CN109925516A - 一种负载外泌体的复合水凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种负载外泌体的复合水凝胶及其制备方法，属于生物医学工程技术领域。其制备方法首先从C57小鼠充间质干细胞分离纯化得到的外泌体，然后将其均匀分散在氧化透明质酸溶液中，利用氧化透明质酸的双醛基基团与乙二酸二酰肼的酰肼基团进行交联反应形成负载外泌体的复合水凝胶。本申请的制备方法简单、快速、可重复性高。制备得到的负载外泌体的复合水凝胶具备局部高浓度、全身低毒性的优点，具有肿瘤渗透性且滞留时间长，此外，该负载外泌体的复合水凝胶还具有可注射性能、生物可降解性能以及药物缓释性能，其凝胶时间快且可以调控。

Description

一种负载外泌体的复合水凝胶及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医学工程技术领域，特别涉及一种负载外泌体的复合水凝胶及其制备方法。

背景技术

无论是可切除或不可切除的肿瘤，局部缓释在术前控制和术后辅助化疗和都发挥重要作用，其主要优点是：药物与肿瘤直接接触，大幅提高药物在肿瘤细胞内的有效浓度；最大限度降低全身毒副作用；药物持续释放，无需频繁给药。1996年美国药监局批准使用一种可植入的载药晶圆(Wafer)治疗复发的Gliomas，该Wafer由一种可降解的聚合物负载3.8％卡莫司汀组成。研究人员将该载药Wafer沿着Gliomas切除后的缺口边缘植入，增加了药物在残留肿瘤细胞中的浓度；这种直接给药方式提高了患者约2个月的中期存活率(11.9升至13.6个月)；在30个月的疗程观察中，降低了29％的死亡风险。而这种技术的主要缺陷在于药物扩散面积较小。另一种直接给药方式是导管介导的增强对流给药，通过正压输液注入化疗药物到脑组织的技术，这种技术扩大了化疗药物在脑组织中的分布面积；同时，给药速度也能够精确调控。但是，这两种局部给药平台都缺乏组织粘附性，药物作用时间短，降低肿瘤治疗效果。因此，需要构建新型的局部给药平台以期增加组织粘附性和药物作用时间。

水凝胶作为一种药物投递平台，已经被广泛应用于药物缓释和组织工程领域。注射型水凝胶可以克服传统局部给药平台的缺点，通过微创注射器植入病灶部位，减低了开创手术给患者带来的疼痛感及感染几率。透明质酸是人体细胞基质的重要成分，具有优良的生物相容性、生物降解性和酶响应特性。200610076650.X公开了一种用于脑损伤修复的透明质酸水凝胶制备方法，在碳二亚胺盐酸盐的介导下，用乙二酸二酰肼进行交联，但是该水凝胶并不具备可注射性。CN108084461A公开了一种自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶的制备方法，该复合水凝胶由巯基之间发生交联反应形成，同样缺乏可注射性而无法满足局部给药的需要。CN104140541A公开了一种可注射透明质酸水凝胶，该水凝胶通过三步化学方法合成而得，制备过程较为复杂。

外泌体是由哺乳动物细胞衍生的纳米囊泡，直径大概在40-200nm。外泌体能够被宿主识别为“自身”，因此其作为一种活性载体，可以将某些细胞RNA、药物分子等物质递送至哺乳动物细胞中。这种囊泡状小体作为载体具有独特的优势，如：较低的免疫原性，较高的稳定性，向细胞运输药物的效率高和更强的增强渗透滞留(EPR)效应等。目前，已有研究报道外泌体负载化疗药物，结果表明与游离药物相比较，外泌体负载药物具有更好的抗肿瘤活性。但外泌体负载药物效率较低，专利CN108114290A公开了一种同时负载化学药物和纳米材料的外泌体的制备方法，用电转法将姜黄素与纳米四氧化三铁装载到外泌体中，但包封率没有报道。外泌体能够用于负载多种不同类型药物，包括核酸分子(mRNA，siRNA等)、化学药物(姜黄素、吲哚菁绿等)和纳米材料(纳米银、纳米铁等)。但是，外泌体在体内缺乏组织特异性。

发明内容

本发明的目的在于克服上述水凝胶缺乏渗透性和滞留性及外泌体缺乏组织特异性的缺点，提供一种负载外泌体的复合水凝胶及其制备方法，以避免现有局部给药平台需要开创手术注入体内病灶部位带来的不适感及高感染几率，提高药物在病灶部位的有效浓度，降低全身毒副作用。该复合水凝胶具备局部高浓度、全身低毒性和组织渗透性强等优点。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种负载外泌体的复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

S1：外泌体提取、纯化：从C57小鼠充间质干细胞培养液中提取外泌体，采用差速超速离心法将得到的外泌体重悬于10mM PBS溶液中，-80℃保存备用；

S2：电转载药：将配置好的药物溶液与步骤S1中的外泌体均匀混合，按电穿孔仪要求及电穿孔皿规格加入相应体积，按照预设电压参数，进行电穿孔载药；

S3：孵育：继步骤S2电穿孔载药之后将样品置于细胞培养箱中避光孵育30min，得到混合液；

S4：纯化：将步骤S3的混合液以100,000-140,000g离心力超速离心60-100min，取沉淀物，得到负载药物的外泌体，用10mM PBS重悬沉淀备用；

S5：将透明质酸与高碘酸钠在无光条件下进行氧化反应24小时，透析后冻干，得到氧化透明质酸；

S6：将步骤S5的氧化透明质酸与步骤S4的负载药物的外泌体混合后，加入乙二酸二酰肼进行反应，得到负载外泌体的复合水凝胶(即负载外泌体的氧化透明质酸水凝胶)。

步骤S1中：

所述C57小鼠充间质干细胞培养液为无外泌体(外泌体是由无血清培养基培养的C57细胞分泌而得。)血清或不含血清。

步骤S2中：

所述电穿孔载药的条件为：电压0-350V，脉宽100μs，间隔1000μs，放电次数：0-9次。

步骤S5中：

所述透明质酸的分子量为80kDa-2000kDa。

所述透明质酸的浓度为1％(w/v)。

所述高碘酸钠的浓度为2.67％(w/v)，所述高碘酸钠与所述透明质酸的摩尔比为1:1。

所述氧化反应采用乙二醇终止氧化反应。

所述透析采用分子截留量为6000-8000的透析袋进行透析；对制备得到的氧化透明质酸透析去除多余的盐离子，将纯化后的氧化透明质酸溶液后进行冷冻干燥，得到氧化透明质酸干燥样品。

所述氧化透明质酸的结构如式(I)所示：

步骤S6中：

所述氧化透明质酸的浓度为6-12％(w/v)，与乙二酸二酰肼进行交联反应。

所述乙二酸二酰肼的浓度为2-8％(w/v)。

本申请还提供由所述制备方法得到的负载外泌体的复合水凝胶；所述负载外泌体的复合水凝胶的凝胶时间为5-60min。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本申请的制备方法简单、快速、可重复性高。制备得到的负载外泌体的复合水凝胶具备局部高浓度、全身低毒性的优点，具有肿瘤渗透性且滞留时间长，此外，该负载外泌体的复合水凝胶还具有可注射性能、生物可降解性能以及药物缓释性能，其凝胶时间快且可以调控。

附图说明

图1为外泌体的透射电镜照片图；

图2为负载姜黄素外泌体复合水凝胶光镜照片图；

图3为负载姜黄素外泌体复合水凝胶扫描电镜照片图(放大倍数*200)；

图4为负载姜黄素外泌体复合水凝胶可注射性检测图；

图5为负载吲哚菁绿外泌体复合水凝胶光镜照片图；

图6为负载吲哚菁绿外泌体复合水凝胶扫描电镜照片图(放大倍数*500)；

图7为负载吲哚菁绿外泌体复合水凝胶可注射性检测图；

图8为负载姜黄素/吲哚菁绿外泌体复合水凝胶光镜照片图；

图9为负载姜黄素/吲哚菁绿外泌体复合水凝胶扫描电镜照片图；

图10为负载姜黄素/吲哚菁绿外泌体复合水凝胶可注射性检测图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文在说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。

本申请中，除有特殊说明外，所有原料均为市售。本申请中，词语“约”或“大约”是指在由所属领域的技术人员确定的指定具体参数的可接受范围内，其部分地取决于测量或测定所述值的方式，即测量系统的限值。例如，“约”可指至多给定值的10％的范围。

本申请首先从C57小鼠充间质干细胞分离纯化得到的外泌体，然后将其均匀分散在氧化透明质酸溶液中，利用氧化透明质酸的双醛基基团与乙二酸二酰肼的酰肼基团进行交联反应形成负载外泌体的复合水凝胶。外泌体可以包覆姜黄素和吲哚菁绿等药物分子，使药物能够更好的渗透到肿瘤组织内部实现控制释放。同时，该水凝胶具备可注射和可生物降解的特点，有效的避免了现有局部给药平台需要开创手术注入体内病灶部位带来的不适感及高感染几率，提高了药物在病灶部位的有效浓度，并降低了全身毒副作用，在生物医学工程领域有重要的应用价值。

所述水凝胶和外泌体可以分别负载姜黄素、吲哚菁绿等药物分子，作为药物缓释载体。制备得到的负载外泌体的复合水凝胶具备多孔微结构。

外泌体的提取和纯化：收集C57小鼠充间质干细胞上清液200mL进行差速离心：300g，10min取上清；2,000g，10min取上清；10,000g，30min取上清；100,000g，70min重悬沉淀；100,000g，70min重悬于200μL 10mM PBS，取30μL样品用于BCA测定蛋白质含量。

电转法负载药物：

1)在10mM PBS溶液中按一定比例加入外泌体、药物溶液；混匀后，加入到96孔细胞培养板中，放入电穿孔电极头，按照设定的参数(电压250V，脉宽100μs，间隔1000μs，放电次数6次)进行电穿孔载药；

2)穿孔后将96孔板避光放入37℃培养箱中，孵育30min；

3)穿孔后的外泌体经过100,000-140,000g超速离心两次，每次70-90min，去上清，沉淀物即为负载药物的外泌体。

氧化透明质酸的制备：首先配制1％(w/v)的透明质酸溶液，然后将2.67％(w/v)的高碘酸钠溶液缓慢加入其中，高碘酸钠与透明质酸的摩尔比为1:1。氧化反应在常温、无光环境下进行24小时。向反应液中缓慢加入0.5ml乙二醇终止反应。选择分子截留量为6000-8000的透析袋对反应液进行透析3天(每天至少换3次水)。对透析后的氧化透明质酸溶液进行冷冻干燥，得到干燥的氧化透明质酸样品。

实施例1

首先配置6％(w/v)的氧化透明质酸溶液；再配置负载姜黄素外泌体与乙二酸二酰肼混合溶液(外泌体浓度为0.4mg/mL(w/v))；然后将氧化透明质酸溶液与负载姜黄素外泌体-乙二酸二酰肼混合溶液以4:1的体积比混合，常温静置反应，得到负载姜黄素外泌体的复合水凝胶，记录凝胶时间；图1所示为提取和纯化的外泌体；图2所示为负载姜黄素外泌体的复合水凝胶；如图3所示，该复合水凝胶具备多孔片层微结构；该复合水凝胶具备可注射性能，见图4。

实施例2

首先配置6％(w/v)的氧化透明质酸溶液；再配置负载吲哚菁绿外泌体与乙二酸二酰肼混合溶液(外泌体浓度为0.4mg/mL(w/v))；然后将氧化透明质酸溶液与负载吲哚菁绿外泌体-乙二酸二酰肼混合溶液以4:1的体积比混合，常温静置反应，得到负载吲哚菁绿外泌体的复合水凝胶，记录凝胶时间；图5所示为负载吲哚菁绿外泌体的复合水凝胶；如图6所示，该复合水凝胶具备片层结构；该复合水凝胶具备可注射性能，见图7。

实施例3

首先配置6％(w/v)的氧化透明质酸溶液；再配置负载姜黄素/吲哚菁绿外泌体与乙二酸二酰肼混合溶液(外泌体浓度为0.4mg/mL(w/v))；然后将氧化透明质酸溶液与负载姜黄素外泌体-乙二酸二酰肼混合溶液以4:1的体积比混合，常温静置反应，得到负载姜黄素/吲哚菁绿外泌体的复合水凝胶，记录凝胶时间；图8所示为负载姜黄素/吲哚菁绿外泌体的复合水凝胶；如图9所示，该复合水凝胶具备多孔片层微结构；该复合水凝胶具备可注射性能，见图10。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种负载外泌体的复合水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：外泌体提取、纯化：从C57小鼠充间质干细胞培养液中提取外泌体，采用差速超速离心法将得到的外泌体重悬于10mM PBS溶液中，-80℃保存备用；

S2：电转载药：将配置好的药物溶液与步骤S1中的外泌体均匀混合，按电穿孔仪要求及电穿孔皿规格加入相应体积，按照预设电压参数，进行电穿孔载药；

S3：孵育：继步骤S2电穿孔载药之后将样品置于细胞培养箱中避光孵育30min，得到混合液；

S4：纯化：将步骤S3的混合液以100,000-140,000g离心力超速离心60-100min，取沉淀物，得到负载药物的外泌体，用10mM PBS重悬沉淀备用；

S5：将透明质酸与高碘酸钠在无光条件下进行氧化反应24小时，透析后冻干，得到氧化透明质酸；

S6：将步骤S5的氧化透明质酸与步骤S4的负载药物的外泌体混合后，加入乙二酸二酰肼进行反应，得到负载外泌体的复合水凝胶。

2.根据权利要求1所述的负载外泌体的复合水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述C57小鼠充间质干细胞培养液为无外泌体血清或不含血清。

3.根据权利要求1所述的负载外泌体的复合水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述电穿孔载药的条件为：电压0-350V，脉宽100μs，间隔1000μs，放电次数：0-9次。

4.根据权利要求1所述的负载外泌体的复合水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S5中所述透明质酸的分子量为80kDa-2000kDa。

5.根据权利要求1所述的负载外泌体的复合水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S5中所述透明质酸的浓度为1％(w/v)。

6.根据权利要求1所述的负载外泌体的复合水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S5中所述高碘酸钠的浓度为2.67％(w/v)，所述高碘酸钠与所述透明质酸的摩尔比为1:1。

7.根据权利要求1所述的负载外泌体的复合水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S5中所述氧化反应采用乙二醇终止氧化反应；所述透析采用分子截留量为6000-8000的透析袋进行透析。

8.根据权利要求1所述的负载外泌体的复合水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S5中所述氧化透明质酸的结构如式(I)所示：

9.根据权利要求1所述的负载外泌体的复合水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S6中所述氧化透明质酸的浓度为6-12％(w/v)，所述乙二酸二酰肼的浓度为2-8％(w/v)。

10.一种负载外泌体的复合水凝胶，由权利要求1-9任一项所述的制备方法得到，所述负载外泌体的复合水凝胶的凝胶时间为5-60min。