CN109908085B - 一种呼吸道给药的药物载体、其制备方法及其在制备治疗心脏病药物中的应用 - Google Patents
一种呼吸道给药的药物载体、其制备方法及其在制备治疗心脏病药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种呼吸道给药的药物载体、其制备方法及其在制备治疗心脏病药物中的应用，包括全氟碳类化合物、磷脂，制备成乳剂，所述药物载体具有连续的水相和不连续的全氟碳相；其中，所述全氟碳类化合物在所述药物载体中的质量占比为1％～60％；所述磷脂与全氟碳类化合物质量之和在所述药物载体中的占比不超过70％，磷脂与全氟碳类化合物质量之比为1∶30～30∶1；余量为水。本发明将药物与磷脂类物质形成药物磷脂复合物，能够增强药物的亲脂性，从而使药物能够稳定地处于O/W乳剂油相中，提高递送效率，因而实现了通过呼吸道灌肺的方式递送药物至心脏的目的。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种呼吸道给药的药物载体、其制备方法及其在制备治疗心脏病药物中的应用。
背景技术
随着蛋白组学的出现，基于蛋白质/肽的治疗领域备受关注，通过对大分子药物研究和开发肽类候选药物，蛋白质/肽的应用价值越来越受重视，但目前临床上尚未有安全、无创用于心脏疾病的蛋白质/肽给药方式。目前的呼吸道给药方式无法有效的使药物到达心脏。
理想情况下，需要具有生物相容性和生物可降解性的药物载体保护蛋白质 /肽，使其尽可能多的剂量到达靶组织，降低与治疗相关的成本，且药物载体不会对正常组织产生毒副作用。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。
因此，作为本发明其中一个方面，本发明提供一种呼吸道给药的药物载体。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种呼吸道给药的药物载体，其包括全氟碳类化合物、磷脂，制备成乳剂，所述药物载体具有连续的水相和不连续的全氟碳相；
其中，所述全氟碳类化合物在所述药物载体中的质量占比为1％～60％；所述磷脂与全氟碳类化合物质量之和在所述药物载体中的占比不超过70％，磷脂与全氟碳类化合物质量之比为1：30～30：1；余量为水。
作为本发明所述的呼吸道给药的药物载体的一种优选方案：还包括，药物，所述药物与磷脂的质量比为100：1～1：100。
作为本发明所述的呼吸道给药的药物载体的一种优选方案：所述药物与磷脂的质量比为1：(1～30)，所述全氟碳类化合物在所述药物载体中的质量占比为1％～20％，所述磷脂在所述药物载体中的质量占比不超过20％。
作为本发明所述的呼吸道给药的药物载体的一种优选方案：所述乳剂包括普通乳、亚微乳、纳米乳，其平均粒径为30nm～250nm。
作为本发明所述的呼吸道给药的药物载体的一种优选方案：所述药物，包括具有生物学功能的大分子蛋白、多肽、小分子肽段、核酸、小分子化合物中的一种或几种。
作为本发明所述的呼吸道给药的药物载体的一种优选方案：所述磷脂包括卵磷脂、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)、二磷脂酰甘油(DG)中的一种或几种。
作为本发明所述的呼吸道给药的药物载体的一种优选方案：所述磷脂包括氢化大豆卵磷脂和/或蛋黄卵磷脂。
作为本发明其中一个方面，本发明提供制备所述的呼吸道给药的药物载体的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：制备所述的呼吸道给药的药物载体的方法，其包括，将磷脂、全氟碳类化合物、水混合均匀，制备水包油型全氟碳乳剂；或，
将药物与磷脂混合均匀制备药物磷脂复合物，将所述药物磷脂复合物与全氟碳类化合物、水混合均匀，制备水包油型全氟碳乳剂；或，
将药物与磷脂混合均匀制备药物磷脂复合物，将所述药物磷脂复合物与磷脂、全氟碳类化合物、水混合均匀，制备水包油型全氟碳乳剂。
作为本发明其中一个方面，本发明提供所述的药物载体在制备呼吸道给药的药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：所述的药物载体在制备呼吸道给药的药物中的应用。
作为本发明所述的药物载体在制备呼吸道给药的药物中的应用的一种优选方案：所述呼吸道给药的药物用于心脏功能保护。
本发明的有益效果：本发明将药物载于O/W乳剂的油相中，增强药物亲脂性，在保证良好生物相容性和患者依从性的基础上，提高药物的递送能力和效率。使药物能够稳定地处于O/W乳剂油相中，提高递送效率，因而实现了通过呼吸道灌肺的方式递送药物至心脏的目的。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为透射电子显微镜观察牛血清白蛋白(BSA)磷脂复合物全氟碳乳剂乳滴形态。
图2为通过荧光显微镜检测全氟碳乳剂在细胞水平的传递结果。
图3为荧光显微镜检测经呼吸道应用Cy5-BSA磷脂复合物全氟碳乳剂。
图4为过Western Blot法，检测经呼吸道应用PEDF磷脂复合物全氟碳乳剂8h后，与对照组相比，大鼠心肌组织PEDF的表达结果。
图5为通过TTC实验比较急性心肌梗死6h后梗死面积的大小。
图6为通过CCK-8实验，检测全氟碳乳剂对H9C2细胞的细胞活性的影响。Control代表对照组，Saline代表生理盐水组，PFOB代表全氟碳乳剂组。
图7为通过光镜观察肺组织HE染色切片，评估经呼吸道应用Cy5-BSA磷脂复合物全氟碳乳剂6h后对肺组织的影响。Control代表正常未做处理组；Saline 代表生理盐水组；PFOB代表全氟碳乳剂组；bar＝50um。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1：
蛋白磷脂复合物的制备：
将牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)1mg溶于3mlPH＝6.5的磷酸二氢钠(NaH2P04)缓冲液中，氢化大豆卵磷脂20mg溶于300ul无水乙醇中，混合搅拌反应，反应控制质量比为1：20，反应结束后冷冻干燥，获得21mgBSA 磷脂复合物。
实施例2：
全氟碳乳剂的制备：
全氟溴辛烷(PFOB)用氢化大豆卵磷脂乳化，具体为：使用60μlPFOB、 40mg氢化大豆卵磷脂、940μl蒸馏水获得1000μl全氟碳乳剂。
操作过程：混合氢化大豆卵磷脂(40mg)、PFOB(60μl)和蒸馏水(940μl)，磁力搅拌均匀，使用Avanti脂质体挤出器(0.1μm)反复挤出15次，以获得全氟碳乳剂，为水包油型乳剂。
实施例3：
蛋白磷脂复合物全氟碳乳剂的制备(说明书实施例中以蛋白质为例进行阐述，本领域技术人员明显能够知道的是，将本发明蛋白质替换为多肽或者其他药物分子同样能够实施)：
使用60μlPFOB、41mg实施例1制备的蛋白磷脂复合物、940μl蒸馏水获得1000μl蛋白磷脂复合物全氟碳纳米乳。
混合蛋白磷脂复合物(21mg)、氢化大豆卵磷脂(20mg)、PFOB(60μl) 和蒸馏水(940μl)，磁力搅拌均匀，使用Avanti脂质体挤出器(0.1um)反复挤出15次，以获得BSA磷脂复合物全氟碳纳米乳。
通过透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)观察全氟碳乳剂的形态。首先，将制备的制剂稀释100倍，取已经涂上无定型碳的铜网在乳液中浸润5-10min，后置于放有滤纸的培养皿中，自然干燥，随后将样品放入透射电镜样品槽内，进行观察。结果显示，该全氟碳乳剂的乳滴粒径约为100nm，见图1。
实施例4：
蛋白磷脂复合物全氟碳乳剂的制备：
使用60μlPFOB、21mg实施例1制备的蛋白磷脂复合物和20mg氢化大豆卵磷脂、940μl蒸馏水获得1000μl蛋白磷脂复合物全氟碳纳米乳。
混合蛋白磷脂复合物(41mg)、PFOB(60μl)和蒸馏水(940μl)，磁力搅拌均匀。使用Avanti脂质体挤出器(0.1um)反复挤出15次，以获得蛋白磷脂复合物全氟碳纳米乳液。
实施例5：
实施例3制备的全氟碳乳剂在细胞水平上的传递：
用微量荧光物质香豆素6溶解于60μlPFOB中，制备1000μl香豆素6标记的全氟碳纳米乳剂，将该乳剂(100μl)加入H9C2细胞培养皿中，恒温箱孵育 4h，荧光显微镜下观察，本实验重复4次，荧光结果见图2。结果表明全氟碳乳剂能够顺利被细胞摄取。
实施例6：
实施例3制备的全氟碳乳剂用于通过呼吸道方式传递蛋白质至心脏：
花氰染料Cy5标记BSA：BSA溶于PH＝6.5的磷酸二氢钠(NaH2P04)缓冲液中，磁力搅拌下，缓慢向其中加入Cy5-NHS溶液(1mg/ml，DMSO)，25℃，反应12h。反应控制质量比为200：1。反应结束后将混合样品置于透析袋(MW： 14000Da)中，然后将透析袋置于装有1L浓度为1％(V/V)的醋酸水溶液中透析2天，搅拌，每12h更换一次醋酸水溶液。透析结束后冷冻干燥，即得 Cy5-BSA。
以Cy5-BSA与大豆卵磷脂制备Cy5-BSA磷脂复合物：以Cy5-BSA磷脂复合物(42mg)、大豆卵磷脂(40mg)、PFOB(120μl)、蒸馏水(1880μl)制成 Cy5-BSA磷脂复合物全氟碳纳米乳剂(2000μl)，接着进行体内研究。
气管滴注全氟碳乳剂：将大鼠(250g)麻醉后，气管插管，滴注Cy5-BSA 磷脂复合物全氟碳纳米乳剂(500μl)，以滴注后6h为观察点，实验组大鼠数量为4只。
为评价蛋白质能否通过呼吸道传递至心肌组织，在气管滴注纳米乳剂6h 后，取下心脏组织做冰冻切片，荧光显微镜下观察，荧光结果见图3。结果显示Cy5-BSA经呼吸道成功到达大鼠心肌组织，并被吸收利用，表明蛋白质能够通过非侵入式方式应用，从呼吸道途径传递至心肌组织。
实施例7：
治疗性蛋白质的传递：
示例治疗性蛋白质的传递：色素上皮衍生因子(Pigment Epithelium-DerivedFactor，PEDF)可在缺氧条件下降低心肌细胞糖代谢，对心梗发生后的心肌具有保护作用。通过本发明制备的全氟碳乳剂载体，由呼吸道传递至心脏，保护心梗发生后的心肌细胞。
制备PEDF磷脂复合物全氟碳纳米乳剂：以PEDF蛋白(2mg)、大豆卵磷脂(40mg)制备PEDF磷脂复合物(42mg)。以PEDF磷脂复合物(42mg)、大豆卵磷脂(40mg)、PFOB(120μl)、蒸馏水(1880μl)制成PEDF磷脂复合物全氟碳纳米乳剂(2000μl)，接着进行体内研究。
气管滴注全氟碳乳剂：将大鼠(250g)麻醉后，气管插管，滴注PEDF磷脂复合物全氟碳纳米乳剂(500μl)，以滴注后8h为观察点。
示例性治疗性蛋白质的传递结果：为评价治疗性蛋白PEDF能否通过呼吸道传递至心肌组织，在气管滴注纳米乳剂8h后，取下心脏组织，行蛋白质免疫印迹(Western Blot，WB)法检测，结果见图4。
示例性治疗性蛋白质的治疗结果：为评价治疗性蛋白PEDF能否通过呼吸道传递至心肌组织，并发挥对心梗发生后的心肌细胞的保护作用，在气管滴注纳米乳剂8h后，结扎大鼠左冠状动脉前降支，造成心肌缺血模型，6h取下心脏组织，行TTC染色法计算梗死面积。对照组为正常未做任何处理组、气管滴注生理盐水8h后心肌缺血6h组，TTC结果见图5。结果显示通过呼吸道给药的方式，治疗性蛋白PEDF有效减小了大鼠心肌的梗死面积。
实施例8：
全氟碳乳剂的毒性检测：
全氟碳乳剂对细胞活性的影响：
在96孔板中接种H9C2细胞悬液，接种数量5000个/孔，将培养板在细胞培养箱(37℃，5％CO2)中培养24h。
按照上述实施例方法制备1ml全氟碳乳剂，在培养板中每孔加入10ul，继续培养24h。对照组不进行任何处理，生理盐水组加入等量生理盐水。
避光条件下，向每孔加入10ulCCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育2h。
用酶标仪测定在450nm处的吸光度，该实验重复3次，结果见图6。结果显示全氟碳乳剂未对H9C2细胞的细胞活性造成影响。
全氟碳乳剂对动物的影响：
按照上述实施例方法制备2ml全氟碳乳剂，接着进行动物体内研究。
气管滴注全氟碳乳剂：将大鼠(250g±15g)麻醉后，气管插管，滴注全氟碳纳米乳剂(500μl)，6h后腹主动脉放血处死，取下肺组织，无菌缓冲液冲洗， 4％多聚甲醛固定，而后进行常规石蜡包埋和HE染色处理，光镜下观察肺组织形态。该实验重复3次，结果见图7。结果显示全氟碳乳剂未对肺组织造成急性损伤。
相比于W/O型乳剂，本发明O/W乳剂具有更好的生物相容性和患者依从性。然而传统O/W乳剂的亲水性蛋白质总会存在于水相中，无法达到利用乳剂实现通过呼吸道蛋白递送至心脏的目的，导致递送效率下降或失败。因此，本发明将蛋白质、多肽或其他分子药物载于O/W乳剂的油相中，增强药物亲脂性，在保证良好生物相容性和患者依从性的基础上，提高蛋白质或多肽的递送能力和效率。本发明将蛋白质或多肽等药物与磷脂类物质形成药物磷脂复合物，能够增强药物的亲脂性，从而使药物能够稳定地处于O/W乳剂油相中，提高递送效率，因而实现了通过呼吸道灌肺的方式递送药物至心脏的目的。
图1通过透射电子显微镜观察BSA磷脂复合物全氟碳乳剂乳滴形态，乳滴具有100nm左右的直径。bar＝50nm。
图2通过荧光显微镜检测全氟碳乳剂在H9C2细胞水平的传递结果。箭头所指代表荧光物质香豆素6，bar＝20um。
图3通过荧光显微镜检测经呼吸道应用Cy5-BSA磷脂复合物全氟碳乳剂， 6h后传递至大鼠心肌组织的结果。箭头所指代表Cy5-BSA，bar＝20um。
图4通过Western Blot法，检测经呼吸道应用PEDF磷脂复合物全氟碳乳剂8h后，与对照组相比，大鼠心肌组织PEDF的表达结果。His-tag代表外源性PEDF特有的组氨酸标签。Control代表正常未做处理组；Saline代表生理盐水组；PEDF代表PEDF磷脂复合物全氟碳乳剂组。从图中可以看出治疗性蛋白PEDF能够通过呼吸道传递至心肌组织。
图5通过TTC实验比较急性心肌梗死6h后梗死面积的大小，验证经呼吸道应用PEDF磷脂复合物全氟碳乳剂后，对心脏的保护作用。Control代表正常未做处理组；Saline代表生理盐水组；PEDF代表PEDF磷脂复合物全氟碳乳剂组。蓝黑色代表正常区；红色代表缺血区；白色代表梗死面积。从附图可以看出通过呼吸道给药的方式，治疗性蛋白PEDF有效减小了大鼠心肌的梗死面积。
图6为通过CCK-8实验，检测全氟碳乳剂对H9C2细胞的细胞活性的影响。Control代表对照组，Saline代表生理盐水组，PFOB代表全氟碳乳剂组。结果显示全氟碳乳剂未对H9C2细胞的细胞活性造成影响。
图7为通过光镜观察肺组织HE染色切片，评估经呼吸道应用Cy5-BSA磷脂复合物全氟碳乳剂6h后对肺组织的影响。Control代表正常未做处理组；Saline 代表生理盐水组；PFOB代表全氟碳乳剂组；bar＝50um。结果显示全氟碳乳剂未对肺组织造成急性损伤。
本发明全氟碳乳剂以蛋白质、磷脂、PFC、水为原料，形成的乳剂具有连续的水相和不连续的全氟碳相，最终产物为蛋白磷脂复合物载于全氟碳乳滴中的水包油型乳剂。该乳剂性质稳定，易于保存，并且制作方式简易，对设备要求低，利于连续生产，为蛋白质的临床应用提供新的方式。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (7)
1.一种呼吸道给药的药物制剂，其特征在于：将药物与磷脂混合均匀制备药物磷脂复合物，将所述药物磷脂复合物与磷脂、全氟碳类化合物、水混合均匀，制备水包油型全氟碳乳剂；
所述药物制剂具有连续的水相和不连续的全氟碳相；其中，所述全氟碳类化合物在所述药物制剂中的质量占比为1%～20%；所述磷脂在所述药物制剂中的质量占比不超过20%，磷脂与全氟碳类化合物质量之比为1：30~30：1；余量为水；
还包括，药物，所述药物与磷脂的质量比为1：（1～30）；
所述药物，为色素上皮衍生因子（PEDF）；
所述药物通过呼吸道灌肺的方式递送药物至心脏。
2.根据权利要求1所述的呼吸道给药的药物制剂，其特征在于：所述乳剂包括普通乳、亚微乳、纳米乳，其平均粒径为30nm~250nm。
3.根据权利要求1所述的呼吸道给药的药物制剂，其特征在于：所述磷脂包括卵磷脂、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰甘油（PG）、二磷脂酰甘油（DG）中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的呼吸道给药的药物制剂，其特征在于：所述磷脂包括氢化大豆卵磷脂和/或蛋黄卵磷脂。
5.制备权利要求1所述的呼吸道给药的药物制剂的方法，其特征在于：
将药物与磷脂混合均匀制备药物磷脂复合物，将所述药物磷脂复合物与磷脂、全氟碳类化合物、水混合均匀，制备水包油型全氟碳乳剂。
6.权利要求1~5中任一项所述的药物制剂在制备呼吸道给药的药物中的应用，其特征在于：所述呼吸道给药的药物用于心脏功能保护，所述药物通过呼吸道灌肺的方式递送药物至心脏。
7.权利要求5所述的药物制剂在制备呼吸道给药的药物中的应用，其特征在于：所述用于心脏功能保护，包括治疗急性心肌梗死。
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