CN109856215B

CN109856215B - 羧基化氧化石墨烯修饰电极检测miRNA-21的方法

Info

Publication number: CN109856215B
Application number: CN201910172088.8A
Authority: CN
Inventors: 肖琦; 黄珊; 李家文; 金晓宇
Original assignee: Ningbo Yuanzhi Cube Energy Technology Co ltd
Current assignee: Ningbo Yuanzhicube Energy Technology Co ltd
Priority date: 2019-03-07
Filing date: 2019-03-07
Publication date: 2021-09-17
Anticipated expiration: 2039-03-07
Also published as: CN109856215A

Abstract

本发明公开了一种羧基化氧化石墨烯修饰电极检测miRNA‑21的方法，第一、滴加miRNA‑21适配体溶液到金电极表面，冲洗吹干；滴加巯基乙醇溶液，冲洗吹干；滴加反应液，冲洗吹干；浸泡羧基化氧化石墨烯复合物饱和溶液，冲洗吹干；滴加亚甲基蓝，冲洗吹干，得修饰电极；将二茂铁和二苯丙氨酸溶于乙醇，加羧基化氧化石墨烯超声处理，取滤液干燥得羧基化氧化石墨烯复合物；第二、制备多个修饰电极，检测每个浓度对应的阻抗值，计算得到阻抗值的差值与浓度的线性关系；第三、制备检测待测样液的修饰电极，检测待测样液的阻抗值，采用线性关系计算得到待测样液中miRNA‑21的浓度。本发明具有增强金电极的电化学信号的有益效果。

Description

羧基化氧化石墨烯修饰电极检测miRNA-21的方法

技术领域

本发明涉及检测领域。更具体地说，本发明涉及一种基羧基化氧化石墨烯修饰电极检测miRNA-21的方法。

背景技术

微小RNA(miRNA)是一类含有约22个核苷酸的小型非编码RNA分子，其功能是基因表达的转录和转录后调控。根据最近的一些报道，某些种类的miRNA与人类癌症密切相关，miRNA-21就是其中之一。在这些不同的miRNA中，miRNA-21被认为是一种潜在的生物标志物，因为它在许多癌组织中过表达，如肺腺癌，胶质母细胞瘤，乳腺癌，宫颈癌。此外，通过递送抑制剂调节特定的microRNA表达，它们也可以成为许多疾病的新型治疗靶点。因此，迫切需要灵敏的microRNA定量方法，具有高灵敏度和高选择性。然而，miRNA的短长度，高序列相似性和低丰度(低至每个细胞的几个分子)使得难以开发用于检测miRNA的快速，简单，灵敏和选择性电化学方法。为了克服这些缺点，已经开发了用于miRNA检测的不同生物传感策略，例如荧光，电化学发光，表面等离子共振，比色，电化学和在这些方法中，电化学生物传感器因其高灵敏度和高精度，快速响应，低成本，用户友好性，仪器简单，易于小型化等突出方面而被吹捧为一类特别有前景的有效分析技术。

石墨烯是由单层片材组成的二维碳材料。由于其独特的电子，光学，热学和机械性能，它已被广泛用于电化学传感器构造，特别是其超薄2D平面结构，极高的表面积，良好的导电性和化学稳定性。据报道，各种生物探针如单链DNA(ssDNA)，抗体和芳香族化合物可通过π-π相互作用和/或范德瓦尔斯力吸收石墨烯表面。亚甲基蓝是一种芳香族杂环染料，它与核酸序列相互作用，可用作电化学核酸生物传感器的杂交指示剂。羧基化氧化石墨烯(COOH-rGO)在其基底和边缘平面上由各种官能团组成，如羧基，环氧基，酮基和羟基。这些大的带负电的官能团主要通过强静电相互作用对许多带正电荷的物种具有很大的吸引力。因此，羧基化氧化石墨烯是亚甲基蓝的高效吸附剂，其在性质上是带正电的。双链特异性核酸酶(DSN)是一种非常倾向于在DNA/RNA杂交双链体中切割双链DNA或DNA的酶，并且不仅对单链DNA或单链或双链RNA几乎无活性，而且还显示出显着的区分能力是否完全匹配短双链体。

针对以上问题，我们研究了一种检测miRNA-21的新方法，该方法检测灵敏度高，抗干扰能力强。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种羧基化氧化石墨烯修饰电极检测miRNA-21的方法，电极的电化学信号强，检测抗干扰能力强。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种羧基化氧化石墨烯修饰电极检测miRNA-21的方法，包括：

步骤一、电极修饰：a、将浓度为2μM的miRNA-21适配体溶液滴加到金电极表面，置于4℃环境中12h后，用PH为7.4的PBS溶液冲洗25s，用超纯水冲洗干净，用氮气吹干；

b、将浓度为1mM的巯基乙醇溶液滴加到步骤a中的金电极表面，直至金电极表面布满巯基乙醇溶液，置于4℃环境中1h后，用PH为7.4的PBS溶液冲洗25s，用超纯水冲洗干净，用氮气吹干；

c、将反应液滴加到步骤b中的金电极表面，置于55℃环境中125min后，用PH为7.4的PBS溶液冲洗25s，用超纯水冲洗干净，用氮气吹干，其中，反应液为10mM Tris-HCl，反应液中还含有0.1M的NaCl、1.0mM的MgCl₂，0.05U的双链特异性核酸酶；

d、将步骤c中的金电极表面浸泡于羧基化氧化石墨烯复合物饱和溶液中，于80℃下静置6h，再用PH为7.4的PBS溶液冲洗25s，用超纯水冲洗干净，再用氮气吹干；

其中，羧基化氧化石墨烯复合物饱和溶液的制备方法为：将二茂铁和二苯丙氨酸溶于乙醇，使二茂铁和二苯丙氨酸的浓度分别为2mM和1mM，再加入羧基化氧化石墨烯，于超声频率为100KHz超声处理50min，加入颗粒粒径小于25μm的二氧化硅，继续于超声频率为100KHz超声处理30min，过滤取滤液，将滤液置于25℃条件下挥发去除溶剂，得到羧基化氧化石墨烯复合物，将羧基化氧化石墨烯复合物置于超纯水中，于超声频率为100KHz超声处理10min，得到羧基化氧化石墨烯复合物饱和溶液；

e、将浓度为1mM的亚甲基蓝滴加到步骤d中的金电极表面，置于4℃环境中100min后，用PH为7.4的PBS溶液冲洗25s，再用超纯水冲洗干净，然后用氮气吹干，得到修饰电极；

步骤二、重复步骤一制备多个修饰电极，其中，制备多个修饰电极的反应液中还含有miRNA-21溶液，且miRNA-21溶液的miRNA-21的浓度不同；

步骤三、以银氯化银电极和铂电极分别为参比电极和对电极，以步骤二制备的修饰电极为工作电极，搭建多个三电极体系，采用交流阻抗法扫描得到多个交流阻抗曲线图，根据交流阻抗曲线图拟合得到每个浓度的miRNA-21溶液对应的阻抗值；

步骤四、以浓度不为0的miRNA-21溶液的阻抗值减去浓度为0的miRNA-21溶液的阻抗值的差值为纵坐标，以miRNA-21溶液的浓度为横坐标，计算得到miRNA-21溶液阻抗值的差值与浓度的线性关系；

步骤五、按照步骤一制备一个修饰电极，其中，制备该修饰电极中的反应液中加入有10μL含有未知浓度的miRNA-21的待测样液；

步骤六、以银氯化银电极和铂电极分别为参比电极和对电极，以步骤五中的修饰电极为工作电极，搭建三电极体系，采用交流阻抗法扫描得到一个交流阻抗曲线图，根据交流阻抗曲线图拟合得到待测样液对应的阻抗值，以该阻抗值减去浓度为0的miRNA-21溶液的阻抗值，得到差值，将该差值代入步骤五中的线性关系，计算得到待测样液中miRNA-21的浓度。

优选的是，还包括：在步骤一之前，对金电极进行以下处理：

将金电极置于NaHCO₃浓度为5μM、KCl浓度为10μM的超纯水溶液中，于温度为65℃水浴条件下浸泡40min，用超纯水冲洗后，再置于乙酸浓度为5μM、硅酸浓度为2μM的超纯水溶液中，于温度为80℃水浴条件下浸泡60min，用超纯水冲洗后，在抛光布上用0.05μm的抛光粉打磨，再用超纯水冲洗干净。

优选的是，miRNA-21的核苷酸序列为：5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'；miRNA-21适配体的核苷酸序列为5'-TCAACATCAGTCTGATAAGCTATTT-(CH2)6-SH-3'。

优选的是，步骤二中的miRNA-21溶液的浓度分别为0mol/L、2×10^-12mol/L、5×10^-12mol/L、1×10^-11mol/L、2×10^-11mol/L，向反应液中加入的miRNA-21溶液的体积为10μL，反应液的总体积为20μL。

优选的是，步骤三和步骤六中扫描参数设置为：振幅为0.005V，频率为0.1～1000Hz的条件下，在反应介质液为含有[Fe(CN)₆]^3-和Fe(CN)₆ ^4-的溶液中进行检测，其中，[Fe(CN)₆]^3-和Fe(CN)₆ ^4-的总浓度为5mmol。

优选的是，羧基化氧化石墨烯的制备方法为：将氧化石墨分散于超纯水中，超声处理分散形成均匀的黄色透明胶体溶液，即得氧化石墨烯，然后加入NaOH和一氯乙酸超声处理，使氧化石墨烯上的羟基和环氧基转化为羧基，然后热过滤除去杂质离子，蒸发掉多余水分，再在65℃下真空干燥得到羧基化氧化石墨烯，其中，氧化石墨、超纯水、NaOH、一氯乙酸的质量体积比为100mg:100mL:6.0g:5.0g。

本发明至少包括以下有益效果：可以将miRNA-21适配体和羧基化氧化石墨烯复合物修饰到金电极表面，并显著增大电化学信号，增强电流强度和表面积，电化学信号更加稳定，以提高检测的准确性。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明的6个金电极的电化学响应的交流阻抗曲线图；

图2为本发明的6个金电极的计时库伦图；

图3为本发明的图2中的6个金电极的μC对Time^1/2图；

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

<实施例1>

羧基化氧化石墨烯修饰电极检测miRNA-21的方法，包括：

miRNA-21的核苷酸序列为：5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'；miRNA-21适配体的核苷酸序列为5'-TCAACATCAGTCTGATAAGCTATTT-(CH2)6-SH-3'。

步骤二中的miRNA-21溶液的浓度分别为0mol/L、2×10^-12mol/L、5×10^-12mol/L、1×10^-11mol/L、2×10^-11mol/L，向反应液中加入的miRNA-21溶液的体积为10μL，反应液的总体积为20μL。

步骤三和步骤六中扫描参数设置为：振幅为0.005V，频率为0.1～1000Hz的条件下，在反应介质液为含有[Fe(CN)₆]^3-和Fe(CN)₆ ^4-的溶液中进行检测，其中，[Fe(CN)₆]^3-和Fe(CN)₆ ^4-的总浓度为5mmol。

羧基化氧化石墨烯的制备方法为：将氧化石墨分散于超纯水中，超声处理分散形成均匀的黄色透明胶体溶液，即得氧化石墨烯，然后加入NaOH和一氯乙酸超声处理，使氧化石墨烯上的羟基和环氧基转化为羧基，然后热过滤除去杂质离子，蒸发掉多余水分，再在65℃下真空干燥得到羧基化氧化石墨烯，其中，氧化石墨、超纯水、NaOH、一氯乙酸的质量体积比为100mg:100mL:6.0g:5.0g。

miRNA-21适配体溶液是以TE缓冲液为溶剂，TE缓冲液为10mM Tris–HCl，包含1mMEDTA，PH为7.4。

<实施例2>

羧基化氧化石墨烯修饰电极检测miRNA-21的方法同实施例1，其中，还包括：在步骤一之前，对金电极进行以下处理：

<对比例1>

羧基化氧化石墨烯修饰电极检测miRNA-21的方法同实施例1，其中，不同的是，步骤d中的羧基化氧化石墨烯复合物饱和溶液，用羧基化氧化石墨烯饱和溶液代替，羧基化氧化石墨烯饱和溶液的制备方法具体为：将羧基化氧化石墨烯加入超纯水中，于超声频率为100KHz超声处理50min，得到羧基化氧化石墨烯饱和溶液。

<金电极电化学信号试验>

1、如图1所示，为裸金电极，及按实施例1中的步骤a、b、c、d、e制备的5个金电极，一共6个金电极，采用交流阻抗法扫描得到对应的多个交流阻抗曲线图，分别一一对应图1中的a、b、c、d、e、f 6条交流阻抗曲线；

由图1可以看出，比较e曲线和a曲线，说明经过步骤a至d的修饰后，可以显著将miRNA-21适配体和羧基化氧化石墨烯复合物修饰到金电极表面，并显著增大电化学信号；

比较e曲线和f曲线，说明经过步骤a至e的修饰后，可以将电化信号放大到合适值。

如图2所示，为上述6个金电极的计时库伦图；

如图3所示，图3是图2中的μC对Time^1/2作图。

如图2所示，比较e曲线和a曲线，可知经过步骤a至d的修饰后，金电极具有更好的电化学响应，电流强度和表面积较大；比较e曲线和f曲线，说明经过步骤a至e的修饰后，可以进一步增强电流强度和表面积。

2、采用实施例1和对比例1的方法检测得到的miRNA-21溶液的浓度与阻抗值的线性关系的R²分别为0.9999和0.9843，说明实施例1的方法中修饰电极所引起的电化学信号更加稳定，可以提高检测的准确性。

3、检测混合样品

将肺腺癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、乳腺癌细胞、宫颈癌细胞分别加入超纯水，并粉碎，离心，取上清液，即得到4种干扰液；

配置4组miRNA-21溶液，每组有4个，且miRNA-21的浓度不同，向每组miRNA-21溶液中加入其中一种干扰液，使干扰液浓度为5×10^-11mol/L，miRNA-21的浓度分别为1×10^- ¹⁴mol/L、1×10^-13mol/L、1×10^-12mol/L、1×10^-11mol/L，得到16个待测样液；

采用实施例1的方法分别检测上述16个待测样液，检测得到的miRNA-21的浓度如表1所示，单位是mol/L：

表1

由表1可以知道，对于存在干扰液的情况下，实施例1的方法的检测准确性依然可以得保证，具有超强的抗干扰能力，可以准确检测低至到1×10^-13mol/L的浓度。

采用对比例1的方法分别检测上述16个待测样液，检测得到的miRNA-21的浓度如表2所示，单位是mol/L：

表2

组别	1×10<sup>-14</sup>	1×10<sup>-13</sup>	1×10<sup>-12</sup>	1×10<sup>-11</sup>
					肺腺癌细胞	-	-	0.74×10<sup>-12</sup>	0.90×10<sup>-11</sup>
胶质母细胞瘤细胞	-	-	0.83×10<sup>-12</sup>	0.92×10<sup>-11</sup>
					乳腺癌细胞	-	-	0.85×10<sup>-12</sup>	0.80×10<sup>-11</sup>
宫颈癌细胞	-	-	0.72×10<sup>-12</sup>	0.88×10<sup>-11</sup>

由表1与表2的数据比较可知，未采用羧基化氧化石墨烯复合物修饰电极检测，其能准确检测到的最低限为1×10^-12并且准确性还不如表1，说明羧基化氧化石墨烯复合物可以增强电化学信号，并且电化学信号更加稳定。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims

1.羧基化氧化石墨烯修饰电极检测miRNA-21的方法，其特征在于，包括：

步骤六、以银氯化银电极和铂电极分别为参比电极和对电极，以步骤五中的修饰电极为工作电极，搭建三电极体系，采用交流阻抗法扫描得到一个交流阻抗曲线图，根据交流阻抗曲线图拟合得到待测样液对应的阻抗值，以该阻抗值减去浓度为0的miRNA-21溶液的阻抗值，得到差值，将该差值代入步骤五中的线性关系，计算得到待测样液中miRNA-21的浓度；

2.如权利要求1所述的羧基化氧化石墨烯修饰电极检测miRNA-21的方法，其特征在于，还包括：在步骤一之前，对金电极进行以下处理：

3.如权利要求1所述的羧基化氧化石墨烯修饰电极检测miRNA-21的方法，其特征在于，miRNA-21的核苷酸序列为：5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'；

miRNA-21适配体的核苷酸序列为5'-TCAACATCAGTCTGATAAGCTATTT-(CH2)6-SH-3'。

4.如权利要求1所述的羧基化氧化石墨烯修饰电极检测miRNA-21的方法，其特征在于，步骤二中的miRNA-21溶液的浓度分别为0mol/L、2×10^-12mol/L、5×10^-12mol/L、1×10^- ¹¹mol/L、2×10^-11mol/L，向反应液中加入的miRNA-21溶液的体积为10μL，反应液的总体积为20μL。

5.如权利要求1所述的羧基化氧化石墨烯修饰电极检测miRNA-21的方法，其特征在于，步骤三和步骤六中扫描参数设置为：振幅为0.005V，频率为0.1～1000Hz的条件下，在反应介质液为含有[Fe(CN)₆]^3-和Fe(CN)₆ ^4-的溶液中进行检测，其中，[Fe(CN)₆]^3-和Fe(CN)₆ ^4-的总浓度为5mmol。