CN109880849A - 靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肿瘤生物治疗领域，具体涉及一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST‑shRNA表达载体复合物及其应用。本发明要解决的技术问题是现有技术中没有有效的靶向肿瘤相关巨噬细胞的治疗手段。本发明解决上述技术问题的技术方案是提供一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST‑shRNA表达载体复合物，即装载有抑制LAMP2a表达的shRNA真核表达载体的细菌GHOST。本发明GHOST‑shRNA表达载体复合物能够特异的、有效的、低毒性的干扰巨噬细胞中LAMP2a的表达，能够有效治疗巨噬细胞高浸润型肿瘤，具有很好的应用前景。

Description

靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物及其 应用

技术领域

本发明涉及肿瘤生物治疗领域，具体涉及一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物及其应用。

背景技术

在肿瘤组织中浸润的巨噬细胞被称为肿瘤相关巨噬细胞，其在多种肿瘤中浸润程度都很高，并在临床上与肿瘤的预后有直接关系。在乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、肾癌、滤泡性淋巴癌、恶性葡萄膜黑色素瘤、食管上皮癌或鳞状细胞癌中，肿瘤相关巨噬细胞浸润程度的高低与不良预后呈明显的正相关作用。在肿瘤的免疫疗法中，肿瘤相关巨噬细胞是有很高潜力的治疗靶点，有研究者发现针对CSF-1/CSF-1R通路的抑制剂在小鼠乳腺癌和宫颈癌模型中可以清除TAM，提高CD8⁺ T细胞活性，从而抑制肿瘤生长；而在脑胶质瘤模型中，CSF-1/CSF-1R通路的抑制剂可以使肿瘤体积明显减小。此外，卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌和黑色素瘤中，也有通过靶向肿瘤相关巨噬细胞来治疗肿瘤的方案报道。LAMP2a(lysosome-associated membrane protein type 2a)是分子伴侣自噬的靶蛋白溶酶体受体，同时也是分子伴侣自噬的关键效应蛋白。分子伴侣自噬相对于其他自噬的主要特点是选择性降解靶蛋白，不依赖于囊泡将靶蛋白输送至溶酶体内腔，并以此特异性的改变细胞进程，且不会引起细胞器损伤或细胞死亡。因此，LAMP2a在细胞生理行为中可以起到一种“特异性开关”的作用，即通过特异性降解某些激酶、核转录因子或蛋白抑制子等，来改变细胞的生理行为；并且能准确的识别某些损伤蛋白，而不影响其他正常蛋白的功能。目前，LAMP2a与分子伴侣自噬的研究热点集中于细胞衰老，神经退行性疾病及其在肿瘤细胞中的作用，而未将其作为肿瘤相关巨噬细胞中的治疗靶点。

大肠杆菌GHOST是人工诱导的大肠杆菌空壳。通过在大肠杆菌中诱导肠道菌属噬菌体phiX174的溶解蛋白E的表达，可导致大肠杆菌的内外膜发生互溶并形成跨膜孔洞，由于内腔压力，细菌基质会被喷吐至胞外，只留下结构相对完整的外壳，即为GHOST。由于大肠杆菌细胞外壁主要成分为磷酸脂多糖，其中的磷酸基团带有负电荷；而内膜中富含的胺基则带有正电荷。这种内外膜电位的不同保证了负电性的DNA质粒只会结合在细菌内部，而非外部。在转染细胞时，这种细菌GHOSTs只会被具有吞噬功能的细胞摄取，而肿瘤微环境中的吞噬细胞主要为肿瘤相关巨噬细胞。在被细胞吞噬之后，大肠杆菌细胞膜中的磷脂酰乙醇胺会与吞噬小泡的囊膜发生互溶，以保证GHOST携带的部分DNA质粒从吞噬小泡的水解环境中逃离至细胞质中，完成外源基因的表达。溶解蛋白E所诱导的细菌内外膜互溶会破坏细菌外壁中脂多糖(LPS)的类脂A(lipid A)基团，影响LPS核心结构，降低GHOST的免疫原性；同时细菌内容物的逸散也会大大降低GHOST的免疫原性。这种细菌GHOST对巨噬细胞的毒性远低于常用的阳离子脂质体。因此，大肠杆菌GHOST可以特异、高效、安全的转染巨噬细胞。

发明内容

本发明要解决的技术问题是现有技术中没有有效的靶向肿瘤相关巨噬细胞的治疗手段。本发明解决上述技术问题的技术方案是提供一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物。该靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物为装载有抑制LAMP2a表达的shRNA真核表达载体的细菌GHOST。

其中，上述靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物中所述的抑制LAMP2a表达的shRNA真核表达载体是能表达针对Lamp2a的第9外显子序列的shRNA序列。

其中，上述靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物中所述的shRNA真核表达载体中的shRNA模板序列为SEQ No.1、SEQ No.2、SEQ No.3、SEQ No.4、SEQ No.5或SEQ No.6中的至少一条所示。

其中，上述靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物中所述的shRNA真核表达载体为质粒载体。

其中，上述靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物中所述的质粒载体为pENTR/U6、pLKO.1、pGPU6、pGPH1或pGenesil-2中的至少一种。

其中，上述靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物中所述的细菌GHOST为大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、肺炎杆菌、胸膜炎放线杆菌或溶血曼海姆菌中至少一种的GHOST。

其中，上述靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物中所述的细菌GHOST为大肠杆菌DH5α的GHOST。

其中，上述靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物中所述的细菌GHOST和shRNA真核表达载体之间的比例为：每10⁸个大肠杆菌GHOST装载0.3～10μg shRNA真核表达载体。优选的，每10⁸个大肠杆菌GHOST装载1～5μg shRNA真核表达载体。更优的，每10⁸个大肠杆菌GHOST装载2μg shRNA真核表达载体。

其中，上述靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物中所述的抑制LAMP2a表达的shRNA真核表达载体是通过细菌GHOST内外的电位差装载于细菌GHOST内。

本发明还提供了上述的靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物在制备治疗巨噬细胞高浸润型肿瘤的药物中的用途。

其中，上述用途中所述的巨噬细胞高浸润型肿瘤为乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、肾癌、滤泡性淋巴癌、恶性葡萄膜黑色素瘤、食管上皮癌或鳞状细胞癌中的至少一种。

此外，本发明还进一步地提供了一种治疗巨噬细胞高浸润型肿瘤的药物。该药物是由上述述的靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物添加药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。所述的巨噬细胞高浸润型肿瘤为乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、肾癌、滤泡性淋巴癌、恶性葡萄膜黑色素瘤、食管上皮癌或鳞状细胞癌中的至少一种。

进一步的，上述治疗巨噬细胞高浸润型肿瘤的药物中所述的制剂为注射剂。所述的注射剂可为注射液或者冻干注射剂。

本发明也提供了制备上述靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物的方法。该方法包括以下步骤：

a、设计针对Lamp2a的shRNA序列，构建可表达该shRNA序列的表达载体；

b、将构建所得的shRNA真核表达质粒装载入细菌GHOST中，制备得到GHOST-shRNA表达载体复合物。

本发明的有益效果在于，本发明在发现LAMP2a在肿瘤相关巨噬细胞中的高表达预示了巨噬细胞高浸润型肿瘤的不良预后的基础上，将构建得到的针对LAMP2a的shRNA真核表达质粒装载入细菌GHOST中，制备得到靶向肿瘤相关巨噬细胞且针对LAMP2a的GHOST-shRNA表达载体复合物。实验证明，该GHOST-shRNA表达载体复合物能够特异的、有效的、低毒性的干扰巨噬细胞中LAMP2a的表达，能够有效治疗巨噬细胞高浸润型肿瘤，具有很好的应用前景。

附图说明

图1：大肠杆菌GHOST的OD₆₀₀曲线。pBV220大肠杆菌是没有溶解蛋白E编码序列的对照组。数据为平均数±标准差，代表性实验。

图2：大肠杆菌GHOST装载体系中，上清未被装载的DNA浓度。数据为平均数±标准差，代表性实验。

图3：不同OD₆₀₀下大肠杆菌GHOST的DNA装载量。数据为平均数±标准差。

图4：将装载DNA的大肠杆菌GHOST与等质量的质粒DNA一起凝胶电泳，泳道1为质粒DNA，泳道2为4℃下放置24小时或48小时后的装载有DNA的GHOST，泳道3为经HBSS平衡液清洗的泳道2中的大肠杆菌GHOST。

图5：分别以未装载质粒的空大肠杆菌GHOST或装载有GFP真核表达质粒的大肠杆菌GHOST转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7与结肠癌细胞系CT26细胞，并于转染后72小时在荧光显微镜下观测细胞GFP的表达。DAPI为细胞核染色；比例尺为100μm；代表性实验。

图6：分别以生理盐水、未装载质粒的空大肠杆菌GHOST、装载有GFP真核表达质粒的大肠杆菌GHOST在体外转染小鼠CT26细胞、RAW264.7细胞，或腹腔注射给Balb/c小鼠(每只小鼠1OD)。72小时后，收取体外培养的细胞或小鼠的腹腔灌洗液细胞，以流式细胞术检测GFP的表达。代表性实验。

图7：分别以装载了三种不同靶向Lamp2a的shRNA真核表达质粒的大肠杆菌GHOST转染经肿瘤细胞培养上清刺激的小鼠骨髓来源巨噬细胞。72小时后，收取细胞，提取全蛋白，以western blotting检测LAMP2a的表达。第2、3、4泳道分别为三种shRNA克隆。

图8：A：分别以装载了无特异靶向性的shRNA真核表达质粒的大肠杆菌GHOST(sh-NC)或靶向Lamp2a的shRNA真核表达质粒的大肠杆菌GHOST(sh-L2a)转染经肿瘤细胞培养上清刺激的小鼠骨髓来源巨噬细胞。72小时后，收取细胞，提取全蛋白，以western blotting检测LAMP2a的表达。B：以qPCR检测如图8A中所述的小鼠骨髓来源巨噬细胞中Lamp2a mRNA的表达。内参为Actin；数据为平均数±标准差；以one-way ANOVA检验；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001，ns无统计学意义。

图9：Balb/c小鼠尾静脉分别注射1OD、2OD、5OD GHOST或生理盐水(NS)作为对照。在12小时、24小时、48小时后，分别处死小鼠，以ELISA检测小鼠外周血中IL-1β、IL-6与TNF-α的浓度。每组小鼠为3只；数据为平均数±标准差。

图10：PyMT荷瘤小鼠以尾静脉分别注射生理盐水(NS)、装载了无特异靶向性的shRNA真核表达质粒的大肠杆菌GHOST(sh-NC)或靶向Lamp2a的shRNA真核表达质粒的大肠杆菌GHOST(sh-L2a)。每只小鼠2OD GHOST，每3天给药一次。在连续时间点分别处死小鼠，称取肿瘤重量。每组小鼠为4-6只，2-4次重复实验；数据为平均数±标准差；以one-way ANOVA检验；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001，ns无统计学意义。

图11：PyMT荷瘤小鼠以尾静脉分别注射生理盐水(NS)、装载了无特异靶向性的shRNA真核表达质粒的大肠杆菌GHOST(sh-NC)或靶向Lamp2a的shRNA真核表达质粒的大肠杆菌GHOST(sh-L2a)后，以流式细胞术检测肿瘤相关巨噬细胞中LAMP2a的表达。数据为平均数±标准差；以one-way ANOVA检验；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001，ns无统计学意义。

图12：以流式细胞术检测如图10所述的PyMT小鼠肿瘤浸润细胞中LAMP2a的表达。数据为平均数±标准差；以one-way ANOVA检验；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001，ns无统计学意义。

图13：小鼠结肠癌细胞系CT26或乳腺癌细胞系4T1皮下接种的Balb/c小鼠，分别瘤内注射(i.t.)或尾静脉注射(i.v.)生理盐水(NS)、装载了无特异靶向性的shRNA真核表达质粒的大肠杆菌GHOST(sh-NC)或靶向Lamp2a的shRNA真核表达质粒的大肠杆菌GHOST(sh-L2a)后，测量小鼠肿瘤体积。每只小鼠2OD GHOST，每3天给药一次。肿瘤体积计算方式为(长直径×短直径²)/2；每组小鼠为5-8只，2次重复实验；数据为平均数±标准差；以one-wayANOVA检验；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001，ns无统计学意义。

图14：以流式细胞术检测如图12所述的PyMT小鼠肿瘤浸润细胞中LAMP2a的表达。数据为平均数±标准差；以one-way ANOVA检验；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001，ns无统计学意义。

图15:将145例乳腺癌患者肿瘤样本，分别以LAMP2a在肿瘤细胞中和肿瘤相关巨噬细胞中的表达量进行分组和分级，并统计各自的生存曲线，以Log-rank(Mantel-Cox)检验。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明进行更进一步的具体说明。

本发明在前期对在145例乳腺癌患者的临床样本进行了研究，发现了LAMP2a在肿瘤相关巨噬细胞中的高表达预示了不良预后，而LAMP2a在肿瘤细胞中的表达则与病人生存期没有明显的相关性。由于乳腺癌是一种典型的巨噬细胞高浸润型肿瘤，而在在多种实体肿瘤中巨噬细胞的浸润程度都明显与不良预后相关，如乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、肾癌、滤泡性淋巴癌、恶性葡萄膜黑色素瘤、食管上皮癌或鳞状细胞癌等。考虑到肿瘤细胞的数目在肿瘤组织中占绝对优势，特异性的抑制肿瘤相关巨噬细胞中LAMP2a的表达可能是巨噬细胞高浸润型肿瘤相关靶向治疗的关键问题。

虽然，发明人未发现以大肠杆菌GHOST为载体，在体内外递送shRNA载体进行基因表达干扰的技术。但是发明人考虑到是否有可能使用细菌GHOST来装载表达抑制LAMP2a表达的shRNA表达载体，靶向肿瘤相关巨噬细胞，从而降低肿瘤相关巨噬细胞中的LAMP2a表达，以达到治疗巨噬细胞高浸润型肿瘤的目的。

在此基础上，本发明开发出靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物。即装载有抑制LAMP2a表达的shRNA真核表达载体的细菌GHOST。

在本发明的一个实施方式中，上述靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物中抑制LAMP2a表达的shRNA真核表达载体是能表达针对Lamp2a的第9外显子序列的shRNA序列。

而小鼠Lamp2a的第9外显子序列(小鼠NM_001017959.2)是a亚型特异性序列(编码LAMP2a功能必需的靶蛋白识别结合肽段)，同时也是LAMP2a蛋白发挥功能所必须的，因此针对的Lamp2a的第9外显子序列设计shRNA能有效抑制LAMP2a的表达以及相应的功能实现。此外，Lamp2a的第9外显子序列也是一段高度保守的序列，比如小鼠与人(人NM_002294.2)的此段序列相似性达到了91％。故针对此段序列的靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物如能在小鼠上取得好的疗效，本领域技术人员就有充分的理由相信本发明技术方案在人的相关肿瘤中治疗中也能起到好的效果。

本发明设计的shRNA的模板序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示。在实验中，均体现出了效果，其中的SEQ ID No.2效果更佳。显然，也可以设计其他不同的针对Lamp2a的第9外显子序列的shRNA干扰分子。本发明也提供了与表1中三条小鼠shRNA模板序列相对应的针对人Lamp2a的相应位点的shRNA模板序列，SEQ ID No.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示。

一般来说，本发明靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物中使用的shRNA真核表达载体可以使用能装载入细菌GHOST中的载体，一般推荐使用质粒载体。在本发明的一个实施例中，使用了商品化的质粒载体pENTR/U6。其他本领域常用的shRNA真核表达质粒上也可构建靶向Lamp2a的shRNA质粒，并装载入大肠杆菌GHOST中制成。比如pLKO.1、pGPU6、pGPH1、pGenesil-2等质粒载体都可以使用。

而对于本发明靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物中细菌GHOST部分。由于细菌GHOST的制备已经有了较多报道，本发明技术人员容易获得可用细菌GHOST。就本发明而言大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、肺炎杆菌、胸膜炎放线杆菌或溶血曼海姆菌等细菌的GHOST都是可以考虑使用的装载和传递shRNA表达载体的工具。在本发明的实施例中，使用了大肠杆菌DH5α的GHOST。

其中，上述靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物中所述的抑制LAMP2a表达的shRNA真核表达载体是通过细菌GHOST内外的电位差装载于细菌GHOST内。

一般而言，为了达到好的靶向转染效果，上述细菌GHOST中尽量多装载一些shRNA表达载体。

在本发明的一个实施例中也给出了一种具体的装载方法以便于实现本发明。显然，本领域也可以通过其他方式来将shRNA表达载体装入细菌GHOST中以实现本发明。

目前来说，细菌GHOST装载的shRNA表达载体之间的比例为：每10⁸个大肠杆菌GHOST装载0.3～10μg shRNA真核表达载体。优选的，每10⁸个大肠杆菌GHOST装载1～5μgshRNA真核表达载体。更优的，每10⁸个大肠杆菌GHOST装载2μg shRNA真核表达载体。

基于本发明的上述方案，本发明还提供了上述的靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物在制备治疗巨噬细胞高浸润型肿瘤的药物中的用途。

其中，上述用途中所述的巨噬细胞高浸润型肿瘤为乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、肾癌、滤泡性淋巴癌、恶性葡萄膜黑色素瘤、食管上皮癌或鳞状细胞癌中的至少一种。

此外，本发明还进一步地提供了一种治疗巨噬细胞高浸润型肿瘤的药物。该药物是由上述的靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物添加药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。所述的巨噬细胞高浸润型肿瘤为乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、肾癌、滤泡性淋巴癌、恶性葡萄膜黑色素瘤、食管上皮癌或鳞状细胞癌中的至少一种。

进一步的，上述治疗巨噬细胞高浸润型肿瘤的药物中所述的制剂为注射剂。

术语“药学上可接受的”是指某载体、运载物、稀释剂、辅料，和/或所形成的盐通常在化学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在生理上与受体相兼容。

本发明药物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括但并不限于：注射(静脉内、肌肉内、皮下或瘤体内)和局部给药。

用于注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明所述药学上可接受的辅料，是指除活性成分以外包含在剂型中的物质。

本发明所述药学上可接受的辅助性成分，它具有一定生理活性，但该成分的加入不会改变上述药物组合物在疾病治疗过程中的主导地位，而仅仅发挥辅助功效，这些辅助功效仅仅是对该成分已知活性的利用，是医药领域惯用的辅助治疗方式。若将上述辅助性成分与本发明药物组合物配合使用，仍然应属于本发明保护的范围。

本发明也提供了制备上述靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物的方法。该方法包括以下步骤：

a、设计针对Lamp2a的shRNA序列，构建可表达该shRNA序列的表达载体；

b、将构建所得的shRNA表达载体装载入细菌GHOST中，制备得到GHOST-shRNA表达载体复合物。

在本发明的一个实施例中，使用了质粒作为表达载体。将表达载体质粒溶于无菌HBSS平衡液中，然后以此HBSS平衡液重悬冻干的大肠杆菌GHOST，24℃恒温震荡30分钟以上即可完成装载。质粒的装载量视体系中DNA浓度与GHOST的数目而定。在该实施例中，1个大肠杆菌大约能携带约6000个质粒。装载完成后，去除未装载的表达载体质粒，并将GHOST-shRNA表达载体复合物保存在无菌缓冲液中或者冻干备用。已装载的表达载体质粒会稳定结合在GHOST内部，多次离心清洗或长时间静置都不会引起明显的丢失。

显然，除了HBSS平衡液，也可以使用其他具有离子缓冲作用的平衡液以完成表达载体的装载，如PBS缓冲液等。

以下实施实例仅用于说明及证实本发明，而非限制本发明的应用范围。以下实例中未具体说明的实验方案，按照常规方法或相对应的试剂生产商提供的说明书进行操作。

实施例1大肠杆菌GHOST的制备与目的DNA的装载

为了方便实施本发明，本实施例提供了一种具体的大肠杆菌GHOST的制备以及装载目的DNA的方法。显然，大肠杆菌GHOST的制备以及目的DNA的装载也可以参考现有报道的其他技术进行实现。

1)构建GHOST诱导质粒：在NCBI数据库中查找噬菌体phiX174溶解蛋白E的编码序列(GQ153915.1)，化学合成该序列并在序列两端构建酶切位点EcoR I与Pst I，将此合成序列与pBV220质粒重组为pBV220-LysisE质粒，并将此重组质粒转入DH5α大肠杆菌中。除本实验所用的pBV220质粒，其他具有条件型启动子元件的原核表达质粒在理论上也能实现大肠杆菌GHOST的诱导制备。

2)制备大肠杆菌GHOST：将上述重组工程大肠杆菌培养于含有100μg/mL氨苄霉素的LB培养基中，28℃220rpm进行扩增培养；待细菌浓度达到大约OD₆₀₀≈0.6时，快速将培养温度提升至42℃，此时伴随着溶解蛋白E激活，大肠杆菌内容物开始逸散至培养基中，细菌OD₆₀₀会持续降低至大约0.1至0.2，如图1所示。诱导完成后，在4℃以8000g离心菌液收取大肠杆菌GHOST。之后将GHOST重悬于含有30mg/mL链霉素、34mg/mL氯霉素、50mg/mL卡那霉素的HBSS平衡液中，4℃静置过夜以杀死未裂解的大肠杆菌。之后，以无菌的HBSS平衡液清洗GHOST，并将其冻干保存。为便于描述GHOST的用量，下文中我们以1OD指代大约5×10⁸个大肠杆菌GHOST。

3)目的DNA质粒的装载：为了便于本发明的实施，本发明提供了一种将DNA质粒装载入细菌GHOST的具体方法。首先，将需要装载的DNA质粒溶于含有10mM乙酸钠、25mM CaCl₂和10mM HEPES的无菌HBSS平衡液中，尽量使DNA浓度大于5mg/mL以保证装载效率。然后以此HBSS平衡液重悬冻干的大肠杆菌GHOST(推荐100μL HBSS平衡液重悬大约30至60ODGHOST)，24℃恒温震荡30分钟以上。为检测质粒的装载进程，可以16,000g离心装载体系，测量上清中DNA含量，如图2所示。质粒的装载量视体系中DNA浓度与GHOST的数目而定，在我们的实验中，1OD GHOST的平均装载量大约为10μg DNA(2000到3000bp的质粒)，如图3所示。1个大肠杆菌GHOST大约能携带6000个质粒。装载完成后，以无菌HBSS清洗GHOST以去除未装载的DNA质粒，并将GHOST以0.1OD/μL的浓度4℃保存在无菌HBSS中。已装载的DNA质粒会稳定结合在GHOST内部，多次离心清洗或长时间静置都不会引起明显的装载DNA的丢失。若需确定GHOST所装载的DNA量，可通过凝胶电泳将质粒与GHOST分离，如图4所示。除本实验所用的HBSS平衡液，其他具有离子缓冲作用的平衡液也可以完成DNA的装载，如PBS缓冲液等；装载体系并不仅限于本实验所用的1mg DNA/50OD GHOST/100μL HBSS缓冲液，不同的DNA/GHOST浓度比也可以完成DNA的装载。

实施例2以装载有GFP真核表达质粒的GHOST验证巨噬细胞特异性转染的效率

为了验证大肠杆菌GHOST对巨噬细胞的转染效率，按实施例1的装载方法装载入表达GFP的真核表达质粒pMAX-GPF制成GFP-GHOST复合物，并分别在体外体内进转染。在体外转染细胞时，推荐以500GHSOT/细胞的比例在完全培养基中进行转染。转染2小时后，洗去未被摄取的大肠杆菌GHOST。首先我们以GFP-GHOST与未装载质粒的空GHOST转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7与结肠癌细胞系CT26细胞。结果如图5所示，在CT26细胞中没有检测到GFP的表达，而GFP-GHOST转染的RAW264.7细胞有广泛的GFP表达。此外，GFP-GHOST也能有效的转染小鼠原代细胞，如图6所示。

实施例3靶向Lamp2a的shRNA真核表达质粒和靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物的构建

针对小鼠Lamp2a的a亚型特异性第9外显子序列(NM_001017959.2)设计shRNA模板序列，如表1所示。并将这些模板序列分别合成相对应的互补Oligo DNA，即：正向：CACC-sense-CGAA-antisense；反向：AAAA-sense-TTCG-antisense。

表1小鼠Lamp2a shRNA模板序列

退火以将各对Oligo DNA形成发卡结构的双链DNA后，各自与线性shRNA真核表达质粒pENTR/U6(Invitrogen提供)连接，插入至质粒pENTR/U6的CACC-TTTT位点，重组为靶向Lamp2a的shRNA真核表达质粒(sh-L2a)。

使用实施例1描述的方法，将上述的靶向Lamp2a的shRNA真核表达质粒(sh-L2a)载装载到大肠杆菌GHOST中，得到靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物。经检测其中每1OD的大肠杆菌GHOST大约装载有10μg DNA，即1个大肠杆菌GHOST大约能携带6000个真核表达质粒(sh-L2a)。

除本实验所用的Invitrogen公司出品的商品化shRNA真核表达质粒pENTR/U6外，其他本领域常用的shRNA真核表达质粒，如pLKO.1、pGPU6、pGPH1、pGenesil-2也可构建靶向Lamp2a的shRNA质粒，并装载入大肠杆菌GHOST中。

实施例4装载有Lamp2a shRNA真核表达质粒的大肠杆菌GHOST的基因干扰效率验证

以装载有Lamp2a shRNA真核表达质粒的大肠杆菌GHOST在体外转染小鼠原代巨噬细胞，验证该系统的基因干扰效率。

首先，用肿瘤细胞培养上清在体外与分离出的小鼠原代骨髓来源巨噬细胞(BMDM)共培养72小时，以激活LAMP2a的表达，随后再以装载有Lamp2a shRNA真核表达质粒的大肠杆菌GHOST(sh-L2a)转染这些细胞。结果如图7所示，在转染72小时后，三种shRNA都可以有效的抑制小鼠巨噬细胞中LAMP2a的表达，其中装载有2号模板序列(SEQ ID No.2:CTGCAATCTGATTGATTA)的shRNA表达质粒(序列如SEQ ID NO:7所示)作用最为显著，因此选用装载有2号模板序列的shRNA表达质粒进行后续实验。

接下来，补充了装载有无特异靶向性的shRNA真核表达质粒的GHOST(sh-NC组)作为对照，以排除大肠杆菌GHOST自身或shRNA表达质粒对巨噬细胞中LAMP2a的表达产生非特异性的影响。结果如图8，结果表明虽然sh-NC组对Lamp2a mRNA的表达产生了一定影响，但是sh-L2a组在蛋白水平和mRNA水平上都显著抑制了巨噬细胞中LAMP2a的表达量。

以上结果表明本发明制备的大肠杆菌GHOST所递送的Lamp2a shRNA表达质粒可以有效的靶向巨噬细胞，并抑制LAMP2a的表达。

实施例5装载有Lamp2a shRNA真核表达质粒的大肠杆菌GHOST的体内实验

以大肠杆菌GHOST-shRNA系统在体内特异性干扰小鼠肿瘤相关巨噬细胞中LAMP2a的表达，验证该系统的基因干扰效率与肿瘤治疗效果。

首先，为了确定体内注射大肠杆菌GHOST的剂量，Balb/c小鼠尾静脉分别注射1OD、2OD、5OD GHOST或生理盐水(NS)作为对照。在12小时、24小时、48小时后，分别处死小鼠，以ELISA检测小鼠外周血中IL-1β、IL-6与TNF-α的浓度，结果如图9所示。选择每只小鼠尾静脉注射2OD大肠杆菌GHOST。

为了检测大肠杆菌GHOST-shRNA系统在小鼠体内的干扰效果，使用了自发乳腺癌小鼠模型PyMT以及结肠癌细胞系CT26、小鼠乳腺癌细胞系4T1皮下接种模型。对于PyMT模型，小鼠在出现可触及的肿瘤后大约4天，待实验小鼠的肿瘤大致达到相同体积时，尾静脉注射重悬于100μL的分别装载了无特异靶向性的shRNA真核表达质粒(sh-NC组)或靶向Lamp2a的shRNA真核表达质粒(sh-L2a组)的大肠杆菌GHOST，或等体积的生理盐水作为对照(NS组)。每只小鼠每次注射2OD大肠杆菌GHOST，每3天注射一次。结果如图10所示，sh-L2a处理显著抑制了PyMT小鼠的肿瘤生长，而NS组与sh-NC组的肿瘤生长并无明显差异。在sh-L2a处理组中，大约有1/3的小鼠出现了肿瘤完全缓解。与此同时，LAMP2a在肿瘤相关巨噬细胞中的表达也收到了明显抑制，如图11。此外，如图12所示，其他肿瘤浸润免疫细胞中的LAMP2a表达量没有明显变化，说明只有肿瘤相关巨噬细胞受到了GHOST所递送的shRNA的干扰，具有较好的靶向性。

对于CT26与4T1小鼠模型，除了尾静脉注射(i.v.)，给三种处理组各增加了一个瘤内注射的对照组(i.t.)。给药剂量与频率与上述PyMT小鼠相同。结果如图13所示，大肠杆菌GHOST-shRNA转染系统在CT26与4T1小鼠模型中也明显抑制了肿瘤的生长。同样的，如图14所示，肿瘤相关巨噬细胞中的LAMP2a表达也受到了大肠杆菌GHOST所递送的sh-L2a的明显抑制。此实施例的结果说明，利用GHOST-shRNA复合物靶向干扰肿瘤相关巨噬细胞中LAMP2a的表达，可以有效的抑制肿瘤生长。

由于在多种实体肿瘤中，巨噬细胞的浸润程度都明显与不良预后相关，如乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、食管上皮癌和鳞状细胞癌等。考虑到LAMP2a在肿瘤相关巨噬细胞中的广泛表达，而LAMP2a阳性巨噬细胞的浸润程度同样与患者生存期相关，如图15所示，在145例乳腺癌患者中就有明确的体现。而且，图15也展示出LAMP2a在肿瘤细胞中的表达量与不良预后并无明显关联。同时，由于Lamp2a的第9外显子序列也是一段高度保守的序列，如小鼠与人的此段序列相似性达到了91％，故提供了与表1中三条小鼠shRNA模板序列相对应的针对人Lamp2a的相应位点的shRNA模板序列，如表2所示，其序列也与表一中的相应序列高度相似。

表2与小鼠Lamp2a shRNA模板序列对应的人shRNA模板序列

由上可见，特异性靶向干扰肿瘤相关巨噬细胞中LAMP2a的表达具有很高的临床转化潜力，本发明GHOST-shRNA表达载体复合物在治疗巨噬细胞高浸润型肿瘤中具有很好的应用前景。

序列表

<110> 四川大学

<120> 靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物及其应用

<130> A190052K

<150> 201910005062.4

<151> 2019-01-03

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gactgcagtg cagatgaag 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgcaatctg attgatta 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taaacactgc ttgaccacc 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gactgcagtg cagatgacg 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctgcaacctg attgatta 18

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taaaatatgt agttgtgtc 19

<210> 7

<211> 2895

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 60

taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 120

gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 180

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc 240

tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta 300

gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc 360

acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa 420

caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg 480

gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa 540

aacgacggcc agtcttaagc tcgggcccca aataatgatt ttattttgac tgatagtgac 600

ctgttcgttg caacaaattg atgagcaatg cttttttata atgccaactt tgtacaaaaa 660

agcaggcttt aaaggaacca attcagtcga ctggatccgg taccaaggtc gggcaggaag 720

agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct gttagagaga 780

taattagaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg tgacgtagaa 840

agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg gactatcata 900

tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg tggaaaggac 960

gaaacaccgc tgcaatctga ttgattacga ataatcaatc agattgcagt tttttctaga 1020

cccagctttc ttgtacaaag ttggcattat aagaaagcat tgcttatcaa tttgttgcaa 1080

cgaacaggtc actatcagtc aaaataaaat cattatttgc catccagctg atatccccta 1140

tagtgagtcg tattacatgg tcatagctgt ttcctggcag ctctggcccg tgtctcaaaa 1200

tctctgatgt tacattgcac aagataaaaa tatatcatca tgaacaataa aactgtctgc 1260

ttacataaac agtaatacaa ggggtgttat gagccatatt caacgggaaa cgtcgaggcc 1320

gcgattaaat tccaacatgg atgctgattt atatgggtat aaatgggctc gcgataatgt 1380

cgggcaatca ggtgcgacaa tctatcgctt gtatgggaag cccgatgcgc cagagttgtt 1440

tctgaaacat ggcaaaggta gcgttgccaa tgatgttaca gatgagatgg tcagactaaa 1500

ctggctgacg gaatttatgc ctcttccgac catcaagcat tttatccgta ctcctgatga 1560

tgcatggtta ctcaccactg cgatccccgg aaaaacagca ttccaggtat tagaagaata 1620

tcctgattca ggtgaaaata ttgttgatgc gctggcagtg ttcctgcgcc ggttgcattc 1680

gattcctgtt tgtaattgtc cttttaacag cgatcgcgta tttcgtctcg ctcaggcgca 1740

atcacgaatg aataacggtt tggttgatgc gagtgatttt gatgacgagc gtaatggctg 1800

gcctgttgaa caagtctgga aagaaatgca taaacttttg ccattctcac cggattcagt 1860

cgtcactcat ggtgatttct cacttgataa ccttattttt gacgagggga aattaatagg 1920

ttgtattgat gttggacgag tcggaatcgc agaccgatac caggatcttg ccatcctatg 1980

gaactgcctc ggtgagtttt ctccttcatt acagaaacgg ctttttcaaa aatatggtat 2040

tgataatcct gatatgaata aattgcagtt tcatttgatg ctcgatgagt ttttctaatc 2100

agaattggtt aattggttgt aacactggca gagcattacg ctgacttgac gggacggcgc 2160

aagctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttacgcgtcg ttccactgag cgtcagaccc 2220

cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt 2280

gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac 2340

tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt 2400

gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct 2460

gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga 2520

ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac 2580

acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagcattg 2640

agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt 2700

cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc 2760

tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg 2820

gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc 2880

ttttgctcac atgtt 2895

Claims (17)

1.靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物，其特征在于，所述的GHOST-shRNA复合物为装载有抑制LAMP2a表达的shRNA真核表达载体的细菌GHOST。

2.根据权利要求1所述的靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物，其特征在于：所述的抑制LAMP2a表达的shRNA真核表达载体是能表达针对Lamp2a的第9外显子序列的shRNA序列。

3.根据权利要求2所述的靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物，其特征在于：所述抑制LAMP2a表达的shRNA真核表达载体中的shRNA模板序列为SEQ No.1、SEQNo.2、SEQ No.3、SEQ No.4、SEQ No.5或SEQ No.6中的至少一条所示。

4.根据权利要求1～3任一项所述的靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物，其特征在于：所述抑制LAMP2a表达的shRNA真核表达载体为质粒载体。

5.根据权利要求4所述的靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物，其特征在于：所述的质粒载体为pENTR/U6、pLKO.1、pGPU6、pGPH1或pGenesil-2中的至少一种。

6.根据权利要求1～5任一项所述的靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物，其特征在于：所述的细菌GHOST为大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、肺炎杆菌、胸膜炎放线杆菌或溶血曼海姆菌中至少一种的GHOST。

7.根据权利要求1所述的靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物，其特征在于：所述的细菌GHOST为大肠杆菌DH5α的GHOST。

8.根据权利要求1～7任一项所述的靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物，其特征在于：所述的抑制LAMP2a表达的shRNA真核表达载体的核苷酸序列为SEQ No.7所示。

9.根据权利要求1～8任一项所述的靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物，其特征在于：所述的细菌GHOST和抑制LAMP2a表达的shRNA真核表达载体之间的比例为：每10⁸个大肠杆菌GHOST装载0.3～10μg shRNA真核表达载体。

10.根据权利要求1～9任一项所述的靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物，其特征在于：所述的细菌GHOST和抑制LAMP2a表达的shRNA真核表达载体之间的比例为：每10⁸个大肠杆菌GHOST装载1～5μg shRNA真核表达载体。

11.根据权利要求1～10任一项所述的靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物，其特征在于：抑制LAMP2a表达的shRNA真核表达载体是通过细菌GHOST内外的电位差装载于细菌GHOST内。

12.权利要求1～11任一项所述的靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物在制备治疗巨噬细胞高浸润型肿瘤的药物中的用途。

13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于：所述的巨噬细胞高浸润型肿瘤为乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、肾癌、滤泡性淋巴癌、恶性葡萄膜黑色素瘤、食管上皮癌或鳞状细胞癌中的至少一种。

14.治疗巨噬细胞高浸润型肿瘤的药物，其特征在于：由权利要求1～11任一项所述的靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物添加药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。

15.根据权利要求14所述的治疗巨噬细胞高浸润型肿瘤的药物，其特征在于：所述的巨噬细胞高浸润型肿瘤为乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、肾癌、滤泡性淋巴癌、恶性葡萄膜黑色素瘤、食管上皮癌或鳞状细胞癌中的至少一种。

16.根据权利要求14或15所述的治疗巨噬细胞高浸润型肿瘤的药物，其特征在于：所述的制剂为注射剂。

17.制备权利要求1～11任一项所述的靶向肿瘤相关巨噬细胞的GHOST-shRNA表达载体复合物的方法，其特征在于包括以下步骤：

a、设计针对Lamp2a的shRNA序列，构建可表达该shRNA序列的表达载体；

b、将构建所得的shRNA真核表达质粒装载入细菌GHOST中，制备得到GHOST-shRNA表达载体复合物。