CN109875988B

CN109875988B - 一种化合物dhnb缩氨基脲的合成及其在防治痛风与高尿酸血症的应用

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Publication number: CN109875988B
Application number: CN201811066452.4A
Authority: CN
Inventors: 余雄英; 廖永翠; 郑里翔; 董欢欢
Original assignee: Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2018-09-13
Filing date: 2018-09-13
Publication date: 2021-08-27
Anticipated expiration: 2038-09-13
Also published as: CN109875988A

Abstract

本发明涉及新药开发与应用领域，特别涉及DHNB缩氨基脲化合物在预防、治疗高尿酸血症和/或痛风领域的应用。该发明提供了一种如式I所示的新型化合物DHNB缩氨基脲的合成及其在降低血尿酸水平药物的应用。药效学实验表明本发明得到的DHNB缩氨基脲化合物比DHNB和阳性药别嘌醇更高效，且安全无毒。本发明提供的应用主要是通过抑制黄嘌呤氧化酶活性作用，从而降低血尿酸水平，能有效预防、治疗痛风和高尿酸血症，为临床治疗痛风和高尿酸血症提供了一种新的药物选择。

Description

一种化合物DHNB缩氨基脲的合成及其在防治痛风与高尿酸血症的应用

技术领域

本发明属于新药开发与应用领域，涉及DHNB缩氨基脲化合物的合成及其在预防、治疗痛风和高尿酸血症领域的应用。

背景技术

痛风是一种单钠尿酸盐（MSU）沉积所致的晶体相关性关节病，与嘌呤代谢紊乱或尿酸排泄减少所致的高尿酸血症（hyperuricemia，HUA）直接相关。中国HUA的患病率呈逐年上升趋势，发病年龄越趋低龄化，现已成为仅次于糖尿病的第二大代谢性疾病，给社会和家庭带来了巨大的经济和精神负担。近十年的流行病学研究显示，中国不同地区HUA患病率存在较大的差别，为5.46%~19.30%，其中男性为9.2%~26.2%，女性为0.7%~10.5%，总体男性高于女性。痛风是长期嘌呤代谢障碍（或）尿酸排泄减少，血尿酸增高引起组织损伤的一组临床综合征，高尿酸血症是痛风最重要的生化基础。尿酸由饮食摄入和体内分解的嘌呤化合物在肝脏中产生，约2/3尿酸通过肾脏排泄，其余由消化道排泄。痛风包括急性痛风性关节炎和慢性痛风石疾病，血尿酸升高除可引起痛风之外，还与肾脏、内分泌代谢和心脑血管等系统疾病的发生和发展有关。

目前治疗痛风的常规药物主要有秋水仙碱、非甾体类抗炎药、别嘌呤醇、非布索坦和苯溴马隆等。这些药物以抑制尿酸的形成或（和）促进尿酸的排泄达到缓解和治疗痛风与高尿酸血症的目的。体内尿酸的合成与嘌呤代谢有关，黄嘌呤氧化酶（XOD）是体内尿酸生成的关键酶，它能催化次黄嘌呤和黄嘌呤转化为尿酸。体内尿酸过多可导高尿酸血症，进而导致痛风。别嘌呤醇和非布索坦是XOD的抑制剂，这两种药物通过抑制XOD，减少体内尿酸合成，从而有效治疗痛风。但它们在临床使用中都具有一定的副作用，如别嘌呤醇可引起皮肤过敏反应及肝肾功能损伤，严重者可发生致死性剥脱性皮炎等超敏反应综合征；非布索坦可引起肝功能损害、恶心、皮疹等。服用苯溴马隆的不良反应有胃肠不适、腹泻、皮疹和肝功能损害等；秋水仙碱不良反应常见有恶心、呕吐、腹泻、腹痛、肝功能障碍和肾功能损伤等。可见目前预防和治疗痛风与高尿酸血症的药物虽然较多，但是大多数的药物副作用较大，影响生活质量。因此，开发新型的治疗高尿酸血症和痛风的药物仍然是目前医药界研究的热点。

有研究表明，3,4-二羟基-5-硝基苯甲醛（DHNB）属于原儿茶醛的一种衍生物，是一种较强的XOD抑制剂，可作为一种治疗高尿酸血症和痛风潜在的药物。DHNB能够降低高尿酸小鼠血清尿酸水平，且大剂量的DHNB对小鼠没有任何副作用(500 mg/kg)。但DHNB抑制XOD活性具有时间依赖性的缺陷，作用时间短。

有鉴于此，本发明提供了一种如式I 所示的化合物DHNB缩氨基脲，将DHNB和氨基脲进行醛胺缩合合成DHNB缩苯基氨基硫脲，并进行纯化，对其反复进行体内外药效学实验，体内测定其对高尿酸模型小鼠血清XOD，肝脏XOD的影响，血清尿酸的影响；体外利用多功能酶标仪测定其对XOD的抑制作用，探讨其抑制机制。并进行急性毒性试验。从而获得高效低毒的XOD抑制剂DHNB缩氨基脲。

发明内容

鉴于以上背景，本发明提供了一种如式I所示的新型DHNB缩氨基脲化合物的合成及其在降低血尿酸水平药物的应用。药效学实验表明本发明得到的DHNB缩氨基脲化合物比DHNB和阳性药别嘌醇更高效，且安全无毒。本发明提供的应用主要是通过抑制黄嘌呤氧化酶活性作用，从而降低血尿酸水平，能有效预防、治疗痛风和高尿酸血症，为临床治疗痛风和高尿酸血症提供了一种新的药物选择。

一种化学合成药物DHNB缩氨基脲，如结构式I所示：

式Ⅰ。

附图说明

图1 DHNB缩氨基脲的化学合成路线。

图2 DHNB缩氨基脲的红外光谱。

图3 DHNB缩氨基脲的氢谱。

图4 DHNB缩氨基脲质谱（正离子）。

图5 酶的浓度对酶促反应速度的影响。

图6 DHNB缩氨基脲抑制黄嘌呤氧化酶催化的Lineweaver-Burk曲线。

图7 DHNB缩氨基脲对高尿酸模型小鼠血清XOD活力的抑制作用。

图8 DHNB缩氨基脲对高尿酸模型小鼠血尿酸的作用。

图9 DHNB缩氨基脲对高尿酸模型小鼠肝脏XOD活力的抑制作用。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。

DHNB缩氨基脲化合物的合成、分离与纯化

所述的合成步骤：取0.01 mol氨基脲于1000 ml三颈烧瓶，再加入200 ml的甲醇加热回流，直到氨基脲完全溶解。取0.01 molDHNB于200 ml甲醇中，解热溶解。待氨基脲完全溶解之后，用恒压滴液漏斗将溶解DHNB的甲醇慢慢滴入三颈烧瓶中，且在20 min内滴完，滴完之后，往三颈烧瓶中滴入2滴冰乙酸作催化剂。继续回流反应2 h，TLC跟踪监测，直至原料点消失，则反应完全。具体反应式如图1。DHNB缩氨基脲化合物的分离和纯化：回流反应结束后，自然冷却至室温，封口放置4 ℃冰箱过夜至晶体完全析出，用冰乙醇洗净产物，真空干燥得砖红色粉末产物。

DHNB缩氨基脲化合物结构表征 DHNB缩氨基脲化合物结构表征：DHNB缩氨基脲，砖红色粉末（CH₃OH）IR (KBr)，ν_max 3420, 2989, 1617.6, 1691,1540 cm^–1 ;红外光谱见图2。¹HNMR(600HZ,DMSO-D₆)δ10.175(S,1H,NH), δ7.718(S,1H,CH), δ6.438(S,2H,NH₂), δ9.458(S,1H,OH-Ph-H), δ7.885,7.881(d,1H,OH-Ph-H), δ7.626,7.623(d,1H,Ph-H), δ7.390,7.387(d,1H,Ph-H);氢谱见图3。ESI-MS(m/z Mr=240)(C₈H₈O₅N₄, M+H⁺) ，质谱图见图4。

实验材料 DHNB缩氨基脲、磷酸盐缓冲液PBS、黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶、别嘌呤醇等。

实验方法

酶活力检测及样品抑制XOD测定：实验设置正常组(不加样品)、样品组，将黄嘌呤底物溶液100 uL,样品溶液依次加入96孔板，其它用PBS代替，保持整个体系的体积（300uL）一致，最后加入XOD溶液3 mL启动反应，测定290 nm处的吸光度值，间隔10 s记录一次，共测2 min内吸光度变化值，以时间为自变量，吸光度值为因变量，可以得到一条吸光度-时间的直线，计算直线的斜率Rate(dA/min)。每个样品需要平行操作3次，取平均值计算样品的抑制率。

抑制率（%）的计算通过对正常组及样品组2 min内的吸光度随时间的变化值，即直线斜率K的大小来计算酶活力的大小，从而求得抑制率。抑制率计算公式如下：抑制率（%）＝[（K1－K2）/K1]×100%。其中K1表示正常组的直线斜率，K2表示样品组的直线斜率。

半数抑制浓度IC₅₀的计算以样品浓度为自变量X,抑制率为因变量Y，采用SPSS19.0统计软件包计算回归方程。再根据回归方程计算抑制率为50%时的样品浓度，即半数抑制浓度IC₅₀。

DHNB缩氨基脲对XOD抑制机理在测活体系中，固定底物黄嘌呤浓度，加入不同浓度的DHNB缩氨基脲，改变XOD的质量浓度，测定不同浓度的抑制剂对XOD催化氧化黄嘌呤能力的影响。以酶促反应的速度对酶浓度作图，若得到一系列通过原点的直线，则为可逆抑制；若得到一组平行线，则为不可逆抑制。

DHNB缩氨基脲对XOD抑制类型固定XOD的质量浓度，改变底物黄嘌呤的浓度，测定不同浓度的抑制剂对酶活力的影响。通过Lineweaver-Burk方程：1/v =Km/Vmax*1/[S] +1/Vmax作图可以得出抑制类型。

实验结果

各样品及别嘌醇对黄嘌呤氧化酶的抑制作用

通过研究DHNB、DHNB缩氨基脲及别嘌醇对XOD的抑制作用发现不同样品对XOD的抑制率都有所不同，但抑制率都随浓度的增加而增加，即抑制率与浓度呈正相关性，而各样品IC50也各有不同，DHNB对XOD的抑制作用IC50为32.12 mmol/L, DHNB缩氨基脲IC50为0.29mmol/L，抑制效果较DHNB更为显著，而阳性对照物别嘌醇IC50则为6.74 umol/L。不同样品对XOD的抑制作用结果见表1。

表1 不同样品对黄嘌呤氧化酶的抑制作用结果（n＝3）

DHNB缩氨基脲对XOD抑制机理

通过固定底物的浓度，改变XOD的浓度，加入不同浓度的DHNB缩氨基脲，分别测定不同浓度的DHNB缩氨基脲对XOD的抑制作用，四个不同浓度的DHNB缩氨基脲对XOD的抑制结果。如图5所示，四条直线并没有平行，而是相交于一点，表明DHNB缩氨基脲是XOD的可逆抑制剂。

DHNB缩氨基脲对XOD抑制类型在XOD体系中，在相同的XOD浓度条件下，改变底物黄嘌呤在总体系300 mL中的体积[50 mL(3.8 mg/mL）、60 mL（4.564 mg/mL）、70 mL（5.32mg/mL）、80 mL（mg/mL）、100mL（7.6 mg/mL）]，即改变了底物XOD在体系中的质量浓度，测定290nm处不同浓度（0 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL 、0.15 mg/mL）的抑制剂对XOD的抑制作用。DHNB缩氨基脲对XOD的抑制类型如图6所示。双倒数作图的各直线在第二象限有共同交点，而交点并没有落在坐标轴上，在同一个底物浓度下，反应速率随抑制剂浓度增大而减小，米氏常数Km与最大反应速率Vm均随抑制剂浓度的改变而发生变化，说明DHNB缩氨基脲对XOD的抑制机制既不是竞争性也不是反竞争性的，因此可以初步判断DHNB缩氨基脲对XOD抑制机制可能是混合型的。

DHNB缩氨基脲对高尿酸模型小鼠的影响

实验动物选取健康雄性昆明种小鼠40只，体重18-22 g，由江西中医药大学实验动物科技中心提供 [实验动物生产许可证号:SCXK(赣)2018-003]。实验前饲养一周，以适应环境。饲养条件：室温25±2℃，相对湿度60%-70%。

药液制备各组灌胃给药药物及动物造模物质均用0.9%CMC-Na液配成含药混悬液。

动物造模参照文献方法用氧嗪酸钾和尿酸ip小鼠，增加血清尿酸水平，造成小鼠高尿酸血症模型。雄性昆明种小鼠适应性饲养一周后随机分成生理盐水组、高尿酸模型组、DHNB缩氨基脲、别嘌呤醇组共4组，每组10只。除生理盐水组外，其他各组均以氧嗪酸钾和尿酸ip小鼠，连续2 d进行造模以增加血清尿酸水平，造成小鼠高尿酸血症模型。

实验操作生理盐水组和高尿酸模型组每天均按20 mL·kg^-1剂量ig生理盐水,连续6d,别嘌呤醇组（10 mg·kg ^-1）每天ig给药1次，持续6 d，DHNB缩氨基脲组均以10 mg·kg^-1剂量每天ig给药1次，持续6 d，从给药第5天开始，除生理盐水组外，其他各组每天ig给药前1h 均要ip氧嗪酸钾和尿酸，氧嗪酸钾和尿酸的剂量分别为0.3 g· kg ^-1和0.25 g· kg^-1，每天1次，连续2 d进行造模。在第6天ig给药1h后从小鼠股动脉进行采血，血样分别置于1.5mL 离心管中，在4 ℃冰箱中凝固2 h,在3000 r·min^-1低温离心5 min。每份血样血清进行血清尿酸水平和血清XOD活力测定。取血后，解剖小鼠取肝脏用锡箔纸包裹后，经液氮速冻置于-20 ℃冰箱中待测XOD活力。

生化指标检测分别测定小鼠血尿酸水平、血和肝脏中XOD活性。采用磷钨酸法检测各组小鼠血尿酸，酶比色法检测XOD活性。具体操作按试剂盒说明书进行。

实验结果

DHNB缩氨基脲对高尿酸模型小鼠血清XOD活力的抑制作用

采用磷钨酸法检测生理盐水组、高尿酸模型组、DHNB缩氨基脲和别嘌呤醇组小鼠血清XOD活力，如图7所示，模型组XOD的活力与生理盐水对照组呈现出极显著差异，表明实验造模成功。造模后，DHNB缩氨基脲和阳性药别嘌呤醇均能抑制小鼠血清XOD活力，且与模型组相比均呈现显著性差异。此外，DHNB缩氨基脲对XOD的抑制作用比别嘌呤醇稍强，但两者之间无显著性差异。以上结果表明，DHNB缩氨基脲对小鼠血清XOD活力具有较好的抑制作用。

DHNB缩氨基脲对高尿酸模型小鼠血尿酸的作用

小鼠经高尿酸造模后，检测生理盐水组、高尿酸模型组、DHNB缩氨基脲和别嘌呤醇组小鼠血清尿酸水平。如图8所示，模型组小鼠血清含量与生理盐水对照组呈现出极显著性差异，表明实验造模成功。DHNB缩氨基脲和阳性药别嘌呤醇均能降低小鼠血清尿酸水平，且与模型组相比具有显著性差异。与阳性药别嘌呤醇相比，小鼠血清尿酸水平在DHNB缩氨基脲给药后更低，且两者之间呈现出显著性差异。以上结果表明，DHNB缩氨基脲具有较好降低小鼠血清尿酸水平的作用，且比阳性药别嘌呤醇的作用更好。

DHNB缩氨基脲对高尿酸模型小鼠肝脏XOD活力的抑制作用

采用磷钨酸法检测生理盐水组、高尿酸模型组、DHNB缩氨基脲和别嘌呤醇组小鼠肝脏XOD活力，如图9所示，模型组XOD的活力与生理盐水对照组增强，表明实验造模成功。造模后，DHNB缩氨基脲和阳性药别嘌呤醇均能抑制小鼠肝脏XOD活力。此外，DHNB缩氨基脲对XOD的抑制作用比别嘌呤醇稍强，但两者之间无显著性差异。以上结果表明，DHNB缩氨基脲对小鼠肝脏XOD活力具有较好的抑制作用。

DHNB缩氨基脲对动物毒性研究

小鼠急性中毒实验选取健康昆明种小鼠24只（32±2g），雌雄各半，分两组，DHNB缩氨基脲组，别嘌醇组，每组12只，雌雄各半，按体重质量500 mg/kg剂量灌胃（ig）一次给药，给药后观察记录小鼠活动及死亡情况。结果，DHNB缩氨基脲组给药一周内小鼠无毒性反应，无一死亡，状态良好；而别嘌醇组12只小鼠，死亡6只，其中雌鼠2只，雄鼠4只。初步毒性试验表明DHNB缩氨基脲毒性极低，或者无毒。

Claims

1.一种预防、治疗痛风与高尿酸血症的化学合成药物3,4-二羟基-5-硝基苯甲醛（DHNB）缩氨基脲，所述药物由DHNB和氨基脲经醛胺缩合反应合成，反应式如下所示：

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。

2.根据权利要求1所述的预防、治疗痛风与高尿酸血症的药物DHNB缩氨基脲，其特征在于，DHNB缩氨基脲作为化学药物配成片剂、胶囊、粒剂、脂质体、注射液、缓释控释制剂。

3.根据权利要求1所述的预防、治疗痛风与高尿酸血症的药物DHNB缩氨基脲，其特征在于，与临床预防和治疗痛风药物别嘌呤醇、非布索坦和秋水仙碱联合应用于痛风和高尿酸血症的预防与治疗。

4.根据权利要求1所述的预防、治疗痛风与高尿酸血症的药物DHNB缩氨基脲，其特征在于，与金属离子合成相应的金属配合物应用于痛风和高尿酸血症的预防与治疗。