CN109939220A - 具有速释和缓释效果的多肽微球及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有速释和缓释效果的多肽微球的制备方法，包括以下步骤：将水溶性多肽与表面活性剂共冻干，得到粉末状共冻干物，然后将所述共冻干物分散于有机溶剂中，得到油相溶液，所述有机溶剂中溶有含有疏水链段的高分子聚合物；将所述油相溶液与高分子聚合物的不良溶剂混匀，形成包裹了高分子聚合物的多肽微球，然后将混合物加入固化剂中，使多肽微球固化完全，得到所述具有速释和缓释效果的多肽微球。本发明采用相分离法进行多肽微球的制备，避免极性溶剂的使用，有效提高安全性，所制备的微球同时兼备速释与缓释效果。

Description

具有速释和缓释效果的多肽微球及其制备方法

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，尤其涉及一种具有速释和缓释效果的多肽微球及其制备方法。

背景技术

多肽蛋白类药物通常因其稳定性及半衰期等原因，需要长期频繁注射给药，造成患者顺应性差。近年来缓控释制剂发展迅速，多肽蛋白类药物的缓控释长效注射制剂的开发也取得了一定的进展，主要有埋植剂和微球注射制剂两大类。

将蛋白多肽类药物制备成为微球可以达到掩味，提高蛋白多肽类药物的稳定性，制剂靶向性的作用，可延长药物作用时间，进而提高疗效。微球制备方法通常有乳化溶剂挥发法、相分离法、热熔挤出法和喷雾干燥法。

热熔挤出法由于对温度有较高的要求，较少用于蛋白多肽这类不稳定的药物的微球制备，此外，喷雾干燥法由于其收率低、损失较大的原因并不适用于价值较高的蛋白多肽类药物。复乳化溶剂挥发法是蛋白多肽类药物微球制备的常用方法，然而，载药量与包封率较低及突释较高的问题是该法最常见的问题，如中国发明专利CN104010629中醋酸曲普瑞林微球突释作用过大，会带来很多副作用。相分离法的应用可以有效提高载药量与包封率，但是通常水溶性蛋白多肽类药物的分散情况会显著影响所得微球的载药量、包封率以及释放情况。

中国发明专利CN201811434326公布了一种多肽微球及其制备方法，以相分离法制备多肽微球，但该工艺中采用极性溶剂如冰乙酸和二甲亚砜来溶解蛋白多肽类药物。根据2015版中国药典说明，冰乙酸(醋酸)和二甲亚砜均为第三类溶剂，均需要通过残留溶剂的检测来证明其安全性，存在较大的安全问题。另外，该专利所示释放图初期释放过低，注射后起效缓慢。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种具有速释和缓释效果的多肽微球及其制备方法，本发明采用相分离法进行多肽微球的制备，避免极性溶剂的使用，有效提高安全性，所制备的微球同时兼备速释与缓释效果。

为了实现上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种具有速释和缓释效果的多肽微球的制备方法，包括以下步骤：

(1)将水溶性多肽与表面活性剂共冻干，得到粉末状共冻干物，然后将所述共冻干物分散于有机溶剂中，得到油相溶液，所述有机溶剂中溶有含有疏水链段的高分子聚合物；

(2)将所述油相溶液与高分子聚合物的不良溶剂混匀，形成包裹了高分子聚合物的多肽微球，然后将混合物加入固化剂中，使多肽微球固化完全，得到所述具有速释和缓释效果的多肽微球。

进一步地，在步骤(1)中，所述水溶性多肽选自曲普瑞林或其盐、戈舍瑞林或其盐、亮丙瑞林或其盐、布舍瑞林或其盐、奥曲肽或其盐、艾塞那肽或其盐、兰瑞肽或其盐、利拉鲁肽或其盐、胸腺五肽和生长激素中的一种或几种。

优选地，水溶性多肽选自曲普瑞林或其盐。更优选地，水溶性多肽为醋酸曲普瑞林。

进一步地，在步骤(1)中，所述表面活性剂选自多元醇型共聚物、聚氧乙烯型共聚物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物中的一种或几种。

优选地，表面活性剂选自聚山梨酯、卖泽、苄泽和泊洛沙姆中的一种或几种。

更优选地，表面活性剂选自聚山梨酯，如吐温80或吐温20。

进一步地，在步骤(1)中，冻干过程中，所采用的冷冻干燥机的冷阱温度为-50℃至-60℃，冻干压力为0.01-0.52mbar。将水溶性多肽与表面活性剂共冻干，可以使多肽的比表面积增大，使得到的微球形态良好。

进一步地，在步骤(1)中，所述水溶性多肽、表面活性剂和高分子聚合物的质量比为1:0.01～0.43:2～40。

优选地，水溶性多肽与表面活性剂的质量比为1:0.01～0.43。当表面活性剂的用量过高时，微球制备过程中相对更为黏稠，所得到的微球之间会有较多黏连，测得粒径因团聚而增大，微球形态差。

进一步地，在步骤(1)中，所述有机溶剂选自二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮和甲基乙基酮中的一种或几种。

优选地，有机溶剂选自二氯甲烷或乙酸乙酯。

进一步地，在步骤(1)中，所述高分子聚合物选自丙交酯-乙交酯共聚物、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-聚乙二醇(PLGA)和聚己内酯中的一种或几种。

优选地，高分子聚合物选自丙交酯-乙交酯共聚物或聚乳酸。丙交酯-乙交酯共聚物中的单体比例为50:50～85:15，丙交酯-乙交酯共聚物的分子量为10000～60000g/mol。

进一步地，在步骤(2)中，不良溶剂选自二甲基硅油和/或液体石蜡。

进一步地，在步骤(2)中，在转速为400～1200rpm条件下将油相溶液与高分子聚合物的不良溶剂混匀。

进一步地，在步骤(2)中，油相溶液和不良溶剂的比例为2:1～1:1。

进一步地，在步骤(2)中，所述固化剂选自正庚烷、正辛烷和正己烷中的一种或几种。

进一步地，在步骤(2)中，在转速为200～600rpm条件下将混合物加入固化剂中进行固化。

本发明的第二个目的是提供一种采用上述制备方法所制备的具有速释和缓释效果的多肽微球，其特征在于：包括水溶性多肽以及包裹在水溶性多肽表面的高分子聚合物，所述高分子聚合物中含有疏水链段，所述多肽微球的粒径的中位径为40～100μm，所述多肽微球中的水溶性多肽的释放率为前期速释，后期缓释。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明将水溶性多肽与表面活性剂共冻干，其共冻干物直接分散于含高分子聚合物的油相溶液中，采用相分离法进行多肽微球的制备。首先，未采用极性溶剂溶解水溶性多肽，提高了制剂的安全性；其次，采用合理的表面活性剂，与水溶性多肽以合适的质量比共冻干，使得微球形态良好，不粘连，不成块。本发明采用水溶性多肽与表面活性剂共冻干的方法，并结合相分离法制备微球，很好地解决了微球释放中突释过高或过低而导致的疗效问题。

采用本发明的方法所制备的多肽微球，能有效改善多肽的释放在多肽微球释放前期为速释阶段，达到药效，后期为缓释阶段，维持血药浓度。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1为实施例1制备的醋酸曲普瑞林缓释微球的扫描电镜图(800×)；

图2为实施例1制备的醋酸曲普瑞林缓释微球的体外释放曲线；

图3为实施例2制备的醋酸曲普瑞林缓释微球的体外释放曲线；

图4为实施例4制备的醋酸曲普瑞林缓释微球的体外释放曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

称取15mg醋酸曲普瑞林与2mg吐温80共冻干，冷阱温度为-50℃，冻干压力为0.52mbar。称取500mg的PLGA溶于20g二氯甲烷中，将得到的共冻干物直接分散在PLGA的二氯甲烷溶液中，超声分散后，以1000rpm的转速搅拌并加入12.5g二甲基硅油，使得PLGA包裹于醋酸曲普瑞林的表面。然后将所得混合物加至750mL正庚烷浴中，以400rpm的转速固化，固化30min。静置，待悬浮物沉底后，移去上层澄清正庚烷，用石油醚洗涤三次，干燥，收集多肽微球。

实施例2

称取15mg醋酸曲普瑞林与4mg吐温80共冻干，冷阱温度为-50℃，冻干压力为0.52mbar。称取500mg的PLGA溶于20g二氯甲烷中，将共冻干物直接分散在PLGA的二氯甲烷溶液中，超声分散后，以1000rpm的转速搅拌并加入12.5g二甲基硅油，然后将所得混合物加至750mL正庚烷浴中，以400rpm的转速固化，固化30min。静置，待悬浮物沉底后，移去上层澄清正庚烷，用石油醚洗涤三次，干燥，收集多肽微球。

实施例3

称取40mg艾塞那肽与2mg吐温20共冻干，冷阱温度为-60℃，冻干压力为0.37mbar。称取400mg的PLA溶于20g乙酸乙酯中，将共冻干物直接分散在PLA的乙酸乙酯溶液中，超声分散后，以1000rpm的转速搅拌并加入12.5g二甲基硅油，然后将所得混合物加至750mL正庚烷浴中，以400rpm的转速固化，固化30min。静置，待悬浮物沉底后，移去上层澄清正庚烷，用石油醚洗涤三次，干燥，收集多肽微球。

实施例4

本实施例作为对比例：称取500mg的PLGA溶于20g二氯甲烷中，称取15mg醋酸曲普瑞林直接分散在PLGA的二氯甲烷溶液中，超声分散后，以1000rpm的转速搅拌并加入12.5g二甲基硅油，然后将所得混合物加至750mL正庚烷浴中，以400rpm的转速固化，固化30min。静置，待悬浮物沉底后，移去上层澄清正庚烷，用石油醚洗涤三次，干燥，收集多肽微球。

测试例1微球粒径测试

取实施例1～4制备的微球适量，分成三份，各用适量0.1％的吐温80水溶液混悬，各超声30s，用激光粒度分布仪测定微球粒径，结果见表1，所得的微球粒径(特指中位径)范围在40～100μm之间，适合注射使用。

表1不同实施例制备的微球粒径

实施例	平均中位径±SD
		1	92.17±0.61
2	92.25±0.61
		3	70.18±5.07
4	69.48±0.64

测试例2微球形态测试

取实施例1制备的微球适量，用扫描电镜测定微球形态，结果见图1。结果表明，当多肽与吐温80以实施例1的质量比共冻干后，制备的微球球形圆整。

测试例3微球载药量与包封率测试

分别称取实施例1～4制备的醋酸曲普瑞林微球30mg，加入3mL超纯水，振摇1min，离心(6000rpm，10min)，收集上清液，重复步骤3次，合并上清液，离心，取上清液，HPLC分析，可求得游离药物量。

在残留物中加1mL二氯甲烷，再加4mL超纯水，振摇1min，离心，取水层(上层)，重复操作4次，合并水层，离心，取上清液，HPLC分析，可求得包载药物量。结果见表2。

其中，载药量与包封率的计算公式如下：

表2不同实施例制备的微球载药量与包封率

实施例	载药量(％)	包封率(％)
			1	2.19	74.87
2	1.64	56.21
			3	5.30	57.89
4	0.78	26.48

测试例4微球的体外释放曲线测试

按药典规定量取79mL 0.1mol/L NaOH溶液，加入1.36g KH₂PO₄，加水稀释至200mL，即得pH 7.4的磷酸盐中性缓冲液，加入40μL吐温80，得到吐温80浓度为0.2％的PBS-吐温80溶液。

各称取实施例1、2、4制备的醋酸曲普瑞林缓释微球约30mg，分别用3mL PBS-吐温80溶液混悬，恒温37℃摇床(100rpm)，分别于4h、1d、3d、7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d和56d取样，上清液用于HPLC分析，剩下微球用新鲜介质重新混悬继续放样，计算累积释放百分率，绘制累积释放百分率-时间的释放曲线图，结果见图2、3、4，从图中可以看出采用水溶性多肽与表面活性剂共冻干，可以得到速释缓释兼备的释放曲线，其前期为速释，后期为缓释；而未提前冻干所制备的微球(实施例4)则只有速释阶段。由图3和图2对比可知，当与水溶性多肽共冻干的表面活性剂比例增加时，在PLGA溶蚀的释放阶段有明显的促进释放的作用。

本发明中，制备具有速释和缓释效果的多肽微球时，水溶性多肽还可选择其他多肽，如戈舍瑞林或其盐、亮丙瑞林或其盐、布舍瑞林或其盐、奥曲肽或其盐、艾塞那肽或其盐、兰瑞肽或其盐、利拉鲁肽或其盐、胸腺五肽和生长激素中的一种或几种。表面活性剂还可选择卖泽、苄泽和泊洛沙姆中的一种或几种。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种具有速释和缓释效果的多肽微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将水溶性多肽与表面活性剂共冻干，得到粉末状共冻干物，然后将所述共冻干物分散于有机溶剂中，得到油相溶液，所述有机溶剂中溶有含有疏水链段的高分子聚合物；

(2)将所述油相溶液与高分子聚合物的不良溶剂混匀，形成包裹了高分子聚合物的多肽微球，然后将混合物加入固化剂中，使多肽微球固化完全，得到所述具有速释和缓释效果的多肽微球。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述水溶性多肽选自曲普瑞林或其盐、戈舍瑞林或其盐、亮丙瑞林或其盐、布舍瑞林或其盐、奥曲肽或其盐、艾塞那肽或其盐、兰瑞肽或其盐、利拉鲁肽或其盐、胸腺五肽和生长激素中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述表面活性剂选自多元醇型共聚物、聚氧乙烯型共聚物和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，冻干过程中，所采用的冷冻干燥机的冷阱温度为-50℃至-60℃，冻干压力为0.01-0.52mbar。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述水溶性多肽、表面活性剂和高分子聚合物的质量比为1:0.01～0.43:2～40。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述有机溶剂选自二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮和甲基乙基酮中的一种或几种。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述高分子聚合物选自丙交酯-乙交酯共聚物、聚乳酸、聚乳酸-聚乙二醇和聚己内酯中的一种或几种。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，不良溶剂选自二甲基硅油和/或液体石蜡。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述固化剂选自正庚烷、正辛烷和正己烷中的一种或几种。

10.一种权利要求1-9中任一项所述的制备方法所制备的具有速释和缓释效果的多肽微球，其特征在于：包括水溶性多肽以及包裹在水溶性多肽表面的高分子聚合物，所述高分子聚合物中含有疏水链段，所述多肽微球的粒径的中位径为40～100μm，所述多肽微球中的水溶性多肽的释放率为前期速释，后期缓释。