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