CN109897842B

CN109897842B - 淀粉酶突变体zdamya及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN109897842B
Application number: CN201910227641.3A
Authority: CN
Inventors: 罗会颖; 黄火清; 邱锦; 王亚茹; 涂涛; 王苑; 柏映国; 苏小运; 姚斌
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2019-03-25
Filing date: 2019-03-25
Publication date: 2020-12-11
Anticipated expiration: 2039-03-25
Also published as: CN109897842A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及淀粉酶突变体ZDAMYA及其编码基因和应用。本发明的淀粉酶突变体ZDAMYA，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明提供的突变酶酶活力由比野生型提高53％；突变后催化效率较野生型相比提高了1.52倍。因此，本发明提供的淀粉酶突变体能很好的满足食品、医药、饲料以及纺织工业等领域中应用的需求，具有广阔的应用前景。

Description

淀粉酶突变体ZDAMYA及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及淀粉酶突变体ZDAMYA及其编码基因和应用。

背景技术

淀粉酶是水解淀粉分子内的α-1，4糖苷键和α-1，6糖苷键得到葡萄糖、寡糖或者糊精等产物的一类酶。淀粉酶对于糊化淀粉具有很强的水解作用，因此可以迅速将淀粉水解，使其粘度降低，流动性增高，利于淀粉的糖化。啤洒是最早用酶酿造的产品之一，在啤洒酿造中添加淀粉酶可使淀粉快速液化以取代一部分麦芽，从而降低成本。此外，淀粉酶还普遍应用在医药、洗涤剂、焙烤、酒精工业、饲料以及纺织等行业。

高水解活力的淀粉酶在生产应用过程中有很大的优势，可以节约投资，提高产率，或作为饲料添加剂提高动物对营养物质的吸收效率。目前，国内外已经克隆表达出很多新型的淀粉酶，但这些酶在某些性质上存在一些缺点，从而限制其应用。例如，水解能力差、在酸性条件下稳定性差，或高温条件下稳定性不好等。虽然可以通过定向进化及理性分子改造方法获得淀粉酶工程菌株，但是进化的突变体的性状往往不可控制。因此，找到新的能够满足实际应用需求的淀粉酶，进一步推广其在饲料、食品、医药等行业中应用是产业上的迫切需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种淀粉酶突变体ZDAMYA。

本发明的再一目的在于提供上述淀粉酶突变体ZDAMYA的编码基因。

本发明的再一目的在于提供包含上述淀粉酶突变体ZDAMYA基因的重组表达载体。

本发明的再一目的在于提供包含上述淀粉酶突变体ZDAMYA的重组菌株。

本发明的再一目的在于提供上述淀粉酶突变体ZDAMYA的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述淀粉酶突变体ZDAMYA的应用。

根据本发明具体实施方式的野生型淀粉酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：

根据本发明具体实施方式的淀粉酶突变体ZDAMYA，将野生型淀粉酶氨基酸序列进行S62A/D63E/I64H/L473K/K474H/N475K突变，得到的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示：

根据本发明具体实施方式的野生型淀粉酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示：

根据本发明具体实施方式的淀粉酶突变体编码基因ZDAMY，其核苷酸序列如SEQID No.4所示：

根据本发明具体实施方式的含有淀粉酶突变体ZDAMYA基因的重组表达载体，优选为pHYP16-ZDAMY。

根据本发明具体实施方式的含有淀粉酶突变体ZDAMYA基因的重组菌株，菌株优选为SCK6/ZDAMY。

根据本发明具体实施方式的淀粉酶突变体ZDAMYA的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)用包含淀粉酶突变体ZDAMYA编码基因的重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

(2)培养重组菌株，诱导表达淀粉酶突变体ZDAMYA；

(3)分离并纯化淀粉酶突变体ZDAMYA。

根据本发明的具体实施方式的淀粉酶突变体ZDAMYA的应用，尤其是在食品、医药饲料和/或纺织工业领域中的应用。

本发明的淀粉酶突变体ZDAMYA的比活为10480U/mg，较野生型的6835U/mg提高了53％；野生型淀粉酶的K_m值为3.578mg/mL，淀粉酶突变体ZDAMYA的K_m值为2.498mg/mL；突变后催化效率由1577mL/s/mg升高至3908mL/s/mg，较野生型提高了1.48倍。70℃处理30min，野生型剩余92％酶活，淀粉酶突变体剩余91％酶活。因此，本发明提供的淀粉酶突变体能很好的满足食品、医药、饲料以及纺织工业等领域中应用的需求，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1显示淀粉酶在枯草芽孢杆菌SCK6中表达后的SDS-PAGE电泳检测结果；其中，1：野生型纯化后蛋白质条带，2：突变体纯化后蛋白质条带，M：蛋白Marker；

图2显示野生型及突变体淀粉酶学性质；其中，A显示野生型和突变体的最适温度；B显示野生型和突变体的最适pH；C显示野生型和突变体在70℃稳定性情况；D显示野生型和突变体在80℃稳定性情况。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：表达宿主Bacillus subtilis SCK6，表达质粒载体pHYP16-ZDAMY。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自Fermentas公司，连接酶购自Promaga公司。

3、培养基：

LB培养基：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％NaCl，pH 7.0；

淀粉培养基：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％NaCl，1％淀粉，1.5％琼脂，pH7.0。

实施例1定点突变淀粉酶编码基因

将突变位点设计为S62A/D63E/I64H/L473K/K474H/N475K。通过点突变试剂盒的方法引入突变位点，并对其进行测序验证，获得突变基因淀粉酶。所用引物如表1所示：

表1突变体淀粉酶特异性引物

测序结果表明，上述点突变扩增得到具有序列表中SEQ ID No.4的核苷酸序列，共1545bp，该编码区序列编码序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，共515个氨基酸残基。将该具有序列表中SEQ ID No.4中的核苷酸序列的片段命名为突变体基因ZDAMY；将具有序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白命名为淀粉酶突变体ZDAMYA。

实施例2制备淀粉酶突变体ZDAMYA

2.1获得重组质粒pHYP16-ZDAMY

分别扩增得到载体及目的片段，将二者回收后，按合适的比例混合，加入PCR体系中进行构建，获得含有所述淀粉酶基因的重组质粒。以构建好的野生型质粒作为模板，利用点突变试剂盒引入突变碱基，将上述所得重组质粒送去测序，验证序列的正确性。将所得质粒中插入的外源基因的序列为SEQ ID No：4第1-1545位核苷酸的重组质粒，命名为pHYP16-ZDAMY。

2.2获得重组菌SCK6/ZDAMY

将重组质粒pHYP16-ZDAMY转化芽孢杆菌SCK6细胞，获得重组菌株SCK6/ZDAMY。

2.3制备淀粉酶突变体

取上述重组芽孢菌株SCK6/ZDAMYA菌株，接种于50mL培养基的100mL三角瓶中，置于37℃，220rpm摇床培养24h；后将培养液转接于200mL培养基的1L三角瓶中，并再次置于37℃，220rpm条件下培养。离心后收集上清回收和亲和层析纯化淀粉酶突变体ZDAMYA，SDS-PAGE电泳结果如图1所示。

实施例3比较淀粉酶突变体ZDAMYA和野生型的性质

3.1分析比较酶活

采用紫外分光光度计法对淀粉酶酶活进行测定。具体方法如下：在给定条件下进行酶促反应，酶促反应体系为：1mL的反应体系，包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，在一定温度及pH条件下反应20min。在540nm波长处测定吸光度值，计算酶活。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下，单位时间内生成1μmol的葡萄糖所需的酶量。

将上述实施例2制备的突变体淀粉酶纯化后，在pH 7.0，60℃下测定酶活；野生型淀粉酶在pH 7.0，55℃下进行酶促反应以测定其酶活性。

酶活测定结果如图2所示，野生型的酶淀粉酶活力为6835U/mg，淀粉酶突变体的酶活力为10480U/mg。如图2中A所示,野生型最适温度55℃，突变体S62A/D63E/I64H/L473K/K474H/N475K最适温度60℃。如图2中B所示，野生型和突变体的最适pH均为6.0，pH 4-9突变体的酶活均高于野生型。如图2中C所示，70℃处理30min，野生型剩余92％酶活，突变体S62A/D63E/I64H/L473K/K474H/N475K剩余91％酶活。如图2中D所示，80℃处理60min，野生型剩余38％酶活，突变体S62A/D63E/I64H/L473K/K474H/N475K剩余20％酶活。

3.2测定动力学常数

野生型淀粉酶在pH 7.0，55℃下进行酶促反应以测定其酶活性；突变体在pH 7.0，60℃下测定酶活，测定方法如下：

所述野生型和突变体的动力学常数测定为在0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 7.0)缓冲液体系在55℃或60℃下反应10min，进行剩余酶活性测定。结果如表2所示：

表2野生型和突变体的酶活性质

结果如表2所示，野生型的酶活6835U/mg，突变体S62A/D63E/I64H/L473K/K474H/N475K比活为10480U/mg，比野生型提高了53％；野生型的K_m值为3.578mg/mL，突变后S62A/D63E/I64H/L473K/K474H/N475K的K_m值为2.498mg/mL；突变后催化效率由1577mL/s/mg升高至3908mL/s/mg，较野生型相比提高了1.48倍。

序列表

<110> 中国农业科学院饲料研究所

<120> 淀粉酶突变体ZDAMYA及其编码基因和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 514

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ile Gln Lys Arg Lys Arg Thr Val Ser Phe Arg Leu Val Leu Met

1 5 10 15

Cys Thr Leu Leu Phe Val Ser Leu Pro Ile Thr Lys Thr Ser Ala Val

20 25 30

Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro Asn Asp Gly

35 40 45

Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu Ser Asp Ile

50 55 60

Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Leu Ser Gln

65 70 75 80

Ser Asp Asn Gly Tyr Gly Pro Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu Phe

85 90 95

Gln Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Ser Glu Leu

100 105 110

Gln Asp Ala Ile Gly Ser Leu His Ser Arg Asn Val Gln Val Tyr Gly

115 120 125

Asp Val Val Leu Asn His Lys Ala Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp Val

130 135 140

Thr Ala Val Glu Val Asn Pro Ala Asn Arg Asn Gln Glu Thr Ser Glu

145 150 155 160

Glu Tyr Gln Ile Lys Ala Trp Thr Asp Phe Arg Phe Pro Gly Arg Gly

165 170 175

Asn Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe Asp Gly Ala

180 185 190

Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Ile Ser Arg Ile Phe Lys Phe Arg Gly

195 200 205

Glu Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Ser Glu Asn Gly Asn Tyr

210 215 220

Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Tyr Asp His Pro Asp Val Val

225 230 235 240

Ala Glu Thr Lys Lys Trp Gly Ile Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Ser Leu

245 250 255

Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Ala Lys His Ile Lys Phe Ser Phe Leu

260 265 270

Arg Asp Trp Val Gln Ala Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Glu Met Phe

275 280 285

Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asn Ala Gly Lys Leu Glu Asn Tyr

290 295 300

Leu Asn Lys Thr Ser Phe Asn Gln Ser Val Phe Asp Val Pro Leu His

305 310 315 320

Phe Asn Leu Gln Ala Ala Ser Ser Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met Arg

325 330 335

Arg Leu Leu Asp Gly Thr Val Val Ser Arg His Pro Glu Lys Ala Val

340 345 350

Thr Phe Val Glu Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu Ser

355 360 365

Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr

370 375 380

Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly Thr

385 390 395 400

Lys Gly Thr Ser Pro Lys Glu Ile Pro Ser Leu Lys Asp Asn Ile Glu

405 410 415

Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Glu Tyr Ala Tyr Gly Pro Gln His Asp

420 425 430

Tyr Ile Asp His Pro Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ser

435 440 445

Ser Ala Ala Lys Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly

450 455 460

Gly Ser Lys Arg Met Tyr Ala Gly Leu Lys Asn Ala Gly Glu Thr Trp

465 470 475 480

Tyr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Lys Ile Gly Ser Asp

485 490 495

Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Asp Gly Ser Val Ser Ile Tyr Val

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Gln Lys

<210> 2

<211> 514

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ile Gln Lys Arg Lys Arg Thr Val Ser Phe Arg Leu Val Leu Met

1 5 10 15

Cys Thr Leu Leu Phe Val Ser Leu Pro Ile Thr Lys Thr Ser Ala Val

20 25 30

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35 40 45

Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu Ala Glu His

50 55 60

Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Leu Ser Gln

65 70 75 80

Ser Asp Asn Gly Tyr Gly Pro Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu Phe

85 90 95

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100 105 110

Gln Asp Ala Ile Gly Ser Leu His Ser Arg Asn Val Gln Val Tyr Gly

115 120 125

Asp Val Val Leu Asn His Lys Ala Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp Val

130 135 140

Thr Ala Val Glu Val Asn Pro Ala Asn Arg Asn Gln Glu Thr Ser Glu

145 150 155 160

Glu Tyr Gln Ile Lys Ala Trp Thr Asp Phe Arg Phe Pro Gly Arg Gly

165 170 175

Asn Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe Asp Gly Ala

180 185 190

Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Ile Ser Arg Ile Phe Lys Phe Arg Gly

195 200 205

Glu Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Ser Glu Asn Gly Asn Tyr

210 215 220

Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Tyr Asp His Pro Asp Val Val

225 230 235 240

Ala Glu Thr Lys Lys Trp Gly Ile Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Ser Leu

245 250 255

Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Ala Lys His Ile Lys Phe Ser Phe Leu

260 265 270

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275 280 285

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Tyr Ile Asp His Pro Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ser

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Ser Ala Ala Lys Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly

450 455 460

Gly Ser Lys Arg Met Tyr Ala Gly Lys His Lys Ala Gly Glu Thr Trp

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Tyr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Lys Ile Gly Ser Asp

485 490 495

Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Asp Gly Ser Val Ser Ile Tyr Val

500 505 510

Gln Lys

<210> 3

<211> 1545

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgattcaaa aacgaaagcg gacagtttcg ttcagacttg tgcttatgtg cacgctgtta 60

tttgtcagtt tgccgattac aaaaacatca gccgtaaatg gcacgctgat gcagtatttt 120

gaatggtata cgccgaacga cggccagcat tggaaacgat tgcagaatga tgcggaacat 180

ttatcggata tcggaatcac tgccgtctgg attcctcccg catacaaagg attgagccaa 240

tccgataacg gatacggacc ttatgatttg tatgatttag gagaattcca gcaaaaaggg 300

acggtcagaa cgaaatacgg cacaaaatca gagcttcaag atgcgatcgg ctcactgcat 360

tcccggaacg tccaagtata cggagatgtg gttttgaatc ataaggctgg tgctgatgca 420

acagaagatg taactgccgt cgaagtcaat ccggccaata gaaatcagga aacttcggag 480

gaatatcaaa tcaaagcgtg gacggatttt cgttttccgg gccgtggaaa cacgtacagt 540

gattttaaat ggcattggta tcatttcgac ggagcggact gggatgaatc ccggaagatc 600

agccgcatct ttaagtttcg tggggaagga aaagcgtggg attgggaagt atcaagtgaa 660

aacggcaact atgactattt aatgtatgct gatgttgact acgaccaccc tgatgtcgtg 720

gcagagacaa aaaaatgggg tatctggtat gcgaatgaac tgtcattaga cggcttccgt 780

attgatgccg ccaaacatat taaattttca tttctgcgtg attgggttca ggcggtcaga 840

caggcgacgg gaaaagaaat gtttacggtt gcggagtatt ggcagaataa tgccgggaaa 900

ctcgaaaact acttgaataa aacaagcttt aatcaatccg tgtttgatgt tccgcttcat 960

ttcaatttac aggcggcttc ctcacaagga ggcggatatg atatgaggcg tttgctggac 1020

ggtaccgttg tgtccaggca tccggaaaag gcggttacat ttgttgaaaa tcatgacaca 1080

cagccgggac agtcattgga atcgacagtc caaacttggt ttaaaccgct tgcatacgcc 1140

tttattttga caagagaatc cggttatcct caggtgttct atggggatat gtacgggaca 1200

aaagggacat cgccaaagga aattccctca ctgaaagata atatagagcc gattttaaaa 1260

gcgcgtaagg agtacgcata cgggccccag cacgattata ttgaccaccc ggatgtgatc 1320

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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tttcatgtaa acgatgggtc cgtctccatt tatgttcaga aataa 1545

Claims

1.淀粉酶突变体ZDAMYA，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.淀粉酶突变体ZDAMYA基因，其特征在于，编码权利要求1所述的淀粉酶突变体ZDAMYA。

3.根据权利要求2所述的淀粉酶突变体ZDAMYA基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID No.4所示。

4.包含权利要求2所述的淀粉酶突变体ZDAMYA基因的重组表达载体。

5.包含权利要求2所述的淀粉酶突变体ZDAMYA基因的重组菌株。

6.制备权利要求1所述的淀粉酶突变体ZDAMYA的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）用包含淀粉酶突变体ZDAMYA编码基因的重组表达载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

（2）培养重组菌株，诱导表达淀粉酶突变体ZDAMYA；

（3）分离并纯化淀粉酶突变体ZDAMYA。

7.权利要求1所述的淀粉酶突变体ZDAMYA的用于水解淀粉的应用。

8.权利要求1所述的淀粉酶突变体ZDAMYA在食品、饲料和/或纺织工业领域中的应用。