CN109870583B - 急性胰腺炎相关的代谢物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了急性胰腺炎相关的代谢物及其应用，所述代谢物为盐酸肉桂硫胺或头孢氮氟，本发明采用代谢物盐酸肉桂硫胺或头孢氮氟用于急性胰腺炎的诊断、预测用于急性胰腺炎受试者对治疗剂的响应反应。本发明同时提供了治疗胰腺炎的药物组合物，所述药物组合物可引起代谢物水平的变化。

Description

急性胰腺炎相关的代谢物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及与急性胰腺炎相关的代谢物及其应用。

背景技术

急性胰腺炎(Acute pancreatitis，AP)是引起急性腹痛的常见疾病之一，它是由多种病因导致胰腺内的胰酶被激活，引起胰腺组织自身消化、水肿、出血，胰腺局部发生炎症反应为主要特征的疾病，病情严重者可发生全身炎性反应综征(Systemic inflammatoryresponse syndrome，SIRS)，并伴有器官功能障碍(Organ dsfunction,OD)。急性胰腺炎的临床表现多种多样，特异性低，对于不良预后的预测敏感性低于40％(SteinbergWM.Predictors of severity of acute pancreatitis[J].Gastroenterol C1inN Am,1990,19(4):849-61.)，且AP发生全身炎性反应综合征的病理学基础尚未明确。由于AP病因多样、发病机制复杂、死亡率较高，急性胰腺炎的总体病死率达5％～10％，重度急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis，SAP)患者病死率高达36％～50％(Lankisch PG,Apte M,Banks PA.Acute pancreatitis[J].Lancet,2015,386(9988):85-96)，因此尽早判断急性胰腺炎患者的严重程度，鉴别病情变化，尤其是重症急性胰腺炎(Severe acutepancreatitis,SAP)患者，及时对SAP患者进行密切监测和积极治疗，对提高患者生存率和减轻经济压力等至关重要。临床上存在多种评估AP严重程度的多重评分系统，例如APACHEII,Ransom BISAP等，但是这些评价系统耗费时间长，变量较多，很难应用于重症科室以外的临床科室(Pavlidis TE,Pavlidis ET,Sakantamis AK.Advances in prognosticfactors in acute pancreatitis:a mini-review[J].Hepatobiliary Pancreat DisInt.2010,9(5):482-6.)，不利于疾病早期诊断及治疗。

代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后，系统生物学的重要组成领域(Coodacre R.Marking sence of the metabolome using evolutionary computation:seeing the wood with trees[J].J Exp Bot 2005,56(410):245-254.)。它是指运用核磁共振、高效液相谱、气相色谱、质谱等系统研究手段，分析病理生理学刺激和遗传修饰引起的生物的体液、组织中的内源性代谢产物谱的变化来研究整体的生物学状况和基因功能调节。代谢组学是一项动态的、多参数应答的新技术和新方法，反映的是基因、环境、致病因素、营养、药物、时间等诸多因素综合作用于机体后的总的反应，是判定健康、疾病和治疗效果合适的分子集合(Holmes E,Tang H R,Wang Y L,et al.The assessment of plantmetabolite profiles by NMR-based methodologies[J].Plant Med,2006,72(9):771-785.)。它跳过生命体内的复杂调控过程，通过对代谢物的分析给出最终的、整体的结果，在健康评估、疾病诊断、疗效评价、药物开发等方面有巨大的优势，不仅可以用于一些疾病的诊断，揭示其病理过程，而且可以预示部分疾病的转归，同时在个性化治疗、健康监测、疾病诊断等各个方面都能提供寻找相关生物标记物的技术平台(Schnackenbrg LK,BegerRD.Monitoring the health to disease continuum with global metabolic profilingand systems biology[J].Pharmacogenomics,2006,7(7):1077.)。与传统的代谢研究相比，代谢组学通过现代化学的仪器分析技术检测机体整个代谢产物谱的变化，并通过多元统计分析方法研究整体的生物学功能状况。将代谢组学研究与疾病发生及药物治疗相结合，量化生物代谢随时间变化的规律，来辨识和解析被研究对象的生理，病理状态及环境因子，基因组成等的关系，并找出有可能与之相关的生物标志物，从而达到把握健康状态和疾病治疗措施的效果。

发明内容

本发明的目的在于发现与急性胰腺炎及其治疗响应相关的代谢物标志物，通过检测所述代谢物标志物的含量，可以判断急性胰腺炎患者是否患有急性胰腺炎以及对药物治疗的响应，从而为患者的个性化治疗提供指导。

本发明的第一方面提供了一种试剂，所述试剂可以检测代谢物盐酸肉桂硫胺(Cinanserin hydrochloride)或头孢氮氟(Cefazaflur)的水平。

进一步，所述试剂包括通过色谱、光谱或质谱仪/光谱法检测代谢物的含量的试剂。

进一步，所述色谱检测为超高效液相层析检测。

本发明的第二方面提供了一种体外检测代谢物的产品，所述产品包括本发明第一方面所述的试剂。

本发明的第三方面提供了一种筛选治疗急性胰腺炎的候选药物的方法，包括步骤：

将待筛选物质加入含有盐酸肉桂硫胺或头孢氮氟的培养体系，和

检测所述体系中盐酸肉桂硫胺或头孢氮氟的含量，

若待筛选物质可增加盐酸肉桂硫胺、头孢氮氟的含量，则表明该待筛选物质是治疗急性胰腺炎的候选药物。

本发明的第四方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括盐酸肉桂硫胺或头孢氮氟的促进剂。

进一步，所述促进剂为增加盐酸肉桂硫胺或头孢氮氟的试剂。

本发明的第五方面提供了如下任一项所述的应用：

a.本发明第一方面所述的试剂在制备诊断急性胰腺炎的产品中的应用；

b.本发明第一方面所述的试剂在制备判断治疗剂治疗急性胰腺炎的响应产品中的应用

c.本发明第二方面所述的产品在制备诊断急性胰腺炎的工具中的应用；

d.本发明第二方面所述的产品在制备判断治疗剂治疗急性胰腺炎的响应工具中的应用；

e.本发明第四方面所述的药物组合物在制备治疗急性胰腺炎的工具中的应用；

f.盐酸肉桂硫胺、头孢氮氟在构建预测急性胰腺炎的计算模型中的应用；

g.盐酸肉桂硫胺、头孢氮氟在构建预测药物治疗急性胰腺炎的治疗响应的计算模型中的应用。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了与急性胰腺炎以及药物治疗效果相关的代谢物，通过检测代谢物的含量，可以判断受试者是否患有急性胰腺炎以及急性胰腺炎患者对药物治疗的应答反应，有利于急性胰腺炎患者的个性化治疗。

附图说明

图1是小鼠血清淀粉酶含量图。

图2是小鼠胰腺组织图。

图3是小鼠胰腺组织病理改变图。

图4是QC样本正负离子(ES+/-)模式BPI和TIC图，其中，图A是正离子(ES+)模式BPI图，图B是正离子(ES+)模式TIC图，图C是负离子(ES-)模式BPI图，图D是负离子(ES-)模式TIC图。

图5是OPLS-DA分析图。

具体实施方式

为了评估代谢物能否作为急性胰腺炎的标志物，本发明基于质谱色谱联用技术，对使用药物治疗急性胰腺炎受试者的样本的代谢组学进行研究，寻找正常与疾病，以及疾病治疗前后的代谢物的变化，建立重要差异代谢列表，研究其所表征的与急性胰腺炎相关的生物信息，并从中进一步筛选出关键代谢物生物标志物，从而使以一种改进的方式并在疾病的早期阶段筛查和诊断急性胰腺炎成为可能，并且允许更准确和可靠地预测患有急性胰腺炎的患者是否可能对药物疗法有反应。

通常，由于生物标志物可能将两种或更多种生物状态彼此区分，因此它是一种有价值的工具，作为正常生物过程、致病过程的指示物或作为药物干预的反应。代谢物是低分子化合物(<1kDa)，小于大多数蛋白质、DNA和其它大分子。蛋白质活性的小变化导致生化反应及其代谢物(＝代谢生物标志物，着眼于身体的代谢)的巨大变化，其浓度、流量和转运机制对疾病和药物干预敏感。这可能获得反映遗传学和环境因素(例如:营养、身体活动、肠微生物和药物)的生理物质和病理生理物质的个体概况。因此，与如作为生物标志物而不是代谢生物标志物的蛋白质或激素相比较，代谢生物标志物提供了更全面的信息。

本发明通过代谢组学测序以及生物信息学分析，首次发现了盐酸肉桂硫胺或头孢氮氟在不同的组之间呈现显著性差异。盐酸肉桂硫胺(Cinanserin hydrochloride)，化合物ID为CSID4938327，分子式为C₂₀H₂₄ClN₂OS，在急性胰腺炎中含量显著增加，使用药物治疗后，该代谢物的水平显著降低，与正常对照无显著性差异；头孢氮氟(Cefazaflur)化合物ID为CSID36777，分子式为C₁₃H₁₃F₃N₆O₄S₃，在急性胰腺炎中含量显著增加，使用药物治疗后，该代谢物的水平显著降低，且与正常对照无显著性差异。

本文使用的术语“代谢物生物标志物”或短的“生物标志物”被定义为适合作为急性胰腺炎存在和状态的指标化合物，这种化合物是哺乳动物体内的代谢过程中出现的代谢物或代谢化合物。本发明提供了通过比较所检测的代谢物水平与代谢物参考水平，提供对患者是否患有急性胰腺炎的诊断，或者判断受试者患者对急性胰腺炎治疗剂的响应情况。

术语代谢物的“参考水平”意指可指示具体疾病状态、其显型或缺乏以及疾病状态的组合、其显型或缺乏的代谢物的水平。在一个实施方案中，代谢物的疾病参考水平意指在患者中可指示急性胰腺炎的阳性诊断的代谢物的水平。在另一个实施方案中，代谢物的“健康参考水平”意指在患者中可指示健康状况的阳性诊断的代谢物的水平。

作为一种可实施的方案，代谢物的“参考水平”可为以下的一个或多个代谢物的绝对或相对量或浓度；代谢物的存在或缺乏；代谢物的量或浓度的范围；代谢物的最小和/或最大量或浓度；代谢物的平均量或浓度；和/或代谢物的中位数量或浓度。作为另外一种可实施的方案，对于代谢物的组合的“参考水平”也可为相关彼此的两个或更多个代谢物的绝对或相对量或浓度的比值。可通过检测在一个或多个适当的患者中所需代谢物的水平，确定对于特定疾病状态、其显型或缺乏的适当代谢物的阳性和阴性参考水平，且这样的参考水平可被修改使之适合于特殊的患者群体(如，参考水平可为年龄相匹配的，以便可在得自某个年龄的患者样品中的代谢物水平与在某个年龄组中的具体疾病状态、其显型或缺乏的参考水平之间进行比较)。作为另外一种可实施方案，参考水平可被修改使之适合于特殊的技术，所述技术可被用于检测生物样品中的代谢物水平(如LC-MS、GC-MS等)，在那里代谢物水平基于所用的特殊技术可不同。

本发明的一个方面涉及急性胰腺炎发展的诊断。在一个实施方案中，可在疾病进展的临床体征出现之前作出诊断。在一个实施方案中，本发明提供在患者中诊断受试者患急性胰腺炎的方法，其中从患者收集样品并检测样品中一种或多种代谢物的水平。基于所检测的代谢物的水平，判断患者是否患有急性胰腺炎。在一个这样的实施方案中，所检测的代谢物包括盐酸肉桂硫胺、头孢氮氟。本发明可采用本领域熟知的方法进行检测，包括并不限于简单比较法如手工比较法、统计分析法如t-检验、Welch′s T-检验、Wilcoxon′s秩和检验、随机森林算法。

本发明也涉及判断或预测患者对使用急性胰腺炎的治疗剂的响应，如用于本文的，“响应”意指显示以下情况的患者：与急性胰腺炎相关联的代谢物水平的下降；与急性胰腺炎相关联的代谢物水平的增高；与健康状况相关联的代谢物水平的下降；和与健康的状况相关联的代谢物水平的增高。在本发明的具体实施方案中，响应是指使用治疗剂后，与未接受治疗的急性胰腺炎患者相比，盐酸肉桂硫胺或头孢氮氟的水平增加；或者与健康受试者相比，盐酸肉桂硫胺或头孢氮氟无显著性差异。

在本发明中，可以使用本领域已知的用于这样的代谢物的任何合适方法来分析生物样品中的特定代谢物。使用定量分析方法包括但不限于色谱法、光谱法和质谱法。典型的质谱仪由其将样品内的分子离子化的来源和用于检测电离分子或分子片段的检测仪组成。常用来源的非限制性实例包括电子冲击、电子喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)、大气压光电离(APPI)、基质辅助激光解析电离(MALDI)、表面增强激光解析电离(SELDI)，及其衍变。常见的质谱分离和检测系统可以包括四级、四级离子阱、线性离子阱、飞行时间(TOF)、扇形磁场、离子回旋加速器(FTMS)、轨道离子阱，及其衍变和组合。FTMS优于其他基于MS的平台的优势是其高分辨力，允许分离差异只在数百道尔顿的代谢物，许多这样的将被较低分辨的仪器错过。

色谱可以包括GC，LC，HPLC和UHPLC；光谱可包括UV/Vis，IR和NMR；质谱分析器/光谱可以包括ESI-QqQ，ESI-QqTOF，MALDI-QqQ，MALDI-QqTOF和MALDI-TOF-TOF。更优选地，质量分析器/光谱分析包括四极杆质量分析器，离子阱质谱分析器，TOF(飞行时间)质量分析器、轨道阱质量分析器、磁式扇形质量分析器、静电场扇形质量分析器(ElectrostaticSector Mass Analyzer)、离子回旋共振(ICR)以及质量分析器的组合(包括单四极杆(Q)和三重四极杆(QqQ)，QqTOF，TOF-TOF，Q轨道阱)。优选是使用FLA-和HPLC-串联质谱法。

其中，GC＝气相色谱，CE＝毛细管电泳，LC＝液相色谱，HPLC＝高度液相色谱，UHPLC＝超高效液相色谱，UV-Vis＝紫外可见，IR＝红外，NIR＝近红外，NMR＝核磁共振，ESI＝电子喷雾电离，MALDI＝基质辅助激光解吸/电离，TOF＝飞行时间，APCI＝大气压化学电离，QqQ＝三重四极杆配置(也称为Qlq2Q3(Q1和Q3四极杆是质量过滤器，q2是无质量分辨四极杆(no mass-resolving quadrupole)))。

在本发明中，也可以通过特定化学或生物学试验来测定所述至少一种代谢物。所述试验将包含允许特异性检测样品中所述至少一种代谢物的工具。优选地，所述工具能够特异性识别代谢物的化学结构，或基于其与其他化合物反应的能力或其在生物学读出系统中诱导响应(例如报道基因的诱导)的能力特异性鉴定代谢物。能够特异性识别代谢物的化学结构的工具优选为抗体，或特异地与化学结构如受体或酶相互作用的其他蛋白质。例如可以使用代谢物作为抗原通过本领域所熟知的方法获得特异抗体。如此处所指的抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体，及其片段，如能够结合抗原或半抗原的Fv、Fab和F(ab)2片段。本发明也包括人源化的杂交抗体，其中显示想要的抗原特异性的非人供体抗体的氨基酸序列与人受体抗体的序列组合。此外，还包括的是单链抗体。供体序列通常至少包括供体的抗原结合氨基酸残基，但也可包含供体抗体的其他结构和/或功能相关的氨基酸残基。此类杂合体可以通过本领域所熟知的几种方法来制备。能够特异性识别代谢物的合适的蛋白质优选为酶，其参与所述代谢物的代谢转化。所述酶可以使用代谢物作为底物或可以转化底物成为代谢物。此外，所述抗体可以用作产生特异性识别代谢物的寡肽的基础。这些寡肽将例如包含酶的结合结构域或接受所述代谢物的袋。基于合适的抗体和/或酶的试验可以是RIA(放射免疫测定)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、夹层酶免疫试验、电化学发光夹层免疫测定(ECLIA)、解离增强镧系荧光免疫测定(dissociation-enhanced lanthanide fluoroimmuno assay，DELFIA)或固相免疫试验。此外，代谢物也可基于它与其他化合物反应的能力(即通过特异的化学反应)得到鉴定。合适的反应为本领域所熟知，并优选地包括酶促反应、酶促分光光度测定方法、荧光分光光度法和荧光；化学发光。可以使用其他检测方法如毛细管电泳和比色法。另外，代谢物可因其在生物学读出系统中诱导响应的能力而得到测定。生物学响应将检测为表示样品中包含的代谢物的存在和/或量的读出。生物学响应可以是例如，基因表达的诱导，或细胞或生物体的表型响应。

在本发明中，生物样本取自哺乳动物，优选为小鼠，大鼠，豚鼠，狗，小型猪或人，最优选为人。生物样品优选是血液，然而，允许根据本发明进行测定的本领域技术人员已知的任何其他生物样品也是合适的。血液样品通常是全血，血清或血浆。

尽管使用一种代谢物对于诊断急性胰腺炎疾病就足够了，但使用一种或多种，两种或多种，三种或多种，或四种或多种这样的代谢物包括在本发明内，并且在许多情况中，这是优选的。可以分析代谢物，并且以任意组合用于诊断。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

实施例1中药对急性胰腺炎的治疗

1、实验材料

1.1实验主要材料

表1使用材料清单

1.2实验主要器材

手术器械：无菌显微弯镊2把，眼科剪2把，持针钳1把，手术刀1把。

其他：干棉球，医用棉签，缝合线，手术灯，手术板，固定橡皮筋，酒精棉，无菌纱布，无菌培养皿，生理盐水，10mL注射器，1mL注射器，4号缝合针。

2、实验方法

2.1动物分组

30只SPF级C57BL/6小鼠，雄性，8周龄，20g左右，适应性饲养1周后随机分为五组，每组6只，分组情况如表2所示：

表2小鼠分组情况

2.2药物配制

表3药物配制

2.3动物模型构建及药物处理

实验小鼠制模前禁食12h，不禁水。对照组注射等体积生理盐水，其余各组接受7次腹腔注射雨蛙肽(50μg/kg，每次间隔1h)，最后一次注射完后，腹腔注射30mg/kg剂量的LPS，制备AP模型。大黄酸治疗组、和厚朴酚治疗组、大黄酸+和厚朴酚治疗组于首次注射雨蛙肽后1h、5h、9h分别尾静脉注射0.2％大黄酸4mg/kg，腹腔注射和厚朴酚5mg/kg。

2.4血清和胰腺的收集

模型构建完成后，即首次注射雨蛙肽7h后，小鼠眼眶采血。于首次腹腔注射雨蛙肽12h后在无菌状态下进行小鼠眼球取血，全血室温放置2h或4℃过夜后，6000r/min，离心5min，收集血清，-80℃保存备用。同时取胰腺组织，拍照，在同样的位置将胰腺组织分为2份，1份用福尔马林溶液固定，1份直接液氮速冻后放-80℃冻存备用。

2.5血清淀粉酶的检测

采用上海酶联生物科技有限公司的小鼠淀粉酶(AMS)试剂盒(ELISA)检测血清淀粉酶含量。

1)从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条。

2)加样：每孔各加入标准品或待测样品50μL，加酶标抗体工作液50μL。将反应板充分混匀后置37℃恒温箱温育60min。

3)洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

4)每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

5)每孔加入50μL终止液，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

6)以标准品为横坐标，OD值为纵坐标，画出标准曲线。根据样品OD值在该曲线图上查出相应样本中待测因子蛋白含量。

2.6胰腺组织的HE染色

1)石蜡切片制作

①切片：包埋后的组织块经修整后，用切片机切成5μm的石蜡带。

②贴片：将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用处理干净的载玻片捞片，组织带可黏在载玻片上。

③烤片：60℃恒温箱内烤片2h。

2)脱蜡和水化

①60℃恒温箱中烘烤20min。

②二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min；

③无水乙醇中浸泡5min；

④95％乙醇中浸泡5min；

⑤70％乙醇中浸泡5min；

⑥50％乙醇中浸泡5min；

⑦纯水中浸泡5min；

3)苏木素染色5min；盐酸乙醇分化5s；

4)自来水返蓝15min。

5)伊红染色5min。

6)95％乙醇快速清洗2次。

7)无水乙醇2min快速脱水，二甲苯透明5min*3。

8)树胶封片，镜检拍照。

3、实验结果

3.1小鼠血清淀粉酶含量

7h，12h小鼠血清淀粉酶含量如图1所示(*：与对照组相比，p<0.05，**：与对照组相比，p<0.01，#：与模型组相比，p<0.05，##：与模型组相比，p<0.01)，首次腹腔注射雨蛙肽7h后，测得胰腺炎小鼠模型中血清淀粉酶含量显著高于空白对照组和给药治疗组，说明小鼠胰腺炎模型构建成功，而大黄酸和厚朴酚力联合用药组的效果显著优于单独用药的效果。

3.2小鼠胰腺组织图片

首次注射雨蛙肽12h后，取胰腺组织拍照，结果如图2所示，相较空白对照组，模型组动物的胰腺组织有明显的水肿，大黄酸+和厚朴酚联合用药比单独使用这两种药物效果好，能够缓解胰腺炎模型小鼠的胰腺组织水肿现象。

3.3 HE染色结果

HE染色结果如图3所示，与空白对照组相比，胰腺炎模型组的细胞间间隙较大，且细胞核较多，说明炎症模型会导致巨噬细胞等聚集在炎症周围。大黄酸治疗组、和厚朴酚治疗组相对胰腺炎模型组，细胞间间隙有所减小，细胞核数目也减少了。大黄酸+和厚朴酚联合用药组相对胰腺炎模型组，能明显减少细胞核的数目，细胞间间隙也有所减小，说明联合用药能够缓解胰腺炎炎症。

实施例2筛选与影响急性胰腺炎的相关的代谢物

1、样本的收集

本实验收集实施例中空白对照组、模型组以及大黄酸+和厚朴酚联合治疗组的小鼠组织样本各10例。

2、实验信息

2.1仪器及试剂

表4试剂

表5仪器

2.2实验方法

2.2.1代谢物提取

1)取100mg组织，加入500μL的裂解液(MeOH：H₂O＝1:1)；

2)在组织破碎仪中打碎，6,500MHz，1min，振荡3次；

3)涡旋混匀后，在-20℃冰箱中放置过夜；

4)离心：4℃，13,000rpm，20min；

5)取相同体积上清液冻干；

6)加入100μL裂解液复溶，超声5min；

7)离心：4℃，13,000rpm，20min；

8)取上清液上机。

2.2.2仪器参数

1)液相条件

柱温(℃):45

样品温度(℃):4

液相流速:0.35ml/min

A相:水+0.1％甲酸

B相:乙腈+0.1％甲酸

表6液相条件

2)质谱条件

在正离子采集模式下，Masslynx软件基于MSE功能对样品进行一级、二级质谱数据采集。毛细管电压：2.5kV，锥孔电压24V，离子源温度100℃，去溶剂气流速800L/h，锥孔气流速50L/h，14min内对m/z为50-1500Da的离子进行扫描，0.2s/循环。

在负离子采集模式下，Masslynx软件基于MSE功能对样品进行一级、二级质谱数据采集。毛细管电压：2.5kV，锥孔电压25V，离子源温度100℃，去溶剂气流速600L/h，锥孔气流速10L/h，14min内对m/z为50-1500Da的离子进行扫描，0.2s/循环。

2.2.3上机检测

为了更好地采集数据，确保仪器的最佳状态，在正式样品上机前需要用QC样本做稳定性测试，一般将同一个QC样本重复进样10针左右，此样本为condition QC，待仪器稳定方可进样。每10针样本中间插入一个QC，确保仪器进样过程中的稳定性。

3、实验结果

3.1数据结果

在本次实验中正离子共检出了15013个features、负离子共检出了10431个features。其中QC样本的BPI(base peak intensity,基峰图)和TIC(total ionChromatogram，总离子流色谱图)如图4所示，图右上角表示峰强度，左上角标明样品名称。BPI图中的峰型比较窄、数量多，表明色谱分离效果好。

3.2数据质控

在仪器进行数据采集的过程中，将插在样品中间的QC样品做overlay，确定保留时间和峰强度基本保持不变；对QC样本进行PCA分析，主要是对数据进行降维分析，检测实验组间的差异性及组内的重复性，对QC样本的相关性进行分析，考察研究样本多次生物学实验的重复性，结果显示，在数据采集过程中，时间和峰强度基本保持不变；且QC样本相对集中在一起，不存在随时间变动的情况，任意两组重复实验共定量多肽强度值的Pearson相关系数均大于0.9，具有较好的一致性，说明实验仪器具有较好的稳定性。

4、数据分析

4.1 PCA分析

将获得的原始数据导入Progenesis QI(Waters)软件进行统计分析，首先对数据进行Lockmass的质量分数校正和保留时间的峰对齐，然后对样本进行分组，导入EZinfo软件进行差异代谢物的筛选。PCA分析是EZinfo软件分析的第一步，主要是对数据进行降维分析，可以检测实验组间的差异性及组内的重复性。在二维图中，取前两个主成分PC1，PC2来表示样本，空间分布差异越小，表示两个样本的数据越接近。重复性较好的实验，同一组内的不同样本应该聚集在一个相对集中的范围内，并可以与其他组的数据聚集区域区分开。

4.2 OPLS-DA(正交偏最小二乘法-判别分析)

为了消除与分类不相关的噪音信息，同时也为了筛选导致分类差异的可信代谢物，选取OPLS-DA分析过滤与分类不相关的信号，即正交信号，获得OPLS-DA模型，对模型的质量用交叉验证法进行检验(即用一部分样本数据制作分组模型，另外一部分数据用来测试已分组的模型)，得到的R2X和Q2分别代表模型可解释的变量和可预测度，可对模型的优劣进行判别(详见图5)，实验中的OPLS-DA模型的R2Y和Q2分别是99％和98％，表示模型有良好的可解释能力和可预测分组能力。通过模型分析对代谢物进行VIP打分筛选，VIP分数越高的代谢物，对分组的贡献越大，本实验选取VIP>1、P value<0.05的代谢物为差异代谢物。

5、结果

经过数据分析发现，代谢物盐酸肉桂硫胺或头孢氮氟在空白对照组和模型组、治疗组和模型组间存在显著性差异，而在空白对照组和治疗组之间则无显著性差异，相比空白对照组，模型组中的盐酸肉桂硫胺或头孢氮氟的含量显著降低，约降低1.51倍和2.13倍，相比模型组，治疗组中的盐酸肉桂硫胺或头孢氮氟的含量显著增加，分别增加约1.45倍和2.07倍，说明盐酸肉桂硫胺或头孢氮氟可作为标志物指示胰腺炎的发生，同时可以作为药物治疗有效性的监测指标，应用于药物治疗胰腺炎的效果判断。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (7)

1.一种筛选治疗小鼠急性胰腺炎的候选药物的方法，其特征在于，包括步骤：

将待筛选物质加入含有盐酸肉桂硫胺或头孢氮氟的培养体系，和

检测所述体系中盐酸肉桂硫胺或头孢氮氟的含量，

若待筛选物质可增加盐酸肉桂硫胺或头孢氮氟的含量，则表明该待筛选物质是治疗急性胰腺炎的候选药物。

2.如下任一项所述的应用：

a. 检测代谢物盐酸肉桂硫胺或头孢氮氟的水平的试剂在制备诊断小鼠急性胰腺炎的产品中的应用；

b. 检测代谢物盐酸肉桂硫胺或头孢氮氟的水平的试剂在制备判断治疗剂治疗小鼠急性胰腺炎的响应产品中的应用；

c. 体外检测代谢物盐酸肉桂硫胺或头孢氮氟产品在制备诊断小鼠急性胰腺炎的工具中的应用；

d. 体外检测代谢物盐酸肉桂硫胺或头孢氮氟产品在制备判断治疗剂治疗小鼠急性胰腺炎的响应工具中的应用；

e.药物组合物在制备治疗小鼠急性胰腺炎的工具中的应用，其特征在于，所述药物组合物包括盐酸肉桂硫胺或头孢氮氟的促进剂，所述促进剂为增加盐酸肉桂硫胺或头孢氮氟的试剂；

f. 盐酸肉桂硫胺或头孢氮氟在构建预测小鼠急性胰腺炎的计算模型中的应用；

g. 盐酸肉桂硫胺或头孢氮氟在构建预测药物治疗小鼠急性胰腺炎的治疗响应的计算模型中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，a或b中所述试剂包括通过色谱、光谱或质谱法检测代谢物的含量的试剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述色谱检测为超高效液相层析检测。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，c或d中所述产品包括检测代谢物盐酸肉桂硫胺或头孢氮氟水平的试剂。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述试剂包括通过色谱、光谱或质谱法检测代谢物的含量的试剂。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述色谱检测为超高效液相层析检测。

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