CN109890419A

CN109890419A - 用于治疗癌症的载体-pd-l1结合剂组合物

Info

Publication number: CN109890419A
Application number: CN201780067542.2A
Authority: CN
Inventors: 斯韦托米尔·N·马尔科维奇; 温迪·K·内瓦拉
Original assignee: Mayo Foundation for Medical Education and Research
Current assignee: Mayo Foundation for Medical Education and Research
Priority date: 2016-09-01
Filing date: 2017-08-31
Publication date: 2019-06-14
Also published as: EP3506942A1; RU2019109211A; KR20220151022A; JP2025028161A; JP7525999B2; US20230159640A1; EP3506942B1; KR102462041B1; JP2019526578A; WO2018045239A1; US20190202916A1; AU2017318668A1; US11548946B2; EP4177271A1; CA3035378A1; ES2937291T3; MX2019002474A; JP2022082806A; KR20190129818A

Abstract

本文描述了结合剂和载体蛋白和任选的至少一种治疗剂的组合物，以及其制备和使用方法，特别是作为癌症治疗剂。还描述了结合剂和载体蛋白和任选的至少一种治疗剂的冻干组合物，以及其制备和使用方法，特别是作为癌症治疗剂。还描述了通过向患者施用纳米颗粒组合物和PD‑1免疫疗法来治疗和/或提高患有表达PD‑L1或PD‑L2的癌症的患者的免疫疗法的疗效的方法。

Description

用于治疗癌症的载体-PD-L1结合剂组合物

技术领域

本申请涉及结合剂和载体蛋白的新组合物及其制备和使用方法，特别是作为癌症治疗剂。

背景技术

化疗仍然是包括黑素瘤在内的许多癌症类型全身治疗的主要方法。大多数化学治疗剂对肿瘤细胞仅具有轻微选择性，并且对健康增殖细胞的毒性可能很高(Allen TM.(2002)Cancer 2:750-763)，通常需要减少剂量甚至停止治疗。理论上，克服化疗毒性问题以及提高药物疗效的一种方法是，使用对肿瘤细胞选择性表达(或过表达)的蛋白质具有特异性的抗体将化疗药物靶向肿瘤，以将靶向药物吸引到肿瘤，从而改变化疗的生物分布，并导致更多的药物进入肿瘤和对健康组织的影响更小。然而，尽管已经进行了30年的研究，但特异性靶向在治疗方面仍然鲜有成功。

常规抗体依赖性化疗(ADC)设计有通过合成的蛋白酶可切割连接体与靶向抗体连接的毒性剂。这种ADC疗法的功效取决于靶细胞与抗体结合的能力、待切割的连接体以及靶细胞对毒性剂的摄入。Schrama,D.et al.(2006)Nature reviews.Drug discovery 5:147-159。

靶向抗体的化疗具有优于常规疗法的优点，因为它提供靶向能力、多种细胞毒性剂和改善的治疗能力的组合，且具有潜在的较低毒性。尽管进行了广泛研究，但是临床上有效的靶向抗体的化疗仍然难以捉摸：主要障碍包括抗体和化疗药物之间的连接体的不稳定性、化学治疗剂与抗体结合时肿瘤毒性降低，以及缀合物不能结合并进入肿瘤细胞。另外，这些疗法不允许控制抗体-药物缀合物的大小。

本领域仍然需要基于抗体的癌症治疗剂，其对靶向药物递送保留细胞毒性作用，以提供优于现有治疗剂的可靠且改善的抗肿瘤功效。

编程性细胞死亡蛋白-1(PD-1，也称为CD279，下文称为“PD-1”)受体在激活的T细胞、B细胞以及骨髓细胞的表面表达。PD-1配体包括编程性死亡配体-1(PD-L1，也称为B7-H1、CD274，下文称为“PD-L1”)和编程性死亡配体-2(PD-L2，也称为B7-DC和CD273，在下文中称为“PD-L2”)，通常在树突细胞或巨噬细胞的表面表达。PD-L1在许多肿瘤上表达，包括在各种器官中发展的癌症，例如头颈、肺、胃、结肠、胰腺、乳腺、肾、膀胱、卵巢、子宫颈，以及黑素瘤、胶质母细胞瘤、多发性骨髓瘤、淋巴瘤和各种白血病。PD-L1通常在肿瘤细胞表面过表达，例如转移性非小细胞肺癌(NSLC)。

当与激活的T细胞的PD-1受体结合时，表达PD-L1的肿瘤细胞可利用PD-1途径的抑制性信号传导，从而限制或甚至停止宿主自身T细胞的抗肿瘤免疫应答。在该抑制性信号传导的另一方面，PD-1与PD-L1/PD-L2的相互作用的阻断或干扰会破坏由该途径发出信号的抑制。因此，基于PD-1、PD-L1或PD-L2的抗体的免疫疗法旨在克服肿瘤的这种免疫应答抵抗能力并恢复或再刺激宿主自身的针对肿瘤的免疫机制。

因此，需要提高患有表达PD-L1或PD-L2的癌症的患者的免疫疗法治疗的疗效。

发明概述

令人意外地和令人惊讶地发现，通过施用(a)治疗有效量的本文所述的纳米颗粒或纳米颗粒组合物和(b)PD-1免疫疗法，可以提高患有表达PD-L1或PD-L2的癌症的患者的免疫疗法治疗的疗效，其中所述纳米颗粒能够结合PD-L1或PD-L2。

已经开发并批准了抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体用于治疗各种癌症。抗PD-1抗体包括但不限于：由Bristol-Myers Squibb U.S.开发并且在美国被批准用于治疗转移性黑素瘤和鳞状NSCL癌的尼沃鲁单抗(Nivolumab,)；由Merck U.S.开发并批准用于治疗转移性黑素瘤的派姆单抗(Pembrolizumab,)。抗PD-L1抗体包括但不限于由瑞士Roche(Genentech U.S.)开发并且被批准用于治疗最常见的膀胱癌类型即尿路上皮癌的阿特珠单抗(atezolizumab)BMS-936559/MDX-1105(BristolMyers Squibb)、MeDI4736(MedImmune/AstraZeneca)以及MSB00100718C(EMD Serono)。参见，例如，Philips and Atkins“Therapeutic uses of anti-PD-1and anti-PD-L1antibodies”International Immunology Vol.27(1)pp.39-46。

阿特珠单抗是靶向PD-1途径从而阻断由此发出信号的免疫检查点抑制的人源化单克隆抗体。PD-1途径在本文中是指在PD-1和PD-L1/PD-L2相互作用后抑制T细胞免疫应答的信号传导。正在研究和开发使用其他抗PD-L1抗体(例如，阿维鲁单抗(avelumab)、度伐鲁单抗(durvalumab)、BMS 936559)治疗各种其他类型癌症的疗法，包括例如非鳞状NSCLC、肾细胞癌和膀胱癌。

与PD-L1类似，PD-L2结合PD-1。据报道，人PD-L1和PD-L2彼此共享约41％的氨基酸序列同一性，并具有相似的功能。PD-L2与PD-1的结合还抑制T细胞增殖以及细胞因子产生，从而证明了对T细胞免疫应答的类似抑制性调节。还正在研究和开发使用抗PD-L2抗体治疗各种其他类型癌症的疗法，包括例如非鳞状NSCLC、肾细胞癌和膀胱癌。

根据本发明，纳米颗粒包含(a)载体蛋白，(b)第一结合剂，和(c)任选的治疗剂，其中纳米颗粒能够结合PD-L1或PD-L2。在优选的实施方案中，纳米颗粒通过纳米颗粒的一种或多种组分(载体蛋白、结合剂和/或治疗剂)之间的非共价键保持在一起。

在一个方面，提供了治疗患有表达PD-L1或PD-L2的癌症的患者的方法，其中所述方法包括向患者施用(a)纳米颗粒(或包含纳米颗粒的纳米颗粒组合物)和(b)PD-1免疫疗法，其中每个纳米颗粒都包含载体蛋白、具有抗原结合部分的第一结合剂和任选地至少一种治疗剂，其中所述抗原是PD-L1或PD-L2，其中纳米颗粒能够结合PD-L1或PD-L2。在一个实施方案中，PD-1免疫疗法包括能够结合PD-1的第二结合剂。

另一方面，本发明涉及提高患有表达PD-L1或PD-L2的癌症的患者的免疫疗法治疗的疗效的方法，所述方法包括向患者施用(a)治疗有效量的本文所述的纳米颗粒组合物和(b)PD-1免疫疗法。在一个实施方案中，PD-1免疫疗法包括施用能够结合PD-1的第二结合剂。

在一个方面，本发明涉及治疗患有表达PD-L1或PD-L2的癌症的患者的方法，其中所述方法包括向患者施用(a)纳米颗粒(或包含纳米颗粒的纳米颗粒组合物)和(b)PD-1免疫疗法，其中每个纳米颗粒都包含白蛋白、具有抗原结合部分的抗体和紫杉醇，其中所述抗原是PD-L1或PD-L2；使得纳米颗粒能够结合PD-L1或PD-L2。在一个实施方案中，PD-1免疫疗法包含能够结合PD-1的第二抗体(抗PD-1抗体)。在一个实施方案中，抗体是抗PD-L1抗体。在一个实施方案中，抗体是抗PD-L2抗体。

在一些实施方案中，向患者联合施用CTLA-4免疫疗法和能够结合PD-L1或PD-L2的纳米颗粒。在一个实施方案中，除PD-1免疫疗法外还施用CTLA-4免疫疗法。在一个实施方案中，施用CTLA-4免疫疗法代替PD-1免疫疗法。在一个实施方案中，CTLA-4免疫疗法是抗CTLA-4抗体。

在一个方面，纳米颗粒组合物的每个纳米颗粒都包含约400至约1000个所述第一结合剂。

在一些方面，第一结合剂是适体。在一些方面，PD-1免疫疗法的第二结合剂是适体。

在一些方面，第一结合剂是抗体(例如，抗PD-L1抗体或抗PD-L2抗体)。在一些方面，PD-1免疫疗法的第二结合剂是抗体(例如，抗PD-1抗体)。在一些方面，抗PD-1抗体包括尼沃鲁单抗、派姆单抗、匹利珠单抗(Pidilizumab)、PDR001或其生物类似药。在一些方面，抗PD-L1抗体是阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗或BMS 936559(MDX1105)。在一些方面，CTLA-4免疫疗法的结合剂是抗CTLA-4抗体。在一个实施方案中，抗-CTLA-4抗体是易普利姆玛(ipilimumab)。

在一些方面，第一结合剂和/或第二结合剂是融合蛋白。在一个实施方案中，融合蛋白是AMP-224(PD-L2IgG2a融合蛋白；Amplimmune/GlaxoSmith Klein)；AMP-514(MEDI0680)(PD-L2融合蛋白；Amplimmune/GlaxoSmith Klein)，或其生物类似药。

在一些方面，纳米颗粒或纳米颗粒组合物是冻干的。

在一些方面，PD-1免疫疗法的第二结合剂是游离结合剂，其中游离结合剂并不与纳米颗粒组合物复合或以其他方式整合到纳米颗粒组合物之上和/或之中。

在一些方面，PD-1免疫疗法是免疫疗法纳米颗粒组合物，其包含与纳米颗粒组合物复合或整合到纳米颗粒组合物之上和/或之中的第二结合剂，其中免疫疗法纳米颗粒组合物包含载体蛋白和所述第二结合剂。

在一些方面，免疫疗法纳米颗粒组合物的第二结合剂是抗体。在一些方面，免疫疗法纳米颗粒组合物的第二结合剂是抗PD-1抗体。在一些方面，免疫疗法纳米颗粒组合物的抗体包含阿特珠单抗、尼沃鲁单抗、派姆单抗、阿维鲁单抗或度伐鲁单抗、匹利珠单抗、BMS936559、PDR001或其生物类似药。

在一些方面，免疫疗法纳米颗粒组合物的第二结合剂是融合蛋白。在一个实施方案中，融合蛋白是AMP-224(PD-L2IgG2a融合蛋白；Amplimmune/GlaxoSmith Klein)、AMP-514(MEDI0680)(PD-L2融合蛋白；Amplimmune/GlaxoSmith Klein)或其生物类似药。

在一些方面，免疫疗法纳米颗粒组合物的第二结合剂是适体。在一些方面，免疫疗法纳米颗粒组合物的第二结合剂是PD-1适体。

在一些方面，免疫疗法纳米颗粒和/或纳米颗粒组合物是冻干的。

在一些方面，顺序施用纳米颗粒组合物和PD-1免疫疗法。在一些方面，在施用PD-1免疫疗法之前施用纳米颗粒组合物。在一些方面，在施用纳米颗粒组合物之前施用PD-1免疫疗法。在一些方面，同时施用纳米颗粒组合物和PD-1免疫疗法。

在一些实施方案中，本发明涉及提高患有表达PD-L1或PD-L2的癌症的患者的免疫疗法治疗的疗效的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患者施用治疗有效量的本文所述的纳米颗粒或纳米颗粒组合物和包括第二结合剂的PD-1或CTLA-4免疫疗法。在一个实施方案中，第二结合剂能够结合PD-1或CTLA-4。在一个实施方案中，PD-1或CTLA-4免疫疗法包括含有载体蛋白(例如白蛋白)和第二结合剂以及任选的治疗剂(例如紫杉醇)的纳米颗粒。

在一些实施方案中，本发明涉及治疗患有表达PD-L1或PD-L2的癌症的患者的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向患者施用治疗有效量的本文所述的纳米颗粒组合物，并向患者施用包含第二结合剂的免疫疗法，其中纳米颗粒组合物的结合剂能够结合PD-L1、PD-L2或PD-1，并且免疫疗法的第二结合剂能够结合PD-L1、PD-L2或PD-1。

在不受理论束缚的情况下，据信结合剂通过本质上是弱的疏水相互作用与载体蛋白结合。然而，尽管组合物被冻干和重构，但各个组分的活性以及它们在纳米颗粒中的相对关系得以保持。还进一步考虑通过结合剂上的白蛋白结合基序和/或载体蛋白上的抗体结合基序发生与载体蛋白的结合，例如结合剂与载体蛋白的复合。白蛋白结合基序和抗体结合基序描述于2017年8月4日提交的PCT申请号PCT/US17/45643中，其通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，结合剂是非治疗性和非内源性人抗体、融合蛋白或适体。

由于纳米颗粒用于治疗，因此施加了进一步的挑战。

虽然可以通过组分之间的共价键来减轻纳米颗粒中疏水性组分的重排，但是这种共价键对纳米颗粒在癌症治疗中的治疗用途提出了挑战。结合剂、载体蛋白和另外的治疗剂通常在肿瘤的不同位置通过不同的机制起作用。非共价键允许纳米颗粒的组分在肿瘤处解离。因此，虽然共价键对于冻干可能是有利的，但是它对于治疗用途可能是不利的。

纳米颗粒的尺寸和尺寸的分布也是重要的。纳米粒子根据其尺寸可能有不同的表现。在大尺寸下，纳米颗粒或颗粒的聚集可能阻塞血管，其中任何一种血管都会影响组合物的性能和安全性。

当静脉内施用时，大颗粒(例如大于1μm)通常是不受欢迎的，因为它们可能滞留在肺的微脉管系统中。同时，较大的颗粒可以在肿瘤或特定器官中聚集。例如，20-60微米玻璃颗粒，也称为放射性栓塞，在临床用于肝癌，其被注射到供养肝脏肿瘤的肝动脉中以递送放射性元素。

因此，对于静脉内施用，使用1μm以下的颗粒。更通常地，将超过1μm的颗粒直接施用于肿瘤(“直接注射”)或供养肿瘤部位的动脉中。

最后，冷冻保护剂和有助于冻干过程的试剂必须是安全的并且耐受治疗用途。

在不希望受理论束缚的情况下，据信结合剂通过本质上是弱的疏水相互作用与载体蛋白结合。然而，尽管组合物被冻干和重构，仍然实现了各个组分的活性及其在纳米颗粒中的相对关系。

在一个方面，本文提供了包含纳米颗粒的纳米颗粒组合物，其中每个纳米颗粒都包含载体蛋白、结合剂和任选的至少一种治疗剂，其中结合剂从纳米颗粒的表面向外排列，并且其中纳米颗粒能够在体内结合PD-L1、PD-L2或PD-1。

在另一个方面，本文提供了包含纳米颗粒的纳米颗粒组合物，其中每个纳米颗粒都包含不是白蛋白的载体蛋白、结合剂和任选的至少一种治疗剂，其中结合剂排列在纳米颗粒的外表面上，并且其中纳米颗粒能够在体内结合PD-L1、PD-L2或PD-1。在一个实施方案中，纳米颗粒包含约100至约1000个，优选约400至约800个结合剂。当纳米颗粒多聚化时，结合剂的数量成比例增加。例如，如果160nm的纳米颗粒含有400个结合剂，320nm的二聚体则含有约800个结合剂。

在另一个方面，本文提供了包含纳米颗粒的纳米颗粒组合物，其中每个纳米颗粒都包含载体蛋白结合剂和任选的至少一种非紫杉醇的治疗剂，其中纳米颗粒能够在体内结合PD-L1、PD-L2或PD-1。在一个实施方案中，纳米颗粒还包含紫杉醇。在一个实施方案中，结合剂排列在纳米颗粒的表面上，使得结合剂的结合部分(例如抗体的可变区)被从该表面向外引导。

在其他实施方案中，纳米颗粒多聚化，例如二聚化。可以观察到多聚化，作为单位分子的重量或大小的倍数，例如，160nm的颗粒多聚化至约320nm、480nm、640nm等。在一些实施方案中，群体中少于20％的纳米颗粒是多聚体。在一些实施方案中，群体中大于80％的纳米颗粒是多聚体。

在一个实施方案中，载体结合的药物与结合剂(例如，白蛋白结合的紫杉醇和抗PD-L1或抗PD-L2抗体)的重量比在约5:1至约1:1之间。在一个实施方案中，载体结合的药物与结合剂的重量比为约10:4。在一个实施方案中，结合剂在纳米颗粒的全部或部分表面上基本上是单层。在一个实施方案中，组合物中小于0.01％的纳米颗粒的尺寸选自大于200nm、大于300nm、大于400nm、大于500nm、大于600nm、大于700nm和大于800nm。据信较大的尺寸是若干个纳米颗粒多聚化的结果，每个纳米颗粒都包含核心和在每个纳米颗粒的全部或部分表面上的结合剂涂层。

本发明还包括冻干组合物与新制备的纳米颗粒的性质实质上不同或相同的冻干组合物。特别是，在重悬于水溶液中时，冻干的组合物在粒径、粒径分布、癌细胞毒性、结合剂亲和性以及结合剂特异性方面与新鲜组合物相似或相同。令人惊讶的是，重悬浮后冻干的纳米颗粒保留了新制纳米颗粒的性质，尽管在这些颗粒中存在两种不同的蛋白质组分。

在一个方面，本发明涉及冻干的纳米颗粒或包含纳米颗粒的冻干的纳米颗粒组合物，其中每个纳米颗粒都包含载体结合的药物核心和一定量的结合PD-L1、PD-L2或PD-1的结合剂。在一个实施方案中，结合剂排列在核心的表面上，使得结合剂的结合部分被从该表面向外引导，其中结合剂在用水性重构时保持与纳米颗粒外表面的缔合(association)。在一个实施方案中，冻干的组合物在室温下稳定至少约3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长。在一个实施方案中，冻干的组合物在室温下稳定至少3个月。在一个实施方案中，重构的纳米颗粒保留治疗剂的活性，并且能够在体内结合靶标。在另一个实施方案中，组合物在约20℃至约25℃下稳定高达约12个月或更长。

在一个实施方案中，重构纳米颗粒的平均尺寸为约90nm至约1μm。在优选的实施方案中，重构纳米颗粒的平均尺寸为约100nm至约200nm，更优选约100nm至约160nm。在一个实施方案中，重构纳米颗粒的平均尺寸为大于800nm至约3.5μm，包含较小纳米颗粒的多聚体，例如，90-200nm的纳米颗粒的多聚体。在一个实施方案中，核心与结合剂的重量比为大于1:1至约1:3。在一个实施方案中，重构纳米颗粒的平均尺寸为约90nm至约225nm。

在一个方面，本公开涉及冻干的纳米颗粒或包含纳米颗粒的冻干的纳米颗粒组合物，其中每个纳米颗粒都包含：(a)白蛋白结合的紫杉醇核心和(b)结合PD-L1、PD-L2或PD-1并在白蛋白结合的紫杉醇核心的表面上排列的结合剂，使得结合剂的结合部分被从该表面向外引导，其中结合剂在用水溶液重构时保持与纳米颗粒表面的缔合，并且所述冻干组合物在约20℃至约25℃下稳定至少3个月，并且重构的纳米颗粒能够在体内结合PD-L1、PD-L2或PD-1。

在一个实施方案中，重构纳米颗粒的平均尺寸与新制备的纳米颗粒的粒径并无实质性不同。在一些实施方案中，平均粒径为90nm至800nm，包括90、100、110、130、150、160、200、300、400、500、600、700或800nm。在其他实施方案中，平均颗粒较大，例如，大于800nm到大约3.5μm。在一些实施方案中，颗粒是纳米颗粒的多聚体。在一些实施方案中，或者新鲜制备的，或者在冻干和重悬浮于适于注射的水溶液中之后，纳米颗粒的平均粒径为约90nm至约225nm。

在一些实施方案中，白蛋白结合的紫杉醇与结合剂的重量比为约5:1至约1:1。在其他实施方案中，结合白蛋白的紫杉醇与结合剂的重量比为约10:4。在进一步的实施方案中，白蛋白结合的紫杉醇与结合剂的重量比为大于1:1至约1:3。

在一些实施方案中，核心是白蛋白结合的紫杉醇(例如)，并且结合剂选自选择性识别PD-L1或PD-L2的结合剂。在一些实施方案中，核心是白蛋白结合的紫杉醇(例如)，并且结合剂选择性识别PD-1。在一些实施方案中，核心是白蛋白结合的紫杉醇(例如)，并且结合剂选择性识别CTLA-4。

在一些实施方案中，至少一种治疗剂位于纳米颗粒内。在其他实施方案中，至少一种治疗剂位于纳米颗粒的外表面上。仍然在其他实施方案中，至少一种治疗剂位于纳米颗粒内部和纳米颗粒的外表面上。

在一些实施方案中，纳米颗粒含有一种以上类型的治疗剂。例如，紫杉烷和铂类药物，例如紫杉醇和顺铂。

在一些实施方案中，结合剂包括阿特珠单抗、尼沃鲁单抗、派姆单抗、阿维鲁单抗或度伐鲁单抗、匹利珠单抗、BMS 936559或其生物类似药。在一些实施方案中，结合剂在纳米颗粒的全部或部分表面上基本上是单层结合剂。

在进一步的实施方案中，抗体的糖基化程度低于天然人抗体中通常发现的程度。例如表达系统或表达过程中糖基化抑制剂的存在可以影响这种糖基化。在一些实施方案中，通过酶促作用或化学作用改变抗体或其他结合剂的糖基化状态。

在一些实施方案中，所述至少一种治疗剂选自阿比特龙(abiraterone)、苯达莫司汀(bendamustine)、硼替佐米(bortezomib)、卡铂(carboplatin)、卡巴他赛(cabazitaxel)、顺铂、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、达沙替尼(dasatinib)、多西紫杉醇(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、厄洛替尼(erlotinib)、依托泊苷(etoposide)、依维莫司(everolimus)、吉非替尼(gefitinib)、伊达比星(idarubicin)、伊马替尼(imatinib)、羟基脲、伊马替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、亮丙瑞林(leuprorelin)、美法仑(melphalan)、甲氨蝶呤、米托蒽醌(mitoxantrone)、奈达铂(nedaplatin)、尼罗替尼(nilotinib)、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇、帕唑帕尼(pazopanib)、培美曲塞(pemetrexed)、吡铂(picoplatin)、罗米地辛(romidepsin)、赛特铂(satraplatin)、索拉非尼(sorafenib)、维罗非尼(vemurafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、替尼泊苷(teniposide)、三铂(triplatin)、长春碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春新碱(vincristine)和环磷酰胺。

在一些实施方案中，结合剂、载体蛋白和治疗剂(如存在)通过非共价键结合。

在一些实施方案中，载体蛋白选自明胶、弹性蛋白、麦醇溶蛋白、豆球蛋白、玉米醇溶蛋白、大豆蛋白、乳蛋白和乳清蛋白。在其他实施方案中，载体蛋白是白蛋白，例如人血清白蛋白。在一些实施方案中，载体蛋白是重组蛋白，例如重组人血清白蛋白。

在一些实施方案中，配制纳米颗粒组合物，用于静脉内递送。在其他实施方案中，配制纳米颗粒组合物，用于直接注射或灌注到肿瘤中。

在一些实施方案中，配制免疫疗法的第二结合剂，用于静脉内递送。在其他实施方案中，配制免疫疗法的第二结合剂，用于直接注射或灌注到肿瘤中。

在一些实施方案中，纳米颗粒组合物中的平均纳米颗粒尺寸为大于800nm至约3.5μm。

在一些实施方案中，纳米颗粒的解离常数为约1x 10^-11M至约1x 10^-9M。

另一方面，本文提供了制备纳米颗粒组合物的方法，其中所述方法包括使载体蛋白和任选的至少一种治疗剂与抗体在pH为5.0-7.5且温度为约5℃至约60℃、约23℃至约60℃或约55℃至约60℃的溶液中，在允许形成所需纳米颗粒的组分的条件和比例下接触。在一个实施方案中，在55-60℃和pH 7.0下制备纳米颗粒。另一方面，本文提供了制备纳米颗粒组合物的方法，其中所述方法包括(a)使载体蛋白和任选的至少一种治疗剂接触以形成核心，和(b)使核心与抗体在pH值为约5.0至约7.5的溶液中，在约5℃至约60℃、约23℃至约60℃或约55℃至约60℃的温度下，在允许形成所需纳米颗粒的组分的条件和比例下接触。

为了形成所需纳米颗粒，控制组分(例如，载体蛋白、抗体、治疗剂、其组合)的量。组分的量太稀的组合物不会形成本文所述的纳米颗粒。在优选的实施方案中，载体蛋白与结合剂的重量比为10:4。在一些实施方案中，载体蛋白的量为约1mg/mL至约100mg/mL。在一些实施方案中，结合剂的量为约1mg/mL至约30mg/mL。例如，在一些实施方案中，载体蛋白：结合剂：溶液的比例是在1mL溶液(例如盐水)中约9mg载体蛋白(例如白蛋白):4mg结合剂。还可以将一定量的治疗剂(例如紫杉醇)加入到载体蛋白中。

预形成本文所述的纳米颗粒，其意指在施用于患者之前(和/或在冻干纳米颗粒之前)，在允许形成纳米颗粒的条件下在体外混合载体蛋白(例如白蛋白)、治疗剂(例如紫杉醇)和结合剂(例如抗体)。在一些实施方案中，在施用于患者之前，将在水溶液中稀释预形成的纳米颗粒。作为非限制性实例，可以在施用于患者前不超过5、10、20、30、45分钟或60分钟，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或24小时，稀释预形成的纳米颗粒用于施用。

在进一步的实施方案中，如上制备纳米颗粒，然后冻干。

在另一个方面，本文提供了用于治疗癌细胞的方法，所述方法包括使细胞与有效量的本文公开的纳米颗粒组合物和免疫疗法接触以治疗癌细胞。

另一方面，本文提供了治疗有需要的患者的肿瘤的方法，所述方法包括使肿瘤与有效量的本文公开的纳米颗粒组合物和免疫疗法接触以治疗肿瘤。在一些实施方案中，减小肿瘤的尺寸。

通常，以与标准临床方案一致的方式，例如，与FDA-(或其他监管机构)批准的标签一致的方式施用免疫疗法(PD-1免疫疗法和/或CTLA-4免疫疗法)。

在一些实施方案中，本文提供的方法包括以下步骤：a)每周一次施用纳米颗粒组合物和免疫疗法，持续三周；b)停止施用纳米颗粒组合物和免疫疗法一周；c)根据需要重复步骤a)和b)以治疗癌症或肿瘤。

在相关实施方案中，治疗包括在施用免疫疗法之前施用纳米颗粒组合物。在一个实施方案中，在施用免疫疗法之前约6-48小时或12-48小时施用纳米颗粒组合物。在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之前6-12小时施用纳米颗粒组合物。还在另一个实施方案中，在施用免疫疗法之前2-8小时施用纳米颗粒组合物。仍然在其他实施方案中，在施用免疫疗法前一周施用纳米颗粒组合物。

在相关实施方案中，治疗包括在施用纳米颗粒组合物之前施用免疫疗法。在一个实施方案中，在施用纳米颗粒组合物之前约6-48小时或12-48小时施用免疫疗法。在另一个实施方案中，在施用纳米颗粒组合物之前6-12小时施用免疫疗法。还在另一个实施方案中，在施用纳米颗粒组合物之前2-8小时施用免疫疗法。仍然在其他实施方案中，在施用纳米颗粒组合物前一周施用免疫疗法。

在一些实施方案中，治疗有效量的纳米颗粒组合物包含约75mg/m²至约175mg/m²的载体蛋白(即，每平方米患者的载体蛋白毫克数)。在其他实施方案中，治疗有效量包含约75mg/m²至约175mg/m²的治疗剂(例如紫杉醇)。在其他实施方案中，治疗有效量包含约30mg/m2至约70mg/m²的结合剂。还在其他实施方案中，治疗有效量包含约30mg/m²至约70mg/m²贝伐珠单抗(bevacizumab)。

在一个实施方案中，冻干组合物包含约75mg/m²至约175mg/m²的优选为白蛋白的载体蛋白、约30mg/m²至约70mg/m²的结合剂、约75mg/m²至约175mg/m²的紫杉醇。

在一些实施方案中，本发明涉及试剂盒，其包含：(a)一定量的本文所述的纳米颗粒组合物，(b)一定量的能够结合PD-1的免疫治疗剂，和任选的(c)使用说明。

附图简述

以下附图仅是本发明的代表，并非旨在作为限制。为了一致，使用和利妥昔单抗(rituximab)的纳米颗粒使用首字母缩写词“AR”，AR之后的数字如AR160意在赋予这些纳米颗粒的平均粒径(以纳米计，基于Mastersizer 2000分析)。同样，当结合剂是阿特珠单抗时，首字母缩写词是“AA”，其后的数字是纳米颗粒的平均粒径(以纳米计，基于Malvern Nanosight分析)。

图1描绘了实验结果，其中CD20阳性Daudi淋巴瘤细胞分别用图板F和A中的荧光标记的抗人CD20或同种型匹配的对照标记，并通过流式细胞术分析。在其他图板中，在CD20标记之前，将Daudi细胞用(ABX)、ABX/利妥昔单抗纳米颗粒(AR160)、冻干并重悬浮的AR160(AR160L)或利妥昔单抗预处理。CD20结合被AR160纳米颗粒和利妥昔单抗特异性阻断，但不是被单独的ABX特异性阻断，这表明AR160和AR160L在这些细胞上结合CD20并阻断荧光抗CD20抗体的结合。

图2是图1的散点图的直方图叠加。

图3A-B描绘了ABX单独相对于ABX/利妥昔单抗纳米颗粒(AR；图3A)和ABX/曲妥珠单抗纳米颗粒(AT；图3B)的粒径比较，两者均为新鲜制备的并冻干/重悬浮的。

图4比较了Daudi细胞增殖试验中ABX和AR颗粒的毒性。

图5A-5C图示了在用标记的用非特异性(贝伐珠单抗)抗体(ABIgG)涂覆的标记的或用利妥昔单抗(AR160)涂覆的标记的处理的小鼠中获得的结果。图5A描绘了每个肿瘤(ROI 2、3和4)和背景区域(ROI 1、5和6)中感兴趣区域(ROI)中的荧光累积。ROI 1、5和6作为背景参考。图5B是所有三个治疗组中小鼠每单位肿瘤面积的平均荧光的条形图，并显示了总肿瘤递送。图5C是通过背景ROI归一化的每单位肿瘤面积的平均荧光的条形图，以给出递送至肿瘤的药物与身体的比例。数据表明，与单独的或涂有非特异性抗体的相比，AR160纳米颗粒给药导致荧光增加。

图6描述了用单剂量盐水、BEV24(贝伐珠单抗24mg/kg)、ABX30(ABX，30mg/kg)、AB160(12mg/kg BEV和30mg/kg ABX)和AB225(24mg/kg BEV和30mg/kg ABX)治疗的小鼠的存活。在给药后30天，用AB225和AB160治疗的小鼠的存活远远超过单独用BEV或单独用治疗的小鼠的存活。

图7显示了阿特珠单抗和ABX之间的结合亲和力。Kd经测定为1.462x10^-9。使用链霉抗生物素蛋白探针进行生物层干涉测量(BLItz)(Forte Bioscience)。

图8A显示了由Mastersizer NS300测定的单独ABX(平均尺寸为90nm)和ABX-阿特珠单抗纳米颗粒(AA；平均尺寸为129nm)的粒径分布。图8B是来自图8A的ABX-阿特珠单抗纳米颗粒的照片。

图9A-9E显示了与标记的抗PD-L1抗体竞争结合PD-L1阳性人黑素瘤细胞系C8161的ABX-阿特珠单抗纳米颗粒(AA130)的流式细胞术。用同种型对照抗体(图9A)、未处理(图9B)、(图9C)、阿特珠单抗(图9D)或AA130(图9E)预处理C8161细胞，然后用荧光标记的抗PD-L1抗体标记。

图10显示了ABX(实线)和AA130(虚线)对C8161细胞的剂量依赖性毒性。

图11A-11D显示了，在注射2x10⁶PD-L1阳性C8161黑素瘤肿瘤细胞，然后用盐水(图11A)、单独的阿特珠单抗(18mg/kg；图11B)、单独的ABX(45mg/kg；图11C)和AA130(18mg/kg阿特珠单抗和45mg/kg ABX；图11D)通过100ul IV尾静脉注射一次治疗的小鼠中，肿瘤体积随时间的变化。每周监测肿瘤生长3次。肿瘤尺寸用下式计算：(长度×宽度²)/2。

图12描绘了来自图11A-11D所示实验的小鼠的存活。使用Graph Pad软件生成Kaplan Meier曲线。对于盐水、阿特珠单抗、Abraxane和AA130而言，每组的中值存活分别为14天、13天、16天和21.5天。AA130与所有其他组之间的存活差异明显，盐水的p值为0.0008，阿特珠单抗的p值为0.0015，ABX的p值为0.0113。

发明详述

在阅读本说明书之后，对于本领域技术人员来说，如何在各种替代实施方案和替代应用中实现本发明将变得显而易见。然而，这里不会描述本发明的所有各种实施方案。应当理解，这里给出的实施方案仅作为示例而非限制来呈现。因此，各种替代实施方案的详细描述不应被解释为限制如下所述的本发明的范围或广度。

在公开和描述本发明之前，应理解下述方面不限于特定组合物、制备此类组合物的方法或其用途，因此当然可以改变。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定方面的目的，而非意图限制。

将本发明的详细描述分成各个部分仅是为了方便读者，并且在任何部分中找到的公开内容可以与另一部分中的公开内容组合。为了方便读者，可以在说明书中使用标题或副标题，这些标题或副标题不旨在影响本发明的范围。

定义

除非另外定义，否则本文使用的所有科技术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在本说明书和随后的权利要求中，会参考许多术语，这些术语应定义为具有以下含义：

这里使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并不意图限制本发明。如本文所用，单数形式“一个/种(a)”，“一个/种(an)”和“所述(the)”旨在也包括复数形式，除非上下文另有明确说明。

“任选的(optional)”或“任选地(optionally)”是指随后描述的事件或情况可以发生或可以不发生，并且所述描述包括所述事件或情况发生和不发生的情形。

术语“约”当用于数字标号之前时，例如温度、时间、量、浓度等，包括范围，表示近似值可以变化(+)或(-)10％、5％、1％或其间的任何子范围或子值。优选地，当针对剂量使用时，术语“约”意指剂量可以变化+/-10％。例如，“约400至约800个粘合剂”表示纳米颗粒的外表面含有的结合剂的量为360-880个颗粒。

“包含(comprising)”或“包含(comprises)”旨在表示组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由......组成”意味着排除对于所述目的的组合具有任何重要意义的其他元素。因此，基本上由本文定义的元素组成的组合物不排除不会实质上影响要求保护的发明的基本和新颖特征的其他材料或步骤。“由......组成”是指排除超过微量元素的其他成分和实质性方法步骤。由这些过渡术语的每一个定义的实施方案都在本发明的范围内。

本文所用的术语“纳米颗粒”或“纳米颗粒复合物”是指具有至少一个小于5微米的维度的颗粒。在优选的实施方案中，例如对于静脉内给药，纳米颗粒具有至少一个小于1微米的维度。对于直接给药，纳米颗粒更大。本发明明确考虑了甚至更大的颗粒。

在一群颗粒中，单个颗粒的尺寸围绕平均值分布。因此，群的粒径可以用平均值表示，也可以用百分位数表示。D50是这样一种粒径，即50％的颗粒低于此粒径。10％的颗粒小于D1O值，90％的颗粒小于D90。如果不清楚，“平均”尺寸相当于D50。因此，例如，AB160和AR160是指平均尺寸为160纳米的纳米颗粒。

术语“纳米颗粒”还可包括较小单位纳米颗粒的离散多聚体。例如，320nm颗粒包含单位160nm纳米颗粒的二聚体。因此，对于160nm的纳米颗粒，多聚体会为约320nm、480nm、640nm、800nm、960nm、1120nm等。

如本文所用的术语“载体蛋白”是指用于转运结合剂和/或治疗剂的蛋白质。本公开的结合剂可以可逆地结合载体蛋白。载体蛋白的实例在下文有更详细的讨论。

如本文所用的术语“核心”是指纳米颗粒的可以由载体蛋白、载体蛋白和治疗剂或其他试剂或试剂组合组成的中心部分或内部部分。在一些实施方案中，结合剂的一部分可与核心结合(例如，非共价结合)。

本文所用的术语“治疗剂”是指治疗上有用的试剂，例如用于治疗、缓解或减轻疾病状态、生理状况、症状或病因，或用于其评价或诊断的试剂。治疗剂可以是化学治疗剂，例如，有丝分裂抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、类固醇、抗肿瘤抗生素，抗代谢物、烷化剂、酶、蛋白酶体抑制剂或其任何组合。

如本文所用，术语“结合剂”、“特异性结合剂”或“特异性结合……的结合剂”是指结合靶抗原并且不显著结合不相关化合物的试剂。可以在所公开的方法中有效使用的结合剂的实例包括但不限于凝集素、蛋白质和抗体，例如单克隆抗体，例如人源化单克隆抗体，嵌合抗体或多克隆抗体或其抗原结合片段，以及适体、融合蛋白和适体。在一个实施方案中，结合剂是外源抗体。外源性抗体是不在具体哺乳动物例如人中由哺乳动物的免疫系统天然产生的抗体。

如本文所用的术语“抗体(antibody)”或“抗体(antibodies)”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分(即，含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子)。所述术语还指由两个免疫球蛋白重链和两个免疫球蛋白轻链组成的抗体以及其多种形式，包括全长抗体及其部分；包括例如，免疫球蛋白分子、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR嫁接抗体、人源化抗体、Fab、Fab'、F(ab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv，单结构域抗体(dAb)、双抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、抗独特型抗体、双特异性抗体、其功能活性表位结合片段、双功能杂合抗体(例如Lanzavecchia et al.,Eur.J Immunol.17,105(1987))和单链(例如Huston et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.,85,5879-5883(1988)和Bird et al.,Science 242,423-426(1988)，其通过引用并入本文)。(通常参见Hood et al.,Immunology(免疫学),Benjamin,N.Y.,2ND ed.(1984)；Harlow and Lane,Antibodies.A LaboratoryManual(抗体：实验室手册),Cold Spring Harbor Laboratory(1988)；Hunkapiller andHood,Nature,323,15-16(1986)，其通过引用并入本文)。抗体可以是任何类型(例如，IgG、IgA、IgM、IgE或IgD)。优选地，抗体是IgG。抗体可以是非人的(例如，来自小鼠、山羊或任何其他动物)、全人的、人源化的或嵌合的。一种抗体或多种抗体包括本文公开的抗体的任何生物类似药。本文所用的生物类似药是在质量、安全性和功效上被认为与创新公司销售的参考产品相当的生物药物(Section 351(i)of the Public Health Service Act(42U.S.C.262(i))。

术语“解离常数”，也称为“K_d”，是指表示特定物质分离成单个组分(例如蛋白质载体、抗体和任选的治疗剂)的程度的量。

本文所用的术语“冻干的”、“冻干”等是指首先冷冻待干燥的材料(例如，纳米颗粒)，然后通过在真空环境中升华除去冰或冷冻溶剂的方法。赋形剂任选地包括在预冻干制剂中以增强冻干产品在储存时的稳定性。在一些实施方案中，纳米颗粒可以在用作治疗剂之前由冻干组分(载体蛋白、抗体和任选的治疗剂)形成。在其他实施方案中，首先将载体蛋白、结合剂例如抗体和任选的治疗剂组合成纳米颗粒，然后冻干。冻干样品还可以含有另外的赋形剂。

术语“填充剂(bulking agent)”包括提供冻干产品结构的试剂。用于填充剂的常见实例包括甘露醇、甘氨酸、乳糖和蔗糖。除了提供药学上优雅的块状物之外，填充剂还可以在改变塌陷温度方面提供有用的品质，从而提供冻融保护，并且在长期储存中提高蛋白质稳定性。这些试剂也可以作为张力改性剂。在一些实施方案中，本文所述的冻干组合物包含填充剂。在一些实施方案中，本文所述的冻干组合物不包含填充剂。

术语“缓冲剂”包括在冻干前将溶液pH维持在可接受范围内的那些试剂，并且可包括琥珀酸盐(钠或钾)、组氨酸、磷酸盐(钠或钾)、三(三(羟甲基)氨基甲烷)、二乙醇胺、柠檬酸盐(钠)等。本发明的缓冲剂的pH值为约5.5至约6.5；优选pH为约6.0。将pH控制该范围内的缓冲剂的实例包括琥珀酸盐(例如琥珀酸钠)、葡糖酸盐、组氨酸、柠檬酸盐和其他有机酸缓冲剂。

术语“冷冻保护剂”通常包括提供蛋白质对抗冷冻诱导的应激的稳定性的试剂，可能是以优先从蛋白质表面排除应激的方式。它们还可以在初级和二级干燥以及长期产品储存期间提供保护。实例是多聚体，例如葡聚糖和聚乙二醇；糖，如蔗糖、葡萄糖、海藻糖和乳糖；表面活性剂如聚山梨醇酯；和氨基酸，如甘氨酸、精氨酸和丝氨酸。

术语“冻干保护剂”包括在干燥或“脱水”过程(初级和二级干燥循环)通过以下方式为蛋白质提供稳定性的试剂：提供无定形玻璃状基质并通过氢键与蛋白质结合，取代在干燥过程中除去的水分子。这有助于维持蛋白质构象，在冻干循环期间使蛋白质降解最小化并改善长期产品。实例包括多元醇或糖，例如蔗糖和海藻糖。

术语“药物制剂”是指这样的制剂，其形式使得活性成分有效，并且不含对制剂所施用的对象有毒的另外成分。

“药学上可接受的”赋形剂(媒介、添加剂)是可以合理地施用于个体哺乳动物以提供有效剂量的所用活性成分的赋形剂。

“重构时间”是将冻干制剂再水化成溶液所需的时间。

“稳定”制剂是其中的蛋白质在储存时基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性的制剂。例如，用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术可在本领域中获得，并在以下文献中有综述：Peptide and Protein Drug Delivery(肽和蛋白质药物递送),247-301,Vincent Lee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)和Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)。可以在选定的温度下、选定的时间段内测量稳定性。

本文所用的术语“表位”是指抗原的被结合剂例如抗体识别的部分。表位包括但不限于能够与蛋白质(例如抗体)或配体特异性相互作用的短氨基酸序列或肽(任选地糖基化或以其他方式修饰)。例如，表位可以是结合剂的抗原结合位点附着的分子的一部分。

术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”涵盖治疗诸如人等个体的疾病或病症(例如，癌症)，并且包括：(i)抑制疾病或病症，即阻止其发展；(ii)缓解疾病或病症，即导致疾病或病症逆转；(iii)减缓疾病或病症的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓疾病或病症的一种或多种症状的进展。在一些实施方案中，“治疗”或“治疗”是指杀伤癌细胞。

就癌症治疗而言，术语“杀伤”涉及包括会导致癌细胞或癌细胞群的至少一部分死亡的任何类型的操作。

术语“适体”是指能够结合诸如多肽等靶分子的核酸分子。例如，本发明的适体可以特异性结合PD-L1、PD-L2、PD-1或CTLA-4。具有特定结合特异性的抗体的产生和适体的治疗用途在本领域中已经很好地建立。参见，例如U.S.Pat.No.5,475,096、U.S.Pat.Nos.5,270,163、5,582,981、5,840,867、6,011,020、6,051,698、6,147,204、6,180,348以及6,699,843，以及(Eyetech,New York)治疗年龄相关性黄斑变性的治疗效力，其全部内容通过引用并入本文。

如本文所用的术语“低聚体”或“低聚的(oligomeric)”或“低聚的(oligomerized)”是指由两种或更多种单体组成的低聚体。

融合蛋白是将一种肽(例如，抗体的可结晶片段(Fc)结构域)与另一种例如蛋白质结构域、肽或核酸或肽适体等生物活性剂连接，以产生具有所需结构功能特性和显著治疗潜力的分子的生物工程多肽。γ免疫球蛋白(IgG)同种型由于有利的特征例如募集效应功能和增加血浆半衰期通常用作产生Fc-融合蛋白的基础。鉴于可用作融合配偶体的适体即肽和核酸两者的范围，融合蛋白具有许多生物和药物应用。

如本文所用，术语“顺序地”是指以任何顺序一个接一个地施用两种或更多种治疗。在一些实施方案中，治疗在彼此超过48小时内施用。在一些实施方案中，治疗在彼此约48小时内，彼此约36小时内，彼此约24小时内，彼此约12小时内，彼此约10小时内，彼此约8小时内，彼此约6小时内，彼此约4小时内，彼此约2小时内，或彼此约1小时内施用。

本文所用术语“同时”是指以基本上相同的时间以任何顺序施用的两种或更多种治疗。

本文所用的术语“PD-1”是指编程性细胞死亡蛋白-1，也称为CD279，其在激活的T细胞、B细胞以及骨髓细胞的表面上表达。

本文所用的术语“PD-L1”是指编程性死亡-配体1，也称为B7-H1或CD274，是通常在树突细胞或巨噬细胞的表面上表达的PD-1配体。

本文所用的术语“PD-L2”是指编程性死亡配体-2，也称为B7-DC或CD273，是通常在树突细胞或巨噬细胞的表面上表达的PD-1配体。

本文所用的术语“生物类似药(biosimilar)”或“生物类似药(biosimilar)”，也称为“后续生物制剂(follow-on biologic)”或“后续进入生物制剂(subsedquent entrybiologic)”，是指生物制品，其是由监管机构经批准的产品的实质上相同的副本。

如本文所用，术语“协同”或“协同效应”或“协同有效量”或“协同功效”是指大于通过施用至少两种产生的叠加疗效，并且超过在不给予其他药剂的情况下给药其中一种药剂所产生的疗效。例如，当与结合剂顺序或同时施用以提供协同效应时，纳米颗粒组合物的疗效提高，条件是所述提高大于单独施用时结合剂和纳米颗粒组合物的叠加效力。术语“协同治疗量”通常是指低于一种或两种治疗剂的标准治疗量，这意味着所需疗效所需的量低于单独使用治疗剂时所需的量。协同治疗量还包括以标准治疗剂量给予一种治疗剂而以低于标准治疗剂量施用另一种治疗剂。

如本文所用，纳米颗粒组合物或结合剂的术语“治疗有效量”或“疗效”是指纳米颗粒组合物或结合剂水平，其中疾病或病症的生理作用至少得到改善。可以使用一个或多个片剂、胶囊或其他药物单位在一次或多次给药中给予治疗有效量。构成治疗有效量的纳米颗粒组合物或结合剂的量应根据纳米颗粒组合物或结合剂、病症及其严重程度以及待治疗的个体的一般健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受性而变化，但可以由本领域普通技术人员常规确定。在一些实施方案中，术语“治疗有效量”是指协同有效量或协同治疗量。

另外，本说明书中使用的一些术语在下面有更具体的定义。

综述

本发明部分地基于以下令人惊讶的发现，即任选冻干的纳米颗粒，其包含载体蛋白、结合剂以及治疗剂，例如具有PD-L1或PD-L2结合结构域的抗体、适体或融合蛋白，向肿瘤提供靶向治疗，同时使对患者的毒性最小化。因此，与常规ADC相比，本文所述的纳米颗粒具有显著改善。

本发明还部分地基于免疫检查点抑制剂免疫疗法(例如，PD-1免疫疗法和/或CTLA-4免疫疗法)与纳米颗粒的协同作用而预测。不受理论束缚，预期本文所述的结合剂(例如，抗体)结合PD-L1或PD-L2会消耗或减少可用于结合T细胞上PD-1的PD-L1或PD-L2的量，从而提高基于PD-1的免疫疗法的疗效。单独施用或与PD-1免疫疗法联合施用纳米颗粒可以增加不含PD-1途径介导的抑制的T细胞的数量，并恢复患者对表达PD-L1-或PD-L2的癌症的免疫应答。

为了使常规ADC有效，关键是连接体足够稳定，不在体循环中解离，但允许在肿瘤部位释放足够的药物。Alley,S.C.,et al.(2008)Bioconjug Chem 19:759-765。这已被证明是开发有效药物缀合物的主要障碍(Julien,D.C.,et al.(2011)MAbs 3:467-478；Alley,S.C.,et al.(2008)Bioconjug Chem 19:759-765)；因此，本文描述的纳米颗粒的吸引人的特征是不需要生化连接体。

当前ADC的另一个缺点是，尚未在人肿瘤中实质证明渗透到肿瘤中的药物较高。在小鼠模型中进行的早期ADC测试表明，用抗体靶向肿瘤会导致肿瘤中活性剂的浓度较高(Deguchi,T.et al.(1986)Cancer Res 46:3751-3755)；然而，这与人类疾病的治疗无关，可能是因为人类肿瘤在渗透性方面比小鼠肿瘤更加异质。Jain,R.K.et al.(2010)Nat RevClin Oncol 7:653-664。而且，纳米颗粒的尺寸对于从脉管系统外渗到肿瘤是至关重要的。在使用人结肠腺癌异种移植模型进行的小鼠研究中，血管孔可渗透高达400nm的脂质体。Yuan,F.,et al.(1995)Cancer Res 55:3752-3756。另一项关于肿瘤孔径和渗透性的研究表明，这两种特征都依赖于肿瘤位置和生长状态，其中逆转性肿瘤和颅骨肿瘤可以渗透小于200nm的颗粒。Hobbs,S.K.,et al.(1998)Proc Natl Acad Sci U S A 95:4607-4612。本文所述的纳米免疫缀合物(纳米颗粒)通过以下事实克服了这一问题：小于200nm的完整大复合物在体循环中部分解离成更容易渗透肿瘤组织的较小功能单位。此外，一旦缀合物到达肿瘤部位，可以释放较小的毒性有效负载，并且仅有毒部分而不是整个缀合物需要被肿瘤细胞吸收。

含有治疗剂的抗体(即)涂覆的白蛋白纳米颗粒(即)的出现，已经导致将两种或更多种治疗剂定向递送至体内预定位点的新范例。参见PCT专利公开号WO2012/154861和WO2014/055415，其各自通过引用整体并入本文。

当白蛋白和结合剂例如抗体的组合物以特定浓度和比例在水溶液中混合在一起时，可用于本发明的结合剂自发地自组装到白蛋白中和白蛋白上，形成具有多拷贝(高达500或更多)的结合剂的纳米颗粒。在不受任何理论限制的情况下，预期结合剂(例如，抗体)通过结合剂的一个或多个白蛋白结合基序和载体蛋白上的一个或多个抗体结合基序非共价结合载体蛋白(例如白蛋白)。此类基序的实例可以见于PCT申请号PCT/US17/45643中，其通过引用整体并入本文。

虽然包含单一来源蛋白质的蛋白质组合物通常以冻干形式储存，其中它们表现出显著的保存期，但是这种冻干组合物通常不含有通过疏水-疏水相互作用整合在一起的两种不同蛋白质的自组装纳米颗粒。而且，其中结合剂的大部分结合部分暴露在纳米颗粒表面上的纳米颗粒构型使其自身易于通过会被认为是良性的条件移位或重新配置。例如，在冻干过程中，蛋白质上的离子电荷脱水，从而暴露下面的电荷。暴露的电荷允许两种蛋白质之间的可以改变每种蛋白质与另一种蛋白质的结合亲和性的电荷相互作用。此外，随着溶剂(例如水)的去除，纳米颗粒的浓度显著增加。这种增加的纳米颗粒浓度可能导致不可逆的低聚化。低聚化是蛋白质的一种已知特性，其与单体形式相比降低低聚体的生物学性质，并且增加颗粒的尺寸，有时超过1微米。

另一方面，临床用途和/或商业用途需要稳定形式的纳米颗粒组合物，其中需要至少3个月的保存期并且优选超过6个月或9个月的保存期。这种稳定的组合物必须易于静脉内注射，必须在静脉注射后保持其自组装形式，以便在体内将纳米颗粒引导至预定部位，必须具有小于1微米的最大尺寸，以避免当递送到血流中时缺血事件，最后必须与注射所用的含水组合物相容。

化合物

在阅读本公开内容后对于本领域技术人显而易见的是，本公开涉及含有载体蛋白、结合剂和任选的至少一种治疗剂的纳米颗粒组合物，其中所述组合物任选地是冻干的。

在一些实施方案中，载体蛋白可以是白蛋白、明胶、弹性蛋白(包括topoelastin)或弹性蛋白衍生的多肽(例如，α-弹性蛋白和弹性蛋白样多肽(ELP))、麦醇溶蛋白、豆球蛋白、玉米醇溶蛋白、大豆蛋白(例如，大豆蛋白分离物(SPI))、乳蛋白(例如，β-乳球蛋白(BLG)和酪蛋白)或乳清蛋白(例如，乳清蛋白浓缩物(WPC)和乳清蛋白分离物(WPI))。在优选的实施方案中，载体蛋白是白蛋白。在优选的实施方案中，白蛋白是蛋清(卵清蛋白)、牛血清白蛋白(BSA)等。在甚至更优选的实施方案中，载体蛋白是人血清白蛋白(HSA)。在一些实施方案中，载体蛋白是重组蛋白，例如重组人血清白蛋白。在一些实施方案中，载体蛋白通常被认为是由美国食品和药物管理局(FDA)批准的安全(GRAS)赋形剂。

在一些实施方案中，结合剂是抗体。

在一些实施方案中，抗PD-1抗体包括尼沃鲁单抗、派姆单抗、匹利珠单抗、PDR001或其生物类似药。在一些方面，抗PD-L1抗体是阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗或BMS936559(MDX1105)。在一些方面，CTLA-4免疫疗法的结合剂是抗CTLA-4抗体。在一个实施方案中，抗-CTLA-4抗体是易普利姆玛。

在一些方面，第一结合剂和/或第二结合剂是融合蛋白。在一个实施方案中，融合蛋白是AMP-224(PD-L2IgG2a融合蛋白；Amplimmune/GlaxoSmith Klein)；AMP-514(MEDI0680)(PD-L2融合蛋白；Amplimmune/GlaxoSmith Klein)，或其生物类似药。AMP-224和AMP-514靶向PD-1。

在一些实施方案中，抗体在纳米颗粒的全部或部分表面上基本上是单层抗体。

表1描绘了抗体的非限制性列表的列表。

表1：抗体实例

在一些实施方案中，所述至少一种治疗剂选自阿比特龙、苯达莫司汀、硼替佐米、卡铂、卡巴他赛、顺铂、苯丁酸氮芥、达沙替尼、多西紫杉醇、多柔比星、表柔比星、厄洛替尼、依托泊苷、依维莫司、吉非替尼、伊达比星、伊马替尼、羟基脲、伊马替尼、拉帕替尼、亮丙瑞林、美法仑、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奈达铂、尼罗替尼、奥沙利铂、紫杉醇、帕唑帕尼、培美曲塞、吡铂、罗米地辛、沙铂、索拉非尼、维罗非尼、舒尼替尼、替尼泊苷、三铂、长春碱、长春瑞滨、长春新碱和环磷酰胺。优选地，治疗剂是紫杉醇。另外的治疗剂是已知的，例如PCT公开号WO2017/031368所列出的那些，其通过引用整体并入本文。

应当理解，治疗剂可位于纳米颗粒内、纳米颗粒的外表面上或两者。纳米颗粒可含有一种以上的治疗剂，例如，两种治疗剂、三种治疗剂、四种治疗剂、五种治疗剂或更多种。此外，纳米颗粒可以在纳米颗粒内部和外部含有相同或不同的治疗剂。

在一个方面，纳米颗粒包含至少100个非共价结合纳米颗粒表面的结合剂。在一个方面，纳米颗粒包含至少200个非共价结合纳米颗粒表面的结合剂。在一个方面，纳米颗粒包含至少300个非共价结合纳米颗粒表面的结合剂。在一个方面，纳米颗粒包含至少400个非共价结合纳米颗粒表面的结合剂。在一个方面，纳米颗粒包含至少500个非共价结合纳米颗粒表面的结合剂。在一个方面，纳米颗粒包含至少600个非共价结合纳米颗粒表面的结合剂。

在一个方面，纳米颗粒包含约100至约1000个非共价结合于纳米颗粒表面的结合剂。在一个方面，纳米颗粒包含约200至约1000个非共价结合于纳米颗粒表面的结合剂。在一个方面，纳米颗粒包含约300至约1000个非共价结合于纳米颗粒表面的结合剂。在一个方面，纳米颗粒包含约400至约1000个非共价结合于纳米颗粒表面的结合剂。在一个方面，纳米颗粒包含约500至约1000个非共价结合于纳米颗粒表面的结合剂。在一个方面，纳米颗粒包含约600至约1000个非共价结合于纳米颗粒表面的结合剂。在一个方面，纳米颗粒包含约200至约800个非共价结合于纳米颗粒表面的结合剂。在一个方面，纳米颗粒包含约300至约800个非共价结合于纳米颗粒表面的结合剂。在优选的实施方案中，纳米颗粒包含约400至约800个非共价结合于纳米颗粒表面的结合剂。考虑的值包括任何所述范围内的任何值或子范围，包括端点。

在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒径小于约1μm。在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒径为约90nm至约1μm。在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒径为约90nm至约900nm。在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒径为约90nm至约800nm。在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒径为约90nm至约700nm。在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒径为约90nm至约600nm。在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒径为约90nm至约500nm。在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒径为约90nm至约400nm。在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒径为约90nm至约300nm。在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒径为约90nm至约200nm。在优选的实施方案中，纳米颗粒组合物的平均粒径为约100nm至约180nm。在特别优选的实施方案中，纳米颗粒组合物的平均粒径为约130nm或约160nm。考虑的值包括任何所述范围内的任何值、子范围或范围，包括端点。在一个实施方案中，使用Mastersizer 2000测定纳米颗粒尺寸。在一个实施方案中，使用Malvern Nanosight测定纳米颗粒尺寸。

在一个方面，配制纳米颗粒组合物，用于静脉内注射。为了避免缺血事件，配制用于静脉内注射的纳米颗粒组合物应包含平均粒径小于约1μm的纳米颗粒。

在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒径大于约1μm。在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒径为约1μm至约5μm。在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒径为约1μm至约4μm。在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒径为约1μm至3μm。在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒径为约1μm至约2μm。在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒径为约1μm至约1.5μm。考虑的值包括任何所述范围内的任何值、子范围或范围，包括端点。

在一个方面，配制纳米颗粒组合物，用于直接注射到肿瘤中。直接注射包括注射到肿瘤部位或近肿瘤部位、灌注到肿瘤中等。当配制用于直接注射到肿瘤中时，纳米颗粒可包含任何平均粒径。在不受理论束缚的情况下，据信较大的颗粒(例如，大于500nm、大于1μm等)更可能固定在肿瘤内，从而提供有益效果。较大的颗粒可在肿瘤或特定器官中聚集。参见例如20-60微米的玻璃颗粒，其用于注入供养肝脏肿瘤的肝动脉中，称为(用于肝癌的临床用途)。因此，对于静脉内给药，通常使用1μm以下的颗粒。更通常将超过1μm的颗粒直接施用于肿瘤(“直接注射”)或进入供养肿瘤部位的动脉。

在一个方面，组合物中小于约0.01％的纳米颗粒的粒径大于200nm，大于300nm，大于400nm，大于500nm，大于600nm，大于700nm，或大于800nm。在一个方面，组合物中小于约0.001％的纳米颗粒的粒径大于200nm，大于300nm，大于400nm，大于500nm，大于600nm，大于700nm，或者大于800nm。在优选的实施方案中，组合物中小于约0.01％的纳米颗粒的粒径大于800nm。在更优选的实施方案中，组合物中小于约0.001％的纳米颗粒的粒径大于800nm。

在优选的方面，本文所述的尺寸和尺寸范围涉及重构的冻干纳米颗粒组合物的粒径。即，在将冻干的纳米颗粒重悬浮在水溶液(例如水，其他药学上可接受的赋形剂、缓冲剂等)中之后，粒径或平均粒径在本文所述的范围内。

在一个方面，至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的纳米颗粒作为单个纳米颗粒存在于重构的组合物中。也就是说，少于约50％、40％、30％等的纳米颗粒二聚化或低聚化。

在一些实施方案中，组合物的纳米颗粒的二聚化数量小于20％，小于10％，优选小于5％。

在一些实施方案中，可以通过调节载体蛋白与结合剂的量(例如比例)来控制纳米颗粒的尺寸。纳米颗粒的尺寸和尺寸分布也很重要。本发明的纳米颗粒可根据其尺寸而表现不同。在大尺寸时，凝聚可能阻塞血管。因此，纳米颗粒的凝聚可能影响组合物的性能和安全性。另一方面，较大的颗粒在某些条件下可能更具治疗性(例如，当不是静脉内给药时)。

在一个方面，纳米颗粒组合物包含至少一种另外的治疗剂。在一个实施方案中，至少一种另外的治疗剂非共价结合于纳米颗粒的外表面。在一个实施方案中，至少一种另外的治疗剂排列于纳米颗粒的外表面上。在一个实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂选自阿比特龙、苯达莫司汀、硼替佐米、卡铂、卡巴他赛、顺铂、苯丁酸氮芥、达沙替尼、多西紫杉醇、多柔比星、表柔比星、厄洛替尼、依托泊苷、依维莫司、吉西他滨、吉非替尼、伊达比星、伊马替尼、羟基脲、伊马替尼、拉帕替尼、亮丙瑞林、美法仑、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奈达铂、尼罗替尼、奥沙利铂、帕唑帕尼、培美曲塞、吡铂、罗米地辛、沙拉非尼、索拉非尼、维罗非尼、舒尼替尼、替尼泊苷、三乙酸甘氨酸、长春碱、长春瑞滨、长春新碱和环磷酰胺。在一个实施方案中，至少一种另外的治疗剂是抗癌结合剂，例如抗癌抗体。另外的抗癌抗体是已知的，例如PCT公开号WO2017/031368所列出的那些，其通过引用整体并入本文。

制备纳米颗粒的方法

在一些方面，本发明涉及制备本文所述的纳米颗粒组合物的方法。

在一个方面，通过使载体蛋白颗粒或载体蛋白治疗剂颗粒与结合剂以载体蛋白颗粒或载体蛋白治疗剂颗粒与结合剂的比例为约10:1至约10:30的比率接触，形成纳米颗粒组合物的纳米颗粒。在一个实施方案中，所述比例为约10:2至约10:25。在一个实施方案中，所述比例为约10:2至约1:1。在优选的实施方案中，所述比例为约10:2至约10:6。在特别优选的实施方案中，所述比例为约10:4。考虑的比率包括任何所述范围内的任何值、子范围或范围，包括端点。

在一个实施方案中，用于形成纳米颗粒的溶液或其他液体介质的量特别重要。在载体蛋白(或载体蛋白治疗剂)和抗体的过于稀的溶液中不形成纳米颗粒。过于浓缩的溶液会导致非结构化聚集体。在一些实施方案中，所用的溶液(例如，无菌水、盐水、磷酸缓冲盐水)的量为约0.5mL溶液至约20mL溶液。在一些实施方案中，载体蛋白的量为约1mg/mL至约100mg/mL。在一些实施方案中，结合剂的量为约1mg/mL至约30mg/mL。例如，在一些实施方案中，载体蛋白：结合剂：溶液的比例为在1mL溶液(例如，盐水)中约9mg载体蛋白(例如白蛋白)，4mg结合剂，例如抗体(例如BEV)。还可以将一定量的治疗剂(例如紫杉醇(taxol))加入到载体蛋白中。例如，可以在1mL溶液中加入1mg紫杉醇(taxol)、9mg载体蛋白(10mg载体蛋白治疗剂)和4mg结合剂，例如抗体、Fc融合分子或适体。使用典型的静脉内注射袋例如，具有约1升溶液的静脉内注射袋，与1mL使用的量相比，需要使用1000倍量的载体蛋白/载体蛋白治疗剂和抗体。因此，不能在标准静脉内注射袋中形成本发明的纳米颗粒。此外，当将成分以本发明的治疗量添加到标准静脉内注射袋中时，所述成分不会自组装而形成纳米颗粒。

在一个实施方案中，使载体蛋白颗粒或载体蛋白治疗剂颗粒在pH为约4至约8的溶液中与结合剂接触。在一个实施方案中，使载体蛋白颗粒或载体蛋白治疗剂颗粒在pH为约4的溶液中与结合剂接触。在一个实施方案中，使载体蛋白颗粒或载体蛋白治疗剂颗粒在pH约为5的溶液中与结合剂接触。在一个实施方案中，使载体蛋白颗粒或载体蛋白治疗剂颗粒在pH约为6的溶液中与结合剂接触。在一个实施方案中，使载体蛋白颗粒或载体蛋白治疗剂颗粒在pH值为约7的溶液中与结合剂接触。在一个实施方案中，使载体蛋白颗粒或载体蛋白治疗剂颗粒在pH约为8的溶液中与结合剂接触。在优选的实施方案中，使载体蛋白颗粒或载体蛋白治疗剂颗粒在pH为约5至约7的溶液中与结合剂接触。

在一个实施方案中，将载体蛋白颗粒或载体蛋白治疗剂颗粒与结合剂在约5℃至约60℃或在所述范围内的任何范围、子范围或值，包括端点的温度下孵育。在优选的实施方案中，将载体蛋白颗粒或载体蛋白治疗剂颗粒与结合剂在约23℃至约60℃的温度下孵育。

在不受理论束缚的情况下，据信纳米颗粒组合物中纳米颗粒的稳定性至少部分地取决于形成纳米颗粒的温度和/或pH，以及溶液中成分(即载体蛋白、结合剂和任选的治疗剂)的浓度。在一个实施方案中，纳米颗粒的K_d为约1x 10^-11M至约2x 10^-5M。在一个实施方案中，纳米颗粒的K_d为约1x 10^-11M至约2x 10^-8M。在一个实施方案中，纳米颗粒的K_d为约1x 10^-11M至约7x 10^-9M。在优选的实施方案中，纳米颗粒的K_d为约1x 10^-11M至约3x 10^-8M。考虑的值包括任何所述范围内的任何值、子范围或范围，包括端点。

冻干

冻干或冷冻干燥从组合物中除去水。在该方法中，首先将待干燥的材料冷冻，然后通过在真空环境中升华除去冰或冷冻的溶剂。预冻干制剂可包括赋形剂以增强冷冻干燥过程中的稳定性和/或改善冻干产品在储存时的稳定性。Pikal,M.Biopharm.3(9)26-30(1990)和Arakawa et al.,Pharm.Res.8(3):285-291(1991)。

虽然可以冻干蛋白质，但冻干和重构过程可能影响蛋白质的性质。因为蛋白质比传统的有机和无机药物更大且更复杂(即除了复杂的三维结构之外还具有多个官能团)，这种蛋白质制剂带来了特殊的问题。为了使蛋白质保持生物活性，制剂必须保持蛋白质氨基酸的至少核心序列的构象完整性，同时保护蛋白质的多个官能团免于降解。蛋白质的降解途径可涉及化学不稳定性(即涉及通过键形成或切割修饰蛋白质，导致新化学实体的任何过程)或物理不稳定性(即蛋白质的高级结构的变化)。化学不稳定性可由脱酰胺、外消旋化、水解、氧化、β消除或二硫化物交换引起。例如，物理不稳定性可以由变性、聚集、沉淀或吸附引起。三种最常见的蛋白质降解途径是蛋白质聚集、脱酰胺和氧化。Cleland,et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4):307-377(1993)。

在存在或不存在稳定剂、缓冲剂等的情况下，通过标准冻干技术制备本发明的冻干组合物。令人惊奇的是，这些条件不会改变纳米颗粒的相对脆弱的结构。此外，这些纳米颗粒在冻干时充其量保持其尺寸分布，并且更重要的是，可以以与新鲜制备的基本相同的形式和比例重构，用于体内施用(例如，静脉内递送)。

制剂

在一个方面，配制纳米颗粒组合物，用于全身递送，例如静脉内递送。

在一个方面，配制纳米颗粒组合物用于直接注射到肿瘤中。直接注射包括注射到肿瘤部位或近肿瘤部位、灌注到肿瘤中等。因为纳米颗粒组合物不是全身施用的，所以配制用于直接注射到肿瘤中的纳米颗粒组合物可包含任何平均粒径。在不受理论束缚的情况下，据信较大的颗粒(例如，大于500nm，大于1μm等)更可能固定在肿瘤内，从而提供被认为是更好的有益效果。

在另一个方面，本文提供了包含本文提供的纳米颗粒和至少一种药学上可接受的赋形剂的组合物。

通常，可以配制本文提供的组合物，用于通过任何可接受的给药方式施用于患者。本领域可获得各种制剂和药物递送系统。参见，例如Gennaro,A.R.,ed.(1995)Remington'sPharmaceutical Sciences(雷明顿药物学),18th ed.(第十八版),Mack Publishing Co.。

通常，本文提供的纳米颗粒应通过以下途径中的任一种作为药物组合物施用：口服给药、全身(例如，透皮、鼻内或通过栓剂)给药或肠胃外(例如，肌肉内、静脉内或皮下)给药。

通常，组合物由本发明的纳米颗粒与至少一种药学上可接受的赋形剂的组合组成。可接受的赋形剂是无毒的，有助于施用，并且不会不利地影响所要求保护的化合物的治疗益处。这种赋形剂可以是任何固体、液体、半固体，或者在气溶胶组合物的情况下，可以是本领域技术人员通常可获得的气态赋形剂。

固体药物赋形剂包括淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶，硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、脱脂乳等。液体和半固体赋形剂可选自甘油、丙二醇、水、乙醇和各种油，包括石油，动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。优选的液体载体，特别是用于可注射溶液的液体载体包括水、盐水、葡萄糖水溶液和乙二醇。其他合适的药物赋形剂及其制剂描述于Remington'sPharmaceutical Sciences(雷明顿药物学),edited by E.W.Martin(E.W.Martin编辑)(Mack Publishing Company,18th ed.(第十八版),1990。

如果需要，可将本发明的组合物提供于含有一个或多个含有活性成分的单位剂型的包装或分配器装置中。这种包装或装置可以例如包括金属箔或塑料箔，例如泡罩包装或玻璃，以及橡胶塞，例如小瓶。包装或分配器装置可附有给药说明。还可以制备包含在相容的药物载体中配制的本发明的纳米颗粒的组合物，将其置于合适的容器中，并标记用于治疗指定的疾病状况。

治疗方法

如本文所述的纳米颗粒组合物可用于治疗患有表达PD-L1和/或PD-L2的癌症或肿瘤的哺乳动物的癌细胞和/或肿瘤。在优选的实施方案中，哺乳动物是人(即人类患者)。优选地，在给药之前将冻干的纳米颗粒组合物重构(悬浮在含水赋形剂中)。

在一个方面，提供了治疗癌细胞的方法，所述方法包括使细胞与有效量的本文所述的纳米颗粒和免疫疗法(例如，PD-1或CTLA-4)接触以治疗癌细胞。癌细胞的治疗包括但不限于增殖减少、杀伤细胞、防止细胞转移等。

本文所用的“免疫疗法(immune therapy)”、“免疫疗法(immune therapies)”、“免疫疗法(immunotherapy)”或“免疫疗法(immunotherapies)”通常是指通过诱导、增强或抑制免疫应答来治疗疾病。在一些情况下，免疫疗法(immune therapies)或免疫疗法(immunotherapies)可以引发或激活或扩增免疫应答(也称为“激活免疫疗法”)，或减少或抑制免疫应答(也称为“抑制免疫疗法”)。例如，癌症免疫疗法(cancer immune therapy)或癌症免疫疗法(cancer immunotherapy)试图刺激或激活针对肿瘤或癌细胞的免疫应答。如本领域技术人员所理解的，免疫疗法(immune therapy)或免疫疗法(immunotherapy)可利用多种方法或机制，包括但不限于抗体、抗原、免疫应答细胞的使用和/或激化，例如淋巴细胞、巨噬细胞、树突细胞、其他抗原呈递细胞、自然杀伤细胞(NK细胞；例如NK-92)、T细胞(例如，辅助T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)等)，疗法涉及免疫调节剂(包括，但不限于：白细胞介素(例如，IL-2、IL-7、IL-12等)，细胞因子(例如，干扰素、G-CSF、咪喹莫特等)，趋化因子(例如，CCL3、CCL26、CXCL7等)，免疫调节性酰亚胺药物等)。可以通过使用一种类型的抗体或多种类型的抗体来施用免疫疗法(immune therapy)或免疫疗法(immunotherapy)。免疫疗法(immune therapy approach)或免疫疗法(immunotherapy approach)也可以单独施用或与其他治疗剂或机制例如化学治疗剂等联合施用，以增强针对例如肿瘤的免疫应答。

在一个方面，提供了治疗有需要的患者的肿瘤的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的本文所述的纳米颗粒组合物和免疫疗法以治疗肿瘤。在一个实施方案中，减小肿瘤的尺寸。在一个实施方案中，肿瘤尺寸在治疗期间和/或治疗后至少一段时间内不增加(即进展)。

在一个实施方案中，静脉内施用纳米颗粒组合物。在一个实施方案中，将纳米颗粒组合物直接施用于肿瘤。在一个实施方案中，通过直接注射或灌注于肿瘤中施用纳米颗粒组合物。

在一个实施方案中，静脉内施用免疫疗法。在一个实施方案中，将免疫疗法直接施用于肿瘤。在一个实施方案中，通过直接注射或灌注到肿瘤中施用免疫疗法。

在一个方面，提供了治疗患有表达PD-L1或PD-L2的癌症的患者的方法，其中所述方法包括向患者施用包含纳米颗粒的纳米颗粒组合物，其中每个纳米颗粒都包含载体蛋白、具有PD-L1或PD-L2结合部分的结合剂和任选的至少一种治疗剂，其中纳米颗粒能够结合PD-L1或PD-L2。在一些实施方案中，所述方法还包括向患者施用PD-1免疫疗法。在一个实施方案中，PD-1免疫疗法包括施用能够结合PD-1的第二结合剂。

另一方面，本发明涉及提高患有表达PD-L1或PD-L2的癌症的患者的免疫疗法治疗的疗效的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的本文所述的纳米颗粒组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括向患者施用PD-1免疫疗法。在一个实施方案中，PD-1免疫疗法包括施用能够结合PD-1的第二结合剂。

在一个实施方案中，所述方法包括：

a)每周一次施用纳米颗粒组合物，持续三周；

b)停止施用纳米颗粒组合物一周；和

c)如果需要，任选地重复步骤a)和b)以治疗肿瘤。

在一个方面，同时施用PD-1免疫疗法与纳米颗粒组合物。在一个方面，在纳米颗粒组合物之前施用PD-1免疫疗法。在一个方面，在纳米颗粒组合物之后施用PD-1免疫疗法。在一个方面，根据监管实体(例如FDA)批准的标签施用PD-1免疫疗法。

在一些方面，纳米颗粒组合物的每个纳米颗粒都包含约400至约800个所述结合剂。

在一些方面，第一结合剂(纳米颗粒中的结合剂)是适体。在一些方面，PD-1免疫疗法的第二结合剂是适体。

在一些方面，第一结合剂(纳米颗粒中的结合剂)是抗体。在一些方面，PD-1免疫疗法的第二结合剂是抗体。

在一些方面，抗PD-1抗体包括尼沃鲁单抗、派姆单抗、匹利珠单抗、PDR001或其生物类似药。在一些方面，抗PD-L1抗体是阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗或BMS 936559(MDX1105)或其生物类似药。在一些方面，CTLA-4免疫疗法的结合剂是抗CTLA-4抗体。在一个实施方案中，抗CTLA-4抗体是易普利姆玛或其生物类似药。

在一些方面，第一结合剂和/或第二结合剂是融合蛋白。在一个实施方案中，融合蛋白是AMP-224(PD-L2IgG2a融合蛋白；Amplimmune/GlaxoSmith Klein)；AMP-514(MEDI0680)(PD-L2融合蛋白；Amplimmune/GlaxoSmith Klein)或其生物类似药。在一些方面，纳米颗粒组合物是冻干的。

在一些方面，PD-1免疫疗法的第二结合剂是游离结合剂，其中游离结合剂不与纳米颗粒组合物复合或不以其他方式整合到纳米颗粒组合物之上和/或之中。

在一些方面，PD-1免疫疗法是免疫疗法纳米颗粒组合物，其包含与纳米颗粒组合物复合或整合到纳米颗粒组合物之上和/或之中的第二结合剂，其中免疫疗法纳米颗粒组合物包含载体蛋白和所述第二结合剂。在一些方面，免疫疗法纳米颗粒组合物是冻干的。

在一些方面，免疫疗法纳米颗粒组合物的第二结合剂是抗体。在一些方面，免疫疗法纳米颗粒组合物的第二结合剂是抗PD-1抗体。在一些方面，抗PD-1抗体包括尼沃鲁单抗、派姆单抗、匹利珠单抗、PDR001或其生物类似药。

在一些方面，免疫疗法纳米颗粒组合物的第二结合剂是融合蛋白。在一些方面，免疫疗法纳米颗粒组合物的第二结合剂是PD-1靶向融合蛋白。在一个实施方案中，融合蛋白是AMP-224(PD-L2IgG2a融合蛋白；Amplimmune/GlaxoSmith Klein)；AMP-514(MEDI0680)(PD-L2融合蛋白；Amplimmune/GlaxoSmith Klein)或其生物类似药。

在一些实施方案中，本发明涉及提高患有表达PD-L1或PD-L2的癌症的患者的免疫疗法治疗的疗效的方法。所述方法包括向患者施用治疗有效量的本文所述的纳米颗粒组合物和包含第二结合剂的PD-1免疫疗法，其中当纳米颗粒组合物的结合剂能够结合PD-L1和/或PD-L2时，免疫疗法的第二结合剂能够结合PD-1，并且其中当纳米颗粒组合物的结合剂能够结合PD-1时，免疫疗法的第二结合剂能够结合PD-L1和/或PD-L2。

在一些实施方案中，本发明涉及治疗患有表达PD-L1或PD-L2的癌症的患者的方法。所述方法包括向患者施用治疗有效量的本文所述的纳米颗粒组合物和包含第二结合剂的免疫疗法，其中纳米颗粒组合物的结合剂能够结合PD-L1、PD-L2或PD-1，且免疫疗法的第二结合剂能够分别结合PD-L1、PD-L2或PD-1。

在一个实施方案中，治疗患有表达PD-L1或PD-L2的癌症的患者的方法包括向患者施用包含纳米颗粒和PD-1免疫疗法的纳米颗粒组合物。纳米颗粒组合物的每个纳米颗粒都包含：(a)载体蛋白，(b)具有PD-L1或PD-L2结合部分的结合剂和(c)任选的至少一种治疗剂。在用水溶液重构后，纳米颗粒的结合剂能够结合PD-L1或PD-L2。

在一个实施方案中，提高患有表达PD-L1或PD-L2的癌症的患者的免疫疗法治疗的疗效的方法包括向患者施用(a)治疗有效量的本文所述的纳米颗粒组合物和(b)PD-1免疫疗法。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物是冻干的，并且在用水溶液重构后，纳米颗粒的结合剂能够结合PD-L1或PD-L2。

在一些方面，纳米颗粒的量和第二结合剂的量以彼此的相对比例确定。

在一些方面，纳米颗粒组合物和免疫疗法第二结合剂的协同有效量之比提高了免疫疗法的疗效，使得免疫疗法的效果显著高于单独给药。在一个方面，纳米颗粒组合物与第二结合剂的量的比例可以为约1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10至约1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:15或约1:20。

在另一个方面，用于提高免疫疗法疗效的方法通过向患者施用如上所述的纳米颗粒，降低了免疫疗法所需或优选的第二结合剂的治疗有效剂量。纳米颗粒组合物的量与第二结合剂的量的比例为约1:1至约1:10，和/或其中施用这种组合的协同疗效可以实现的协同疗效比单独施用第二结合剂的疗效高至少约5％，或约10％，或约15％，或约20％，或约25％，或约30％，或约35％，或约40％，或约45％，或约50％，或约55％，或约60％，或约或约65％，或约70％，或约80％，或约90％或约100％。在另一方面，施用这种组合的协同疗效比单独施用纳米颗粒组合物或第二结合剂的疗效高至少约25％，或约30％，或约35％，或约40％，或约45％，或约50％。

在一个实施方案中，免疫疗法的第二结合剂包含约60mg/mL，用于在约30分钟至约60分钟的时间内静脉内递送(例如，阿特珠单抗)。

在一个实施方案中，免疫疗法的第二结合剂包含约1.0mg/mL至约3.0mg/mL，用于在约60分钟的时间内静脉内递送(例如，尼沃鲁单抗)。

在一个实施方案中，免疫疗法的第二结合剂包含约2mg/mL，用于在约30分钟的时间内静脉内递送(例如，派姆单抗)。

在一些实施方案中，本发明涉及提高患有表达PD-L1或PD-L2的癌症的患者的免疫疗法治疗的疗效的方法。所述方法包括向患者施用治疗有效量的如上所述的纳米颗粒组合物和包含第二结合剂的免疫疗法，其中当纳米颗粒的结合剂能够结合PD-L1和/或PD-L2时，免疫疗法的第二结合剂能够结合PD-1，并且其中当纳米颗粒的结合剂能够结合PD-1时，免疫疗法的第二结合剂能够结合PD-L1和/或PD-L2。

在一些实施方案中，本发明涉及治疗患有表达PD-L1或PD-L2的癌症的患者的方法。所述方法包括向患者施用治疗有效量的如上所述的纳米颗粒组合物和包含第二结合剂的免疫疗法，其中纳米颗粒的结合剂能够结合PD-L1、PD-L2、PD-1，其中免疫疗法的第二结合剂能够与纳米颗粒的结合剂结合PD-L1、PD-L2、PD-1中相同一种。

在一些方面，纳米颗粒的量是纳米颗粒组合物的有效量。在一些方面，当单独施用于患者时，纳米颗粒的量小于纳米颗粒组合物的有效量。

在一些方面，第二结合剂具有有效量。在一些方面，第二结合剂的量小于单独施用于患者时的有效量。

在一个实施方案中，本文所述的纳米颗粒的治疗有效量包括约1mg/m²至约200mg/m²抗体，约2mg/m²至约150mg/m²，约5mg/m²至约100mg/m²，约10mg/m²至约85mg/m²，约15mg/m²至约75mg/m²，约20mg/m²至约65mg/m²，约25mg/m²至约55mg/m²，约30mg/m²至约45mg/m²，或约35mg/m²至约40mg/m²抗体。在其他实施方案中，治疗有效量包括约20mg/m²至约90mg/m²抗体。在一个实施方案中，治疗有效量包括30mg/m²至约70mg/m²抗体。在一个实施方案中，本文所述的纳米颗粒的治疗有效量的包括约50mg/m²至约200mg/m²的载体蛋白或载体蛋白和治疗剂。在优选的实施方案中，治疗有效量包括约75mg/m²至约175mg/m²的载体蛋白或载体蛋白和治疗剂。考虑的值包括任何所述范围内的任何值、子范围或范围，包括端点。

在一个实施方案中，纳米颗粒组合物的治疗有效量包括约20mg/m²至约90mg/m²的结合剂，例如抗体、适体或Fc融合体。在优选的实施方案中，治疗有效量包括30mg/m²至约70mg/m²的结合剂，例如抗体、适体或Fc融合体。考虑的值包括任何所述范围内的任何值、子范围或范围，包括端点。

可通过本文所述的组合物和方法治疗的癌症或肿瘤包括但不限于：胆道癌；脑癌，包括胶质母细胞瘤和髓母细胞瘤；乳腺癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食道癌、胃癌；血液肿瘤，包括急性淋巴细胞白血病和髓细胞性白血病；多发性骨髓瘤；AIDS相关白血病和成人T细胞白血病淋巴瘤；上皮内肿瘤，包括鲍恩病(Bowens disease)和佩吉特病(Paget’s disease)；肝癌(liver cancer)(肝癌(hepatocarcinoma))；肺癌；淋巴瘤，包括霍奇金病和淋巴细胞淋巴瘤；神经母细胞瘤；口腔癌，包括鳞状细胞癌；卵巢癌，包括由上皮细胞、基质细胞、生殖细胞和间充质细胞引起的卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤，包括平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和骨肉瘤；皮肤癌，包括黑素瘤、卡波西氏肉瘤、基底细胞癌和鳞状细胞癌；睾丸癌，包括胚组织瘤(精原细胞瘤、非精原细胞瘤[畸胎瘤、绒毛膜癌])，间质瘤和生殖细胞肿瘤；甲状腺癌，包括甲状腺腺癌和髓样癌；和包括腺癌和肾母细胞瘤(Wilms)的肾癌。在重要的实施方案中，癌症或肿瘤包括乳腺癌/淋巴瘤、多发性骨髓瘤和黑素瘤。

通常，应通过具有类似用途的试剂的任何可接受的给药方式以治疗有效量给药施用本发明的化合物。本发明化合物即纳米颗粒的实际量会取决于许多因素，例如待治疗疾病的严重性、个体的年龄和相对健康状况、所用化合物的效力、给药途径和给药形式以及本领域技术人员熟知的其他因素。

与最有效和方便的给药途径以及最合适的制剂一样，通过常规实验可以容易地确定此类试剂的有效量。本领域可获得各种制剂和药物递送系统。参见，例如，Gennaro,A.R.,ed.(1995)Remington's Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学),18th ed.,MackPublishing Co.。

试剂例如本发明化合物的有效量或治疗有效量或剂量，是指导致个体症状改善或存活延长的试剂或化合物的量。这些分子的毒性和疗效可以通过细胞培养或实验动物中的标准制药程序来测定，例如，通过测定LD50(50％的群体致死的剂量)和ED50(在50％的群体治疗有效的剂量)。毒性效果与治疗效果的剂量比是治疗指数，其可表示为LD50/ED50之比。表现出高治疗指数的试剂是优选的。

有效量或治疗有效量是引起研究人员、兽医、医生或其他人临床医生正在寻求的组织、系统、动物或人的生物或医学反应的化合物或药物组合物的量。剂量可以在该范围内变化，这取决于所用的剂型和/或所用的给药途径。鉴于个体疾病状况的具体情况，应根据本领域已知的方法选择确切的制剂、给药途径、剂量和剂量间隔。

可以单独调整剂量和间隔，以提供足以实现所需效果的活性部分的血浆水平；即最小有效浓度(MEC)。每种化合物的MEC会有所不同，但可以根据例如体外数据和动物实验估算。实现MEC所需的剂量会取决于个体特征和给药途径。在局部给药或选择性摄取的情况下，药物的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。

实施例

使用由作为核心的白蛋白结合的紫杉醇(即)或顺铂和识别PD-L1的抗体(例如，阿特珠单抗)组成的纳米颗粒说明本公开。本领域技术人员应当理解，制备和使用实施例的纳米颗粒仅用于说明的目的，并且本公开不限于该说明。

本文使用的任何缩写具有正常的科学含义。除非另有说明，否则所有温度均为℃。在本文中，除非另有定义，否则以下术语具有以下含义：

实施例1：冻干的AR160的抗原结合

在图板F和A中分别用荧光标记的抗人CD20或同种型匹配的对照标记CD20阳性Daudi淋巴瘤细胞，并通过流式细胞术分析。在其他图板中，在CD20标记之前，用ABX、AR160、AR160L(将AR160冻干并重悬浮于适合注射的溶液中)或美罗华(Rituxan)预处理Daudi细胞。图1表明CD20结合被AR颗粒和美罗华特异性阻断，但不被单独的ABX阻断。这些结果表明AR与这些细胞上的CD20配体结合，从而阻断荧光抗CD20的结合。

图2是图1呈现的数据的直方图叠加。

图3A和3B描绘了单独的ABX相对于新鲜制备和冻干的AR(图3A)和AT(图3B)的粒径比较。

图4所示的Daudi增殖测定结果比较了ABX和AR颗粒的毒性。数据表明冻干的纳米颗粒和非冻干的纳米颗粒在Daudi测定中具有基本相同的毒性。

实施例2：AlexaFluor 750标记的纳米颗粒的肿瘤累积的荧光分析

小鼠接受静脉内(IV)注射等量的标记涂有非特异性抗体(ABIgG)的标记的或涂有利妥昔单抗(AR160)的标记的感兴趣区域(ROI)2、3和4(图5A)基于荧光阈值跟踪肿瘤累积；ROI 1、5和6(图5A)用作背景参考。注射后24小时测定ROI中的荧光。图5B是确定所有三个治疗组中小鼠每单位肿瘤面积的平均荧光的条形图，以提供总肿瘤递送。图5C是通过背景ROI归一化的每单位肿瘤面积的平均荧光的条形图，以给出递送至肿瘤与身体的药物的比例。数据表明，与单独的或涂有非特异性抗体的相比，施用AR160纳米颗粒导致荧光增加。

实施例3：尺寸为225nm的ABX-利妥昔单抗纳米颗粒的体内功效

为了制备尺寸为225nm的纳米颗粒，如PCT公开号WO2017/031368(通过引用整体并入本文)所述制备颗粒，但BEV与的比例为4:5，即4份BEV和5份ABRAXANE。该比例产生尺寸为225nm的纳米颗粒(AB225)。如PCT公开号WO2017/031368所述，在动物中测定AB225的效果。图6描绘了用单剂量盐水、BEV、ABX、AB160和AB225处理以及在BEV预处理的情况下用AB160处理的小鼠的存活。在给药后30天，用AB225处理的小鼠和在用BEV预处理或不用BEV处理的情况下用AB160处理的小鼠存活远远超过仅用BEV或仅用处理的小鼠存活。

实施例4：制备阿特珠单抗-纳米颗粒

将阿特珠单抗和(ABX)在室温下分别以4mg/mL和10mg/mL的浓度共孵育30分钟，以形成纳米颗粒AA130。

为了确定阿特珠单抗和ABX是否能够相互作用以形成纳米颗粒复合物，使用链霉抗生物素蛋白探针进行生物层干涉测定法(BLItz)(Forte Bioscience)。将1x PBS中100ug/ml生物素化的阿特珠单抗与链霉抗生物素蛋白探针结合。在从探针洗涤未结合的阿特珠单抗后，将抗体结合的探针暴露于在1X PBS中浓度为100、500、1000μg/mL的ABX。将暴露于PBS的抗体探针用作背景并减去背景。用BLItz软件计算解离常数(图7)。Kd经测定为1.462x10^-9。

实施例5：阿特珠单抗-纳米颗粒的尺寸测定

使用Mastersizer NS300测定阿特珠单抗结合的ABX对于单独的ABX的粒径。Nanosight使用动态光散射和布朗运动计算粒径。

如上所述，将阿特珠单抗和ABX共孵育以形成纳米颗粒AA130。将ABX以1:200稀释，并将阿特珠单抗结合的ABX以1:800稀释；捕获并分析三个30秒的视频剪辑以测定粒径(图8A)。图8B是来自AA130的视频剪辑之一的静止图像。阿特珠单抗-ABX纳米颗粒的平均粒径经测定为约129nm；单独ABX的平均尺寸为约90nm。

实施例6：AA130结合PD-L1

进行流式细胞术以获得阿特珠单抗和阿特珠单抗结合的Abraxane与配体PD-L1的结合。PD-L1阳性黑素瘤细胞系C8161用于该实验。如上所述制备AA130，并将纳米颗粒的等分试样以6000rpm旋转10分钟以除去任何未结合的阿特珠单抗。将C8161细胞用分别作为阴性和阳性对照的FITC标记的同种型对照和抗人PD-L1染色。将C8161细胞用单独的ABX和阿特珠单抗以及AA130纳米颗粒一起孵育30分钟。孵育后，将细胞用FITC标记的抗人PD-L1标记30分钟，并用FACS缓冲剂(1x PBS+0.5％BSA和0.05％叠氮化钠)洗涤。洗涤后，通过流式细胞仪在Guava 8HT上分析细胞，并用Gauvasoft软件(Millipore)进行数据分析。

用同种型对照抗体(图9A)、未处理(图9B)、(图9C)、阿特珠单抗(图9D)或AA130(图9E)预处理C8161细胞，然后用荧光标记的抗PD-L1抗体标记。在130nm颗粒的背景下的阿特珠单抗保留其结合其配体PD-L1的能力。

实施例7：AA130细胞毒性

将C8161黑素瘤细胞暴露于紫杉醇浓度为0-200μg/mL的ABX和AA130过夜以测定细胞毒性。还将细胞用胸苷类似物EdU孵育。第二天收获细胞，用2％多聚甲醛固定，并用1％皂苷透化。透化后，将细胞用FITC标记的抗-EdU抗体孵育30分钟，以测定细胞增殖的百分比。洗涤后，通过流式细胞仪在Guava 8HT上分析细胞，并用Gauvasoft软件(Millipore)进行数据分析。通过归一化至未处理的阳性对照来计算增殖指数。

图10显示ABX(实线)和AA130(虚线)对C8161细胞的剂量依赖性毒性。AA130的细胞毒性与单独的ABX相似。

实施例8：AA130纳米颗粒的体内功效

向无胸腺裸鼠(Harlan Sprague Dawley)注射2x10⁶个PD-L1阳性C8161黑素瘤肿瘤细胞。允许肿瘤生长至约600mm³，并通过尾静脉静脉内注射100μl盐水、单独的阿特珠单抗(18mg/kg)、单独的ABX(45mg/kg)和AA130(18mg/kg阿特珠单抗和45mg/kg ABX)一次进行治疗(图11A-11D)。每周监测肿瘤生长3次。肿瘤尺寸用下式计算：(长度×宽度²)/2。

肿瘤生长曲线(图12)显示，相对于盐水和单独的各个药物，用AA130治疗的小鼠的肿瘤生长减慢。使用Graph Pad软件生成Kaplan Meier曲线。对于盐水、阿特珠单抗、ABX和AA130，各组的中位数存活分别为14、13、16和21.5天。AA130与所有其他组之间的存活差异明显，盐水的p值为0.0008，阿特珠单抗的p值为0.0015，Abraxane的p值为0.0113。

Claims

1.治疗患有表达PD-L1或PD-L2的癌症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用：

(a)包含纳米颗粒的纳米颗粒组合物，其中每个所述纳米颗粒都包含白蛋白、能够结合PD-L1或PD-L2的结合剂和紫杉醇，其中所述纳米颗粒能够结合PD-L1或PD-L2；和

(b)PD-1免疫疗法。

2.提高患有表达PD-L1或PD-L2的癌症的患者的免疫疗法治疗的疗效的方法，包括向所述患者施用(a)治疗有效量的纳米颗粒组合物，和(b)PD-1免疫疗法；其中所述纳米颗粒组合物包含一种或多种包含白蛋白、能够结合PD-L1或PD-L2的结合剂和紫杉醇的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒能够结合PD-L1或PD-L2。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述PD-1免疫疗法包括能够结合PD-1的第二结合剂。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述第二结合剂是游离结合剂。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述第二结合剂整合到包含载体蛋白和所述第二结合剂以及任选的第二治疗剂的纳米颗粒之上和/或之中。

6.根据权利要求3所述的方法，其中所述第二结合剂是抗PD-1抗体。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述抗PD-1抗体是尼沃鲁单抗、派姆单抗、匹利珠单抗、PDR001或其生物类似药。

8.根据权利要求3所述的方法，其中所述第二结合剂是融合蛋白。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述融合蛋白是AMP-224或AMP-514。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述能够结合PD-L1或PD-L2的结合剂是抗体。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述抗体包括阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、BMS 936559(MDX1105)或其生物类似药。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒组合物是冻干的，所述方法还包括在施用之前在水溶液中重构所述纳米颗粒组合物。

13.根据权利要求1或2所述的方法，其中顺序施用所述纳米颗粒组合物和所述第二结合剂。

14.根据权利要求13所述的方法，其中在施用所述第二结合剂之前施用所述纳米颗粒组合物。

15.根据权利要求13所述的方法，其中在施用所述纳米颗粒组合物之前施用所述第二结合剂。

16.根据权利要求1或2所述的方法，其中同时施用所述纳米颗粒组合物和所述第二结合剂。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，还包含选自以下的另外的治疗剂：阿比特龙、苯达莫司汀、硼替佐米，卡铂、卡巴他赛、顺铂、苯丁酸氮芥、达沙替尼、多西紫杉醇、多柔比星、表柔比星、厄洛替尼、依托泊苷、依维莫司、吉非替尼、伊达比星、伊马替尼、羟基脲、伊马替尼、拉帕替尼、亮丙瑞林、美法仑、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奈达铂、尼罗替尼、奥沙利铂、帕唑帕尼、培美曲塞、吡铂、罗米地辛、赛特铂、索拉非尼、维罗非尼、舒尼替尼、替尼泊苷、三铂、长春碱、长春瑞滨、长春新碱或环磷酰胺。

18.纳米颗粒，包含：

a.白蛋白，

b.能够结合PD-1、PD-L1或PD-L2的结合剂，以及

c.紫杉醇，

从而使得所述纳米颗粒能够结合PD-1、PD-L1或PD-L2。

19.根据权利要求18所述的纳米颗粒，其中所述结合剂是融合蛋白。

20.根据权利要求18所述的纳米颗粒，其中所述结合剂是抗体。

21.根据权利要求20所述的纳米颗粒，其中所述抗体与PD-1结合并选自尼沃鲁单抗、派姆单抗、匹利珠单抗、PDR001或其生物类似药。

22.根据权利要求20所述的纳米颗粒，其中所述抗体与PD-L1结合并且选自阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、BMS 936559(MDX1105)或其生物类似药。

23.纳米颗粒组合物，包含权利要求18-22中任一项所述的纳米颗粒。

24.根据权利要求23所述的纳米颗粒组合物，其是冻干的，其中在用水溶液重构后，所述纳米颗粒能够结合PD-1、PD-L1或PD-L2。

25.根据权利要求18-22中任一项所述的纳米颗粒，还包含选自以下的另外的治疗剂：阿比特龙、苯达莫司汀、硼替佐米，卡铂、卡巴他赛、顺铂、苯丁酸氮芥、达沙替尼、多西紫杉醇、多柔比星、表柔比星、厄洛替尼、依托泊苷、依维莫司、吉非替尼、伊达比星、伊马替尼、羟基脲、伊马替尼、拉帕替尼、亮丙瑞林、美法仑、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奈达铂、尼罗替尼、奥沙利铂、帕唑帕尼、培美曲塞、吡铂、罗米地辛、赛特铂、索拉非尼、维罗非尼、舒尼替尼、替尼泊苷、三铂、长春碱、长春瑞滨、长春新碱或环磷酰胺。

26.试剂盒，包含权利要求23所述的纳米颗粒组合物和PD-1免疫治疗剂。

27.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述PD-1免疫治疗剂包括能够结合PD-1的第二结合剂。

28.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述第二结合剂是游离结合剂。

29.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述第二结合剂整合到包含白蛋白和所述第二结合剂的纳米颗粒之上和/或之中。

30.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述第二结合剂是抗PD-1抗体。

31.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述抗体包括匹利珠单抗、PDR001、派姆单抗或尼沃鲁单抗或其生物类似药。

32.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述PD-1免疫治疗剂是融合蛋白。

33.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述融合蛋白是AMP-224、AMP-514或其生物类似药。

34.如权利要求26所述的试剂盒，其中所述纳米颗粒组合物是冻干的。