CN109846887B - 2-氨基嘌呤-6（h）硫酮在制备单纯疱疹病毒的抑制剂中的应用 - Google Patents
2-氨基嘌呤-6（h）硫酮在制备单纯疱疹病毒的抑制剂中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及医药技术领域，具体涉及2‑氨基嘌呤‑6(H)硫酮在制备单纯疱疹病毒的抑制剂中的应用，同时提供了2‑氨基嘌呤‑6(H)硫酮在制备预防和/或治疗由单纯疱疹病毒感染导致的疾病的药物中的应用。通过实验证明了2‑氨基嘌呤‑6(H)硫酮对单纯疱疹病毒具有抑制作用，能提高被单纯疱疹病毒感染的细胞的存活率。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及2-氨基嘌呤-6(H)硫酮的应用。
背景技术
单纯疱疹病毒Ⅰ型(herpes simplex virus-1,HSV-1)感染眼睛所引起的单纯疱疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis,HSK)是当今世界上危害严重的感染性眼病之一，发病率占角膜病首位。同时，HSK是难治性致盲性角膜病的首要原因，是重大的公共卫生和社会问题之一。
HSK在发达国家的发病率为5.9-20.7/104，患病率为149/104，发展中国家发病率和患病率皆高于发达国家，而且更趋于年轻化，发生在年轻人群中更为严重。在我国HSK致盲占角膜盲的42.8％，居首位。HSK发病率高，难治愈，易复发，严重影响患者的视功能，已成为我国内外眼科界极为关注的热点问题之一。
抗HSV-1感染以及结合抗炎是HSK治疗的首选方案。目前市面上首选治疗药物阿昔洛韦治疗HSK已经出现如下的问题：(1)目前阿昔韦洛治疗 HSK，只能在HSK感染早期起到抑制HSV-1增殖的效果，当HSV-1感染进入潜伏期感染，阿昔韦洛的治疗就非常的有限，而且阿昔韦洛治疗也不能达到完全清除HSV-1的目的；(2)长期使用阿昔洛韦，已经出现了对阿昔韦洛耐药的HSV-1耐药病毒株，所以免疫缺陷患者被耐药病毒株HSV-1感染后，接受阿昔韦洛治疗没有任何效果；(3)目前尚无针对HSV感染的疫苗。所以急需寻找新的化合物和新的治疗靶点来解决以上问题。
2-氨基嘌呤-6(H)硫酮是一种鸟嘌呤的类似物，可以抑制鸟嘌呤核苷的合成以及DNMT1的活性，广泛的用于治疗急性淋巴细胞白血病、自身免疫性疾病(如克罗恩病和类风湿关节炎)和器官移植接受者。
目前国内外没有关于2-氨基嘌呤-6(H)硫酮抑制HSV-1或HSV-2的研究报道，也没有2-氨基嘌呤-6(H)硫酮在制备预防和/或治疗单纯疱疹病毒感染的疾病的药物中的应用。
发明内容
本发明为了解决上述问题提供了2-氨基嘌呤-6(H)硫酮在制备单纯疱疹病毒的抑制剂中的应用，本研究发现，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮不仅能够抑制HSV-1胞膜蛋白gD-1 mRNA表达也能抑制gD-1蛋白表达，从而抑制 HSV-1的复制，它的抗病毒效果十分明显。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供了2-氨基嘌呤-6(H)硫酮在制备单纯疱疹病毒的抑制剂中的应用。
进一步，所述单纯疱疹病毒为单纯疱疹病毒Ⅰ型或单纯疱疹病毒Ⅱ型。
本发明还提供了2-氨基嘌呤-6(H)硫酮在制备预防和/或治疗由单纯疱疹病毒感染导致的疾病的药物中的应用。
进一步，所述单纯疱疹感染的疾病包括龈口炎、单纯疱疹病毒性角膜炎、脑炎和单纯疱疹病毒感染引起的生殖器疱疹。
本发明还提供了一种预防和/或治疗由单纯疱疹病毒感染导致的疾病的药物，包括2-氨基嘌呤-6(H)硫酮和药学上可接受的辅料。
进一步，所述药物的剂型为任意一种临床可接受的口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药制剂。
本发明的有益效果是：本发明提供了2-氨基嘌呤-6(H)硫酮在制备单纯疱疹病毒的抑制剂中的应用，本发明实验结果表明，2-氨基嘌呤-6(H) 硫酮对单纯疱疹病毒Ⅰ型和单纯疱疹病毒Ⅱ型具有抑制作用，可以抑制病毒的复制，从而抑制病毒的增殖和扩散，提高被病毒感染细胞的存活率，并且体外细胞毒性实验表明，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮对人角膜上皮细胞、人宫颈癌上皮细胞和非洲绿猴肾细胞具有极低的毒性，对于龈口炎或单纯疱疹病毒性角膜炎或脑炎或单纯疱疹病毒感染引起的生殖器疱疹也可以获得治疗效果。
附图说明
图1为本发明实施例1中In-cell-Western方法检测2-氨基嘌呤-6(H) 硫酮抑制HSV-1和HSV-2感染Vero细胞的结果图，其中图A：为不同浓度 2-氨基嘌呤-6(H)硫酮处理被HSV-1感染的Vero细胞后，HSV-1的胞膜蛋白gD-1和DRAQ5(内参标准化)免疫荧光照片。图B：通过oddssey软件读取gD-1和DRAQ5的免疫荧光读值，通过计算获取gD-1/DRAQ5比值，并自定义0.02％DMSO处理的病毒对照组的gD-1/DRAQ5为1.0，以此类推不同浓度2-氨基嘌呤-6(H)硫酮处理的病毒处理组，计算gD-1/DRAQ5 的数值。图C：为不同浓度2-氨基嘌呤-6(H)硫酮处理被HSV-2感染的 Vero细胞后，HSV-2的胞膜蛋白gD-2和DRAQ5(内参标准化)免疫荧光照片。图D：通过oddssey软件读取gD-2和DRAQ5的免疫荧光读值，获取 gD-2/DRAQ5比值，并自定义0.02％DMSO处理的病毒对照组的gD-2为1.0，以此类推不同浓度2-氨基嘌呤-6(H)硫酮处理的病毒处理组，计算 gD-2/DRAQ5的数值。
图2为本发明实施例2中In-cell-Western方法检测2-氨基嘌呤-6(H) 硫酮抑制HSV-1和HSV-2感染HeLa细胞的结果图，其中图A：不同浓度 2-氨基嘌呤-6(H)硫酮处理被HSV-1感染的HeLa后，HSV-1的胞膜蛋白 gD-1和DRAQ5(内参标准化)免疫荧光照片。图B：通过oddssey软件读取gD-1和DRAQ5的免疫荧光读值，获取gD-1/DRAQ5比值，并自定义 0.02％DMSO处理的病毒对照组的gD-1为1.0，以此类推不同浓度2-氨基嘌呤-6(H)硫酮处理的病毒处理组，计算gD-1/DRAQ5的数值。图C：不同浓度2-氨基嘌呤-6(H)硫酮处理被HSV-2感染的HeLa细胞后，HSV-2 的胞膜蛋白gD-2和DRAQ5(内参标准化)免疫荧光照片。图D：通过oddssey 软件读取gD-2和DRAQ5的免疫荧光读值，获取gD-2/DRAQ5比值，并自定义0.02％DMSO处理的病毒对照组的gD-2为1.0，以此类推不同浓度2- 氨基嘌呤-6(H)硫酮处理的病毒处理组，计算gD-2/DRAQ5的数值。
图3为本发明实施例3中In-cell-Western方法检测2-氨基嘌呤-6(H) 硫酮抑制HSV-1感染人角膜上皮细胞(HCEC)的结果图。图3A：不同浓度2-氨基嘌呤-6(H)硫酮处理被HSV-1感染的HCEC后，HSV-1的胞膜蛋白gD-1和DRAQ5(内参标准化)免疫荧光照片；图3B：通过oddssey软件读取gD-1和DRAQ5的免疫荧光读值，获取gD-1/DRAQ5比值，并自定义0.02％DMSO处理的病毒对照组的gD-1为1.0，以此类推不同浓度2- 氨基嘌呤-6(H)硫酮处理的病毒处理组，计算gD-1/DRAQ5的数值。
图4为本发明实施例4中不同浓度2-氨基嘌呤-6(H)硫酮处理被HSV-1 感染HCEC后，收集细胞上清，通过TCID50方法检测细胞上清重新感染Vero 细胞后产生的病毒滴度；
图5为不同浓度2-氨基嘌呤-6(H)硫酮处理被HSV-1感染HCEC后， HSV-1胞膜蛋白gD-1 mRNA的表达量；
图6为2-氨基嘌呤-6(H)硫酮(6-thioguanine)、阿昔洛韦(Acyclovir) 和更昔洛韦(Ganciclovir)分别抑制HSV-1感染HCEC的半数有效抑制浓度 (EC50)；
图7为2-氨基嘌呤-6(H)硫酮(6-thioguanine)、阿昔洛韦(Acyclovir) 和更昔洛韦(Ganciclovir)分别抑制HSV-2对HCEC感染的半数有效抑制浓度(EC50)。
图8为2-氨基嘌呤-6(H)硫酮(6-thioguanine)、阿昔洛韦(Acyclovir) 和生理盐水治疗HSV-1感染小鼠眼睛引起单纯疱疹病毒性角膜炎的效果。
图9为不同浓度的2-氨基嘌呤-6(H)硫酮(6-thioguanine)在Vero、 HeLa和HCEC细胞上无明显的细胞毒性。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
2-氨基嘌呤-6(H)硫酮是一种鸟嘌呤的类似物，分子式：C5H5N5S，分子量167.19200，具有式Ⅰ所示结构，可以抑制DNMT1的活性，广泛的用于治疗急性淋巴细胞白血病，自身免疫性疾病(如克罗恩病和类风湿关节炎) 和器官移植接受者。
实施例中材料分别购自：
单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1 HF株)和单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2G株) 购自美国模式培养物集存库(ATCC)；
非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、海拉细胞(HeLa细胞)和角膜上皮细胞(HCEC)购自中国科学院细胞库。
HSV-1/2 gD抗体既可以识别HSV-1胞膜蛋白gD-1也可以识别HSV-2 胞膜蛋白gD-2，购自圣克鲁斯生物技术有限公司(货号：SC-69802)，羊抗鼠二抗(IRDye 800CW Goat-anti-mouse 800),购自LI-COR公司(货号： C808116-15)。
2-氨基嘌呤-6(H)硫酮(6-thioguanine)购自selleck公司(货号：S1774)、阿昔洛韦(Acyclovir)购自selleck公司(货号：S1807)、更昔洛韦 (Ganciclovir)购自selleck公司(货号：S1878)。
实施例1利用In-cell-Western方法检测2-氨基嘌呤-6(H)硫酮抑制 HSV-1或HSV-2感染Vero细胞的抗病毒效果。
Vero细胞接种于96孔培养板中，待细胞汇合后，分别加入浓度为0、 10-3、10-2、10-1、1、5μM的2-氨基嘌呤-6(H)硫酮(2-氨基嘌呤-6(H) 硫酮溶于DMSO)，37℃孵育30min，然后分别用HSV-1 HF株和HSV-2G 株感染Vero细胞，感染病毒滴度MOI＝1。24h后，弃去培养基，4％多聚甲醛固定15min，然后利用0.1％的TritonX-100进行穿透处理，共5次，每次5min。穿透结束后，利用4％的脱脂奶粉封闭90min，分别加入胞膜蛋白gD的一抗(1:200)孵育2h；PBST缓冲液洗板5次，每次5min，加入二抗(1：2500)和DRAQ5，孵育1h；PBST缓冲液洗板5次，每次5min，然后用Oddssey Infrared Image System检测，结果如图1所示：①在横向轴上，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮浓度为0μM时，只有HSV-1或HSV-2复制，纵轴上gD-1或gD-2蛋白表达为1.0；②在横向轴上，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮浓度为10-3μM时，纵轴上gD-1和gD-2蛋白表达分别为0.90和0.95；③在横向轴上，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮浓度为10-2μM时，纵轴上gD-1和gD-2 蛋白表达分别为0.30和0.85；④在横向轴上，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮浓度为10-1μM时，纵轴上gD-1和gD-2蛋白表达分别为0.1和0.55；⑤在横向轴上，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮浓度为1μM时，纵轴上gD-1和gD-2蛋白表达都为0.05；⑥在横向轴上，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮浓度为5μM时，纵轴上gD-1和gD-2蛋白表达都为0.01。HSV毒胞膜蛋白gD-1或gD-2蛋白表达的数值大小与子代病毒复制水平成正比，表明2-氨基嘌呤-6(H)硫酮可以分别抑制HSV-1 gD-1和HSV-2 gD-2的表达，从而抑制HSV-1和HSV-2 在Vero细胞中的复制，提高被HSV-1/2感染的细胞存活率；在横轴上根据 Graphpad统计软件计算半数有效抑制浓度EC50，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮抑制HSV-1复制的半数有效抑制浓度EC50＝0.05μM,2-氨基嘌呤-6(H)硫酮抑制HSV-2复制的半数有效抑制浓度EC50＝2μM。通过比较EC50大小，可以得出2-氨基嘌呤-6(H)硫酮抑制HSV-1复制效果好于2-氨基嘌呤-6(H) 硫酮抑制HSV-2的复制效果。
实施例2利用In-cell Western方法检测2-氨基嘌呤-6(H)硫酮抑制 HSV-1或HSV-2对HeLa细胞的感染
HeLa细胞接种于96孔培养板中，待细胞汇合后，分别加入浓度为0、 10-3、10-2、10-1、1、5μM的2-氨基嘌呤-6(H)硫酮(2-氨基嘌呤-6(H) 硫酮溶于DMSO)，37℃孵育30min，然后分别用HSV-1HF株和HSV-2G 株感染HeLa细胞，感染病毒滴度MOI＝1。24h后，弃去培养基，4％多聚甲醛固定15min，然后利用0.1％的TritonX-100进行穿透处理，共5次，每次5min。穿透结束后，利用4％的脱脂奶粉封闭90min，分别加入HSV 胞膜蛋白gD-1/2的一抗(1:200)，然后孵育2h；PBST缓冲液洗板5次，每次5min，加入二抗(1：2500)和DRAQ5，孵育1h；PBST缓冲液洗板 5次，每次5min，然后用Oddssey Infrared Image System检测，结果如图2 所示，①在横轴上，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮浓度为0μM时，只有HSV-1或 HSV-2复制，纵轴上gD-1或gD-2蛋白表达为1.0；②在横轴上，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮浓度为10-3μM时，纵轴上gD-1和gD-2蛋白表达分别为0.75 和0.95；③在横轴上，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮浓度为10-2μM时，纵轴上gD-1 和gD-2蛋白表达为0.25和0.85；④在横轴上，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮浓度为10-1μM时，纵轴上gD-1和gD-2蛋白表达为0.1和0.75；⑤在横轴上， 2-氨基嘌呤-6(H)硫酮浓度为1μM时，纵轴上gD-1和gD-2蛋白表达为0.05 和0.60；⑥在横轴上，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮浓度为5μM时，纵轴上gD-1 和gD-2蛋白表达为0.01和0.25。HSV毒胞膜蛋白gD-1或gD-2蛋白表达的数值大小与子代病毒复制水平成正比，表明2-氨基嘌呤-6(H)硫酮可以分别抑制HSV-1 gD-1和HSV-2 gD-2的表达，从而抑制HSV-1和HSV-2 在Vero细胞中的复制，提高被HSV-1/2感染的细胞存活率；在横轴上根据半数有效抑制浓度，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮抑制HSV-1复制的半数有效抑制浓度EC50＝0.05μM,2-氨基嘌呤-6(H)硫酮抑制HSV-2复制的半数有效抑制浓度EC50＝2μM。通过比较EC50大小，可以得出2-氨基嘌呤-6(H)硫酮抑制HSV-1复制效果好于2-氨基嘌呤-6(H)硫酮抑制HSV-2的复制效果。海拉细胞系是源自一位美国黑人妇女海瑞塔·拉克斯(Henrietta Lacks) 的宫颈癌细胞的细胞系，用HSV-2感染HeLa细胞模拟HSV-2感染生殖器官，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮抑制HeLa细胞里HSV-2复制证明2-氨基嘌呤 -6(H)硫酮可以用于治疗生殖器官被HSV-2感染导致的相关性疾病。
实施例3利用In-cell Western法检测2-氨基嘌呤-6(H)硫酮抑制HSV-1 对角膜上皮细胞(HCEC细胞)的感染
将HCEC细胞接种于96孔细胞培养板上，待细胞汇合后，分别加入浓度为0、10-3、10-2、10-1、1μM的2-氨基嘌呤-6(H)硫酮(2-氨基嘌呤-6(H) 硫酮溶于DMSO)，37℃孵育30min，用HSV-1感染HCEC细胞，感染病毒滴度MOI＝1。24h后，弃去培养基，4％多聚甲醛固定15min，然后利用 0.1％的TritonX-100进行穿透处理，共5次，每次5min。穿透结束后，利用4％的脱脂奶粉封闭90min，加入HSV-1胞膜蛋白gD-1/2的一抗(1:200)，然后孵育2h；PBST缓冲液洗板5次，每次5min，加入二抗(1：2500) 和DRAQ5，孵育1h；PBST缓冲液洗板5次，每次5min，然后用Oddssey Infrared Image System检测，结果如图3所示，①在横轴上，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮浓度为0μM时，只有HSV-1复制，纵轴上gD-1蛋白表达为1.0；②在横轴上，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮浓度为10-3μM时，纵轴上gD-1蛋白表达分别为0.3；③在横轴上，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮浓度为10-2μM时，纵轴上gD-1蛋白表达为0.15；④在横轴上，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮浓度为 10-1μM时，纵轴上gD-1蛋白表达为0.1；⑤在横轴上，2-氨基嘌呤-6(H) 硫酮浓度为1μM时，纵轴上gD-1蛋白表达为0.05。HSV胞膜蛋白gD-1或 gD-2蛋白表达的数值大小与子代病毒复制水平成正比，表明2-氨基嘌呤-6 (H)硫酮可以分别抑制HSV-1 gD-1和HSV-2 gD-2的表达，从而抑制HSV-1 和HSV-2在HCEC细胞中的复制，提高被HSV-1/2感染的细胞存活率。HCEC 细胞为人角膜上皮细胞，在细胞实验上，可以用来模拟HSV-1感染眼睛导致单纯疱疹病毒性角膜炎的疾病模型。2-氨基嘌呤-6(H)硫酮抑制角膜上皮细胞内HSV-1复制，证明2-氨基嘌呤-6(H)硫酮可以用来治疗HSV-1 感染眼睛导致的单纯疱疹病毒角膜炎的疾病。
实施例4利用Vero细胞检测2-氨基嘌呤-6(H)硫酮抑制HSV-1对角膜上皮细胞(HCEC细胞)的感染
将角膜上皮细胞(HCEC细胞)接种于96孔细胞培养板中，待细胞汇合后，分别加入浓度为0、10-3、10-2、10-1μM的2-氨基嘌呤-6(H)硫酮(2- 氨基嘌呤-6(H)硫酮溶于DMSO)，37℃孵育30min，用HSV-1HF株感染HCEC细胞，感染病毒滴度MOI＝1。24h后，弃去培养基，加入200μL 新鲜培养基，然后-20℃和37℃反复冻融3次，释放病毒粒子。将新鲜培养基里含有的病毒粒子感染Vero细胞，Vero细胞提前24h接种于96孔板，待汇合后，加入50μL上述含有病毒粒子培养基加入到孔中，72h后，记录和统计HSV-1病毒蚀斑数目，结果如图4所示，①在横轴上，2-氨基嘌呤-6 (H)硫酮浓度为0μM时，只有HSV-1复制，纵轴上HSV-1噬斑数为4.2；②在横轴上，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮浓度为10-3μM时，纵轴上HSV-1噬斑数为3.2；③在横轴上，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮浓度为10-2μM时，纵轴上HSV-1噬斑数为2.8；④在横轴上，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮浓度为10-1μM 时，纵轴上HSV-1噬斑数为1.8。结论：HSV-1噬斑数的数值大小与子代病毒复制水平成正比，表明2-氨基嘌呤-6(H)硫酮可以抑制HSV-1子代病毒感染HCEC。
实施例5利用Real-time-PCR检测2-氨基嘌呤-6(H)硫酮抑制HSV-1 对角膜上皮细胞(HCEC细胞)的感染
将HCEC细胞接种于24孔细胞培养板中，待细胞汇合后，分别加入浓度为0、10-3、10-2、10-1、1、5μM的2-氨基嘌呤-6(H)硫酮(2-氨基嘌呤 -6(H)硫酮溶于DMSO)，37℃孵育30min，用HSV-1感染HCEC细胞，感染HSV-1滴度MOI＝1。24h后，弃去培养基，加入300μLTrizol裂解细胞，提取细胞总RNA，利用TOYOBO逆转录试剂盒进行HSV-1胞膜蛋白 gD-1的合成，然后进行Real-time-PCR检测，采用SYBR Green法。HSV-1 gD-1上游引物为：CCAAATACGCCTTAGCAGACC，HSV-1 gD-1下游引物为：CACAGTGATCGGGATGCTGG；内参为GAPDH，GAPDH上游引物为：TGCACCACCAACTGCTTAGC，GAPDH下游引物为： GGCATGGACTGTGGTCATGAG；反应体系20μl，反应条件为预变性95℃， 10min；95℃，15s，60℃,1min，共40循环，延伸阶段检测荧光，结果如图5所示，①在横轴上，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮浓度为0μM时，只有HSV-1 复制，纵轴上gD-1mRNA为100％；②在横轴上，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮浓度为10-3μM时，纵轴上gD-1 mRNA为85％；③在横轴上，2-氨基嘌呤-6 (H)硫酮浓度为10-2μM时，纵轴上gD-1 mRNA为50％；④在横轴上，2- 氨基嘌呤-6(H)硫酮浓度为10-1μM时，纵轴上gD-1 mRNA为30％；⑤在横轴上，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮浓度为1μM时，纵轴上gD-1 mRNA为12.5％；⑥在横轴上，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮浓度为5μM时，纵轴上gD-1 mRNA 为5％。gD-1 mRNA数值与HSV-1在HCEC内复制水平成正比。结论：2- 氨基嘌呤-6(H)硫酮抑制HSV-1在HCEC内gD-1 mRNA表达，代表2- 氨基嘌呤-6(H)硫酮可以抑制HSV-1在人角膜上皮细胞内的复制。可以用来治疗HSV-1感染眼睛导致的单纯疱疹病毒性角膜炎。
实施例6用In-cell Western方法检测2-氨基嘌呤-6(H)硫酮、阿昔洛韦和更昔洛韦分别抑制HSV-1对角膜上皮细胞(HCEC细胞)的感染
将HCEC细胞接种于96孔细胞培养板中，待细胞汇合后，分别加入相同浓度的的2-氨基嘌呤-6(H)硫酮(6-thioguanine)、阿昔洛韦(Acyclovir) 和更昔洛韦(Ganciclovir)，它们加入的相同浓度分别为0、10-3、10-2、10-1、 1、5μM。37℃孵育30min，然后感染HSV-1，感染HSV-1滴度MOI＝1。 24h后，弃去培养基，4％多聚甲醛固定15min，然后利用0.1％TritonX-100 进行穿透处理，共5次，每次5min。穿透结束后，利用4％脱脂奶粉封闭 90min，加入HSV-1胞膜蛋白gD-1/2的一抗(1:200)，孵育2h。PBST 缓冲液洗板5次，每次5min，加入二抗(1：2500)和DRAQ5，然后孵育 1h。PBST缓冲液洗板5次，每次5min，然后用OddsseyInfrared Image System 检测，结果如图6所示，①在横轴上，以log10计数时，2-氨基嘌呤-6(H) 硫酮X＝-3，纵轴上HSV-1抑制率Y(6-thioguanine)＝5.09％、 Y(Acyclovir)＝6.49％、Y(Ganciclovir)＝7.09％。；②在横轴上，以log10计数时，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮X＝-2，纵轴上HSV-1抑制率 Y(6-thioguanine)＝48.44％、Y(Acyclovir)＝15.19％、Y(Ganciclovir)＝17.09％。③在横轴上，以log10计数时，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮X＝-1，纵轴上HSV-1 抑制率Y(6-thioguanine)＝88.34％、Y(Acyclovir)＝33.12％、 Y(Ganciclovir)＝26.03％。④在横轴上，以log10计数时，2-氨基嘌呤-6(H) 硫酮X＝0，纵轴上HSV-1抑制率Y(6-thioguanine)＝90.39％、 Y(Acyclovir)＝89.90％、Y(Ganciclovir)＝84.03％；⑤在横轴上，以log10计数时，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮X＝0.699，纵轴上HSV-1抑制率Y(6-thioguanine)＝91.54％、Y(Acyclovir)＝90.80％、Y(Ganciclovir)＝89.33％。结论：2-氨基嘌呤-6(H)硫酮、阿昔洛韦和更昔洛韦分别抑制HSV-1对HCEC细胞感染的 50％抑制效率最大效应的浓度(EC50)为0.009μM、0.158μM和0.208μM。 2-氨基嘌呤-6(H)硫酮比阿昔洛韦和更昔洛韦有更好的抑制HSV-1复制的效果。
实施例7用In-cell Western法检测2-氨基嘌呤-6(H)硫酮、阿昔洛韦和更昔洛韦分别抑制HSV-2对角膜上皮细胞(HCEC细胞)的感染
将HCEC细胞接种于96孔细胞培养板中，待细胞汇合后，分别加入相同浓度的的2-氨基嘌呤-6(H)硫酮(6-thioguanine)、阿昔洛韦(Acyclovir) 和更昔洛韦(Ganciclovir)，它们加入的相同浓度分别为0、10-3、10-2、10-1、 1、5μM。37℃孵育30min，然后感染HSV-2，感染HSV-2滴度MOI＝1。 24h后，弃去培养基，4％多聚甲醛固定15min，而后利用0.1％TritonX-100 进行穿透处理，共5次，每次5min。穿透结束后，利用4％脱脂奶粉封闭 90min，加入HSV-2胞膜蛋白gD-1/2的一抗(1:200)，孵育2h。PBST 缓冲液洗板5次，每次5min，加入二抗(1：2500)和DRAQ5，然后孵育 1h。PBST缓冲液洗板5次，每次5min，然后用OddsseyInfrared Image System 检测，结果如图7所示，①在横轴上，以log10计数时，2-氨基嘌呤-6(H) 硫酮X＝-3，纵轴上HSV-2抑制率Y(6-thioguanine)＝30.25％、 Y(Acyclovir)＝12.51％、Y(Ganciclovir)＝10.25％；②在横轴上，以log10计数时，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮X＝-2，纵轴上HSV-2抑制率 Y(6-thioguanine)＝40.25％、Y(Acyclovir)＝22.43％、Y(Ganciclovir)＝15.25％；③在横轴上，以log10计数时，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮X＝-1，纵轴上HSV-2 抑制率Y(6-thioguanine)＝50.12％、Y(Acyclovir)＝28.25％、 Y(Ganciclovir)＝19.35％；④在横轴上，以log10计数时，2-氨基嘌呤-6(H) 硫酮X＝0，纵轴上HSV-2抑制率Y(6-thioguanine)＝70.00％、Y(Acyclovir)＝45.12％、Y(Ganciclovir)＝25.25％；⑤在横轴上，以log10计数时，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮X＝0.699，纵轴上HSV-2抑制率 Y(6-thioguanine)＝82.00％、Y(Acyclovir)＝70.00％、Y(Ganciclovir)＝28.56％。结论：2-氨基嘌呤-6(H)硫酮、阿昔洛韦和更昔洛韦分别抑制HSV-2对HCEC 细胞感染的EC50分别为0.1uM、1uM和5uM，2-氨基嘌呤-6(H)硫酮比阿昔洛韦和更昔洛韦有更好对HSV-2的抑制效率。
实施例8动物实验
选用6周龄C57BL/6雄鼠15只，随机分成4组：5只作为对照组，15 只作为HSV-1感染组。按照文献(Science Translational Medicine，2018， 5861-5869)造模方法，根据角膜基质法从小鼠眼睛注射50uL HSV-1(病毒滴度：1×106PFU)，HSV-1感染小鼠眼睛获得HSK动物模型。然后将15 只HSK模型小鼠随机分为3组：一组作为HSV-1感染组，注射生理盐水(saline)；这组作为生理盐水治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的阴性对照。一组作为HSV-1感染组，注射2-氨基嘌呤-6(H)硫酮(6-thioguanine)(浓度： 4.5ug/eye)；一组作为HSV-1感染组，注射阿昔洛韦(Acyclovir)(浓度： 4.5ug/eye)。这组作为阿昔洛韦治疗单纯疱疹病毒性角膜炎的阳性对照。在小鼠眼睛感染HSV-1后4小时，开始每天三次给药治疗，连续给药治疗7 天。在每次治疗之前，使用异氟烷轻度麻醉小鼠。将药物以5uL逐滴地施用于角膜表面。待给药后，小鼠恢复意识保持清醒后返回笼中。结果如图8 所示，在横轴上显示小鼠眼睛被HSV-1感染1、3、5、7天后，用2-氨基嘌呤-6(H)硫酮、阿昔洛韦和生理盐水治疗角膜炎的效果。在纵轴上采用TCID50方法检测小鼠角膜上皮里面HSV-1病毒滴度。分别用2-氨基嘌呤-6(H)硫酮、阿昔洛韦和生理盐水处理后，测得小鼠角膜上皮里面HSV-1病毒滴度。从测定的小鼠角膜上皮里面HSV-1病毒滴度大小可以判断2-氨基嘌呤-6(H) 硫酮抑制角膜炎里面HSV-1复制的效果比阿昔洛韦的效果好。
实施例9细胞毒性实验
将vero、HeLa和HCEC细胞分别接种于96孔细胞培养板中，待细胞汇合后，分别加入不同浓度的的2-氨基嘌呤-6(H)硫酮，2-氨基嘌呤-6(H) 硫酮的浓度为10-3、10-2、10-1、1和5μM；2-氨基嘌呤-6(H)硫酮与细胞共孵育72h后，采用CCK8实验方法测得细胞活力大小。最后通过Tecan 仪器在450nm处测得吸光值大小(OD)。结果如图9所示，在横轴上分别为Vero、HeLa和HCEC细胞在不同浓度2-氨基嘌呤-6(H)硫酮处理。在纵轴上分为Vero、HeLa和HCEC细胞在不同浓度2-氨基嘌呤-6(H)硫酮处理后对应的细胞活力大小。2-氨基嘌呤-6(H)硫酮在这三种细胞系上对应的细胞活力为100，所以几乎没有细胞毒性。排除了2-氨基嘌呤-6(H)硫酮细胞毒性对HSV-1复制的影响。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.2-氨基嘌呤-6(H)硫酮在制备单纯疱疹病毒的抑制剂中的应用，所述单纯疱疹病毒为单纯疱疹病毒II型。
2.2-氨基嘌呤-6(H)硫酮在制备预防和/或治疗由单纯疱疹病毒感染导致的疾病的药物中的应用，所述单纯疱疹病毒为单纯疱疹病毒II型。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述由单纯疱疹病毒感染导致的疾病包括龈口炎、单纯疱疹病毒性角膜炎、脑炎和单纯疱疹病毒感染引起的生殖器疱疹。
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