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CN109863172A - 抗vegf-a抗体及其用途 - Google Patents

抗vegf-a抗体及其用途 Download PDF

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CN109863172A CN201780064561.XA CN201780064561A CN109863172A CN 109863172 A CN109863172 A CN 109863172A CN 201780064561 A CN201780064561 A CN 201780064561A CN 109863172 A CN109863172 A CN 109863172A
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Abstract

本发明涉及具有针对血管内皮生长因子(VEGF)的活性的抗体以及制备和使用这类抗体的方法。

Description

抗VEGF-A抗体及其用途
技术领域
本发明涉及具有针对血管内皮生长因子(VEGF)的活性的抗体以及这类抗体的用途。
背景技术
血管生成(由现有的脉管系统形成新的血管)是基本上所有的器官的形成和生理功能所需的复杂生物过程。它是胚胎发生、正常生理生长、修复和病理过程如肿瘤扩散的重要元素。通常，血管生成受多步骤过程中的血管生成因子和血管生成抑制性因子的局部平衡严格调控，该多步骤过程涉及通过内皮细胞进行的血管芽生、分枝和微管形成(涉及如内皮细胞(EC)的激活、血管稳定性丧失、降解酶的合成和释放、EC迁移、EC增殖、EC组织和分化以及血管成熟等的过程)。
在成年人中，生理血管生成在很大程度上受限于伤口愈合和女性生殖功能的若干组件以及胚胎发育。在包括任何异常、不希望或病理性血管生成的疾病相关血管生成中，血管生成因子与血管生成抑制性因子之间的局部平衡失调，从而导致不适当和/或结构上异常的血管形成。病理性血管生成已经与疾病状态相关，包括糖尿病性视网膜病、银屑病、癌症、类风湿性关节炎、粥样斑、卡波西氏肉瘤和血管瘤(Fan等人,1995,TrendsPharmacology.Science.[药物科学趋势]16:57-66；Folkman,1995,Nature Medicine[自然医学]1:27-31)。在癌症中，大于1-2mm3的原发性肿瘤和继发性肿瘤的生长需要血管生成(Folkman,J.New England Journal of Medicine[新英格兰医学期刊]1995；33,1757-1763)。
VEGF是有效且普遍存在的血管生长因子。在VEGF的作用被鉴定为内皮细胞的分泌型促分裂素之前，它被鉴定为血管渗透性因子，从而突出显示VEGF的控制内皮细胞行为的许多不同方面(包括增殖、迁移、特异性化和存活)的能力(Ruhrberg,2003BioEssays[生物学论文集]25:1052-1060)。VEGF-A是属于有待鉴定的血小板衍生生长因子超家族的结构上相关二聚体糖蛋白的VEGF家族的首个成员。除了基础成员VEGF-A以外，VEGF家族还包括VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、胎盘生长因子(PIGF)和内分泌腺衍生VEGF(EG-VEGF)。VEGF的活性形式与其他VEGF家族成员合成为同型二聚体或异型二聚体。人类VEGF-A以通过选择性剪接生成的六种同种型存在：VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF189和VEGF206。这些同种型主要以其生物可利用性而不同，其中VEGF165是主要同种型(Podar等人2005Blood[血液]105(4):1383-1395)，但是其他同种型也具有生物活性。在胚胎发生过程中调控剪接以产生阶段和组织特异性比例的各种同种型产生内皮细胞的响应于VEGF的不同和环境依赖性行为的极大可能性。
据信，VEGF是正常和疾病相关血管生成(Jakeman等人1993 Endocrinology[内分泌学]:133,848-859；Kolch等人1995Breast Cancer Research and Treatment[乳腺癌研究和]:36,139-155)和血管渗透性(Connolly等人1989J.Biol.Chem[生物化学杂志]:264,20017-20024)两者的重要调节剂。由于VEGF与抗体的螯合作用而拮抗VEGF作用可以导致肿瘤生长减少(Kim等人1993Nature[自然]:362,841-844)。VEGF基因的杂合破坏导致血管形成的致命缺陷(Carmeliet等人1996Nature[自然]380:435-439；Ferrara等人1996Nature[自然]380:439-442)。
具有至少一种商业销售的抗VEGF-A抗体，即然而，存在与其用途相关的严重的、有时致命的毒性，包括非胃肠瘘、血栓栓塞事件、高血压、可逆性后部白质脑病综合症等。由此，至少因为它涉及改善与靶向VEGF-A相关的安全性，所以存在一种尚未满足的需要。为此，本发明的抗体具有支持优于现有技术的这种改善的结合特征，包括这些抗体有差别地结合VEGF-A同种型的能力。
发明内容
本发明涉及结合VEGF-A的结合分子，包括抗体。本发明进一步涉及以与一种或多种其他VEGF-A同种型相比时更大的亲和力结合一种或多种VEGF-A同种型的结合分子，包括抗体。本发明还涉及结合VEGF-A并且降低VEGF-A的至少一种生物活性的活性的结合分子，包括抗体。
附图说明
图1.证明结合人类VEGF165和小鼠VEGF164的代表性数据。
图2.证明缺少结合VEGF121的代表性数据。
图3.克隆E06和最具序列同源性的胚系基因的序列比对。
图4.证明亲和力优化变体的改善结合的代表性数据。
图5.证明作为Fab和IgG的亲和力优化变体的改善结合的代表性数据。Fab在顶部两个图中示出。IgG在底部两个图中示出。
图6.证明亲和力优化变体与鼠VEGF164的结合的代表性数据。
图7.证明亲和力优化变体与VEGF121缺乏结合的代表性数据。
图8A至图8B.在基于细胞的功能性测定中证明亲和力优化变体的活性的代表性数据。
图9.在视网膜血管发生模型中证明亲和力优化变体的活性的代表性数据。
具体实施方式
定义
在详细描述本发明之前，应当理解的是本发明不限于特定的组合物或方法步骤，因为这些组合物或方法步骤可以变化。如本说明书和所附权利要求书中所用的，单数形式“一个/一种(a/an)”和“该(the)”包括复数指代物，除非上下文明确地指示其他的情况。术语“一个”(或“一种”)、以及术语“一个或多个/一种或多种(one or more)”和“至少一个/至少一种(at least one)”可以在本文中互换使用。另外，应当理解，无论在什么情况下在此用语言“包含”描述方面时，也提供了用“由……组成”和/或“主要由……组成”描述的其他类似方面。
如在此使用的，术语“结合分子”是指能够以与抗体结合抗原相似的方式结合靶分子或抗原的分子。结合分子的实例包括全长抗体和抗原结合片段。抗体的“抗原结合片段”的实例包括：(i)Fab片段，一种包含抗体的VL、VH、CL和CH1结构域的单价片段；(ii)F(ab')2片段，一种包含两个在绞链区由二硫桥键连接的Fab片段的二价片段；(iii)包含VH和CH1结构域的Fd片段；(iv)包含抗体的单一臂的VL和VH结构域的Fv片段，(v)包含VH结构域的dAb片段(Ward等人,(1989)Nature[自然]341:544-546)；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。抗原结合片段可以通过重组DNA技术，或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学裂解来产生。在一个实施例中，该抗原结合片段包括单链抗体，该单链抗体包含例如“单链可变片段”或“scFv”。scFv是指融合蛋白，该融合蛋白包含免疫球蛋白的至少一个重链可变区(VH)和至少一个轻链可变区(VL)。可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些单链抗体片段。例如，可以使用重组方法通过合成接头将由单独的基因编码的Fv片段的VH和VL结构域接合，该合成接头使它们制备为单一多肽链，其中VH和VL区对形成单价分子(参见，Bird等人(1988)Science[科学]242:423-426；以及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院报]85:5879-5883)。
互补决定区(CDR)负责抗体与其抗原结合。CDR通过本领域中的多种方法来确定(包括Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest[具有免疫性兴趣的蛋白序列],第5版Public Health Service[公共卫生署]，National Institutesof Health[国立卫生研究院]，Bethesda，Md.[马里兰州贝塞斯达](1991))；Chothia(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917(1987))；IMGT(免疫遗传学)(Lefranc,M.P.等人,Dev.Comp.Immunol.[发育和比较免疫学]27:55-77(2003))；以及其他方法)。虽然在此提及并要求保护特异性CDR序列，但是本发明还涵盖通过本领域中已知的任何方法定义的CDR序列。
如在此使用的，术语“受试者”是指脊索动物亚纲的任何成员，包括但不限于人类和其他灵长类动物，包括非人类灵长类动物(如黑猩猩和其他猿和猴类)；农场动物(如牛、绵羊、猪、山羊和马)；驯养的哺乳动物(如狗和猫)；实验室动物，包括啮齿类动物(如小鼠、大鼠和豚鼠)；禽，包括驯养的、野生的和狩猎的禽(如鸡、火鸡和其他鹑鸡类禽、鸭、鹅等)也是非限制性实例。
结合分子
结合分子可以包括全长或完整抗体、抗体片段(包括抗原结合片段)、人类、人源化、翻译后修饰、嵌合或融合抗体、免疫缀合物、或其功能片段。
本发明的合适的免疫球蛋白分子或其部分(即，结合分子)可以是或衍生自任何同种型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、亚同种型(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或同种异型(例如，Gm，例如G1m(f、z、a或x)、G2m(n)、G3m(g、b、或c)、Am、Em、和Km(1、2或3))。免疫球蛋白分子可以包含基于轻链恒定区的氨基酸序列的被分类为λ链或κ链的轻链。
结合分子的产生
用于产生和筛选多肽(如在此所述的结合分子)的重组DNA方法是本领域已知的(例如，美国专利号4,816,567)。编码结合分子或其片段的DNA，例如编码VH结构域、VL结构域、scFv、或其组合的DNA可以插入到合适的表达载体中，然后可以将该表达载体转染到不以其他方式产生抗体蛋白质的合适的宿主细胞(如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或骨髓瘤细胞)中以获得结合分子。
合适的表达载体是本领域已知的。表达载体可以含有编码抗体的连接到启动子的多核苷酸。这类载体可以包含编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列(参见例如，美国专利号5,981,216；5,591,639；5,658,759和5,122,464)，并且可以将抗体的可变结构域克隆到这种载体中用于表达整个重链、整个轻链、或整个重链和轻链两者。通过常规技术可以将表达载体转移至宿主细胞中，并且通过常规技术来培养转染的细胞以产生结合分子。
作为用于表达重组抗体的宿主合适的哺乳动物细胞系是本领域已知的，并且包括许多可从美国典型培养物保藏中心获得的永生化细胞系，包括但不限于CHO细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人类肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、人类上皮肾293细胞、以及多种其他细胞系。不同宿主细胞具有翻译后加工和修饰蛋白质和基因产物的特征和特定机制。可以选择适当细胞系或宿主系统以确保结合分子的正确修饰和加工。为此，可以使用具有用于初级转录物的适当加工、基因产物的糖基化和磷酸化的细胞机器的真核宿主细胞。这类哺乳动物宿主细胞包括CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0(不内源性地产生任何功能性免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、SP20、CRL7O3O以及HsS78Bst细胞。通过使人类淋巴细胞永生化而产生的人类细胞系可以用来重组产生单克隆抗体。人类细胞系(库赛尔公司(Crucell)，荷兰)可以用于重组产生单克隆抗体。可以用作表达重组抗体的宿主的另外的细胞系包括昆虫细胞(例如，Sf21/Sf9，粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)Bti-Tn5b1-4)、或酵母细胞(例如，啤酒酵母(S.cerevisiae)、毕赤酵母属(Pichia)、US7326681；等)、植物细胞(US20080066200)；以及鸡细胞(WO 2008142124)。
抗体可以使用本领域已知的方法在细胞系中稳定地表达。稳定表达可以用于重组蛋白的长期、高产量生产。为了稳定表达，可以用包含表达控制元件(例如，启动子、增强子、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和选择性标记基因的适当工程化的载体转化宿主细胞。在引入外源DNA后，允许细胞在富集培养基中生长1-2天，并且然后切换至选择性培养基。在重组质粒中的选择性标记赋予对选择的抗性，并且允许已经将质粒稳定整合到其染色体中的细胞生长并且形成病灶，进而可以将其克隆并且扩增成细胞系。用于以高产量产生稳定细胞系的方法在本领域是已知的，并且试剂通常是可商购的。瞬时表达还可以使用本领域已知的方法进行。瞬时转染是引入细胞中的核酸不整合到该细胞的基因组或染色体DNA中并且在该细胞中维持为染色体外元件(例如，作为附加体)的一个过程。
稳定或瞬时转染的细胞系被维持在本领域已知的细胞培养基和条件中，从而导致结合分子的表达和产生。细胞培养基可以基于可商购的培养基配制品，包括例如DMEM或Ham's F12。另外，可以将细胞培养基进行改良以便支持细胞生长和生物蛋白表达两者的增长。如在此所使用的术语“细胞培养基”、“培养基”、以及“培养基配制品”是指在一个多细胞有机体或组织以外的一个人工体外环境中用于细胞的维持、生长、繁殖、或扩增的营养液。可以将细胞培养基优化以用于特定的细胞培养用途，包括被配制来促进细胞生长的细胞培养物生长培养基或者被配制来促进重组蛋白产生的细胞培养物生产培养基。术语营养素、成分、以及组分(component)在此可互换使用，是指组成细胞培养基的组分(constituent)。细胞系可以使用补料分批法维持。如在此使用，“补料分批法”是指在首先用基础培养基孵育之后，用另外的营养素供应给细胞培养物的方法。例如，一种补料分批法可以包括根据一个所确定的补料时间表在一个给定时期内添加补充培养基。因此，“补料分批细胞培养”是指这样一种细胞培养：其中最初将细胞(典型地为哺乳动物细胞)和培养基供应至培养容器，并且在培养期间，连续地或以不连续递增方式将另外的培养营养素馈送至培养物，有或没有在培养终止之前的定期的细胞和/或产物的收获。
细胞培养基以及其中包含的营养素是本领域技术人员已知的。细胞培养基可以包含一种基础培养基以及产生改良的基础培养基的至少一种水解产物，例如基于大豆的水解产物、基于酵母的水解产物、或这两种类型的水解产物的组合。另外的营养素可以仅包括基础培养基，如浓缩的基础培养基，或者可以仅包含水解产物、或浓缩的水解产物。适合的基础培养基包括但不限于达尔伯克改良的伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle'sMedium，DMEM)、DME/F12、最低必需培养基(MEM)、伊格尔基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、α-最低必需培养基(α-MEM)、格拉斯哥最低必需培养基(Glasgow's MinimalEssential Medium，G-MEM)、PF CHO(参见例如，CHO无蛋白质培养基(西格玛公司(Sigma))或用于无蛋白质的CHO细胞的EX-CELLTM325 PF CHO无血清培养基(SAFC生物科学公司(SAFCBioscience)))、以及伊斯科夫改良的达尔伯克培养基(Iscove's Modified Dulbecco'sMedium)。可以用于本发明的基础培养基的其他实例包括BME基础培养基(吉布-英杰公司(Gibco-Invitrogen)；还参见Eagle,H(1965)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.[实验生物学与医学学会学报]89,36)；达尔伯克改良的伊格尔培养基(DMEM，粉末)(吉布-英杰公司(Gibco-Invitrogen)(#31600)；还参见Dulbecco和Freeman(1959)Virology.[病毒学]8:396；Smith等人(1960)Virology.[病毒学]12:185.组织培养标准协会(Tissue Culture StandardsCommittee),体外6:2,93)；CMRL 1066培养基(吉布-英杰公司(Gibco-Invitrogen)(#11530)；还参见Parker等人(1957)Special Publications[特种出版物],纽约科学院(N.Y.Academy of Sciences),5:303)。
基础培养基可以是无血清的，意指该培养基不含血清(例如，胎牛血清(FBS)、马血清、山羊血清、或本领域的技术人员已知的任何其他动物源的血清)或没有动物蛋白的培养基或化学上限定的培养基。
可以改良基础培养基以便去除在标准基础培养基中发现的某些非营养组分，如各种无机和有机缓冲剂、一种或多种表面活性剂、以及氯化钠。这类组分从基础细胞培养基的去除允许剩余营养组分的浓度增加，并且可以改善总体的细胞生长和蛋白质表达。另外，可以根据细胞培养条件的要求，将省去的组分添加回至含有改良的基础细胞培养基的细胞培养基中。细胞培养基可以含有改良的挤出细胞培养基、以及以下营养素中的至少一种，铁源、重组生长因子；缓冲液；表面活性剂；等渗浓度调节剂；能量源；以及非动物水解产物。另外，改良的基础细胞培养基可以任选地含有氨基酸、维生素、或氨基酸和维生素两者的组合。改良的基础培养基可以进一步含有谷氨酰胺，例如L-谷氨酰胺和/或氨甲蝶呤。
纯化和分离
一旦已经产生结合分子，就可以通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的方法，例如，通过色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱(特别是通过对于特定抗原蛋白A或蛋白G的亲和力)、以及尺寸柱色谱(sizing column chromatography))、离心、差别溶解度、或者通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术将其纯化。此外，本发明的结合分子可以融合至异源多肽序列(在此称为“标签”)以促进纯化。
用途
本发明的结合分子可以多种方式使用。例如，本发明的抗体可以用于结合VEGF-A并且从而降低VEGF-A的至少一种生物活性。更具体地，本发明的抗体可以用于结合VEGF-165并且从而降低VEGF-165的至少一种生物活性，其可以包括减少它的受体的激活或磷酸化、减少与细胞失调相关的血管生成、减少肿瘤生长、减小肿瘤体积、和/或减少肿瘤生长和肿瘤体积。
示例性实施例
本发明的一个实施例涉及一种结合分子，其包含在此所述的抗体的重链互补决定区1–3(即，HCDR1、HCDR2、和HCDR3)和轻链互补决定区1–3(即，LCDR1、LCDR2、和LCDR3)。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子结合VEGF165。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子以与VEGF121相比更大的亲和力结合VEGF165。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子以与VEGF189相比更大的亲和力结合VEGF165。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子以与VEGF121和VEGF189相比更大的亲和力结合VEGF165。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子减少人类VEGFR2磷酸化、鼠VEGFR2磷酸化、或者人类和鼠VEGFR2磷酸化两者。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子减少血管生成。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子由于被提供给具有肿瘤的受试者而减少肿瘤生长、减小肿瘤体积、或减少肿瘤生长和肿瘤体积。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子具有在此所述的特征中的一种或多种或任何组合，包括结合VEGF165、以与VEGF121相比更大的亲和力结合VEGF165、以与VEGF189相比更大的亲和力结合VEGF165、以与VEGF121和VEGF189相比更大的亲和力结合VEGF165、减少人类VEGFR2磷酸化、鼠VEGFR2磷酸化、或者人类和鼠VEGFR2磷酸化两者、减少血管生成、或由于被提供给具有肿瘤的受试者而减少肿瘤生长、减小肿瘤体积、或减少肿瘤生长和肿瘤体积。
本发明的一个实施例涉及一种结合分子，其包含：重链可变结构域，该重链可变结构域包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3；以及轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含在此所述的抗体的LCDR1、LCDR2、和LCDR3。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含：重链可变结构域，该重链可变结构域包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3；以及轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含在此所述的抗体的LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子结合VEGF165。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含：重链可变结构域，该重链可变结构域包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3；以及轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含在此所述的抗体的LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子以与VEGF121相比更大的亲和力结合VEGF165。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含：重链可变结构域，该重链可变结构域包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3；以及轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含在此所述的抗体的LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子以与VEGF189相比更大的亲和力结合VEGF165。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含：重链可变结构域，该重链可变结构域包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3；以及轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含在此所述的抗体的LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子以与VEGF121和VEGF189相比更大的亲和力结合VEGF165。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含：重链可变结构域，该重链可变结构域包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3；以及轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含在此所述的抗体的LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子减少人类VEGFR2磷酸化、鼠VEGFR2磷酸化、或者人类和鼠VEGFR2磷酸化两者。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含重链可变结构域，该重链可变结构域包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3；并且包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含在此所述的抗体的LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子减少血管生成。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含重链可变结构域，该重链可变结构域包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3；并且包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含在此所述的抗体的LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子由于被提供给具有肿瘤的受试者而减少肿瘤生长、减小肿瘤体积、或减少肿瘤生长和肿瘤体积。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含重链可变结构域，该重链可变结构域包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3；并且包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含在此所述的抗体的LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子具有在此所述的特征中的一种或多种或任何组合，包括结合VEGF165、以与VEGF121相比更大的亲和力结合VEGF165、以与VEGF189相比更大的亲和力结合VEGF165、以与VEGF121和VEGF189相比更大的亲和力结合VEGF165、减少人类VEGFR2磷酸化、鼠VEGFR2磷酸化、或者人类和鼠VEGFR2磷酸化两者、减少血管生成、或由于被提供给具有肿瘤的受试者而减少肿瘤生长、减小肿瘤体积、或减少肿瘤生长和肿瘤体积。
本发明的一个实施例涉及一种结合分子，其包含全长抗体，该全长抗体包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含全长抗体，该全长抗体包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子结合VEGF165。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含全长抗体，该全长抗体包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子以与VEGF121相比更大的亲和力结合VEGF165。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含全长抗体，该全长抗体包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子以与VEGF189相比更大的亲和力结合VEGF165。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含全长抗体，该全长抗体包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子以与VEGF121和VEGF189相比更大的亲和力结合VEGF165。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含全长抗体，该全长抗体包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子减少人类VEGFR2磷酸化、鼠VEGFR2磷酸化、或者人类和鼠VEGFR2磷酸化两者。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含全长抗体，该全长抗体包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子减少血管生成。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含全长抗体，该全长抗体包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子由于被提供给具有肿瘤的受试者而减少肿瘤生长、减小肿瘤体积、或减少肿瘤生长和肿瘤体积。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含全长抗体，该全长抗体包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子具有在此所述的特征中的一种或多种或任何组合，包括结合VEGF165、以与VEGF121相比更大的亲和力结合VEGF165、以与VEGF189相比更大的亲和力结合VEGF165、以与VEGF121和VEGF189相比更大的亲和力结合VEGF165、减少人类VEGFR2磷酸化、鼠VEGFR2磷酸化、或者人类和鼠VEGFR2磷酸化两者、减少血管生成、或由于被提供给具有肿瘤的受试者而减少肿瘤生长、减小肿瘤体积、或减少肿瘤生长和肿瘤体积。
本发明的一个实施例涉及一种结合分子，其包含全长IgG1抗体，该抗体包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含全长IgG1抗体，该抗体包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子结合VEGF165。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含全长IgG1抗体，该抗体包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子以与VEGF121相比更大的亲和力结合VEGF165。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含全长IgG1抗体，该抗体包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子以与VEGF189相比更大的亲和力结合VEGF165。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含全长IgG1抗体，该抗体包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子以与VEGF121和VEGF189相比更大的亲和力结合VEGF165。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含全长IgG1抗体，该抗体包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子减少人类VEGFR2磷酸化、鼠VEGFR2磷酸化、或者人类和鼠VEGFR2磷酸化两者。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含全长IgG1抗体，该抗体包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子减少血管生成。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含全长IgG1抗体，该抗体包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子由于被提供给具有肿瘤的受试者而减少肿瘤生长、减小肿瘤体积、或减少肿瘤生长和肿瘤体积。
另一个实施例涉及一种结合分子，其包含全长IgG1抗体，该抗体包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子具有在此所述的特征中的一种或多种或任何组合，包括结合VEGF165、以与VEGF121相比更大的亲和力结合VEGF165、以与VEGF189相比更大的亲和力结合VEGF165、以与VEGF121和VEGF189相比更大的亲和力结合VEGF165、减少人类VEGFR2磷酸化、鼠VEGFR2磷酸化、或者人类和鼠VEGFR2磷酸化两者、减少血管生成、或由于被提供给具有肿瘤的受试者而减少肿瘤生长、减小肿瘤体积、或减少肿瘤生长和肿瘤体积。
本发明的一个实施例涉及一种结合分子，该结合分子是全长抗体(包括全长IgG1抗体)，该全长抗体包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3。
另一个实施例涉及一种结合分子，该结合分子是全长抗体(包括全长IgG1抗体)，该全长抗体包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子结合VEGF165。
另一个实施例涉及一种结合分子，该结合分子是全长抗体(包括全长IgG1抗体)，该全长抗体包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子以与VEGF121相比更大的亲和力结合VEGF165。
另一个实施例涉及一种结合分子，该结合分子是全长抗体(包括全长IgG1抗体)，该全长抗体包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子以与VEGF189相比更大的亲和力结合VEGF165。
另一个实施例涉及一种结合分子，该结合分子是全长抗体(包括全长IgG1抗体)，该全长抗体包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子以与VEGF121和VEGF189相比更大的亲和力结合VEGF165。
另一个实施例涉及一种结合分子，该结合分子是全长抗体(包括全长IgG1抗体)，该全长抗体包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子减少人类VEGFR2磷酸化、鼠VEGFR2磷酸化、或者人类和鼠VEGFR2磷酸化两者。
另一个实施例涉及一种结合分子，该结合分子是全长抗体(包括全长IgG1抗体)，该全长抗体包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子减少血管生成。
另一个实施例涉及一种结合分子，该结合分子是全长抗体(包括全长IgG1抗体)，该全长抗体包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子由于被提供给具有肿瘤的受试者而减少肿瘤生长、减小肿瘤体积、或减少肿瘤生长和肿瘤体积。
另一个实施例涉及一种结合分子，该结合分子是全长抗体(包括全长IgG1抗体)，该全长抗体包含在此所述的抗体的HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中该结合分子具有在此所述的特征中的一种或多种或任何组合，包括结合VEGF165、以与VEGF121相比更大的亲和力结合VEGF165、以与VEGF189相比更大的亲和力结合VEGF165、以与VEGF121和VEGF189相比更大的亲和力结合VEGF165、减少人类VEGFR2磷酸化、鼠VEGFR2磷酸化、或者人类和鼠VEGFR2磷酸化两者、减少血管生成、或由于被提供给具有肿瘤的受试者而减少肿瘤生长、减小肿瘤体积、或减少肿瘤生长和肿瘤体积。
在一个特定实施例中，存在一种抗体，其包含HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3分别包含SEQ IDNO:79–84。
在另一个特定实施例中，存在一种抗体，其包含分别包含SEQ ID NO:73和SEQ IDNO:77的重链和轻链。
在另一个特定实施例中，存在一种抗体，其包含含有SEQ ID NO:71的重链氨基酸序列和含有SEQ ID NO:75的轻链氨基酸序列。
在另一个特定实施例中，存在一种抗体，其包含HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3分别包含SEQ IDNO:79–84，并且其中该抗体是单克隆抗体。
在另一个特定实施例中，存在一种核酸序列，其包含编码抗体的多核苷酸，该抗体包含HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3分别包含SEQ ID NO:79–84。
在另一个特定实施例中，存在一种载体，其包含编码抗体的多核苷酸，该抗体包含HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3分别包含SEQ ID NO:79–84。
在另一个特定实施例中，存在一种细胞，其包含载体，该载体包含编码抗体的多核苷酸，该抗体包含HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3分别包含SEQ ID NO:79–84。
在另一个特定实施例中，存在一种制备抗体的方法，该方法包括培养包含载体的细胞，该载体包含编码抗体的多核苷酸，该抗体包含HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3分别包含SEQ IDNO:79–84。
在另一个特定实施例中，存在一种减少血管生成的方法，该方法包括向受试者提供抗体，其中该抗体包含HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3，其中HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3分别包含SEQ ID NO:79–84。
序列
实例
对于在此所述的实验，使用各种抗体，包括(Ferrara,N等人BiochemBiophys Res Comm[生物化学与生物物理研究通讯],333:328-335,2005)、G6-31(Liang,WC等人J Biol Chem[生物化学杂志],281:951-961,2006)、B20-4.1(Liang,WC等人J BiolChem[生物化学杂志],281:951-961,2006)、以及同种型对照，命名为R347，根据需要作为单特异性或双特异性抗体。能够结合所有VEGF同种型的与小鼠不具有交叉反应性的抗VEGFIgG1抗体可以用作一些结合和功能性研究的阳性对照。在需要与小鼠VEGF的交叉反应性的情况下，抗体G6-31和B20-4.1可以用作阳性对照。
实例1：从噬菌体抗体展示文库鉴定抗VEGF抗体
应用溶液噬菌体淘选来从抗体噬菌体文库分离抗VEGF抗体。将噬菌体文库与生物素化VEGF165(派普泰克公司，新泽西(PeproTech,NJ))在4μg/ml的最终浓度下一起孵育(人类VEGF165用于第一和第三轮次淘选，并且mVEGF164用于第二和第四轮次淘选)。在孵育30分钟之后，通过添加链霉抗生物素蛋白珠(英杰公司(Invitrogen))来从溶液捕获VEGF结合的噬菌体，这些链霉抗生物素蛋白珠用磷酸盐缓冲盐水(PBS)预洗涤并且用PBS中的3％牛血清白蛋白(BSA)封闭。将珠捕获的噬菌体用100mM TEA缓冲液洗脱，用1M Tris-HC1(pH8.0)中和，并且然后使用1ml的洗脱噬菌体来感染5ml的对数期TG1和4ml的2YT培养基(天惠华公司(Teknova))以用于噬菌体扩增。在37℃下在水浴中孵育30分钟之后，将细胞在4000g下旋转沉积，重悬浮在2YT中，与100μg/ml的羧苄青霉素和2％葡萄糖一起铺展在2YT琼脂板(天惠华公司(Teknova))上，并且在30℃下孵育过夜。在第二天，从琼脂板采集菌落，在OD600＝0.1的最终浓度下接种到2YT培养基中，在37℃下生长，直至对数期，用辅助噬菌体(英杰公司(Invitrogen))感染，并且然后使其在30℃下与羧苄青霉素(英杰公司(Invitrogen))和卡那霉素(西格玛公司(Sigma))一起在2YT中生长过夜，以便生成高滴度噬菌体。将扩增的噬菌体用PEG8000沉淀，重悬浮在PBS中并且用于使用标准程序的下一轮次的淘选。应用总计四个轮次的淘选以便分离VEGF特异性抗体。观察到从第一轮次的2x105pfu至第四轮次的淘选的4x107pfu的输出噬菌体数量的显著增加。
实例2：VEGF特异性抗体的筛选
通过噬菌体ELISA评估来自第四轮次淘选的单个噬菌体Fab的特异性。将96孔微升板在40℃下用在PBS中5μg/ml的浓度的人类VEGF165涂覆过夜。在用PBS洗涤三次之后，将孔在37℃下用封闭缓冲液(PBS中的4％脱脂乳)封闭1h。然后，添加50μl/孔噬菌体并且在37℃下孵育1h。在洗涤之后，在30分钟内在37℃下添加50μl的具有1:1,000稀释度的在封闭缓冲液中的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的小鼠抗M13(阿莫仙医药公司(Amersham Pharmacia))。为了进行检测，在5分钟内在室温下添加50μl/孔的SureBlue Reserve TMB底物(KPL公司)，并且通过添加50μL的TMB终止溶液(KPL公司)来使反应停止。在450nm下读取吸光度。在四个轮次的淘选之后，多于50％的菌落是VEGF特异性的，具有高于1的吸光度，这是大约0.05的非特异性背景读取的20倍高。代表性数据在表1中示出。
表1
实例3-克隆E06与人类和小鼠VEGF的结合
在初始噬菌体筛选之后，使用标准分子生物学材料和方法将与小鼠VEGF164具有交叉反应性的一个克隆(E06)进一步转化并表达为全长IgG。将96孔微升板(康宁公司(Corning))在4℃下用50μl/孔的在PBS中5μg/ml的浓度的人类和小鼠VEGF165或VEGF121涂覆过夜。在用含有0.1％Tween-20的PBS(PBST)洗涤三次之后，将孔用封闭缓冲液(PBS中的4％脱脂乳)封闭。在室温下孵育1h之后，将板用PBST洗涤，并且在室温下添加在封闭缓冲液中的2倍系列稀释度的抗体(从8nM开始)并且孵育1小时。通过用PBST洗涤取得抗体溶液，接着在室温下与在PBST中制备的1:3000稀释度的抗人类-Fc-HRP抗体(赛默科技公司(ThermoScientific))一起孵育1小时。在5分钟内在室温下添加50μL的SureBlue Reserve TMB底物(KPL公司)来使结合可视化，并且通过添加50μL的TMB终止溶液(KPL公司)来使反应停止。使用微升板读数器测量450nm处的吸光度。使用Prism 5软件(GraphPad公司)分析数据。
观察到抗体E06与人类VEGF165和小鼠VEGF164的相似的结合活性，分别具有0.048nM和0.049nM的EC50。如所预期的，(一种抗VEGF抗体)显示与人类VEGF165的强结合，但是没有显示与小鼠VEGF164的可检测的结合。同种型对照抗体R347不与VEGF的人类或小鼠形式结合。代表性数据在图1中示出。
为了评估抗体E06是否与(一种抗VEGF抗体)结合不同的表位，使用人类VEGF121实施ELISA测定。(一种抗VEGF抗体)显示与人类VEGF121的非常强的结合。然而，对于E06没有检测到结合，从而指示抗体E06与(一种抗VEGF抗体)结合不同的表位。同种型对照抗体R347也未展示与人类VEGF121的任何结合。代表性数据在图2中示出。
实例4–克隆E06的胚系
对克隆E06的框架序列进行工程化以匹配其最近的胚系序列。针对IgG胚系基因数据库的序列分析显示，E06VL序列与胚系基因VK3-NL5*01最佳地匹配，具有在VL的位置1、3、4和86处的4个氨基酸差异。虽然VH序列与胚系基因VH3-23*2相同，但是T98在此位置处与R或K的最保守的胚系氨基酸不同。针对胚系E06，设计并表达四种变体。这些变体在E06与最佳匹配的胚系基因不同的位置处部分或完全用胚系基因编码氨基酸取代。例如，M1在VL中含有D1E/Q3V/M4L取代并且在VH中含有T98R取代；M4在VL中含有D1E/Q3V/M4L/T86V取代；M7在VL中含有D1E/Q3V/M4L/T86V取代并且在VH中含有T98R取代；并且F1在VL中含有D1E/Q3V/M4L取代，其中第一个字母表示原始序列的单字母氨基酸代码，并且第二个字母表示胚系序列的单字母氨基酸代码。图3示出了亲本E06和最具同源性的胚系序列的序列比对。
将胚系变体表达并纯化为Fab，并且通过ELISA确定其与重组VEGF165的结合。结合结果显示，含有完全或部分VL胚系氨基酸取代的胚系变体M4和F1保留E06WT Fab结合活性。另外，M4在使用HUVEC的pVEGFR2测定中显示与WT E06Fab相比相似的活性。另一方面，在位置T98处含有VH胚系氨基酸取代的胚系变体M1和M7展示明显减少的结合和pVEGFR2磷酸化，从而指示T98涉及结合和活性并且必须被保留。胚系克隆M4用作用于进一步亲和力优化的模板。
实例5–亲和力优化
使用杂交诱变方法将胚系克隆M4的全部6个CDR的每个氨基酸单个地突变为其他20个氨基酸(Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院报]第82卷,第488-492页,1985)。使用两组DNA引物来将突变引入到每个靶向的CDR位置，一组DNA引物含有编码8个氨基酸的NSS密码子并且另一组DNA引物含有编码12个不同氨基酸的NWS密码子。单个简并引物用于杂交诱变反应。简而言之，将每个简并引物磷酸化并且与尿苷化M4Fab ssDNA以10:1比率使用。将混合物加热至95℃，然后在1小时内冷却至55℃。之后，添加T4连接酶和T7DNA聚合酶，并且将混合物在37℃下孵育1.5小时。分别汇集VH和VL CDR的合成产物；然而，将NSS和NWS文库保持分开并且单独筛选。典型地，将1μL汇集的文库DNA电穿孔到XL1-Blue中，以用于在XL1-Blue菌苔上形成菌斑或者用于产生Fab片段(Wu H,An LL.Tailoringkinetics of antibodies using focused combinatorial libraries.[使用富集组合文库的抗体的定制的动力学]Methods Mol Biol[分子生物学方法]2003；207:213-33)。然后针对活性筛选这些突变体。
初级筛选由单点ELISA(SPE)测定组成，该测定使用在96孔板(深孔)中生长并用如其他地方所述的单个重组M13克隆感染的细菌的培养物上清液来实施(Wu H,AnLL.Tailoring kinetics of antibodies using focused combinatorial libraries.[使用富集组合文库的抗体的定制的动力学]Methods Mol Biol[分子生物学方法]2003；207:213-33)。简而言之，此捕获ELISA涉及在4℃下用大约50ng的pH 8.5的在碳酸盐缓冲液中的羊抗人类Fd抗体(生物设计国际公司，缅因州(Biodesign International,ME))涂覆96孔Maxisorp免疫板的单个孔过夜。在第二天，在室温下将板用在PBS缓冲液中的3％BSA封闭1小时。然后将Fab上清液添加到板并且在室温下孵育1小时。在洗涤之后，将生物素化VEGF165蛋白添加到孔，并且将混合物在室温下孵育1.5小时。这之后在室温下与中性链亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)缀合物(皮尔斯公司，伊利诺斯州(Pierce,IL))一起孵育大约40分钟。用四-甲基-联苯胺(TMB)底物检测HRP活性，并且用0.2M H2SO4使反应淬灭。在450nm处读板。
挑选在450nm处表现出大于亲本克隆M4Fab的光密度(OD)信号的克隆并再生长(15mL)(Wu H,An LL.Tailoring kinetics of antibodies using focusedcombinatorial libraries.[使用富集组合文库的抗体的定制的动力学]Methods MolBiol[分子生物学方法]2003；207:213-33)并且一式两份通过ELISA(如上所述)再测定以便确认阳性结果。对重复表现出比M4Fab的信号大的信号的克隆进行测序。然后通过定量FabELISA确定具有CDR变化的每个克隆的Fab蛋白质浓度，其中具有已知浓度的Fab用作参考。通过将ELISA信号与由参考Fab生成的信号进行比较来确定Fab浓度。在归一化的Fab浓度下针对所有的阳性变体再重复一次结合测定，以便确定突变体Fab和亲本M4Fab的相对结合亲和力。
许多点突变显示超过M4的与VEGF165的结合改善。在这些突变体中，D04、J05、和I20显示与作为Fab的胚系E06相比超过10倍的EC50改善。代表性数据在图4中示出。序列分析揭示，有益于VEGF165结合的氨基酸取代存在于VL中，尤其是在VL-CDR3中。例如，突变体J05中的点突变S94R使结合相对于E06改善大约25倍，从而指示此氨基酸在结合中的关键作用。
然后使用定点诱变方法将展示改善的结合的点突变体组合。组合突变体表达为Fab和IgG并且在VEGF165ELISA中进行测试。代表性数据在图5中示出。
组合突变体在ELISA测定中显示比点突变体J05显著更高的结合。组合突变体的表观结合亲和力相对于作为Fab的J05改善大约3至10倍。相似地，作为IgG测试的所有组合突变体显示与亲本克隆E06相比显著的结合改善。使用KinExA测量亲和力优化克隆的平衡结合常数(KD)。代表性数据在表2中示出。点突变体以及组合突变体的序列在表3中示出。
表2
表3
实例6-AVASTIN、E06和亲和力优化E06变体与人类VEGF165的结合的KD的测量。
在KinExA 3000和3200仪器(萨皮蒂尼仪器公司，博伊西，爱达荷州(SapidyneInstruments,Boise,ID))上执行平衡结合常数(KD)测量。将人类VEGF 165(huVEGF)蛋白以涂覆缓冲液(50mM碳酸钠缓冲液，pH 9)在2ug/mL、3ug/mL、和30ug/mL的浓度下涂覆到生物载体珠(皮尔斯公司，罗克福德，伊利诺斯州(PIERCE,Rockford,IL))上。然后将涂覆珠从未反应的huVEGF蛋白质溶液分离(旋转)，并且在室温下用含有10mg/mL的BSA的1M Tris、pH 8封闭)大约15分钟。之后，旋转珠浆料以去除封闭溶液，并且然后使用新鲜封闭缓冲液重复封闭步骤大约2小时，并且在4℃下储存，直至使用。在使用之前，将huVEGF涂覆的珠转移至珠小瓶，重悬浮在大约27mL的仪器缓冲液(10mM HEPES+300mM NaCl+5mM CaCl2+0.05％P20+0.02％NaN3，pH8)中，并且附连到KinExA仪器上。对于KD测量，在含有BSA(mg/mL)的仪器缓冲液中以100pM和2.5nM浓度制备单独的抗体溶液，然后分配到两个单独系列的13个管中。选择这些浓度的mAb以允许在受体受控和KD受控的条件两者下进行测量，这使得更严格地分别估计试剂活性和亲和力。由于其相对弱的KD，还制备mAb EO6-wt的第3浓度系列(50nM)以满足对于完全受体受控测量的需要。然后将两倍系列稀释度的huVEGF蛋白质在每个mAb系列中在9个管中滴定，接着在另外两个管中以10倍稀释度滴定，从而留下一个管作为仅mAb的“零”对照。这样一来，这产生在488fM–25nM(100pM mAb实验)、3.91pM–200nM(2.5nM mAb实验)、以及9.77pM–500nM(50nM mAb实验)范围内的huVEGF蛋白质的浓度系列。基于可通过供应商软件(萨皮蒂尼仪器公司，博伊西，爱达荷州(SapidyneInstruments,Boise,ID))获得的理论曲线模拟，将混合物在室温下孵育1–4天以允许结合达到平衡。在此时间结束之后，实施信号测试实验以确定每组测量的适当运行条件。使用在含有1mg/mL的BSA的仪器缓冲液中以0.75ug/mL、1.0ug/mL或2ug/mL采用的种特异性的二级抗体试剂(山羊抗人类IgG(H+L)-DyLight649，品号109-495-088，杰克逊免疫研究实验室(Jackson ImmunoResearch Laboratories))使得游离抗体的检测成为可能。然后使用供应商的软件将针对每个mAb/huVEGF相互作用获得的数据同时拟合到一个位点结合模型以便获得平衡KD。使用KinExA测量亲和力优化克隆的KD，并且结果总结在表2中。
实例7-针对与鼠VEGF164的结合测定亲和力优化变体。
筛选亲和力优化变体以确认与鼠VEGF164的结合，与先前针对VEGF165 ELISA所述的相似，不同的是用鼠VEGF164。在GraphPad Prism 5.01版本(圣地亚哥，加利福尼亚州(San Diego,CA))中使用非线性回归分析(log剂量响应，4参数拟合曲线)确定EC50值。代表性数据在图6中示出。所有的亲和力优化变体均表现出与鼠VEGF164的强结合，与亲本E06抗体相似。
实例8-针对与VEGF121的减少的结合测定亲和力优化变体。
筛选亲和力优化变体以在ELISA中确认与人类VEGF121的减少的结合，与先前针对VEGF165 ELISA所述的相似。在GraphPad Prism 5.01版本(圣地亚哥，加利福尼亚州(SanDiego,CA))中使用非线性回归分析(log剂量响应，4参数拟合曲线)确定EC50值。代表性数据在图7中示出。相比于与VEGF121具有强结合的VEGF阳性对照抗体(0.0063nM的EC50)，J05、H1R、和H1DR的VEGF121结合减少。
实例9-针对与VEGF189的结合测定亲和力优化变体。
在ELISA形式中进行针对与VEGF189的结合的亲和力优化变体筛选。将96孔半孔maxisorp板用25μl的在没有Ca++或Mg++的PBS中稀释的2μg/mL人类VEGF189(R&D系统公司(R&D Systems))涂覆并且冷藏过夜。对板进行倾析，然后用180μl的含有3％BSA(西格玛公司(Sigma)，目录号A-3059)和1X PBS中的0.1％Tween-20的封闭缓冲液在37℃下封闭1.5小时。将板用含有0.1％Tween-20的1X PBS洗涤3次。一式两份添加50μl的在封闭缓冲液中的6.7nM和系列稀释度的亲和力优化变体、阳性对照、和阴性对照，并且在37℃下孵育1小时。将板用洗涤缓冲液洗涤3次，然后向每个孔添加50μl的1:5000山羊抗人类HRP IgG H+L(杰克逊免疫研究(Jackson Immunoresearch))并且在室温下孵育1小时。通过向每个孔添加50μl的TMB溶液(KPL公司)来使板显色，接着用50μl的1M磷酸使反应停止。在微板读数器上在450nm处读取板。亲和力优化变体显示与VEGF189的结合降低。
实例10-比较亲和力优化变体的功效的基于细胞的功能性测定。
如先前所述执行基于人类和鼠pVEGFR2细胞的测定以确认亲和力优化变体的功效。在GraphPad Prism 5.01版本(圣地亚哥，加利福尼亚州(San Diego,CA))中使用非线性回归分析(log剂量响应，4参数拟合曲线)确定EC50值。代表性数据在图8A和图8B中示出。克隆J05、H1R、和H1DR在人类pVEGFR2测定中表现出相对于E06亲本对照(EC50＝52.25nM)的多至20倍改善(2.6-10.15nM的范围内的EC50)(图8A)，而在小鼠pVEGFR2测定中的改善相比于亲本抗体是多至2倍(2.38-3.57nM范围内的EC50相对于5.34nM(图8B))。
实例11–亲和力优化E06变体的体内活性
在视网膜血管发生模型、以及786-0肾细胞癌和BxPC3胰腺癌模型中实施针对体内活性的亲和力优化变体测试。除这些模型之外，还实施血小板减少模型中的评估。
对于视网膜血管发生模型，在出生时、第1天、第3天、和第5天对CD1小鼠进行腹膜内给药。在第8天，对小鼠进行麻醉并且输注荧光素标记的右旋糖酐。取出眼睛并且用10％福尔马林固定，之后制备铺片(flat mount)。通过荧光显微镜检查铺片。新生视网膜血管生成由两个步骤组成，即血管从视神经迁移到视网膜的边缘以及分枝。与未处理组相比，在H1RK的存在下分枝减少。代表性数据在图9中示出。H1RK与H1R不同，因为在位置107(107处的胚系校正位置)处的轻链含有苏氨酸而非赖氨酸。
对于786-0肾细胞癌模型，将786-0片段皮下植入到右胁腹中。在肿瘤体积达到大约200mm3之后，对小鼠进行处理。每周2X处理小鼠，总计6个剂量。亲和力优化变体展示减少肿瘤生长、减小肿瘤体积、或减少肿瘤生长和肿瘤体积的有效性。除减少肿瘤生长、减小肿瘤体积、或减少肿瘤生长和肿瘤体积之外，亲和力优化变体还减少肿瘤脉管系统。简而言之，用肝素对小鼠进行预处理以便在安乐死之前15分钟防止凝血。在大约6mL/min的速率下灌注0.1mM硝普钠的溶液。通过混合8mL的乳胶、10mL的稀释剂和900uL的药物来制备Microfil MV-122。在混合物稳定之后(1分钟)，将其在2mL/min的速率下灌注，直至给予17mL的总体积。在60-90分钟之后，切除肿瘤并且浸入在10％NBF中24小时。然后将样品转移到25％ETOH/PBS、50％ETOH/PBS、75％ETOH/PBS、95％ETOH，并且然后转移到100％ETOH，每个进行24小时。在最终孵育之后，将样品浸入在水杨酸甲酯中以便使脱水的肿瘤样品澄清，之后通过光学显微镜成像。
对于BxPC3胰腺癌模型，皮下植入到雌性SCID小鼠的右胁腹中。在肿瘤体积达到大约200mm3之后，对小鼠进行处理。每周2X处理小鼠，总计6个剂量。亲和力优化变体展示减少肿瘤生长、减小肿瘤体积、或减少肿瘤生长和肿瘤体积的有效性。除减少肿瘤生长、减小肿瘤体积、或减少肿瘤生长和肿瘤体积之外，亲和力优化变体还减少肿瘤脉管系统。
对于血小板减少模型，使用改编自Meyer等人,2009(J Thromb Haemost[血栓和止血杂志]7:171-81,2009)的方法。简而言之，将8-16周大的FCγ受体2A转基因小鼠用预混合的VEGF165、0.6个单位肝素、和亲和力优化变体注射到侧尾静脉中。然后针对患病的行为症状观察小鼠并且如下评分：(-)不停地从一个角落到另一个角落停留和移动，呼吸正常，(+)嗜睡的症状，以更长的持续时间停留和移动，呼吸浅弱，(++)非常嗜睡，停止移动，主要待在箱的一侧，深呼吸，(+++)严重的血栓性事件抽搐和旋转，(++++)死亡。与抗VEGF对照相比，亲和力优化变体展示血小板减少的减少。
通过引用结合
将在此引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书和类似物，以及其中引用的参考文献，在尚未被结合在此的程度上，出于所有目的以其全部内容特此通过引用结合在此。
等效物
前述书面说明书被认为足以使本领域技术人员能够实践这些实施例。然而，将会了解的是无论前述内容可以如何详述出现在本文中，能以许多方式实践这些实施例并且权利要求书包括其任何等效物。

Claims (9)

1.一种抗体，该抗体包含重链互补决定区1–3(HCDR1、HCDR2、和HCDR3)和轻链互补决定区1–3(LCDR1、LCDR2、和LCDR3)，其中HCDR1、HCDR2、和HCDR3以及LCDR1、LCDR2、和LCDR3分别包含SEQ ID NO:79–84。
2.如权利要求1所述的抗体，其中该抗体包含分别包含SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:77的重链和轻链。
3.如权利要求1所述的抗体，其中该重链氨基酸序列包含SEQ ID NO:71并且该轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO:75。
4.如权利要求1所述的抗体，其中该抗体是单克隆抗体。
5.一种核酸序列，该核酸序列包含编码如权利要求1所述的抗体的多核苷酸。
6.一种载体，该载体包含如权利要求5所述的核苷酸序列。
7.一种细胞，该细胞包含如权利要求6所述的载体。
8.一种制备如权利要求1所述的抗体的方法，该方法包括培养包含如权利要求6所述的载体的细胞。
9.一种减少血管生成的方法，该方法包括向受试者提供如权利要求1所述的抗体。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7485273B2 (ja) 2020-06-25 2024-05-16 国立大学法人 鹿児島大学 抗ｖｅｇｆ－ａ抗体による癌に対する治療応答性を予測又は決定するための方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1259962A (zh) * 1997-04-07 2000-07-12 基因技术股份有限公司 抗－血管内皮生长因子的抗体
WO2010124009A2 (en) * 2009-04-21 2010-10-28 Schering Corporation Fully human anti-vegf antibodies and methods of using
CN102006885A (zh) * 2006-10-20 2011-04-06 先灵公司 完全人源抗vegf抗体及其使用方法
US20110177074A1 (en) * 2008-03-27 2011-07-21 Sivakumar Pallavur V Compositions and methods for inhibiting pdgfrbeta and vegf-a
CN102276722A (zh) * 2011-01-14 2011-12-14 中国科学院北京基因组研究所 新型血管内皮生长因子人源化单克隆抗体
CN103562222A (zh) * 2011-04-01 2014-02-05 勃林格殷格翰国际有限公司 结合VEGF和Ang2的双特异性结合分子

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5981216A (en) 1985-04-01 1999-11-09 Alusuisse Holdings A.G. Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
EP3260468A1 (en) * 1997-04-07 2017-12-27 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
ES2330330T3 (es) 2000-06-28 2009-12-09 Glycofi, Inc. Procedimiento de produccion de glucoproteinas modificadas.
NZ598048A (en) 2006-01-17 2013-05-31 Synthon Biopharmaceuticals Bv Compositions and methods for humanization and optimization of n-glycans in plants
EP1995309A1 (en) 2007-05-21 2008-11-26 Vivalis Recombinant protein production in avian EBx® cells
CN103906533A (zh) * 2011-11-07 2014-07-02 米迪缪尼有限公司 多特异性和多价结合蛋白及其用途

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1259962A (zh) * 1997-04-07 2000-07-12 基因技术股份有限公司 抗－血管内皮生长因子的抗体
CN102006885A (zh) * 2006-10-20 2011-04-06 先灵公司 完全人源抗vegf抗体及其使用方法
US20110177074A1 (en) * 2008-03-27 2011-07-21 Sivakumar Pallavur V Compositions and methods for inhibiting pdgfrbeta and vegf-a
WO2010124009A2 (en) * 2009-04-21 2010-10-28 Schering Corporation Fully human anti-vegf antibodies and methods of using
CN102276722A (zh) * 2011-01-14 2011-12-14 中国科学院北京基因组研究所 新型血管内皮生长因子人源化单克隆抗体
CN103562222A (zh) * 2011-04-01 2014-02-05 勃林格殷格翰国际有限公司 结合VEGF和Ang2的双特异性结合分子

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FERRARA, N 等: "Bevacizumab (Avastin), a humanized anti-VEGF monoclonal antibody for cancer therapy", 《BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS》 *
宣自学等: "靶向肿瘤血管形成的抗肿瘤作用及药物研究进展", 《中国新药杂志》 *
李伊培等: "抗VEGF/VEGFR靶向肿瘤血管药物的研究进展", 《现代生物医学进展》 *

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