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CN109937040A - 治疗肝病的方法 - Google Patents

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CN109937040A
CN109937040A CN201780070020.8A CN201780070020A CN109937040A CN 109937040 A CN109937040 A CN 109937040A CN 201780070020 A CN201780070020 A CN 201780070020A CN 109937040 A CN109937040 A CN 109937040A
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CN201780070020.8A
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D.G.C.布雷肯里奇
G.R.布达斯
J.T.利莱斯
W.J.沃特金斯
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Gilead Sciences Inc
Original Assignee
Gilead Sciences Inc
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Abstract

本发明涉及预防和/或治疗肝病的方法，包括向需要的患者给药ASK1抑制剂与FXR激动剂的组合。

Description

治疗肝病的方法
技术领域
本发明涉及预防和/或治疗肝病的方法。
背景技术
基于疾病的持续时间，肝病通常被分类为急性或慢性。肝病可以由感染、损伤、暴露于药物或有毒化合物、酒精、食物中的杂质，以及血液中正常物质的异常积累、自身免疫过程、遗传缺陷(例如血色素沉着病)或未知原因而引起。
肝病是全世界死亡的主要原因。特别地，已经看到高脂肪的饮食以惊人地类似于肝炎的方式损伤肝脏。美国肝脏基金会估计，超过20％的人口患有非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。已表明肥胖、不健康的饮食和久坐的生活方式可能造成NAFLD的高发病率。当不治疗时，NAFLD可进展到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，引起严重的不良反应。一旦NASH发展，它将导致肝随时间膨胀和形成瘢痕(即肝硬化)。
尽管初步报告表明积极的生活方式可以预防或逆转肝损伤，但仍没有有效的NAFLD的药物治疗。因此，仍然需要提供新的有效的药物来治疗肝病。
发明内容
本文公开了在需要的患者中治疗和/或预防肝病的方法，包括向患者给药治疗有效量的凋亡信号调节激酶1(ASK1)抑制剂与治疗有效量的法尼醇X受体(FXR)激动剂的组合。所述肝病可为任何肝病，包括，但不限于，慢性和/或代谢性肝病、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
在具体实施方案中，本文提供在需要的患者中治疗和/或预防非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法，包括向患者给药治疗有效量的ASK1抑制剂与治疗有效量的FXR激动剂的组合。
在本文提供的方法中，ASK1抑制剂和FXR激动剂可共同给药。在这些实施方案中，ASK1抑制剂和FXR激动剂可作为单一药物组合物一起给药，或在多于一种药物组合物中分开给药。因此，本文还提供包含治疗有效量的ASK1抑制剂和治疗有效量的FXR激动剂的药物组合物。
附图说明
图1：通过形态测定图像分析定量的PSR染色(肝脏面积％)。图表显示平均值±SEM。
图2：肝脏中的羟脯氨酸含量，表示为每克肝组织的羟脯氨酸微克数。图表显示平均值±SEM。
图3：通过形态测定图像分析定量的结蛋白+染色(肝脏面积％)。图表显示平均值±SEM。
图4：通过定量RT-PCR测量的肝纤维化基因Col1a1的肝脏表达。图表显示平均值±SEM。
图5：通过定量RT-PCR测量的肝纤维化基因TIMP-1的肝脏表达。图表显示平均值±SEM。
图6：通过形态测定图像分析定量的肝脏脂肪变性(肝脏的空泡化面积％)。图表显示平均值±SEM。
图7：肝脏的肝胆固醇含量，表示为每克肝脏组织的胆固醇毫克数。图表显示平均值±SEM。
图8：血浆中胆汁酸的总水平，表示为每毫升血浆的胆汁酸纳克数。图表显示平均值±SEM。
图9：通过定量纳米串(nanostring)测量的肝脏中炎症基因IL1-β的肝脏表达。图表显示平均值±SEM。
发明详述
定义和一般参数
本说明书使用的以下术语和短语通常意图具有如在下文中阐述的含义，但上下文另外说明的情况除外。
如本文所使用的，在定量测量的背景下使用的术语“约”是指指示量±10％，或者指示量±5％或±1％。
术语“药学上可接受的盐”是指本文公开的化合物的盐，其保持基础化合物的生物有效性和性质，且不是生物上或其它方面不合需要的。存在酸加成盐和碱加成盐。药学上可接受的酸加成盐可从无机和有机酸制备。
用于与基础化合物反应形成药学上可接受的盐(分别为酸加成盐或碱加成盐)的酸和碱是本领域技术人员已知的。类似地，从基础化合物制备药学上可接受的盐的方法(在公开时)是本领域技术人员已知的，并且公开在例如Berge等人，Journal ofPharmaceutical Science，Jan.1977vol.66，No.1和其他来源。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括对所公开的化合物或其用途无害的赋形剂或试剂，例如溶剂、稀释剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。使用这样的载体和试剂制备药物活性物质的组合物是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences，Mace Publishing Co.，Philadelphia，PA 17thEd(1985)；和Modern Pharmaceutics，Marcel Dekker，Inc.3rd Ed.(G.S.Banker&C.T.Rhodes，Eds.)。
术语“治疗有效量”和“有效量”可互换使用，并且是指当一个或多个剂量给药于需要这种治疗的患者(例如，人)时足以实现如下定义的治疗的化合物的量。治疗有效量将根据患者、所治疗的疾病、患者的体重和/或年龄、疾病的严重性或由合格的药师或护理者确定的给药方式而变化。
术语“治疗”或“治疗”是指给予式(I)的化合物或药学上可接受的盐用于以下目的：(i)延迟疾病的发作，即导致疾病的临床症状不出现或延迟其出现；(ii)抑制疾病，即阻止临床症状的发展；和/或(iii)缓解疾病，即引起临床症状或其严重性的消退。
肝病
肝病是在疾病持续期间对肝脏的急性或慢性损害。肝损伤可以由感染、损伤、暴露于药物或有毒化合物例如酒精或食物中的杂质、血液中正常物质的异常积累、自身免疫过程、遗传缺陷(例如血色病)或其他未知原因引起。示例性肝病包括但不限于肝硬化，肝纤维化，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，酒精性脂肪性肝炎(ASH)，肝缺血再灌注损伤，原发性胆汁性肝硬化(PBC)和肝炎，包括病毒性和酒精性肝炎。
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是并非由酒精引起的肝细胞中额外脂肪的积聚。NAFLD可能导致肝脏肿胀(即脂肪性肝炎)，这又可能随着时间而引起瘢痕(即肝硬化)，并可能导致肝癌或肝衰竭。NAFLD的特征在于脂肪在肝细胞中的积累，并且通常与代谢综合征(例如2型糖尿病、胰岛素抵抗、高脂血症、高血压)的一些方面相关。这种疾病的频率已经变得越来越常见，这是由于消耗富含碳水化合物和高脂肪的饮食。NAFLD患者的一个亚组(～20％)发展为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
NASH是脂肪肝疾病的亚型，是更严重的NAFLD形式。其特征在于大泡性脂肪变性、肝细胞的球囊变性和/或最终导致肝瘢痕形成(即纤维化)的炎症。诊断为NASH的患者进展到晚期肝纤维化并最终肝硬化。目前对具有晚期疾病的肝硬化NASH患者的治疗是肝移植。
一项研究显示，大部分比例的已诊断的NASH患者(39％)没有进行肝活检以确认诊断。相比于文献报道，更大比例的诊断的NASH患者具有代谢综合征参数(II型糖尿病54％，肥胖71％，代谢综合征59％)。与实践指南建议相比，82％的医生使用较低的阈值来定义显著的酒精消耗。88％的医生为NASH开具某种形式的药物治疗(维生素E：为53％的NASH患者开具，他汀类药物：57％，二甲双胍：50％)。因此，绝大多数患者被开具药物，尽管缺乏确诊或显著数据支持该干预，且排除NASH的酒精阈值低于预期。
另一种常见的肝病是原发性硬化性胆管炎(PSC)。它是慢性或长期肝病，慢慢损伤肝脏内部和外部的胆管。在患有PSC的患者中，胆汁由于胆管堵塞而积聚在肝脏中，其逐渐损伤肝细胞并引起肝硬化或肝脏瘢痕形成。目前，没有有效的治疗方法来治愈PSC。许多患有PSC的患者由于肝衰竭最终需要肝移植，通常在被诊断患有该疾病大约10年后。PSC也可能导致胆管癌。
肝纤维化是在大多数类型的慢性肝病中发生的细胞外基质蛋白(包括胶原)的过度积累。晚期肝纤维化导致肝硬化、肝衰竭和门静脉高血压，并且通常需要肝移植。
方法
本文公开了在需要的患者中治疗和/或预防肝病的方法，包括向患者给药治疗有效量的ASK1抑制剂与治疗有效量的FXR激动剂的组合。活性肝病的存在可以通过血液中升高的酶水平的存在来检测。具体来说，已知高于临床上接受的正常范围的丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的血液水平指示正在进行的肝损伤。对肝病患者的ALT和AST的血液水平的常规监测在临床上用于测量在医疗治疗时肝病的进展。将升高的ALT和AST降低到接受的正常范围内作为临床证据，反映患者正在进行的肝损伤的严重性的降低。
在具体实施方案中，肝病是慢性肝病。慢性肝病涉及肝实质的进行性破坏和再生，导致纤维化和肝硬化。一般来说，慢性肝病可由病毒(例如乙型肝炎、丙型肝炎、巨细胞病毒(CMV)或EB病毒(EBV))、毒性剂或药物(例如酒精、甲氨蝶呤或呋喃妥因)、代谢性疾病(例如非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、血色素沉着病或威尔逊氏病)、自身免疫性疾病(例如自身免疫性慢性肝炎、原发性胆汁性胆管炎(以前称为原发性胆汁性肝硬化)或原发性硬化性胆管炎)或其他原因(例如右心衰竭)引起。
在一个实施方案中，本文提供了用于降低肝硬化水平的方法。在一个实施方案中，肝硬化在病理上的特征为正常微小小叶结构的损失、纤维化和结节再生。测量肝硬化程度的方法是本领域熟知的。在一个实施方案中，肝硬化水平降低约5％至约100％。在一个实施方案中，在受试者中肝硬化水平降低至少约5％，至少约10％，至少约15％，至少约20％，至少约25％，至少约30％，至少约35％，至少约40％，至少约45％，至少50％，至少约55％，至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，或约100％。
在具体实施方案中，所述肝病为代谢性肝病。在一个实施方案中，所述肝病为非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。NAFLD与胰岛素抵抗和代谢综合征(肥胖症、混合型高脂血症、糖尿病(II型)和高血压)相关。认为NAFLD涵盖一系列疾病活性，且开始为在肝中的脂肪累积(肝性脂肪变性)。
已经显示，肥胖和胰岛素抵抗可能在NAFLD的疾病过程中发挥强烈的作用。除了饮食不良之外，NAFLD还有几种其他已知的原因。例如，NAFLD可由某些药物引起，例如胺碘酮，抗病毒药物(例如核苷类似物)，阿司匹林(很少作为儿童Reye综合征的一部分)，皮质类固醇，甲氨蝶呤，他莫昔芬或四环素。NAFLD还通过高果糖玉米糖浆的存在与软饮料的消耗相关，这可能引起脂肪在腹部增加的沉积，尽管蔗糖的消耗显示类似的效果(可能是由于其分解成果糖)。遗传学也被认为发挥了作用，因为已经确定了这种易感性的两个遗传突变。
如果不治疗，NAFLD可以发展成非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，其是NAFLD的最极端形式，其中脂肪变性与炎症和纤维化结合的状态。NASH被认为是肝硬化的主要原因。因此，本文提供在需要的患者中治疗和/或预防非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法，包括向患者给药治疗有效量的ASK1抑制剂与治疗有效量的FXR激动剂的组合。
本文还提供在需要的患者中治疗和/或预防肝纤维化的方法，包括向患者给药治疗有效量的ASK1抑制剂与治疗有效量的FXR激动剂的组合。肝纤维化是在大多数类型的慢性肝病中发生的细胞外基质蛋白(包括胶原)的过度积累。在具体实施方案中，晚期肝纤维化导致肝硬化和肝衰竭。用于测量肝组织学的方法，例如纤维化程度、小叶性肝炎和门静脉周围桥接坏死的变化是本领域公知的。
在一个实施方案中，肝纤维化(其为纤维组织形成、纤维瘤或纤维变性)的水平降低超过约90％。在一个实施方案中，肝纤维化(其为纤维组织形成、纤维瘤或纤维变性)的水平降低至少约90％，至少约80％，至少约70％，至少约60％，至少约50％，至少约40％，至少约30％，至少约20％，至少约10％，至少约5％或至少约2％。
在一个实施方案中，本文提供的化合物降低肝脏中的纤维形成水平。肝纤维形成是导致称为纤维化的肝中过量细胞外基质组分沉积的过程。它在诸如慢性病毒性乙型肝炎和丙型肝炎、酒精性肝病、药物诱导的肝病、血色素沉着病、自身免疫性肝炎、威尔逊氏病、原发性胆汁性胆管炎(以前称为原发性胆汁性肝硬化)、硬化性胆管炎、肝血吸虫病等许多病症中观察到。在一个实施方案中，纤维形成水平降低超过约90％。在一个实施方案中，纤维形成水平降低至少约90％，至少约80％，至少约70％，至少约60％，至少约50％，至少40％，至少约30％，至少约20％，至少约10％，至少约5％或至少2％。
在其它实施方案中，本文提供在需要的患者中治疗和/或预防原发性硬化性胆管炎(PSC)的方法，包括向患者给药治疗有效量的ASK1抑制剂与治疗有效量的FXR激动剂的组合。
已经观察到患有NASH的患者在表观遗传测试中平均比健康患者大约2.8岁。因此，在一个实施方案中，可用于治疗NASH的化合物可用于减缓、改善或逆转由NASH引起的表观遗传年龄或衰老的影响。在另一个实施方案中，用于治疗NASH的组合疗法，例如本文公开的ASK1抑制剂与FXR激动剂的组合，可用于改善或逆转由NASH引起的衰老作用。
在一个实施方案中，ASK1抑制剂和FXR激动剂可以在组合制剂中或在单独的药物组合物中一起施用，其中每种抑制剂可以配制成任何合适的剂型。在某些实施方案中，本文提供的方法包括分别施用包含ASK1抑制剂和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物和包含FXR激动剂和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。根据本发明的组合制剂包含ASK1抑制剂和FXR激动剂以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂和任选的其他治疗剂。含有活性成分的组合制剂可以是适合于预期给药方法的任何形式。
ASK1抑制剂
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂为具有式(I)结构的化合物:
或其药学上可接受的盐。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂为具有式(II)结构的化合物:
或其药学上可接受的盐。
式(I)和式(II)的化合物可使用本领域技术人员已知的方法合成和表征，如美国专利申请公开号2011/0009410和2013/0197037中所述的方法。在一个实施方案中，所述ASK1抑制剂为式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，所述ASK1抑制剂为式(II)的化合物或其药学上可接受的盐。
FXR激动剂
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述FXR激动剂为具有式(III)结构的化合物:
或其药学上可接受的盐。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，FXR激动剂为具有式(IV)结构的化合物:
或其药学上可接受的盐。
式(III)和式(IV)的化合物可使用本领域技术人员已知的方法合成和表征，如美国专利公开2014/0221659中所述的方法。
给药和施用
虽然可以单独给药活性成分，但是优选将其作为如下所述的药物制剂或药物组合物提供。本公开的用于兽医和人类使用的制剂包含至少一种活性成分，以及一种或多种可接受的载体和任选的其它治疗成分。载体必须是“可接受的”，意思是与制剂的其它成分相容并且对其接受者是生理上无害的。
每种活性成分可以与常规载体和赋形剂一起配制，其将根据通常的实践进行选择。片剂可以含有赋形剂、助流剂、填充剂、粘合剂等。水性制剂以无菌形式制备，并且当打算用于通过除口服给药之外的递送时，通常将是等渗的。所有制剂将任选地含有赋形剂，例如Handbook of Pharmaceutical Excipients(1986)中所述的那些。赋形剂包括抗坏血酸和其它抗氧化剂、螯合剂如EDTA、碳水化合物如糊精、羟烷基纤维素、羟烷基甲基纤维素、硬脂酸等。制剂的pH范围为约3至约11，但通常为约7至10。
活性成分的治疗有效量可由熟练的临床医生使用常规剂量递增研究容易地确定。通常，活性成分将以0.01毫克至2克的剂量给药。在一个实施方案中，剂量为约10毫克至450毫克。在另一个实施方案中，剂量为约25至约250毫克。在另一个实施方案中，剂量为约50或100毫克。在一个实施方案中，剂量为约100毫克。在一个实施方案中，给药18mg ASK1抑制剂。在一个具体实施方案中，给药18mg式(II)的化合物。在一个实施方案中，给药30mg FXR激动剂。在一个具体实施方案中，给药30mg式(III)的化合物。预期活性成分可以每天给药一次、两次或三次。此外，活性成分可以每周一次或两次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次或每六周一次给药。
用于活性成分的药物组合物可以包括适合于上述给药途径的那些。制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。技术和制剂通常参见Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.，Easton，PA)。这样的方法包括使活性成分与构成一种或多种辅助成分的载体缔合的步骤。通常，制剂通过将活性成分与液体载体或细碎的固体载体或两者均匀和紧密地混合，然后如果需要，使产品成型来制备。
适合于口服给药的制剂可以作为离散单位存在，例如胶囊、扁囊剂或片剂，每个含有预定量的活性成分；作为粉末或颗粒；作为在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；或作为水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。活性成分还可以作为大丸剂、药糖剂或糊剂给药。在具体实施方案中，活性成分可以作为皮下注射给药。
片剂可以通过压缩或模制，任选地使用一种或多种辅助成分制备。压制片剂可以通过在合适的机器中压缩自由流动形式的活性成分如粉末或颗粒，任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂或表面活性剂混合来制备。模制片剂可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状活性成分的混合物来制备。片剂可以任选地被包衣或刻痕，并且任选地被配制以便提供活性成分的缓慢或控制释放。
活性成分可以通过适于该病症的任何途径给药。合适的途径包括口服、直肠、鼻、局部(包括颊和舌下)、阴道和肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外)等。应当理解，优选的途径可以随例如接受者的状况而变化。在具体实施方案中，活性成分是口服生物可利用的，因此可以口服给药。在一个实施方案中，患者是人。
当在本文公开的方法中组合使用时，ASK1抑制剂和FXR激动剂可以在单一药物组合物中一起给药或在多于一种药物组合物中分开(同时或依次)给药。在具体实施方案中，ASK1抑制剂和FXR激动剂一起给药。在其他实施方案中，ASK1抑制剂和FXR激动剂分开给药。在一些方面，ASK1抑制剂在FXR激动剂之前给药。在一些方面，FXR激动剂在ASK1抑制剂之前给药。当分别给药时，ASK1抑制剂和FXR激动剂可以通过相同或不同的递送途径给药于患者。
药物组合物
本发明的药物组合物包含有效量的选自式(I)的化合物和式(II)的化合物的ASK1抑制剂，和有效量的选自式(III)的化合物和式(IV)的化合物的FXR激动剂。
当用于口服使用时，可以制备例如片剂、糖锭、锭剂、水性或油性悬浮液、可分散的粉末或颗粒、乳剂、硬或软胶囊、糖浆或酏剂。用于口服使用的组合物可以根据本领域已知的用于制备药物组合物的任何方法制备，并且这种组合物可以含有一种或多种试剂，包括甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂，以便提供可口制剂。含有与无毒的药学上可接受的赋形剂(其适于制备片剂)混合的活性成分的片剂，是可接受的。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂，例如碳酸钙或碳酸钠、乳糖、乳糖一水合物、交联羧甲基纤维素钠、聚维酮、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或藻酸；粘合剂，例如纤维素、微晶纤维素、淀粉、明胶或阿拉伯胶；和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未包衣的，或者可以通过已知技术包括微囊化来包衣，以延迟在胃肠道中的崩解和吸附，从而提供更长时间的持续作用。例如，可以使用延时材料，例如单独的或与蜡一起的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
口服使用的制剂也可以是硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂例如磷酸钙或高岭土混合，或作为软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质混合，例如花生油、液体石蜡或橄榄油。
本公开的水性悬浮液含有活性材料与适于制备水性悬浮液的赋形剂的混合物。这样的赋形剂包括悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶，以及分散剂或润湿剂，例如天然存在的磷脂(例如，卵磷脂)，环氧烷与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)，环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如十七碳亚乙基氧基鲸蜡醇)，环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯)。水性悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂，例如，蔗糖或糖精。
油悬浮液可以通过将活性成分悬浮在植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)中或在矿物油(例如液体石蜡)中配制。口服混悬液可含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以加入甜味剂，例如上述的那些，以及调味剂，以提供适口的口服制剂。这些组合物可以通过加入抗氧化剂例如抗坏血酸来保存。
适于通过加入水制备水性悬浮液的本公开的可分散粉末和颗粒提供与分散或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂由上面公开的那些举例说明。还可以存在另外的赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。
本公开的药物组合物也可以是水包油乳液的形式。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，矿物油，例如液体石蜡，或这些的混合物。合适的乳化剂包括天然存在的树胶，例如阿拉伯树胶和黄蓍胶，天然存在的磷脂，例如大豆卵磷脂，衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如脱水山梨醇单油酸酯，以及这些偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。乳剂还可以含有甜味剂和调味剂。糖浆和酏剂可以用甜味剂，例如甘油，山梨醇或蔗糖配制。这样的制剂还可以含有缓和剂、防腐剂、矫味剂或着色剂。
本公开的药物组合物可以是无菌可注射制剂的形式，例如无菌可注射的水性或油性悬浮液。该悬浮液可以根据已知技术使用上述合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如在1,3-丁二醇中的溶液或制备为冻干粉末。可以使用的可接受的载体和溶剂是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌不挥发性油通常可用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸也可以用于制备注射剂。
可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的主体和具体的给药方式(例如口服给药或皮下注射)而变化。例如，旨在用于人类口服给药的时间释放制剂可以含有约1至1000mg的活性物质，其与合适和方便量的载体材料混合，载体材料可为总组合物的约5至约95％(重量：重量)。可以制备药物组合物以提供易于测量的给药量。例如，用于静脉内输注的水溶液可以含有每毫升溶液约3至500μg的活性成分，以便能够以约30mL/hr的速率输注合适的体积。当配制用于皮下给药时，通常在历时约2至约4个月的时间内每月约两次给药制剂。
适于肠胃外给药的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；和水性和非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。
制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶中，并且可以储存在仅需要在紧接使用前加入无菌液体载体(例如注射用水)的冷冻干燥(冻干)状态下。临时注射溶液和悬浮液由前述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。优选的单位剂量制剂是含有活性成分的如上文所述的日剂量或单位每日亚剂量或其适当部分的那些。
实施例
实施例1.大鼠NASH模型的功效
进行以下研究以评估ASK1抑制剂和FXR激动剂的组合在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的啮齿动物模型中的功效，相对于模型中单独的药剂的功效。通过给予胆碱缺乏的高脂肪饮食(CDHFD)并长期给予亚硝酸钠(CDHFD/NaNO2)，在雄性Wistar大鼠中诱导NASH。该模型利用NASH的“双击理论”，通过诱导肝脏中的代谢功能障碍(CDHFD)和氧化应激(NaNO2)导致肝纤维化，其特征和严重程度与晚期NASH患者中观察到的相似。
给大鼠喂食CDHFD总共14周，并从第4周到第14周给予NaNO2。式(III)化合物(作为饮食中的混合物提供，调整为递送30mg/kg/天)、式(I)化合物(以饮食中的0.2％混合物给药)或媒介物在第4周至第14周给予。在14周研究完成时评估以下终点：i)通过肝脏羟脯氨酸(OHP)含量和通过Picosirius红(PSR)染色得到的胶原含量的定量形态测定分析测量的肝纤维化；ii)通过肌成纤维细胞标志物结蛋白(Desmin)的定量IHC测量的肝脏切片中的肌成纤维细胞活化；和iii)通过RT-PCR测量的肝组织中的Col1a1和Timp1。
方法
动物
雄性Wistar大鼠(在研究开始时为6-8周龄)用于该研究。将所有动物饲养在标准动物饲养条件下，并在研究开始前使其适应14天。
CDHFD/NaNO2大鼠模型的活体实验方案
实验设计如表1所示。所有CDHFD/NaNO2动物饲喂胆碱缺乏的高脂饮食(CDHFD；Research Diets，Inc)14周，并且还腹膜内注射NaNO2(每周3次注射；Sigma Aldrich#31443)，剂量为25mg/kg(第4周至第10周)，和剂量为12.5mg/kg(第10周至第14周)。
式(III)(作为CDHFD饮食中的混合物给予，调整为递送30mg/kg/天，每组n＝10只动物)和式(I)(作为CDHFD饮食中的0.2％混合物给予，每组n＝10)从第4周到第14周施用药物。媒介物对照组动物给予相同的CDHFD饮食，没有添加药物(媒介物；每组n＝10只动物)，从第4周到第14周。健康对照动物喂食正常的饲料并且没有接受NaNO2(对照，每组n＝10)。在研究的最后一天，大鼠在30mg/kg的剂量下接受式(I)或式(III)的单次口服管饲，在4小时后动物实施安乐死前并收集组织用于分析。在14周研究方案完成时评估所有终点。
表1.实验设计和剂量组
PSR和结蛋白IHC的定量形态测定分析
使用Leica AT2扫描仪以40X放大率捕获Picrosirius Red(PSR)和结蛋白染色的载玻片的整个载玻片图像。检查数字载玻片图像的扫描质量，注释并导出到Leica DigitalImage Hub归档中的相应网络文件夹。使用Definiens Tissue Studio Architect XD(Definiens Inc.)对整个载玻片扫描图像进行定量图像分析，以确定PSR和结蛋白的程度和强度。Definiens Composer功能用于区分肝脏组织与周围玻璃载玻片，并隔离和消除光学异常和组织缺陷。测量总PSR染色面积和结蛋白IHC染色，并表示为染色的总肝脏面积的百分比。
通过qRT-PCR进行基因表达
通过qRT PCR对两个靶器官，回肠和肝脏进行基因表达分析。使用RNAzol RT试剂(Sigma Aldrich，目录号R4533)和RNA分离试剂盒(Qiagen，目录号74182)按照制造商的说明分离来自25mg研磨冷冻组织的总RNA。使用由50pmol无规六聚体引发的SuperscriptIITM逆转录酶(Life Technologies，目录号18064-014)，从0.5μg总RNA合成cDNA。使用AbsoluteQPCR Rox Mix(Life Technologies，目录号AB-1132)和384-格式ABI 7900HT序列检测系统(Applied Biosystems)进行定量PCR和分析。在肝组织中，反向和正向特异性引物和探针(Integraded DNA Technologies，USA)用于Col1A1和TIMP1的表达分析。
肝脏羟脯氨酸计数
通过酶促方法通过氧化的羟脯氨酸与4-(二甲基氨基)苯甲醛(DMAB)的反应来定量肝脏羟脯氨酸，其产生与存在的羟脯氨酸成比例的比色(560nm)产物。将快速冷冻的肝脏样品在液氮下粉化，然后在水中匀浆(100μl/10mg)，并在120℃下在12N HCl溶液中水解18小时。水解完成后，将样品在室温下以13,000g离心5分钟，然后转移到96孔板中并在60℃下干燥。将干燥的样品用100μl氯胺-T氧化，并在室温下温育20分钟。向每个孔中加入100μl新鲜制备的DMAB溶液，并将样品培养30分钟。通过测量560nm处的吸光度，通过光度测定法测定羟脯氨酸含量。使用标准曲线测定每个样品的羟脯氨酸含量。
结果
通过PSR测定的肝脏OHP含量及胶原的定量形态测定分析
在CDHFD/NaNO2的12周后，对组织学肝切片进行Picrosirius Red(PSR)染色以显现肝脏胶原含量。通过形态测定图像分析量化PSR染色。数据显示在图1中。与健康对照大鼠相比，施用CDHFD/NaNO2的大鼠肝脏胶原蛋白增加至5倍(PSR面积从健康对照大鼠的1.7±0.3％增加到媒介物处理的CDHFD/NaNO2大鼠的8.5±0.6％，p<0.001)。用式(I)化合物治疗使肝脏胶原减少27％(媒介物处理的CDHFD/NaNO2大鼠的PSR面积从8.5±0.6％降低至6.2±1.1％，p<0.05)。用式(III)化合物治疗使肝脏胶原减少22％(媒介物处理的CDHFD/NaNO2大鼠的PSR面积从8.5±0.6％降低至6.6±0.9％，p<0.05)。用式(I)化合物和式(III)化合物的组合治疗使胶原减少54％(媒介物处理的CDHFD/NaNO2大鼠的PSR面积从8.5±0.6％降低至3.9±0.6％，p<0.001)。式(I)化合物和式(III)化合物的组合治疗减少肝脏胶原的效果明显优于单独给药的任一种药物(p<0.05)。
通过测量肝脏羟脯氨酸含量进行肝纤维化的生化评估。数据显示在图2中。与健康对照大鼠相比，施用CDHFD/NaNO2的大鼠肝脏羟脯氨酸含量增加至1.6倍(健康对照大鼠肝脏羟脯氨酸从4.0±0.3μmol/g增加至媒介物处理的CDHFD/NaNO2大鼠中的6.5±0.5μmol/g，p<0.001)。用作为单一药剂给予的式(I)化合物或式(III)化合物治疗不会显著降低肝脏羟脯氨酸含量。用式(I)化合物和式(III)化合物的组合治疗使肝羟羟脯氨酸降低33％(媒介物处理的CDHFD/NaNO2大鼠中肝脏羟脯氨酸含量从6.5±0.5μmol/g降低至4.4±0.5μmol/g，p<0.01)。式(I)化合物和式(III)化合物的组合治疗以降低肝脏羟脯氨酸的效果显著大于单独给药的式(III)化合物(p<0.05，相对单独的式(III)化合物)。
肌成纤维细胞标志物结蛋白的定量IHC
将组织学肝切片染色用于结蛋白，结蛋白是活化的肌成纤维细胞标志物。数据显示在图3中。通过形态测定图像分析量化结蛋白染色并表示为％结蛋白标记区域。与健康对照大鼠相比，给予CDHFD/NaNO2的大鼠肝脏结蛋白染色增加至15倍(肝脏％结蛋白标记区域从健康对照大鼠的0.7±0.1％增加到媒介物处理的CDHFD/NaNO2鼠的10.3±0.8％，p<0.001)。用式(I)化合物治疗使肝脏结蛋白染色减少46％(肝脏％结蛋白标志物面积从媒介物处理的CDHFD/NaNO2大鼠中的10.3±0.8％降低至5.6±0.7％，p<0.001)。用式(III)化合物治疗使肝脏结蛋白染色降低43％(肝脏％结蛋白标志物面积从媒介物处理的CDHFD/NaNO2大鼠中的10.3±0.8％降低至5.9±0.7％，p<0.001)。用式(I)化合物和式(III)化合物的组合治疗使肝脏结蛋白染色减少39％(肝脏％结蛋白标志物面积从媒介物处理的CDHFD/NaNO2大鼠中的10.3±0.8％降低至6.2±1.0％，p<0.001)。
Col1a1和Timp1的肝脏表达
在12周研究结束时与健康对照大鼠相比，施用CDHFD/NaNO2后肝纤维化基因Col1a1和TIMP-1的肝脏表达分别增加至40倍和13倍(p<0.001)。图4中示出了Col1a1的数据，图5中示出了TIMP-1的数据。用式(I)化合物治疗使CDHFD/NaNO2诱导的Col1a1减少65％(相对于媒介物p<0.01)并且将TIMP-1减少28％(相对于媒介物p<0.05)。用式(III)化合物治疗使CDHFD/NaNO2诱导的肝Col1a1表达降低44％(相对于媒介物p<0.05)，但没有显著降低TIMP-1。式(I)化合物和式(III)化合物的组合治疗使CDHFD/NaNO2诱导的肝Col1a1表达降低80％(相对于媒介物p<0.001)。与单独施用式(I)化合物或式(III)化合物相比，式(I)化合物和式(III)化合物的组合治疗降低Col1a1基因表达的效果在统计学上显著更高(与媒介物相比p<0.05)。与单独的式(I)化合物观察到的降低相比，式(I)化合物和式(III)化合物的组合治疗降低TIMP-1基因表达的效果在统计学上没有显著差异。
总之，来自该研究的数据表明，与在NASH的啮齿动物模型中单独施用的任一种药剂相比，用ASK1抑制剂和FXR激动剂的组合治疗导致更高的抗纤维化功效。
实施例2.NASH小鼠模型的功效
进行以下研究以评估ASK1抑制剂和FXR激动剂的组合在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的小鼠模型中的功效，相对于单独的个体药剂在模型中的功效。通过长期施用富含饱和脂肪、胆固醇和糖的“快餐”饮食(FFD)总共10个月，在雄性C57BL/6小鼠中诱导NASH，而脂肪少的(lean)对照动物维持正常饲料。与对照小鼠相比，在FFD小鼠中建立NASH表型7个月，其特征在于肥胖、高胆固醇血症和AST/ALT升高；以及NASH的组织学特征，如肝细胞大泡性脂肪变性和气球样变性。参见Charlton M等人Fast food diet mouse:novel smallanimal model of NASH with ballooning,progressive fibrosis,and highphysiological fidelity to the human condition.American journal ofphysiology.Gastrointestinal and liver physiology 2011；301(5):G825-34。
7个月后，随后用安慰剂(媒介物)、ASK1抑制剂(式(I))、FXR激动剂(式(III))或式(I)和式(III)的组合处理FFD小鼠3个月。在整个10个月的研究期间，对照小鼠保持正常的饲料。终点分析包括肝脏脂肪变性的形态测定量化(脂肪变性面积的百分比)、肝脏胆固醇含量、血清ALT/AST水平、血清胆汁酸水平和基因表达的纳米串评估。
方法
动物
雄性C57BL/6小鼠(在研究开始时为12周龄)用于该研究。将所有动物饲养在标准动物饲养条件下，并在研究开始前使其适应环境7天。
FFD小鼠模型的活体实验方案
实验设计如表2所示。给动物施用代表快餐饮食(FFD)的市售的高脂肪、高胆固醇饮食(D12079B；Research Diets Inc.，New Brunswick，NJ)和每1000mL自来水含有23.1g果糖(Sigma，F2543)和17.2g葡萄糖(Sigma，49158)的饮用水，共10个月。将所有研究小鼠单独笼养(1只小鼠/笼)。在研究的最后3个月(第7个月-第10个月)给予单独的式(I)化合物或式(III)化合物或式(I)和式(III)化合物的组合治疗。单独的一组年龄匹配的小鼠在整个研究期间接受标准啮齿动物食物(Teklad饮食TD2014，Indianapolis，IN)以代表正常对照组。
式(I)化合物以在FFD饮食中的0.15％混合物给药(每组n＝x)，式(III)化合物通过口服强饲法每天给药一次(10mg/kg，PO，QD)。用于给予式(III)化合物的媒介物由钠CMC，1％w/w乙醇、98.5％w/w 50mM Tris缓冲液，pH8组成。媒介物对照动物给予相同媒介物，不加药物。
表2.实验设计和剂量组
肝性脂肪变性的测量
使用Leica SCN400扫描仪以40X放大率捕获苏木精和曙红(H&E)和PicrosiriusRed(PSR)染色的载玻片的整个载玻片扫描图像。检查数字载玻片图像的扫描质量，注释并导出到Leica Digital Image Hub归档中的相应网络文件夹。使用Definiens Developer软件包在H&E染色的组织切片上测定脂肪变性的程度。分析参数允许适当测量总组织横截面积，同时排除光学异常和受损组织区域。肝实质内的脂肪性脂质空泡可作为低光密度区域(白色)观察到。列举这些区域的数量和大小，并将总的脂肪变性区域表示为总肝脏组织横截面积的百分比。根据血管大小和尺寸，从该分析中排除肝内血管(例如门静脉和中央静脉的分支)。手动审查自动分析的结果，以确定结果的准确性。样品未达到预定的QC标准(组织的不准确识别和脂肪变性(steatotic)区的不准确识别)被排除在报告之外。
总肝胆固醇的测定
将组织样品(25±5mg，在冷冻状态下称重)均质化并用与水不混溶的有机溶剂混合物萃取，该混合物将游离和酯化的胆固醇级分萃取到有机相中。离心后，分析含有胆固醇和胆固醇酯的有机上层的等分试样。
将内标溶液(胆固醇-d6)和1M氢氧化钾乙醇溶液加入适当样品稀释液的等分试样中。将混合物在70℃温育1小时，以使胆固醇酯水解成游离脂肪酸和胆固醇。然后，将反应混合物用冰醋酸酸化并用己烷萃取。除去己烷层，蒸发并在乙腈中重构。然后将等份的重构提取物注射到配备有C18反相柱的Waters Acquity/AB Sciex QTrap 4000LC MS/MS系统上。测量m/z 369[M-H2O]+→161+胆固醇产物离子的峰面积，相对于m/z 375[M-H2O]+→167+的胆固醇-D6产物离子的峰面积。使用加权(1/x)线性最小二乘回归分析进行定量，所述加权(1/x)线性最小二乘回归分析使用胆固醇油酸酯作为参考标准从强化校准标准产生。通过与组织样品相同的提取和水解步骤获取校准标准样品。使用AB SCIEX软件Analyst 1.5.1收集和处理原始数据。使用Microsoft Excel 2013进行数据简化、重量校正、胆固醇油酸酯对胆固醇水解的校正和浓度计算。最终组织含量以mg总胆固醇/g肝组织给出。
胆汁酸的测量
将血浆样品送至Metabolon，Inc.(Durham，NC)，通过LC-MS/MS定量测定初级和次级胆汁酸及其缀合物。
基因表达
RNA分离、逆转录和qPCR在DC3Therapeutics，South San Francisco进行。根据制造商的说明，使用Precellys 24均化器将肝脏均质化。根据制造商的说明，使用具有DNaseI消化套盒(Omega Biotek#E1091)的E.Z.N.A.HP总RNA试剂盒(Omega Biotek#R6812)分离RNA。使得Nanostring nCounter XT报告代码集(Reporter CodeSet)和捕获探针集(Capture ProbeSet)在室温下解冻。通过向报告代码集管中添加70μL杂交缓冲液来创建主混合物。然后将8μL主混合物加入12个杂交条带管中的每一个中。向每个管中加入5μLRNA，然后加入2μL捕获探针集。然后将管置于预热的65℃热循环仪(Veriti，AppliedBiosystems)中16小时。然后将杂交条带管放入nCounter制备站(NanoStringTechnologies，Inc.目录号NCT-PREP-120)中，其中含有来自nCounter Master试剂盒的试剂和消耗品用于样品处理，并置于数字分析仪(NanoString Technologies，Inc，目录号NCT-DIGA-120)中用于数据采集。使用nSolver分析软件(Nanostring)分析数据，并作为倍数变化呈现。
结果
H&E染色的肝切片的定量证明式(I)化合物、式(III)化合物和式(I)和式(III)化合物的组合分别产生39％、27％和75％的脂肪变性减少(图6)。此外，式(I)化合物、式(III)化合物和式(I)和式(III)化合物的组合分别减少肝胆固醇含量74％、36％和88％(图7)。与单独使用任一种药剂的治疗相比，用式(I)和式(III)化合物的组合治疗导致空泡化面积和肝脏胆固醇含量的统计学上更大的降低。
在对照FFD小鼠中血浆胆汁酸水平显著升高。给予式(I)化合物、式(III)化合物和式(I)和式(III)化合物的组合导致血浆胆汁酸水平分别降低52％、46％和82％(图8)。用式(I)和式(III)化合物的组合治疗导致胆汁酸水平的最大降低。此外，通过用式(I)和式(III)化合物的组合治疗，炎性基因IL1-β的肝表达显著降低(图9)。
总之，来自该研究的数据表明，与在NASH的啮齿动物模型中单独施用的任一种药剂相比，用ASK1抑制剂和FXR激动剂的组合治疗导致更高的抗脂肪变性功效。

Claims (12)

1.在需要的患者中治疗和/或预防肝病的方法，包括向患者给药治疗有效量的ASK1抑制剂与治疗有效量的FXR激动剂的组合，其中所述ASK1抑制剂为式(I)的化合物:
或其药学上可接受的盐；
且所述FXR激动剂为式(III)的化合物:
或其药学上可接受的盐。
2.在需要的患者中治疗和/或预防肝病的方法，包括向患者给药治疗有效量的ASK1抑制剂与治疗有效量的FXR激动剂的组合，其中所述ASK1抑制剂为式(I)的化合物:
或其药学上可接受的盐；
且所述FXR激动剂为式(IV)的化合物:
或其药学上可接受的盐。
3.在需要的患者中治疗和/或预防肝病的方法，包括向患者给药治疗有效量的ASK1抑制剂与治疗有效量的FXR激动剂的组合，其中所述ASK1抑制剂为式(II)的化合物:
或其药学上可接受的盐；
且所述FXR激动剂为式(III)的化合物:
或其药学上可接受的盐。
4.在需要的患者中治疗和/或预防肝病的方法，包括向患者给药治疗有效量的ASK1抑制剂与治疗有效量的FXR激动剂的组合，其中所述ASK1抑制剂为式(II)的化合物:
或其药学上可接受的盐；
且所述FXR激动剂为式(IV)的化合物:
或其药学上可接受的盐。
5.权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述ASK1抑制剂和FXR激动剂一起给药。
6.权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述ASK1抑制剂和FXR激动剂分开给药。
7.权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述肝病为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
8.药物组合物，其包含治疗有效量的ASK1抑制剂和治疗有效量的FXR激动剂，其中所述ASK1抑制剂为式(I)的化合物:
或其药学上可接受的盐；
且所述FXR激动剂为式(III)的化合物:
或其药学上可接受的盐。
9.药物组合物，其包含治疗有效量的ASK1抑制剂和治疗有效量的FXR激动剂，其中所述ASK1抑制剂为式(I)的化合物:
或其药学上可接受的盐；
且所述FXR激动剂为式(IV)的化合物:
或其药学上可接受的盐。
10.药物组合物，其包含治疗有效量的ASK1抑制剂和治疗有效量的FXR激动剂，其中所述ASK1抑制剂为式(II)的化合物:
或其药学上可接受的盐；
且所述FXR激动剂为式(III)的化合物:
或其药学上可接受的盐。
11.药物组合物，其包含治疗有效量的ASK1抑制剂和治疗有效量的FXR激动剂，其中所述ASK1抑制剂为式(II)的化合物:
或其药学上可接受的盐；
且所述FXR激动剂为式(IV)的化合物:
或其药学上可接受的盐。
12.权利要求8-11任一项所述的药物组合物，还包含药学上可接受的载体。
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